Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Psyllidae) tornou-se um psilídeo de grande importância para a citricultura paulista após a constatação da bactéria Candidatus Liberibacter sp., causadora do Huanglongbing (greening). Sabe-se que esse inseto abriga microrganismos endossimbiontes, os quais desempenham papel fundamental em sua ecologia nutricional, sendo transmitidos verticalmente à progênie. Dessa forma, propomos caracterizar a morfologia do aparelho reprodutor feminino durante o seu desenvolvimento para embasar a identificação do processo de migração dos simbiontes do bacterioma aos tecidos reprodutivos. D. citri possui ovário do tipo telotrófico, com ovaríolos organizados em bouquet e características gerais semelhantes às observadas para outros Sternorrhyncha. Os trofócitos parecem ser desprovidos de delimitação por membrana no ovaríolo desenvolvido. Um único oócito se desenvolve por ciclo no vitelário, o qual mantém-se em contato com a câmara trófica por um prolongamento citoplasmático, denominado cordão trófico. As informações morfo-estruturais do aparelho reprodutor de D. citri obtidas indicam similaridades importantes a de outros membros de Sternorryncha. Nesse contexto, a migração de simbiontes do bacterioma para os oócitos em maturação de D. citri, ocorre de modo semelhante ao descrito para aleirodídeos, caracterizandose pela migração de bacteriócito intacto. Este último, atravessa o epitélio de revestimento do oócito, formado por células foliculares, e invade o oócito, liberando as bactérias nele contidas. Entretanto, os simbiontes associados ao sincício do bacterioma, são liberados na hemocele através de uma pequena abertura formada no epitélio de revestimento dessa estrutura, invadindo o oócito por um mecanismo distinto. Os simbiontes contidos no oócito, formam um agrupamento de aspecto arredondado (= symbiont ball) na região posterior do oócito, próximo ao pedicelo. / Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Psyllidae) became a serious problem to the citrus industry in São Paulo State once the Huanglongbing disease (greening), which is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter sp., was detected. Psyllids are known to harbor endosymbiont microorganisms, which are vertically transmitted to the progeny and play a key role in the nutritional ecology of their hosts. Therefore, we aimed to characterize the morphology of the reproductive system during D. citri development as a tool for further investigation on the symbiont migration from the bacteriome to the reproductive tissues. D. citri has telotrophic ovaries with ovarioles organized in a bouquet, sharing all other characteristics with the remaining Sternorrhyncha. In developed ovarioles, trophocytes seems to lack any membrane delimitation. Only one oocyte develops at a time in the vitellarium, remaining in communication with the trophic chamber by a citoplasmatic brigde, named trophic cord. The morphostructural information reported in here on the D. citri reproductive system shows important similarities with other Sternorryncha. Symbionts associated to the bacteriome of D. citrus migrate to the ovaries and invade the oocytes during ovary maturation, as previously reported for aleyrodids. In this case, symbionts will move within the bacteriocyte as it detaches from the bacteriome and moves through the oocyte follicular epithelium, releasing the contained bacteria into the oocyte. However, symbionts associated to the bacteriome syncitium are relased into the hemocoel through small openings on the bacteriome epithelium, invading the oocyte by a different mechanism. All symbionts that invaded or were discharged into the oocyte aggregate into a balllike symbiont structure at the posterior pole close to the egg pedicel.

A podridão floral dos citros (PFC) é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum acutatum responsável por causar grandes danos à produção de citros no Brasil. A doença surge apenas em botões florais com 8mm de comprimento ou maiores, levando a formação de lesões alaranjadas nas pétalas, lesões necróticas no estigma, promove a queda prematura dos frutos e a retenção do cálice e pedúnculo, sendo este último sintoma denominado estrelinha. Este trabalho tem por objetivo: observar o modo de penetração do fungo no hospedeiro Citrus sinensis Valência e os estágios posteriores da colonização, verificar se há fatores estruturais e químicos pré-formados que expliquem o porquê do fungo não conseguir infectar botões florais com menos de 8mm, caracterizar anatomicamente o sintoma estrelinha e estigmas lesionados, investigar ultraestruturalmente pétalas inoculadas, analisar se há o estabelecimento de uma infecção quiescente nos tecidos foliares, analisar grãos de pólen após a inoculação in vivo e in vitro com o fungo. Botões florais sadios, pétalas e estigmas com e sem lesões, foram submetidos às técnicas convencionais de microscopia de luz e eletrônica. Folhas e grãos de pólen foram inoculados e analisados. Foi desenvolvida uma nova técnica de coloração para tecidos vegetais infectados por fungos. A resistência dos botões florais menores que 8mm pode estar associada às barreiras químicas e estruturais pré-formadas. O ápice, nesses botões, apresenta papilas entremeadas, cristais de oxalato de cálcio no mesofilo e câmara subestomática e cavidades de óleo localizadas muito próximas umas das outras. Botões com 8mm e 12mm possuem, no ápice, papilas com arranjo frouxo, ausência de cristais e maior distanciamento entre as cavidades de óleo. No ápice da pétala, verificou-se que as células papilosas são osmóforos. No sintoma estrelinha, nota-se sob a região de abscisão do ovário a instalação de um meristema de cicatrização. A lignificação das paredes das células da medula do receptáculo e do pedúnculo floral está associada à retenção destas estruturas na planta. Nas pétalas infectadas, o C. acutatum pode penetrar intra, intercelularmente e via estômato. O fungo pode crescer de modo subcuticular e intramural e coloniza todos os tecidos da pétala. A nova técnica de coloração se mostrou muito útil nas análises histopatológicas. O fungo associa-se aos tecidos vasculares. Acérvulos ocorrem em ambas as faces das pétalas. A cutícula nos estágios mais avançados da lesão apresenta-se alterada, ou seja, ocorre a perda da ornamentação estriada e maior deposição de material lipofílico. A síntese de materiais lipofílicos envolve o retículo endoplasmático liso e rugoso e plastídios. Vesículas provenientes de dictiossomos e de corpos multivesiculares são observadas ao longo da parede celular e estão associadas ao depósito de material lipofílico na cutícula. No estigma lesionado há a formação de uma camada de proteção. O fungo apresenta quimiotropismo e cresce em direção aos grãos de pólen infectando-os 24 horas após a inoculação. Sugere-se que C. acutatum pode utilizar grãos de pólen para a sua dispersão. Após 48 horas da inoculação as folhas apresentam conídios germinados com apressórios. / The postbloom fruit drop (PFD) is a disease caused by Colletotrichum acutatum responsible for causing great damage to citrus crops in Brazil. The disease appears only in flower buds 8 mm in length or greater, leading to orange lesions in petals, necrotic lesions on the stigma, promoting the young fruit drop and the retention of the calyx and peduncle, which is called buttons. In this context, this study aimed to: observe the fungus penetration mode into the host Citrus sinensis \'Valência\' and the later stages of colonization; study the presence of preformed structural and chemical factors to explain why the fungus cannot infect floral buds with less than 8 mm in length; characterize anatomically the symptom \"buttons\" and injured stigmas; investigate the ultrastructural changes in tissues of inoculated petals; analyze whether there is the establishment of a quiescent infection in leaf tissues, analyze pollen grains after inoculation in vivo and in vitro with the fungus. Healthy buds, petals and stigmas with and without lesions, were processed and analyzed using conventional light and electron microscopy techniques. Leaves and pollen grains were also inoculated and analyzed with light microscopy. It was developed a new staining method for fungal-infected plant tissues. The resistance of flower buds smaller than 8mm may be associated with preformed structural and chemical barriers. These buttons display the apex with interspersed papillae, with crystals in mesophyll and substomatic chamber and oil cavities, which are located very close to each other on the abaxial surface. In 8mm and 12mm flower buds, the papilas in the apex become weakly interspaced, the crystals are not observed and there is the increase of the distance between the oil cavities. The papillose cells are osmophores. In the symptom \"button\", it is noted in the abscission of the ovary, an installation of wound meristem. There is also the lignification in the pith of receptacle and pedicel that can be associated with the retention of these structures in the plant. In infected petals, it was found that C. acutatum can penetrate intra and intercelullar or via stomata. The fungus may grow subcuticular and intramural and colonize all tissues of petal. The new staining technique developed has proved very useful for histopathological analysis. The fungus is closely associated with vascular tissues. The acervulli occur on both surfaces of petals. The cuticle in the later stages of the lesion is altered, i.e., there is loss of striated ornamentation and increased deposition of lipophilic material. The synthesis of lipophilic materials involves rough and smooth endoplasmic reticulum and plastids. Vesicles from dictyosomes and multivesicular bodies were observed throughout the cell wall and are associated with the deposit of lipophilic material in the cuticle. There is the formation of protective layer over the stigma damaged area. The fungus shows chemotropism and grows toward the pollen infecting it 24 hours after inoculation. It is suggested that C. acutatum can use pollen grains for dispersal. After 48 hours of inoculation, the leaves have germinated conidia with appressoria.

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Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_bruna_curcio.pdf: 7472121 bytes, checksum: b7f2b517d0687e52e051d45e308fb2eb (MD5) Previous issue date: 2006-12-05 / The aim of the study was to investigate: 1) the ultrastructural morphologic characteristics in equine oocytes subjected to different times of exposure to cryoprotectant solutions and 2) the effect of initial cumulus morphology and cryoprotectants in the nuclear in vitro maturation (IVM) of the vitrified immature equine oocytes. The oocytes were obtained from ovaries from a slaughterhouse. In the first study 30 oocytes where divided in three groups: Control group (G1, n=10); Group 2 (G2, n=10), the oocytes were vitrified for exposure to VS-1 for 3min and VS-2 for 1min; Group 3 (G3, n=10), exposure to VS1 for 1.5min and VS-2 for 30sec. The oocytes were vitrified in open-pulledstraws (OPS). The ultrastructural characteristics where observed using a transmission electron microscope. The oocytes were classified as: I) oocytes morphologically normal; II) oocytes which presented intermediate damage but had completed organelles, and III) oocytes with severe morphological abnormalities. In the second study, compact (Ccp; n=248) and expanded (Cex; n=264) cumulus oocyte complexes were divided in three groups: Control, Treatment-1 (T1 - Ethylene glycol-EG + Dimetyl sulfoxide-DMSO + SIB) and Treatment-2 (T2 - Formamide + EG + DMSO + Polyvinylpyrrolidone + SIB). The control group was immediately matured in vitro, the other immature oocytes were vitrified in OPS and then matured in vitro. The maturation stage was observed under a fluorescence microscope (Hoechst 33342). The results of ultrastructural morphology were rated as Class I: 80% oocytes of G1, 30% of G2 and 60% of G3; Class II: 0% oocytes of G1, 20% of G2 and 30% of G3 30%, and Class III: 20% oocytes of G1, 50% of G2 and 10% of G3. The maturation rates (metaphase II - MII) were: 41% Control group, 38,3% T1 and 33,3% T2 (P>0,05). In the control group, the MII rates were higher in Cex oocytes (53,2%) than those Cco oocytes (29,3%; P<0,05). The initial cumulus morphology didn t significantly affect MII rates after vitrification (P>0,05). However, Cex oocytes had higher MII rates than Ccp oocytes in T1 (50% vs 27,3%) and T2 (45,7% vs 21,6%). It can be concluded that the reduction in time of exposure to cryoprotectant solutions resulted in better preservation of ultrastructural characteristics of equine oocytes submitted to vitrification. Immature equine oocytes can be IVM after vitrification/re-warming, and satisfactory MII rates can be obtained. The initial cumulus morphology did not affect nuclear in vitro maturation of equine oocytes after vitrification. / Os objetivos do presente estudo foram: 1) analisar características morfológicas ultra-estruturais em oócitos eqüinos submetidos à vitrificação; 2) avaliar a maturação nuclear in vitro (MIV) de oócitos eqüinos vitrificados em soluções contendo bloqueadores sintéticos da formação de gelo (SIB); 3) considerar a influência das características das células do cumulus-oophorus no momento da coleta sobre a maturação nuclear in vitro. Foram utilizados complexos cumulusoócito obtidos de ovários provenientes de éguas de abatedouro. No primeiro experimento 30 oócitos foram divididos em 3 grupos: Grupo controle (G1, n=10); Grupo 2 (G2, n=10), vitrificados após exposição de 3min em VS-1 e 1min em VS-2; Grupo 3 (G3, n=10), exposição por 1,5min à VS-1 e 30s à VS-2. A vitrificação foi realizada em palhetas abertas estiradas (OPS). As características ultra-estruturais foram observadas em microscópio eletrônico de transmissão, sendo os oócitos classificados em três categorias: I) Oócitos sem alterações; II) oócitos com alterações intermediárias e III) oócitos com alterações severas. No segundo experimento, oócitos cumulus compacto (Ccp; n=248) e cumulus expandido (Cex; n=264) foram divididos em três grupos: Controle, Tratamento-1 (T1 - Etilenoglicol-EG + Dimetilsulfóxido-DMSO + SIB) e Tratamento-2 (T2 - formamida + EG + DMSO + Polivinilpirrolidona + SIB). O grupo controle foi MIV imediatamente após a coleta, o restante foi vitrificado imaturo em OPS e submetido a MIV após o reaquecimento. O estágio de maturação após incubação foi avaliado em microscópio de fluorescência (Hoechst 33342). Na avaliação de ultra-estrutura foram classificados no escore I 80% oócitos G1, 30% do G2 e 60% do G3; Classificação II: 0% dos oócitos G1, 20% do G2 e 30% do G3; e Classificação III: 20% dos G1; 50% do G2 e 10% do G3. Na avaliação da maturação, o índice de oócitos que atingiram MII foi 41% Controle, 38,3% T1 e 33,3% T2 (P>0,05). Nos oócitos do grupo controle, o índice de MII foi superior em oócitos Cex (53,2%) do que oócitos Ccp (29,3%; P<0,05). A avaliação da influência das características das células do cumulus na vitrificação não detectou diferença (P>0,05). Contudo oócitos Cex obtiveram maiores índices de MII do que oócitos Ccp em T1 (50% vs 27,3%) e T2 (45,7% vs 21,6%). Pode-se concluir que a diminuição do período de exposição às soluções de vitrificação resultou em melhor preservação das características ultra-estruturais de oócitos eqüinos submetidos à vitrificação. Oócitos eqüinos imaturos podem ser MIV após vitrificação/reaquecimento, obtendo índices satisfatórios de MII. As características das células do cumulus, no momento da coleta, não interferem no índice de maturação nuclear in vitro de oócitos eqüinos após vitrificação.

Orientador: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Maria Luiza Silveira Mello / Banca: Reinaldo Azoubel / Banca: Carlos Alberto Vicentini / Banca: Eliana Morielle Versute / Resumo: O corpo cromatóide (CB) é uma organela citoplasmática que, aparentemente, possui um papel no estoque de RNA e proteínas para a diferenciação final dos espermatozóides. Existem algumas teorias que tentam explicar a origem do material que compõe essa organela. Uma dessas teorias, proposta por alguns autores, sugere que o CB se origine a partir de material nucleolar, que se fragmenta nas etapas iniciais da espermatogênese e, em seguida, migra para o citoplasma. O objetivo do presente estudo foi acompanhar o ciclo nucleolar por meio de análises citoquímicas - hematoxilina-eosina (HE); azul de toluidina (AT); variante da concentração crítica de eletrólitos (CEC); reação de Feulgen; impregnação por íons prata (AgNOR); citogenéticas - impregnação por íons prata (AgNOR), e análises ultra-estruturais - microscopia eletrônica de transmissão (MET), para verificar a relação da fragmentação do material nucleolar com a formação do corpo cromatóide (CB), em algumas espécies de vertebrados: Tilapia rendalli (Teleostei, Cichlidae); Dendropsophus minutus (Amphibia, Anura); Phrynops geoffroanus (Reptilia, Testudines) e coelho albino da raça Nova Zelândia - Oryctolagus cuniculus (Mammalia, Lagomorpha). Por meio das análises citoquímicas foi possível observar que ocorre uma fragmentação do material nucleolar no início da prófase I, em todas as espécies analisadas, e uma posterior reorganização do nucléolo no núcleo de espermátides iniciais, com uma área significantemente menor do que a área do nucléolo das espermatogônias. Três fenômenos podem contribuir para essa diferença significante entre as áreas nucleolar de espermatogônias e espermátides: a) Modificação no estado funcional da célula; b) Diminuição no número de RONs nas espermátides; c) Migração de material nucleolar fragmentado ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The chromatoid body (CB) is a cytoplasmic organelle that has a function related to RNA and protein accumulation and ⁄ or storage for later germ-cell differentiation. Many theories have been postulated in order to explain the origins of the CB material. One of the most accepted theory describes that it originates from a nucleolar material, where it was fragmented in the early spermatogenesis, and finally, this fragmented nucleolar material migrates to cytoplasm. The aims of the present study were: 1) monitoring the nucleolar material distribution by means of cytochemical techniques (hematoxylin-eosin (HE), toluidine blue (TB), modified Critical Electrolyte Concentration for detecting RNA (CEC), silver-ion impregnation (AgNOR) and Feulgen reaction), and by ultrastructural analysis (Transmission Electron Microscopy - TEM); and 2) comparing the nucleolar material distribution with the formation of CB in some vertebrate species: Tilapia rendalli (Teleostei, Cichlidae); Dendropsophus minutus (Amphibia, Anura); Phrynops geoffroanus (Reptilia, Testudines); and Oryctolagus cuniculus (Mammalia, Lagomorpha). For all analyzed species, the cytochemical techniques showed that the nucleolar fragmentation occurred during the beginning of prophase I, and the nucleolus reorganization occurred in the early spermatids nucleus. Statistical tests evidenced that area of the early spermatids nucleolus were smaller than the spermatogonia nucleolus area. Three phenomena can contribute for the statistical difference between the spermatogonia nucleolar area and the early spermatids nucleolar area: a) Modification of cell activity; b) Decrease of the number of NORs in the spermatids; c) Migration of the fragmented nucleolar material from the nucleus to the cytoplasm. This nucleolar material will participate in the CB formation process. The ultrastructural analysis showed an ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor