A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.

SILVA, Michelle Moura. Proteínas do plasma seminal de touros Bos Indicus e associações com parâmetros seminais. 2011. 71 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Zootecnia, Fortaleza-CE, 2011 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-09T13:06:10Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_mmsilva.pdf: 1145339 bytes, checksum: d51993cff038075c4bea680c81c0cb00 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-09T13:06:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_mmsilva.pdf: 1145339 bytes, checksum: d51993cff038075c4bea680c81c0cb00 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T13:06:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_mmsilva.pdf: 1145339 bytes, checksum: d51993cff038075c4bea680c81c0cb00 (MD5) Previous issue date: 2011 / This research aimed to describe the two-dimensional electrophoresis map of bull seminal plasma of adult Bos indicus, Brahman, and the determination of statistical associations between proteins of seminal plasma and semen parameters of these bulls. Semen samples from 56 bulls were collected and seminal plasma was obtained by centrifugation and subjected to two-dimensional electrophoresis. The gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using PDQuest application. The bulls were divided into groups of high and low sperm motility and high and low percentage of morphologically normal sperm cells. The most abundant proteins in seminal plasma of bulls Bos indicus and detected in all 56 gels showed similarity to espermadesinas and BSPs. The expression of spots with pI values ​​kDa protein equivalent to aSFP, BSPs, clusterin, albumin and osteopontin were significantly different between groups of animals with contrasting parameters of sperm motility and morphology. The associations found between such protein spots and semen parameters suggest the possibility of their use as molecular markers of potential fertility of animals. / A realização desta pesquisa teve por objetivos a descrição do mapa eletroforético bidimensional do plasma seminal de touros adultos Bos indicus, raça Brahman, bem como a determinação das associações estatísticas entre proteínas do plasma seminal e parâmetros seminais destes touros. Amostras de sêmen de 56 touros foram coletadas e o plasma seminal foi obtido através de centrifugação e submetido à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados por meio do aplicativo PDQuest. Os touros foram divididos em grupos de alta e baixa motilidade espermática e alto e baixo percentual de células espermáticas morfologicamente normais. As proteínas mais abundantes no plasma seminal dos touros Bos indicus e detectadas em todos os 56 géis apresentaram semelhança com espermadesinas e BSPs. A expressão de spots com valores de kDa e pI equivalentes aos das proteínas aSFP, BSPs, clusterina , albumina e osteopontina foram estatisticamente diferentes entre os grupos de animais com parâmetros contrastantes de motilidade e morfologia espermáticas. As associações encontradas entre tais spots protéicos e os parâmetros seminais sugerem a possibilidade do uso destes como marcadores moleculares da fertilidade potencial dos animais.

A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.

Este projeto teve como objetivo principal realizar um estudo proteômico diferencial aplicado às amostras de casca do caule de plantas cítricas sadias e infectadas pela morte súbita dos citros. Subsequentemente, a identificação de proteínas diferentemente expressas será de grande importância, uma vez que estas poderão servir não somente como candidatos a biomarcadores para a doenças, mas também auxiliarão no melhor compreensão da doença. À partir dos géis bidimensionais obtidos para amostras de porta-enxerto (limão cravo e limão volkameriano) e copa (laranja valência) foi possível verificar que existem dois conjuntos de proteínas sensivelmente sub-expressas em plantas doentes. Um desses conjuntos, constituído por 13 spots, apresenta valores de pI entre 4,5 e 5,2 e MM aproximadamente igual a 30 kDa. No outro conjunto, esse composto por 9 spots, valores de pI variando entre 6,1 e 9,6 e MM em torno de 20 kDa são observados. Por meio das técnicas de MALDI-TOF-TOF e LC-ESI-MS/MS, inúmeros spots foram inequivocamente identificados, incluindo os spots correspondentes às regiões diferentemente expressas. Os 13 spots correspondentes a região com valores de pI entre 4,5 e 5,2 e MM ~ 30 kDa foram todos identificados como sendo constituídos por três isoformas de quitinases. Por outro lado, os spots referentes a região com pI entre 6,1 e 9,6 e MM ~ 20 kDa foram identificados como proteína putativa similar a