Orientador: Jane Megid / Banca: Paulo Eduardo Brandão / Banca: Hélio Langoni / Resumo: O tratamento pós-expositivo da raiva é a principal medida para evitar o desenvolvimento da doença, e baseia-se na aplicação da vacina anti-rábica associada ou não ao soro anti-rábico, em número de doses variáveis de acordo com o tipo de exposição. Protocolos terapêuticos utilizando drogas antivirais vêm sendo aplicados em seres humanos, com resultados positivos e negativos, gerando dúvidas quanto à eficácia. A possibilidade de utilização de RNA de interferência (siRNA) e da ribavirina, associado ou não ao Dimetilsulfóxido (DMSO) no tratamento pós expositivo da raiva experimental em camundongos, representa uma nova perspectiva. Camundongos C57BL6 foram inoculados com uma amostra de rua de vírus rábico proveniente de cão, separados em diferentes grupos e diferentes protocolos terapêuticos, sendo estes administrados 24 horas após a inoculação viral. De cada grupo, oito animais foram separados para observação durante um período de 30 dias sendo os demais sacrificados cinco e dez dias após a inoculação. O cérebro dos animais sacrificados foi coletado e RT-PCR em Tempo Real foi realizada para a detecção e quantificação do gene N do vírus rábico e avaliação da expressão de genes relacionados a resposta imune. Tanto a ribavirina como o siRNA, isoladamente ou associados ao DMSO não demonstraram diferença estatística significante relacionada à letalidade, no entanto, os grupos tratados com ribavirina demonstraram maior percentagem de letalidade e sintomatologia clínica mais severa. Nos animais não inoculados e tratados com a ribavirina, houve um estímulo transitório da resposta imune inata, no entanto, quando associado ao virus rábico este aumento da resposta imune não foi observado. No grupo tratado com siRNA o período de evolução da doença foi mais prolongado quando comparado ao dos demais grupos, sugerindo uma atividade antiviral parcial... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rabies post-exposition treatment is the main measure to prevent disease development, and is based on the use of anti-rabies vaccine with or without anti-rabies serum, in a number of doses varying according to the exposure type. Therapeutic protocols using antiviral drugs have been applied in humans, with positive and negative results, raising doubts about effectiveness. The possibility of using RNA interference (siRNA) and ribavirin, with or without Dimethyl sulfoxide (DMSO) in post exposure treatment of experimental rabies in mice represents in rabies treatment. C57BL6 mice were inoculated with street dog rabies virus, and then separated into different groups and received different post-exposure treatment, wich were administered 24 hours after the inoculation. In each group, eight animals were separated for 30 days of observation and the ramaining sacrificied five and ten days after inoculation. Brains of the sacrificed animals were collected and RT-Real-Time PCR was performed for detection and quantification of the N gene of rabies virus, and for evaluation of the expression of immune response related genes. Both ribavirin and siRNA, alone or associated with DMSO showed no statistically significant differences related to mortality, however, the groups treated with ribavirin showed a greater percentage of mortality and more severe clinical symptoms. In animals not inoculated and treated with ribavirin, there was a transient stimulation of the innate immune response, however, when associated to rabies virus such increase in immune response was not observed. In the group treated with siRNA the period of the disease was more prolonged when compared to the other groups, suggesting a partial antiviral activity with this therapy. The results of ribavirin "in vivo" were evaluated "in vitro in fibroblasts and neuroblastoma cells demonstrating a cell type-dependent efficacy / Mestre

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:54:24Z No. of bitstreams: 1 DANIELA BANDEIRA BRANCANTE MACHADO.pdf: 2047398 bytes, checksum: 1cec6e270d15258ed364f6eda08606e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIELA BANDEIRA BRANCANTE MACHADO.pdf: 2047398 bytes, checksum: 1cec6e270d15258ed364f6eda08606e9 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Vírus Sincicial Respiratório (VSR) humano pertence à família Paramyxoviridae sendo o principal patógeno causador de infecções do trato respiratório inferior, em crianças menores de cinco anos, em todo o mundo. Esse vírus infecta aproximadamente 90% das crianças menores de dois anos e embora há mais de 20 anos o desenvolvimento de uma vacina tenha sido estudado, ainda não há nenhuma eficiente e segura. O VSR é classificado em grupos A e B, com uma variabilidade, entre eles, em torno de 50% de aminoácidos da proteína G. Existem diferentes genótipos dentro de cada grupo que também são identificados pela proteína G. Essa proteína, que tem de 282 a 319 aminoácidos dependendo do grupo, é uma glicoproteína que promove a adsorção do vírus à célula. A variabilidade está concentrada no ectodomínio, que consiste em duas regiões variáveis separados por uma região conservada, presente em ambos os grupos. O VSR possui uma enzima RNA polimerase que catalisa a reação RNA polimerase RNA dependente (RpRd) e é alvo de ação do antiviral ribavirina. A maior subunidade dessa enzima é a proteína L que apresenta seis blocos conservados identificados de I a VI, flanqueados por sequências variáveis. Nos blocos II e III encontramos os sítios de ligação de RNA genômico e o sitio ativo da polimerase viral, respectivamente. O objetivo desse estudo foi identificar os genótipos de VRS, bem como sua diversidade genética no que diz respeito aos genes G e L, em crianças menores de cinco anos com infecções respiratórias. Para isso, realizamos um estudo retrospectivo no qual aspirado de nasofaringe positivo para VSR pelas metodologias de Imunofluorescência Indireta ou RT-PCR dos estados do Rio de Janeiro (2006 a 2010) e do Rio Grande do Sul (2009) foram utilizados. Os últimos dois terços do gene G foram sequenciados em 125 amostras, nas quais 74 eram VSR A e 51 amostras eram VSR B. Enquanto para o gene L, foram sequenciados os blocos II e III de 28 amostras. Observamos que a maioria das amostras do grupo A pertencem ao genótipo GA2 e apenas três ao genótipo GA5, enquanto no grupo B a maioria das amostras era do genótipo BA e cinco amostras do genótipo GB3. Identificamos diversos polimorfismos no gene G; enquanto no gene L, os blocos II e III, amplamente conservados, os polimorfismos foram sinônimos na sequência de nucleotídeos. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) belongs to the family Paramyxoviridae human being the main causative pathogen of lower respiratory tract infections in children under five years worldwide. This virus infects approximately 90% of children under two years and although there are more than 20 years developing a vaccine has been studied, there is still no effective and safe. RSV is classified into groups A and B, with variability between them, around 50% amino acid protein G. Different genotypes within each group are also identified by protein G. This protein, which has 282 to 319 amino acids depending on the group, is a glycoprotein that promotes the adsorption of the virus to the cell. The variability is concentrated in the ectodomain, which consists of two variable regions separated by a conserved region present in both groups. RSV has an RNA polymerase enzyme that catalyzes the reaction RNA dependent RNA polymerase (RpRd) and is the target of action of the antiviral ribavirin. The largest subunit of this enzyme is protein L which has six conserved blocks identified from I to VI, flanked by variable sequences. In blocks II and III we find the binding sites and active site genomic RNA viral polymerase, respectively. The aim of this study was to identify the genotypes of RSV, as well as their genetic diversity with respect to G and L genes in children under five years with respiratory infections. For this, we conducted a retrospective study in which nasopharyngeal aspirate positive for RSV by indirect immunofluorescence methods or RT-PCR in the states of Rio de Janeiro (2006-2010) and Rio Grande do Sul (2009) were used. The last two thirds of the G gene were sequenced in 125 samples in which 74 were RSV A and RSV B. 51 samples were As for the L gene, were sequenced blocks II and III of 28 samples. We note that most of the samples belong to group A genotype GA2 and only three genotype GA5, while in group B was most samples the genotype AB and five samples of genotype GB3. Identified several gene polymorphisms G, while the L gene, blocks II and III, largely preserved in the polymorphisms were synonymous nucleotide sequence.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-02Bitstream added on 2014-06-13T19:38:38Z : No. of bitstreams: 1 appolinario_cm_me_botfmvz.pdf: 1062097 bytes, checksum: c0862e38d266047cdfda34916892af80 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O tratamento pós-expositivo da raiva é a principal medida para evitar o desenvolvimento da doença, e baseia-se na aplicação da vacina anti-rábica associada ou não ao soro anti-rábico, em número de doses variáveis de acordo com o tipo de exposição. Protocolos terapêuticos utilizando drogas antivirais vêm sendo aplicados em seres humanos, com resultados positivos e negativos, gerando dúvidas quanto à eficácia. A possibilidade de utilização de RNA de interferência (siRNA) e da ribavirina, associado ou não ao Dimetilsulfóxido (DMSO) no tratamento pós expositivo da raiva experimental em camundongos, representa uma nova perspectiva. Camundongos C57BL6 foram inoculados com uma amostra de rua de vírus rábico proveniente de cão, separados em diferentes grupos e diferentes protocolos terapêuticos, sendo estes administrados 24 horas após a inoculação viral. De cada grupo, oito animais foram