miraculina 2. A justificativa para o fato de diversos spots terem recebido a mesma identificação é atribuída às inúmeras e diferentes modificações pós-traducionais, comumente verificadas em plantas. Entretando, o aspecto mais relevante relacionado a essas identificações é o fato de que ambas as proteínas são conhecidas marcadoras de resistência de defesa em plantas e assim sendo, a priori, espera-se-ia que estivessem sendo super expressas em plantas doentes. Porém, um comportamento inverso foi verificado, o que reforça as evidências de que as quitinases não agem apenas como marcadores de defesa em plantas, possuindo assim outras funções. Além disso, no total, outras 19 proteínas puderam ser identificadas. / The main goal of this project was to perform a differential proteomic analysis of bark tissues of healthy and CSD (citrus sudden death)- affected citrus plants. Subsequently, the identification of differently expressed proteins will be of great importance since they can be used not only as biomarkers for CSD but also as basic information for improving the knowledge about the disease. According to the 2D gels, obtained for bark tissues of both rootstock (rangpur lime and volkamerian lemon) and scion samples, there are two sets of proteins remarkably under expressed in CSD-affected samples. One of these sets is composed by 13 proteins, which presents MW around 30 kDa and pI ranging from 4.5 to 5.2. The other set includes 9 proteins with pI ranging from 6.1 to 9.6 and MW around 20 kDa. By using two mass spectrometry approaches (MALDI-TOF-TOF and LC-ESI-MS/MS), several proteins have been unequivocally identified, including the differentially expressed ones. Thirteen spots have been identified as a mixture of three chitinase isoforms. These spots are relative to the region with pI ranging from 4.5 to 5.2 and MW ~ 30 kDa. On the other hand, the 9 spots referent to the region with MW ~ 20 kDa and pI between 6.1 and 9.6 were identified as putative miraculin-like 2 protein. Several spots have been identified as the same protein most probably due to the occurrence of different post-translational modifications. The most valuable point regarding the identity of these proteins is the fact that they are well-known plant pathogen-related proteins and then they should be over expressed in affected plants. However, the opposite behavior was verified, which may indicate that chitinases and putative miraculin-like 2 protein perform unknown functions, besides the established ones. In addition, other 19 constitutive proteins have been identified.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-15Bitstream added on 2014-06-13T20:36:06Z : No. of bitstreams: 1 santos_fa_me_botfmvz.pdf: 1235942 bytes, checksum: 7b3f579b06b2874c741bde8ef170587e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O presente trabalho teve como objetivo investigar a presença de manganês e zinco em “spots” protéicos de amostras de plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) obtidos após separação das proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE) para posterior avaliação qualitativa e quantitativa utilizando fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica em chama e em forno de grafite (FAAS/GFAAS). As análises dos espectros de fluorescência indicaram a presença de manganês e zinco em quatro e seis “spots” protéicos de plasma, respectivamente. Observou-se que os íons metálicos estão ligados em proteínas com massa molar na faixa de 19 a 70 kDa e com pI na faixa de 4,7 a 6,30. A concentração de manganês e zinco ligados a essas proteínas foi determinada por GFAAS após a mineralização ácida dos spots protéicos, encontrandose concentrações na faixa de 3,40 a 4,20 mg g-1 e 2,30 a 13,90 mg g-1, respectivamente / The aim of the present study was to investigate the presence of manganese and zinc in protein spots in samples of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) plasma obtained after protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and subsequent qualitative and quantitative determination by synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) and graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS). An analysis of the fluorescence spectra indicated the presence of manganese and zinc in four and six plasma protein spots, respectively. It was observed that the metal ions are bound in proteins with molecular weight ranging from 19 to 70 kDa and pI ranging from 4.7 to 6.30. The manganese and zinc concentrations bound to these proteins were determined by GFAAS after acid digestion of protein spots, finding concentrations ranging from 3.40 to 4.20 mg g-1 and 2.30 to 13.90 mg g - 1, respectively

Orientador: Pedro de Magalhães Padilha / Banca: Gustavo Rocha de Castro / Banca: Eduardo José de Arruda / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo investigar a presença de manganês e zinco em "spots" protéicos de amostras de plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) obtidos após separação das proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE) para posterior avaliação qualitativa e quantitativa utilizando fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica em chama e em forno de grafite (FAAS/GFAAS). As análises dos espectros de fluorescência indicaram a presença de manganês e zinco em quatro e seis "spots" protéicos de plasma, respectivamente. Observou-se que os íons metálicos estão ligados em proteínas com massa molar na faixa de 19 a 70 kDa e com pI na faixa de 4,7 a 6,30. A concentração de manganês e zinco ligados a essas proteínas foi determinada por GFAAS após a mineralização ácida dos spots protéicos, encontrandose concentrações na faixa de 3,40 a 4,20 mg g-1 e 2,30 a 13,90 mg g-1, respectivamente / Abstract: The aim of the present study was to investigate the presence of manganese and zinc in protein spots in samples of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) plasma obtained after protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and subsequent qualitative and quantitative determination by synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) and graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS). An analysis of the fluorescence spectra indicated the presence of manganese and zinc in four and six plasma protein spots, respectively. It was observed that the metal ions are bound in proteins with molecular weight ranging from 19 to 70 kDa and pI ranging from 4.7 to 6.30. The manganese and zinc concentrations bound to these proteins were determined by GFAAS after acid digestion of protein spots, finding concentrations ranging from 3.40 to 4.20 mg g-1 and 2.30 to 13.90 mg g - 1, respectively / Mestre

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Seminal plasma is the fluid portion of semen and its presence positively affects the survival and parameters of sperm motility in rabbits. This study aimed (i) to verify the seminal concentrations of sodium, chloride and citric acid as a function of collection month, the color and aspect of the ejaculate, and to find the frequency of ejaculations with the presence of gel fraction, color and aspect of the semen of rabbits on tropical climate, (ii) to meet monthly protein spots and their possible correlation with seminal and biochemical parameters in rabbits. 20 rabbits of New Zealand White, raised in the flat-deck, fed commercial feed were used. The samples were collected twice a week, and then evaluated for volume, color, aspect, vigor, motility and sperm concentration. After the evaluations, the samples were centrifuged to obtain seminal plasma, which was stored in eppendorfs tubes at -18 oC. A monthly seminal plasma pool of each animal was made to evaluate the concentrations of sodium, chloride, citric acid and proteins. Significant monthly variations were found (p <0.05) in the concentrations of sodium, chloride and citric acid in the seminal plasma of rabbits. All mineral constituents analyzed suffered significant influence (p <0.05) by the color of the ejaculate, and the highest concentrations were found in the white-yellowish ejaculates. Correlation studies found a high and significant association between concentrations of sodium and vigor (r = 0.80, p <0.001), and between sperm concentration and citric acid (r = -0.64, p <0.02). Most of the ejaculates of rabbits showed no gel fraction. The results also showed that the white and milky ejaculate are the most common for the species. It was also observed an average concentration of 2.73  0.31 mg / dl total protein in samples of seminal plasma. From the quantification of total protein were prepared two-dimensional electrophoresis gels stained SDS-PAGE with silver nitrate, with a pH gradient between 3 â 10, mesh 15% and a concentration of 100 mg of protein per sample for each month. Gels were analyzed with the Image Master 2D Platinum 6.0.  