separados para observação durante um período de 30 dias sendo os demais sacrificados cinco e dez dias após a inoculação. O cérebro dos animais sacrificados foi coletado e RT-PCR em Tempo Real foi realizada para a detecção e quantificação do gene N do vírus rábico e avaliação da expressão de genes relacionados a resposta imune. Tanto a ribavirina como o siRNA, isoladamente ou associados ao DMSO não demonstraram diferença estatística significante relacionada à letalidade, no entanto, os grupos tratados com ribavirina demonstraram maior percentagem de letalidade e sintomatologia clínica mais severa. Nos animais não inoculados e tratados com a ribavirina, houve um estímulo transitório da resposta imune inata, no entanto, quando associado ao virus rábico este aumento da resposta imune não foi observado. No grupo tratado com siRNA o período de evolução da doença foi mais prolongado quando comparado ao dos demais grupos, sugerindo uma atividade antiviral parcial... / Rabies post-exposition treatment is the main measure to prevent disease development, and is based on the use of anti-rabies vaccine with or without anti-rabies serum, in a number of doses varying according to the exposure type. Therapeutic protocols using antiviral drugs have been applied in humans, with positive and negative results, raising doubts about effectiveness. The possibility of using RNA interference (siRNA) and ribavirin, with or without Dimethyl sulfoxide (DMSO) in post exposure treatment of experimental rabies in mice represents in rabies treatment. C57BL6 mice were inoculated with street dog rabies virus, and then separated into different groups and received different post-exposure treatment, wich were administered 24 hours after the inoculation. In each group, eight animals were separated for 30 days of observation and the ramaining sacrificied five and ten days after inoculation. Brains of the sacrificed animals were collected and RT-Real-Time PCR was performed for detection and quantification of the N gene of rabies virus, and for evaluation of the expression of immune response related genes. Both ribavirin and siRNA, alone or associated with DMSO showed no statistically significant differences related to mortality, however, the groups treated with ribavirin showed a greater percentage of mortality and more severe clinical symptoms. In animals not inoculated and treated with ribavirin, there was a transient stimulation of the innate immune response, however, when associated to rabies virus such increase in immune response was not observed. In the group treated with siRNA the period of the disease was more prolonged when compared to the other groups, suggesting a partial antiviral activity with this therapy. The results of ribavirin “in vivo” were evaluated “in vitro in fibroblasts and neuroblastoma cells demonstrating a cell type-dependent efficacy

Apesar dos esforços para controlar a infecção por HIV-1, na América do Sul, diversos recombinantes tem sido descritos, principalmente entre os subtipos B e F. Durante a tarefa coordenada de HIV-1 VGDN, foram encontrados diversos novos recombinantes BF no estado de São Paulo, sendo a maioria deles com a protease F. Técnicas filogenéticas usadas em integrases destes pacientes demonstraram que sequências recombinantes com perfis similares surgiram em diferentes eventos de recombinação. Análises filodinâmicas de amostras argentinas apontaram um crescimento contínuo de recombinantes com proteases F após a introdução da terapia intensiva, enquanto o subtipo B deixou de crescer. Dados estruturais e de interação de proteases F resistentes com o inibidor nelfinavir obtidos por dinâmica molecular sugeriram que polimorfismos do subtipo F podem atuar como restauradores de atividade ou acentuar a perda de afinidade pelo inibidor. Um vetor recombinante pNL4-3 com parte do gene gag e a protease do subtipo F foi construído, permitindo a comparação de seu efeito no fitness viral. / Despite general efforts to control HIV-1 infections, many recombinants have been described among B and F subtype in South America. During the VGDN HIV task in São Paulo state, a large number of new BF recombinants was found, most of which harbor a subtype F protease. Phylogenetic analysis of integrase genes from these patients showed distinct origins for similar recombinant regions. Phylodynamic analysis suggested that after HAART introduction in Argentina BF recombinants with F protease depicted a sustained growth, while subtype B had diminished in growth.. Moreover, structural data from proteases after HAART introduction, while subtype B had diminished growth. Subtype F proteases structure and nelfinavir interaction measured by molecular dynamics suggested that polymorphisms of this subtype may restore enzyme activity or decrease even further inhibitor affinity. A pNL4-3 recombinant vector with most of gag gene and a protease of subtype F was made, which allows the comparison of its effects on viral fitness.

A proteína de matriz do Virus Respiratório Sincicial humano foi o foco deste trabalho. Verificamos que o gene de matriz possui sítios internos de poliadenilação, sinais de instabilidade de RNA, baixo índice de adaptação de codons (CAI) e conteúdo GC, que podem impedir a expressão gênica vitro. Quando clonado sob controle do promotor de CMVie, o gene selvagem não apresenta expressão detectável, enquanto um gene sintético com a sequência do gene de matriz otimizada apresenta altos níveis de expressão em células transfectadas. Esse alto nível de expressão permitiu a confirmação da presença da proteína M no núcleo no início de sua expressão, por análise em microscopio confocal de varredura a laser, além de sua associação a membranas em regiões conhecidas como lipid rafts. Também foi observado que a proteína M é capaz de associar à proteína tropomiosina. Ainda foram analisados os possíveis domínios funcionais através de expressão de variantes da proteína M com deleções de trechos da proteína. Finalmente foi analisada a capacidade de indução de resposta imune. / The Human Respiratory Syncytial Vírus was the focus of this work. We found that matrix gene has internal polyadenilation sites, RNA instability motifs, low codon adaptation index (CAI) and GC content, that may impair its expression in vitro. When cloned under control of the ieCMV promoter, the wild-type M gene expression was not detectable, whereas a synthetic optimized matrix gene was highly expressed in transfected cells. This high level of expression made possible to follow M nuclear localization in the beginning of its expression by confocal laser scanning microscopy, and its association with membranes in regions known as lipid rafts. It has also been found that the matrix protein associates with tropomyosin. It was further analyzed the possible functional through expression of deviations of the M protein that lack portions of the protein. Finally it was analyzed its capacity to induce an immune response.

O Vírus Respiratório Sincicial humano (hRSV human Respiratory Syncytial Virus) está entre os principais causadores de doenças do trato respiratório. O hRSV pertence à família Paramyxoviridae. Os sintomas da infecção podem variar de simples estado gripal a doença respiratória grave, e eventualmente levar a óbito. Atualmente não há vacina licenciada ou droga eficaz contra esse vírus. Anteriormente foram obtidos, em nosso laboratório, vetores com genes otimizados. Com essas ferramentas a proteína M foi produzida e purificada tendo sido possível obter anticorpos policlonais específicos e eficientes na sua detecção. Com esses anticorpos confirmamos a interação da proteína M com as proteínas celulares tropomiosina e nucleofosmina. Também foi demonstrado por imunofluorescência e por western blotting que a proteína M quando expressa fora do contexto de infecção apresenta localização nuclear e citoplasmática. Foram feitos testes de imunização com a proteína M purificada ou com um vetor eucariótico que a expressa (DNA). A imunização com proteína M resultou apenas em resposta humoral, enquanto com a vacina de DNA obtivemos apenas resposta celular. Nenhum desses imunógenos, entretanto, foi capaz de conferir proteção contra hRSV. / The human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is among the main causes of respiratory tract diseases, hRSV belongs to the Paramyxoviridae family. The symptoms of the infection can range from simple flulike state to severe respiratory disease eventually leading to death. Currently there is no licensed vaccine or effective drug against this virus. Vectors with genes optimized for of the hRSV Matrix protein (M) expression in bacteria and in eukaryotic cells were previously obtained in our lab. With these tools the M protein was produced and purified. Specific and efficient polyclonal antibodies could then be obtained and used for its detection. Using these antibodies we confirmed M interaction with cellular proteins tropomyosin and nucleophosmin. It was also demonstrated by immunofluorescence and western blotting that protein M when expressed out of viral infection context, presents cytoplasmic and nuclear localization. Immunization tests were made with the purified M protein or with a eukaryotic vector that expresses it (DNA). Immunization with M protein resulted only in humoral response, while with the DNA vaccine only cellular response was obtained. None of these antigens, however, was able to confer protection against hRSV.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano é um vírus envelopado de RNA negativo e considerado o patógeno mais importante do trato respiratório de bebês e crianças. As proteínas virais N e P foram expressas em bactérias, purificadas e usadas para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Estudos in silico permitiram a predição de regiões desordenadas da proteína P, as quais foram identificadas por espectrometria de massa como regiões hiper sensíveis a proteases. A otimização dos genes N e P permitiu uma forte e eficiente expressão das proteínas N e P em células humanas. Vacinas de DNA contendo os genes otimizados foram testadas em camundongos e geraram forte resposta imune humoral. As proteínas N e P expressas em células humanas foram imunoprecipitadas e analisadas quanto a interações com proteínas celulares, identificadas por espectrometria de massa. A proteína P mostrou ser capaz de interagir com a HSP70. Por fim, um sistema Minigenoma alternativo, usando o promotor da RNA polimerase II, foi construído para o HRSV mas pouca ou nula atividade foi detectada. / The Human Respiratory Syncytial Virus is a single stranded negative RNA enveloped virus and it is considered the most important pathogen of the respiratory tract of infants and neonates. The viral N and P proteins were expressed in bacteria, purified and used for the production of polyclonal antibodies in mice. In silico studies allowed the prediction of intrinsically disordered domains for P protein, which were identified by mass spectrometry as protease hyper sensible regions. The optimization of N and P genes allowed a robust expression of the N and P proteins in human cells. DNA vaccines containing the optimized genes were tested in mice and generated strong humoral imune response. The N and P proteins expressed in human cells were immunoprecipitated and their interactions with cellular proteins were identified by mass spectrometry. The P protein was able to interact with the HSP70 protein. Finally, an alternative Minigenome system, using an RNA polymerase II promoter, was developed for HRSV but low or no activity was detected.

O Brasil é o país líder no uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o controle pragas agrícolas. Pouco se conhece sobre a diversidade e o impacto dos micovírus em M. anisopliae sensu stricto. Este trabalho mostra a riqueza dos micovírus associados a isolados de M. anisopliae da coleção de entomopatógenos da Universidade de São Paulo, usinas sucroalcooleiras e produtos microbianos à base do entomopatógeno. RNAfd foram encontrados em 55% dos 36 isolados de Metarhizium e apresentaram 16 diferentes padrões eletroforéticos consistindo de 3 a 18 bandas de RNAfd em gel de poliacrilamida. RNAfd não foram detectados em nenhum dos produtos comerciais utilizados no presente estudo. Os diferentes padrões de vírus encontrados nos isolados aqui estudados, aparentemente, não têm relação com os locais onde foram coletados. O inibidor de síntese protéica ciclohexamida não foi eficiente na eliminação dos vírus de RNAfd em nenhum dos isolados de fungos testados. Colônias dos isolados de M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 e M. anisopliae CTC F8 foram curadas por meio do cultivo monoconidial ou isolamento de ponta de hifas. Alguns segmentos do isolado M. anisopliae PL26 foram perdidos após o subcultivo de ponta das hifas. Colônias de M. anisopliae ESALQ PL26 obtidas por meio do cultivo monoconidial ou subcultivo de ponta de hifas apresentaram grande variabilidade morfológica, no entanto, essa variação não foi correlacionada com a presença de micovírus. Colônias isogênicas de M. anisopliae ESALQ 1256 mostraram diferenças no crescimento, na produção de conídios e na virulência, no entanto, essas diferenças não foram associadas à presença de RNAfd. Não foram observadas diferenças na tolerância aos raios ultravioleta e ao calor entre as colônias de M. anisopliae ESALQ 1256, com e sem vírus de RNAfd. Colônias oriundas de setores formados no isolado M. anisopliae PL26 produziram menor quantidade de conídios e apresentaram menor quantidade de vírus RNAfd em comparação com as colônias oriundas de outras regiões da colônias originais com características normais. A repicagem sucessiva dos isolados de M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 e CTC F15, infectados por diferentes vírus de RNAfd, nos meios de cultura BDA, SDAY e meio de arroz, bem como a passagem dos fungos em larvas de Tenebrio molitor, em geral, não afetaram a replicação dos micovírus. / Brazil is the leading country in the use of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against agricultural pests. Little is known about the diversity and the impact of mycovirus in M. anisopliae sensu stricto. This study shows the richness of mycovirus associated with M. anisopliae isolates from the collections of entomopathogens of the University of São Paulo, from sugar-alcohol factories and microbial based products. dsRNA were found in 55% of the 36 Metarhizium isolates and showed 16 different electrophoretic patterns consisting of 3 to 18 dsRNA bands in polyacrylamide gels. dsRNA was not detected in any of the commercial products used in this study. The different viral patterns found in the isolates studied here apparently have no relation to the locations where they were collected. The inhibitor of protein synthesis cycloheximide culture was efficient in eradicating dsRNA virus from fungi. Colonies of isolates of M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 and M. anisopliae F8 were cured by monoconidial or by hyphal tip isolation of. Some segments of the M. anisopliae PL26 isolate were lost following hyphal tip subculture. Colonies both from monoconidial culture and hyphal tip subculture of M. anisopliae ESALQ PL26 showed great morphological variability; however, this variation was not correlated with the presence of mycoviruses. Isogenic colonies of M. anisopliae ESALQ 1256 showed differences in growth, conidia production and virulence; however, these differences were not associated to the presence of the dsRNA. No difference was observed regarding tolerance to ultraviolet rays and heat among the colonies of M. anisopliae ESALQ 1256, with and without the dsRNA virus. Sectors formed in the isolate M. anisopliae PL26 produced a smaller number of conidia and fewer dsRNA virus in comparison to the original colonies with normal characteristics. The repeated subculture of isolates of M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 and CTC F15, infected by different virus of dsRNA, in the PDA, SDAY culture media and in rice, as well as the fungi passage in larvae of Tenebrio molitor, in general, did not affect the replication of the mycovirus.

O Vírus Respiratório Sincicial humano (hRSV human Respiratory Syncytial Virus) está entre os principais causadores de doenças do trato respiratório. O hRSV pertence à família Paramyxoviridae. Os sintomas da infecção podem variar de simples estado gripal a doença respiratória grave, e eventualmente levar a óbito. Atualmente não há vacina licenciada ou droga eficaz contra esse vírus. Anteriormente foram obtidos, em nosso laboratório, vetores com genes otimizados. Com essas ferramentas a proteína M foi produzida e purificada tendo sido possível obter anticorpos policlonais específicos e eficientes na sua detecção. Com esses anticorpos confirmamos a interação da proteína M com as proteínas celulares tropomiosina e nucleofosmina. Também foi demonstrado por imunofluorescência e por western blotting que a proteína M quando expressa fora do contexto de infecção apresenta localização nuclear e citoplasmática. Foram feitos testes de imunização com a proteína M purificada ou com um vetor eucariótico que a expressa (DNA). A imunização com proteína M resultou apenas em resposta humoral, enquanto com a vacina de DNA obtivemos apenas resposta celular. Nenhum desses imunógenos, entretanto, foi capaz de conferir proteção contra hRSV. / The human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is among the main causes of respiratory tract diseases, hRSV belongs to the Paramyxoviridae family. The symptoms of the infection can range from simple flulike state to severe respiratory disease eventually leading to death. Currently there is no licensed vaccine or effective drug against this virus. Vectors with genes optimized for of the hRSV Matrix protein (M) expression in bacteria and in eukaryotic cells were previously obtained in our lab. With these tools the M protein was produced and purified. Specific and efficient polyclonal antibodies could then be obtained and used for its detection. Using these antibodies we confirmed M interaction with cellular proteins tropomyosin and nucleophosmin. It was also demonstrated by immunofluorescence and western blotting that protein M when expressed out of viral infection context, presents cytoplasmic and nuclear localization. Immunization tests were made with the purified M protein or with a eukaryotic vector that expresses it (DNA). Immunization with M protein resulted only in humoral response, while with the DNA vaccine only cellular response was obtained. None of these antigens, however, was able to confer protection against hRSV.

O Brasil é o país líder no uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o controle pragas agrícolas. Pouco se conhece sobre a diversidade e o impacto dos micovírus em M. anisopliae sensu stricto. Este trabalho mostra a riqueza dos micovírus associados a isolados de M. anisopliae da coleção de entomopatógenos da Universidade de São Paulo, usinas sucroalcooleiras e produtos microbianos à base do entomopatógeno. RNAfd foram encontrados em 55% dos 36 isolados de Metarhizium e apresentaram 16 diferentes padrões eletroforéticos consistindo de 3 a 18 bandas de RNAfd em gel de poliacrilamida. RNAfd não foram detectados em nenhum dos produtos comerciais utilizados no presente estudo. Os diferentes padrões de vírus encontrados nos isolados aqui estudados, aparentemente, não têm relação com os locais onde foram coletados. O inibidor de síntese protéica ciclohexamida não foi eficiente na eliminação dos vírus de RNAfd em nenhum dos isolados de fungos testados. Colônias dos isolados de M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 e M. anisopliae CTC F8 foram curadas por meio do cultivo monoconidial ou isolamento de ponta de hifas. Alguns segmentos do isolado M. anisopliae PL26 foram perdidos após o subcultivo de ponta das hifas. Colônias de M. anisopliae ESALQ PL26 obtidas por meio do cultivo monoconidial ou subcultivo de ponta de hifas apresentaram grande variabilidade morfológica, no entanto, essa variação não foi correlacionada com a presença de micovírus. Colônias isogênicas de M. anisopliae ESALQ 1256 mostraram diferenças no crescimento, na produção de conídios e na virulência, no entanto, essas diferenças não foram associadas à presença de RNAfd. Não foram observadas diferenças na tolerância aos raios ultravioleta e ao calor entre as colônias de M. anisopliae ESALQ 1256, com e sem vírus de RNAfd. Colônias oriundas de setores formados no isolado M. anisopliae PL26 produziram menor quantidade de conídios e apresentaram menor quantidade de vírus RNAfd em comparação com as colônias oriundas de outras regiões da colônias originais com características normais. A repicagem sucessiva dos isolados de M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 e CTC F15, infectados por diferentes vírus de RNAfd, nos meios de cultura BDA, SDAY e meio de arroz, bem como a passagem dos fungos em larvas de Tenebrio molitor, em geral, não afetaram a replicação dos micovírus. / Brazil is the leading country in the use of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against agricultural pests. Little is known about the diversity and the impact of mycovirus in M. anisopliae sensu stricto. This study shows the richness of mycovirus associated with M. anisopliae isolates from the collections of entomopathogens of the University of São Paulo, from sugar-alcohol factories and microbial based products. dsRNA were found in 55% of the 36 Metarhizium isolates and showed 16 different electrophoretic patterns consisting of 3 to 18 dsRNA bands in polyacrylamide gels. dsRNA was not detected in any of the commercial products used in this study. The different viral patterns found in the isolates studied here apparently have no relation to the locations where they were collected. The inhibitor of protein synthesis cycloheximide culture was efficient in eradicating dsRNA virus from fungi. Colonies of isolates of M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 and M. anisopliae F8 were cured by monoconidial or by hyphal tip isolation of. Some segments of the M. anisopliae PL26 isolate were lost following hyphal tip subculture. Colonies both from monoconidial culture and hyphal tip subculture of M. anisopliae ESALQ PL26 showed great morphological variability; however, this variation was not correlated with the presence of mycoviruses. Isogenic colonies of M. anisopliae ESALQ 1256 showed differences in growth, conidia production and virulence; however, these differences were not associated to the presence of the dsRNA. No difference was observed regarding tolerance to ultraviolet rays and heat among the colonies of M. anisopliae ESALQ 1256, with and without the dsRNA virus. Sectors formed in the isolate M. anisopliae PL26 produced a smaller number of conidia and fewer dsRNA virus in comparison to the original colonies with normal characteristics. The repeated subculture of isolates of M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 and CTC F15, infected by different virus of dsRNA, in the PDA, SDAY culture media and in rice, as well as the fungi passage in larvae of Tenebrio molitor, in general, did not affect the replication of the mycovirus.