software. The gel containing the most spots (555 spots) was the gel of the month of May, and the gel with fewer spots (71 spots) was observed in January, but no effect of month on the amount of spots was detected. The majority of spots present in seminal plasma of rabbits have pI below 8, and these spots, about 40% have pI acid, the distribution of the spots as a function of pI was homogeneous throughout the year. The distribution of spots depending on the molecular weight widely varied between the months. Except of a few months, most of the protein had a molecular weight above 100 kDa. The number of protein spot positively and moderately correlated with total protein (r = 0.57, p <0.05) and citric acid (r = 0.59, p <0.05). In silico analysis of 1411 protein spots found compatible proteins with the Swiss-Prote database and TrEMBL (UniProtKB). It is concluded that the composition of the seminal plasma of rabbits showed a broad monthly variation and ejaculated with high concentrations of citric acid are undesirable. In addition, the protein profile of rabbits has great affinity of the proteins to acidic and high molecular weight, no influence of the months of the year on the amount of protein spots identified were found and bioinformatics analysis tool does not provide consistent results with those obtained gel electrophoresis, but it allows an estimate of the probable proteins that can be found. / O plasma seminal representa a porÃÃo fluida do sÃmen e sua presenÃa afeta positivamente a sobrevivÃncia e os parÃmetros de motilidade espermÃtica em coelhos. Este trabalho teve como objetivos (i) verificar as concentraÃÃes seminais de sÃdio, cloretos e Ãcido cÃtrico em funÃÃo do mÃs de coleta, da cor e do aspecto do ejaculado, e encontrar a frequÃncia de ejaculados com presenÃa de fraÃÃo gel, cor e aspecto do sÃmen de coelhos criados em clima tropical; (ii) conhecer os spots proteicos mensais e suas possÃveis correlaÃÃes com parÃmetros seminais e bioquÃmicos de coelhos. Foram utilizados 20 coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, criados em sistema flat-deck, alimentados com raÃÃo comercial. Os ejaculados foram coletados duas vezes por semana, e logo avaliados quanto ao volume, cor, aspecto, vigor, motilidade e concentraÃÃo espermÃtica. ApÃs as avaliaÃÃes os ejaculados foram centrifugados para obtenÃÃo do plasma seminal, que foi acondicionado em tubos eppendorfs a -18 oC. Um pool mensal de PS de cada animal foi feito para avaliaÃÃo das concentraÃÃes de sÃdio, cloretos, Ãcido cÃtrico e proteÃnas totais. Foram constatadas variaÃÃes mensais significativas (p<0,05) nas concentraÃÃes de sÃdio, cloretos e Ãcido cÃtrico no plasma seminal de coelhos. Todos os constituintes minerais analisados sofreram influencia significativa (p<0,05) da cor do ejaculado, e as concentraÃÃes mais elevadas foram constatadas nos ejaculados de cor branco-amarelada. O estudo de correlaÃÃes encontrou associaÃÃo alta e significativa entre as concentraÃÃes de sÃdio e vigor (r=0,80; p<0,001), bem como entre a concentraÃÃo espermÃtica e o Ãcido cÃtrico (r=-0,64; p<0,02). A maior parte dos ejaculados de coelhos nÃo apresentaram a fraÃÃo gel. Os resultados tambÃm mostraram que o ejaculado de cor branca e de aspecto leitoso sÃo os mais comuns nessa espÃcie. TambÃm foi verificado uma concentraÃÃo mÃdia de 2,73 Â0,31 &#956;g/dl de proteÃnas totais nas amostras de plasma seminal. A partir da quantificaÃÃo das proteÃnas totais foram confeccionados dois gÃis de eletroforese bidimensional SDS-PAGE corados com nitrato de prata, com gradiente de pH entre 3 â 10, malha de 15% e uma concentraÃÃo de 100 &#956;g de proteÃnas por amostra, para cada mÃs. Os gÃis foram analisados no software Image Master 2D Platinum 6.0. Â. O gel que continha o maior nÃmero de spots (555 spots) foi o do mÃs de maio, e o gel com menor nÃmero spots (71 spots) foi verificado em janeiro, mas nÃo houve efeito do mÃs sobre a quantidade de spots detectados. A maioria dos spots presentes no plasma seminal de coelhos tem pI abaixo de 8 e, destes spots, cerca de 40% tem pI Ãcido, a distribuiÃÃo dos spots em funÃÃo do pI foi homogÃnea ao longo do ano. A distribuiÃÃo dos spots em funÃÃo do peso molecular variou amplamente entre os meses. Com exceÃÃo de alguns os meses, a maioria das proteÃnas apresentaram peso molecular acima de 100 kDa. O nÃmero de spot proteicos correlacionaram-se moderada e positivamente com as proteÃnas totais (r=0,57; p<0,05) e com o Ãcido cÃtrico (r=0,59; p<0,05). A anÃlise in silico dos spots encontrou 1.411 proteÃnas compatÃveis com os bancos de dados Swiss-Prote e TrEMBL (UniProtKB). Concluiu-se que a composiÃÃo do plasma seminal de coelhos apresentou ampla variaÃÃo mensal e que ejaculados com alta concentraÃÃo de Ãcido cÃtrico sÃo indesejÃveis. AlÃm disso, o perfil proteico de coelhos apresenta grande parte das proteÃnas com afinidade a meio Ãcido e com alto peso molecular, nÃo houve influencia de meses do ano sobre a quantidade de spots proteicos detectados, e devido à ausÃncia de dados sobre coelhos, a ferramenta de anÃlise bioinformÃtica nÃo ofereceu resultados coerentes, mas permite uma estimativa das provÃveis proteÃnas que podem ser encontradas.

A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.

Orientadores: José Camilo Novello, Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fontanesi_KarinaKleinfelder_M.pdf: 2853236 bytes, checksum: 30ce9c486d1739927e3bd38f96e22015 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O sistema citrícola no Brasil representa um setor de grande importância econômica. O Estado de São Paulo é o principal produtor de citros, fazendo do país o maior exportador de suco de laranja concentrado congelado. Apesar do Brasil ocupar uma posição de destaque no cenário mundial de citricultura, o país não consegue aumentar a sua produtividade devido à ocorrência simultânea de pragas e doenças, sendo que a clorose variegada dos citros (CVC) se mostra como uma das mais limitantes sobre esta produção. Ela é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, que é capaz de infectar todas as variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), embora a tangerina Poncan (Citrus reticulata Blanco) seja considerada tolerante à sua infecção. Apesar de muitos estudos já tenham sidos realizados a fim de se compreender melhor os mecanismos da sua patogenicidade, questões ainda permanecem em aberto acerca dos mecanismos que controlam o seu processo de infecção e o desenvolvimento da doença. Desse modo, foi realizado um estudo comparativo do proteoma das folhas de laranja Pêra e de tangerina Poncan após 30 dias da inoculação com a X. fastidiosa e o dos obtidos de folhas não infectadas, empregando a técnica de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas (MS). Foram confeccionados mapas 2DE com o intuito de se verificar proteínas diferencialmente expressas que por ventura poderiam estar relacionadas aos mecanismos de defesa e resistência da planta. Entre as proteínas (spots) de laranja Pêra, separadas por eletroforese bidimensional, 60 spots foram considerados como estatisticamente relevantes, apresentando alteração de intensidade. Entre as proteínas de tangerina Poncan analisadas na mesma condição, 38 foram consideradas como estatisticamente relevantes. Confeccionou-se para a planta tangerina Poncan géis de poliacrilamida utilizando IPG com gradiente de pH linear de 4-7, visto que houve um grande número de proteína diferencialmente expressas nesta faixa. Como resultado, foram obtidos 45 spots com diferença de expressão. A identificação dessas proteínas foi feita por meio do seqüenciamento por espectrometria de massas através do sistema LC ESI-MS/MS ou MALDI-Q-TOF. O seqüenciamento por MS possibilitou a aquisição da seqüência de aminoácidos de 49,7% dos spots. Dentre eles, 76% dos spots foram identificados, enquanto que 24% não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas quatro foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência de eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducionais, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. As proteínas identificadas foram relacionadas com a produção de energia, com o metabolismo primário, com mecanismo de defesa, proteínas de microrganismos e proteínas desconhecidas. Laranja Pêra apresentou uma diminuição da expressão de proteínas relacionadas à fotossíntese, o que coincide com os primeiros efeitos sentidos pelas plantas colonizadas pela bactéria. Em contrapartida, tangerina Poncan apresentou um aumento de expressão de proteínas relacionadas à resposta de defesa contra esse patógeno. / Abstract: The citrus system in Brazil represents one of the most important economic sectors. The State of São Paulo is the main producer of citrus, settling the country as the biggest exporter of concentrated freezing orange juice. Besides holding the outstanding position in the worldwide citrus culture scene, the country cannot raise its productivity due to simultaneous occurrence of plagues and diseases, being the citrus variegated chlorosis (CVC) one of the most limiting diseases affecting the citrus production. This disease is caused by bacterium Xylella fastidiosa, that which is able to infect all sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) varieties, however ponkan (Citrus reticulate Blanco) was considered resistant to it. Although, many studies have already been done in order to understand, in a better way, the mechanism of its pathogenicity, there are still queries about the mechanisms which control the process of its infection and the development of the disease. In this manner, we did a comparative proteomics study of leaves from sweet orange and ponkan after 30 days of the inoculation with X. fastidiosa versus leaves not infected with this bacterium (healthy plants), using two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and mass spectrometry techniques. Comparative 2DE maps were done with the aim to verify differentially expressed proteins related with defense mechanism and the plant resistance. Among the proteins (spots) extracted from sweet orange, separated by two-dimensional gel electrophoresis, 60 spots were considered with statistical significance, showing intensity alteration. On the other hand, among the proteins (spots) extracted from ponkan and analyzed in the same condition, 38 spots were considered with statistical significance. Gels using linear pH gradient ranging from 4 to 7 were prepared for ponkan gels using, because there were a larger number of differentially expressed proteins in this area. As a result, we obtained 45 spots with difference in its expression. The identification of these proteins was done by sequencing using mass spectrometry like LC ESI-MS/MS or MALDI-Q-TOF. 143 spots were analyzed by mass spectrometry and were obtained amino acid sequence from 71 (49,7%) of the spots. Between them, 54 (76%) were identified, while 17 (24%) presented no homology in the database used. Overall, 4 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the protein found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. The identified proteins play a role in energy, primary metabolism, defense mechanism, unknown proteins and microorganism proteins. The sweet orange presented a decrease in expression of photosynthesis related protein, indicating a possible lower photosynthetic activity resulting from early effects of the bacterial colonization in affected plants. On the other hand, ponkan showed an increase in defense-related proteins response against this pathogen. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular