Orientador : Jose Camillo Novello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T02:27:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_DanielaDiogenesde_D.pdf: 8563120 bytes, checksum: 5a9ebb19fc209d4d1d1fd95b58bb9688 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: As lectinas são proteínas ligantes de carboidratos, de origem não-imune, encontradas numa grande variedade de organismos. Aquelas isoladas de venenos de serpentes são constituídas de cadeias polipeptídicas relativas à região molecular correspondente ao domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) de lectinas. Devido às interações lectina ¿ carboidrato serem reversíveis, e não covalentes, estas moléculas podem ser utilizadas como importantes ferramentas bioquímicas. Este estudo tem como objetivo: (i) a caracterização da estrutura primária da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu (BJcuL); (ii) a investigação do efeito de BJcuL sobre a adesão de células tumorais a proteínas da matriz extracelular, (iii) e sobre a proliferação destas e de células endoteliais. O seqüenciamento N-terminal de BJcuL revelou a presença de uma única seqüência, indicando que esta proteína é composta de cadeias idênticas. A determinação da estrutura primária da lectina realizada por meio de análise dos peptídeos obtidos pela fragmentação da proteína com c1ostripaína e protease SV-8, demonstrou que BJcuL possui os 18 resíduos invariantes que caracterizam o tipo C de lectinas animais. Este fato indica que BJcuL pertence à família das lectinas tipo-C ligantes de I3-galactosídeos e apresenta símilaridades estruturais com a região C-terminal do CRD das lectinas animais de membrana. Nos primeiros testes em cultura de células tumorais, a viabilidade celular foi avaliada após 5 dias de cultivo na presença da lectina. Nestas condições, a BJcuL inibiu 50% do crescimento das células de carcinoma de rins ou pâncreas em concentrações entre 1 e 2 mM. Em testes posteriores, foi observado que as células de carcinoma de mama ou de ovário foram capazes de aderir fracamente a BJcuL. Entretanto, esta adesão não inibiu a fixação destas células à proteínas da matriz extracelular tais como; fibronectina, laminina e colágeno tipo I. Após proliferação de linhagens tumorais por 4 dias na presença de BJcuL, foi observado um efeito inibidor dose-dependente da lectina em células tumorais de glioma e carcinomas de mama ou ovário. No intuito de verificar as propriedades anti angiogênicas da lectina, foi realizado um ensaio de proliferação de células endoteliais na presença de BJcuL. Os resultados mostraram que a BJcuL, numa concentração de 0,09mM, foi capaz de reduzir em 50% a viabilidade destas células. Os resultados aqui mostrados fornecem base para estudos acerca da estrutura molecular da BJcuL e suas funções, da caracterização da ligação lectina-carboidrato, e dos mecanismos envolvidos na ligação da lectina às superficies celulares / Abstract: Lectins are carbohydrate-binding proteins of non-immune origin found in a diverse array of organisms. Snake venom lectins are malleable molecules, and their molecular structure comprises the carbohydrate recognition domain (CRD) characterized in other Ca2+-dependent animal lectins. They could be used as interesting tools since lectin-glycan interactions are reversible and non-covalent. The aim of this study was (i) to characterize the molecular structure of lectin from the venom of the snake Bothrops jararacussu (BJcuL); (ii) to investigate the effect of BJcuL on the adhesion properties of tumor cells to the extracellular matrix proteins, (iii) and on the proliferation of cancer and endothelial cells.The determination of the single N-terminal sequence has shown that BJcuL is a homodimer. The analysis of the complete amino acid sequence of the peptides obtained by enzymatic BJcuL digestion (clostripain and SV-8 protease) showed that this lectin displays 18 invariant amino acid residues characteristics of C-type lectins. This fact implies that BJcuL possesses structural similarities to the C-terminal region of the animal membrane lectins CRD, belonging to the C-type j3-galactoside binding lectin family. In the first evaluation in a tumor cell system, cell viability was evaluated after 5 days cultivation. This lectin was a potent inhibitor of growth in human renal or carcinoma cells, with 50% inhibitory concentrations (lC50) of cell growth between 1 and 2 mM of BJcuL. In the second evaluation, cells of human metastatic breast cancer or human ovarian carcinoma cell lines weakly adhere to BJcuL. However, BJcuL was not capable of inhibiting adhesion of these cells to the extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin and type I collagen. 1t was also observed a dose-dependent inhibitory effect of BJcuL in proliferation assays with glioma, breast or ovarian carcinoma cells after 4 days of incubation. Proliferation assays were performed on bovine brain and endothelial cells in order to verify the antiangiogenic properties of the BJcuL These experiments revealed that BJcuL was capable to reduce cell proliferation (lC5o of 0,09mM). Taken together, our findings could be helpful to further studies regarding the lectin structure and function, lectin-glycan binding characterization, as well as, the mechanisms involved in BJcuL binding to cell surface molecules, which influence cell proliferation and angiogenesis / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-12T14:10:10Z No. of bitstreams: 2 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-12T14:10:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-12T14:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The emergence of pathogenic agents resistant to conventional drugs has stimulated the search for new classes of antimicrobial and antiparasitic agents from natural sources. Among these, it highlights antimicrobial peptides (AMPs), which have mechanisms not dependent on the interaction with a specific receptor, providing new possibilities for the development of drugs against resistant organisms. The present study aimed to purify and characterize biochemically the peptides of B. atrox and B. jararacussu snakes venoms, as well as to evaluate the antimicrobial and antiparasitic activities of the peptides against the strains: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Leishmania amazonensis (IFLA/BR/97/PH8), and Plasmodium falciparum (clone W2, resistant to chloroquine). In this work, we carried out a comprehensive analysis of peptides presents in the venom of B. atrox and B. jararacussu using the combination of Amicon ultrafiltration of 3kDa, high performance liquid chromatography in reverse phase and mass spectrometry with electrospray ionization (Electrospray-Ion Trap-Time of Flight). Sixteen peptides were identified in both venoms, with mass range 444.17 to 1356.73 Da and primary structure between 3 to 13 residues. Among them 13 are unique sequences, including 7 peptides and 6 bradykinin-potentiating peptides (BBPs). The other peptides refer to 2 metallopeptidases inhibitor found in both peptidome venoms, but not described for these species, besides 1 BPP identified in the venom of B. atrox, the BPP-Bax12 with peptide sequence described. Some of the new peptides identified showed antibacterial activity against K. pneumoniae, P. aeruginosa and S. aureus, and low hemolytic activity, but did not demonstrate antiparasitic activity. Therefore, in this study 13 new peptides were identified from the B. atrox and B. jararacussu snake venoms, and some with relevant bacterial activities, which can assist in the development of new drugs against multiresistant microorganisms. / O surgimento de agentes patogênicos resistentes aos fármacos convencionais, têm estimulado a procura de novas classes de agentes antimicrobianos e antiparasitários a partir de fontes naturais. Dentre estes, destacam-se os antimicrobianos (AMPs), que possuem mecanismos não dependentes da interação com um receptor específico, oferecendo novas possibilidades para o desenvolvimento de medicamentos contra microrganismos resistentes. O presente estudo teve como objetivo purificar e caracterizar bioquimicamente o conteúdo peptídico dos venenos das serpentes B. atrox e B. jararacussu, além de avaliar as atividades antimicrobiana e antiparasitárias dos peptídeos frente as cepas: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Leishmania amazonensis (IFLA/BR/97/PH8), e Plasmodium falciparum (clone W2, resistente à cloroquina). Neste trabalho realizou-se uma análise abrangente dos peptídeos presentes nos venenos de B. atrox e B. jararacussu utilizando a combinação de ultrafiltração em Amicon de 3kDa, cromatografia líquida de alta perfomance em fase reversa e espectrometria de massas com ionização por electrospray (Electrospray-Ion Trap-Time of Flight). Foram identificados 16 peptídeos em ambos os venenos, com massas moleculares de 444,17 a 1.356,73 Da e estrutura primária variando de 3 a 13 aminoácidos. Dentre os quais, 13 são sequências únicas, incluindo 7 peptídeos e 6 peptídeos potenciadores de bradicinina (BBPs). Os demais peptídeos referem-se a 2 inibidores de metalopeptidases encontrados em ambos os venenos, porém não descritos para estas espécies, além de 1 BPP identificado no veneno de B. atrox, o BPP-Bax12 com sequência peptídica descrita. Alguns dos novos peptídeos identificados apresentaram atividade antibacteriana contra K. pneumoniae, P. aeruginosa e S. aureus, e baixa atividade hemolítica, porém não demonstraram atividade antiparasitária. Portanto, neste estudo foram identificados 13 novos peptídeos a partir dos venenos de B. atrox e B. jararacussu, e alguns com atividades bacterianas relevantes, que podem auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos contra microrganismos multirresistentes.

Orientador: Oswaldo Vital Brazil / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-12T02:00:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HeluanySobrinho_NadimFarah_D.pdf: 2047535 bytes, checksum: b14955981700be368f97b8fe39f1f5e5 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O veneno da Micrurus surinamensis, uma cobra coral da região amazônica, induz bloqueio neuromuscular nas preparações nervo frênico-diafragma de rato e nervo-músculo biventer cervicis de pintos. o veneno deprime a tensão das respostas do diafragma à estimulação direta, não deprimindo, entretanto, a do biventer cervicis. Deve conter uma ou mais toxinas pós-sinápticas curaremiméticas, uma vez que os potenciais de placa terminal em miniatura (ps.p.t.m.) bloqueados pelo veneno reapareceram após a adição da neostigmina ao banho. Deve haver também no veneno toxina ou toxinas que induzem a dessensibilização do receptor da placa terminal, fato demonstrado pelo efeito antagônico da 4-aminopiridina (4-AP) sobre o bloqueio dos ps.p.t.m. induzido pelo veneno. A reversibilidade e o efeito antagônico da neostigmina e da 3,4-diaminopiridina (3,4-DAP) apenas parciais nas preparações nervo frênico-diafragma de rato e biventer-cervicis de pintos sugere a presença de neurotoxina pós-sináptica irreversível ou de neurotoxinas pré-sinápticas no veneno. A ação contraturante do veneno, mais evidente no músculo biventer-cervicis de pintos, não abolida pela curarização da preparação mas suprimida pela elevação da concentração de cálcio na solução nutritiva ou adição de sulfato de magnésio (MgSO4), e a ação despolarizante das membranas das fibras do diafragma mostram que o veneno contém constituintes de ação semelhante à das cardiotoxinas. Portanto, os efeitos neuromusculares e miotóxico do veneno de M. surinamensis resultam de ações de um conjunto de toxinas, que ocorrem em outros venenos de cobras corais. É a primeira vez que ações semelhantes à das cardiotoxinas é identificada em espécies de Micrurus sul-americana / Abstract: Micrurus surinamensis occurs in the Amazon valley and upper Negro and Orinoco rivers. The distribution includes the countries Ecuador, Peru, Colombia, Brazil, Venezuela and the Guianas. M. surinamensis venom produces neuromuscular blockade in the rat phrenic nerve-diaphragm and in the chick biventer-cervicis nerve muscle preparations. It induces depression of the twitches elicited by direct muscle stimulation in the curarized rat diaphragm. In denervated hemidiaphragm of the rat, the contracture produced by acetylcholine (Ach) is blocked by the venom. Ach and carbachol-induced responses are also inhibited in chick biventer-cervicis muscle while the contracture produced by is increased. The blockade of the miniature end-plate potenciais (m.e.p.ps.) induced by M. surinamensis venom in the rat diaphragm is antagonized by neostigmine and by 4 aminopyridine. M. surinamensis venom causes depolarization of the rat diaphragm muscle fibers. It induces contracture of the rat diaphragm and biventer cervicis, the contracture being more intense in the last muscle. It is also produced in curarized muscles and in muscles treated with tetrodotoxin. On the other hand, calcium excess (Krebbs solution with 10 mM CaCb) blocks the venom-induced contracture. These results show that M. surinamensis venom contains reversible curaremimetic toxin(s) and toxin(s) that induces desensitization of the end-plate nicotinic receptor. They also show that it contains cardiotoxin-like toxin(s). Some results (increase of twitch tension before blockade, irreversibility of the neuromuscular blockade) suggest that presynaptic receptor toxins and irreversible curaremimetic toxins are contained in the M. surinamenis venom / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:28:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_Marcelode_M.pdf: 3101951 bytes, checksum: d4351a3ac8b227a606a71136547a3073 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Envenenamentos causados por picadas de serpentes peçonhentas, resultam em graves efeitos biológicos devido à complexidade das peçonhas, condições da vítima, fatores genéticos, entre outros. O tratamento mais eficaz em acidentes ofídicos se faz com uso da soroterapia, embora possa ocorrer reações de hipersensibilidade. A Bothrops lanceolatus endêmica da Ilha da Martinica no Caribe, possui atividades biológicas que se assemelham as das Bothrops brasileiras. Camundongos previamente tratados com 4,8µg/g da peçonha da Bothrops lanceolatus e após 72 horas imunizados com eritrócitos de carneiro (EC) apresentaram uma inibição na produção de anticorpos anti-EC, tanto na resposta primária, quanto na secundária (P<0,05). Esse resultado foi observado com a fração I (2,4µg/g) (P<0,05), obtida por cromatografia de exclusão em Sephadex G-100. Já a fração II (FII) (2,4µg/g) não apresentou essa inibição (P>0,05). Coelhos imunizados com 1mg da FII em adjuvante de Freund, produziram um imunesoro (Anti-FII) mais reativo ao veneno da Bothrops lanceolatus que o imunesoro comercial (Anti-BL) produzido em eqüinos demonstrado através de testes de Imunodifusão e ELISA. Ambos imunesoros neutralizaram as atividades hemorrágica, hemolítica, caseinolítica, esterásica e coagulante da peçonha da Bothrops lanceolatus. O Anti-FII foi mais eficiente em neutralizar as atividades hemolítica e caseinolítica e o Anti-BL, as atividades hemorrágica e coagulante. A esterásica foi igualmente neutralizada por ambos. Nossos resultados indicam que através da seleção do imunógeno, consegue-se produzir imunesoros mais potentes para neutralizarem os efeitos fisiopatológicos observados nos envenenamentos ofídicos. / Abstract: Poisonings caused by venom snakes bitten resulte in serious biological efects due to several factors, such as: the complexity of ofidic poison, victim conditions, genetic factors, and others. The most efficacious treatment of these ofidic accidents is made by serum therapy that may cause hypersensibility reactions. Endemic Bothrops lanceolatus (BL) from the Caribbean Island Martinica has some biological activities similar to the brazilian Bothrops. Mice previous treated with 4.8µg/g Bothrops lanceolatus poison and after 72 hours immunized with sheep erythrocytes (SE) showed inhibition in the production of antibodies Anti-SE in primary and secondary response (P<0.05). This effect was also noticed with the fraction I (2.4µg/g) (P<0.05) obtained by Sephadex G-100 exclusion chromatography. The fraction II (FII) (2.4µg/g) of Bothrops lanceolatus, which did not present significant inhibition of immune response (P>0.05), was used as antigen (in immunization). Rabbit's immunized with 1mg the fraction II in adjuvant of Freund produced immuneserum (Anti-FII) more reactive for Bothrops lanceolatus venom than the commercial (Anti-BL) one produced in equines demonstrated by tests of immunodifusion and ELISA. Both immuneserums neutralized the hemorrhagic, hemolytic, caseinolytic, esterolytic and coagulation activities of the Bothrops lanceolatus poison. The Anti-FII was more efficient in neutralization of hemolytic and caseinolytic activities and Anti-BL hemorrhagic and coagulation activities. The esterolytic activity was equaly neutralized in both immuneserums. Our results suggest that through the selection of antigen (immunogenic) it is possible to produce more potent immuneserum to neutralize the physiopathological effects observed in the ophidians poisonings. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Maria Alice da Cruz-Hofling, Lea Rodrigues-Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T21:59:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_PatriciaDourado_M.pdf: 12162774 bytes, checksum: bc20d738d02786ba6422eeb6cadaf073 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Várias são as motivações que levam ao estudo de substâncias naturais podendo ser citadas, a caracterização dos seus princípios ativos e dos seus efeitos biológicos. Dentre estas, ocupam lugar de destaque os venenos ofídicos, uma vez que é freqüente o envenenamento acidental causado por picada de serpentes, nos países de clima tropical. No Brasil, os acidentes ofídicos representam problema de Saúde Pública, sendo o gênero Bothrops responsável por cerca de 90% dos casos. Dentre os efeitos sistêmicos e locais, destaca-se a mionecrose que se manifesta rapidamente, é de difícil controle e merece atenção especial nas estratégias de tratamento. A mionecrose é provocada por proteínas miotóxicas que atuam especificamente no sítio da picada. Frente à escassez de estudos quanto à ação biológica do veneno da serpente Bothrops pirajai ("jararacussu da Bahia") uma espécie rara e exclusiva do estado da Bahia e nordeste de Minas Gerais, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de investigar as possíveis atividades miotóxica e neurotóxica do seu veneno total e de suas frações isoladas, Piratoxina-I (prTX- I) e Piratoxina-III (PrTX-III). Para o estudo, foram utilizadas preparações neuromusculares, nervo frênico-diafragma (NFD) e extensor longo dos dedos (EDL) de camundongos. Os parâmetros utilizados foram a técnica miográfica, a determinação de creatinoquinase (CK), análise histológica e ultraestrutural. O veneno total e a fração PrTX-III nas doses de 10, 25 e 50 µg/ml causaram bloqueio dose-dependente da resposta contrátil do músculo EDL, alterações morfológicas e ultraestrututais com elevada liberação da enzima creatinoquinase (CK) na cuba. A miotoxina PrTX-I provocou bloqueio dose-dependente (doses de 5, 10 e 20 µg/ml) da resposta contrátil do músculo diafragma de camundongo e severa mionecrose constatada pela análise histológica do tecido. No entanto, esta fração não provocou alterações miográficas ou histológicas no músculo EDL. Essas diferenças quanto à sensibilidade foram provavelmente devidas às diferenças entre o EDL e o diafragma, que diferem quanto às quantidades de fibras de contração rápida e lenta. Nossos resultados sugerem que a miotoxina PrTX-I e a fração PrTX-III do veneno total de B. pirajai seriam os componentes responsáveis pela atividade miotóxica do veneno, muito embora haja evidência de que seus modos de ação podem ser distintos. Além disso, os resultados preliminares com a fração PrTX-III apontam para uma potente ação neurotóxica, fato observado também com o veneno total. / Abstract: Several reasons can be cited which motivate the study of natural substances such as the characterization of the active principles and its biological effects. Among them, the ophidic venoms stand out because it is common the occurrence of accidental envenomation after snake bites in tropical countries. In Brazil, ophidic accidents account for a major part in the context of Public Health were the genus Bothrops is responsable for about 90% of them. Myonecrosis is one ofthe local effects whose rapid onset is difficult to control and deserves special attention in the treatment approaches after envenomation. Myonecrosis is triggred by myotoxic proteins specifical1y acting in muscle fibers at the bite site. Due to the scarcity of studies about the biological actions of Bothrops pirajai (li jararacussu of Bahia") snake venom, arare and exclusive specimen living in Bahia and northeastrn of Minas Gerais, the present work was proposed viewing to investigate miotoxic and neurotoxic activities of crude venom and its fractions Piratoxin-I (PrTX-I) and Piratoxin-III (PrTX-III). The studies were performed in mice isolated muscle preparations of the extensor'digitorum longus (EDL) and phrenic nerve-diaphragm (PND) muscles through myographic, histological and ultrastructural analysis and determination of creatinokinase (CK) in the incubation bath. The venom and the fraction PrTX-III (10, 25 and 50 µg/ml) caused a dose-dependent twitch-tension blockade of the EDL muscle fibers, histological and ultrastructural changes of muscle cells and nerve endings culminating in complete necrosis of both and increased CK release in the bath. PrTX-I caused a dose dependent blockade (5, 10 and 20 µg/ml) onhe twitch tension in PND muscle fibers and severe myonecrosis. However, PrTX-I did not affect muscle fibers nor caused alter(!.tions on the twitch tension responses in EDL. These differences could be accounted for a distinct sensitivity of EDL and PND muscle fibers to the venom and PrTX-I possibly related to the amount of slow- and fast-contracting fibers present in each one. Our results suggest that PrTX-I and PrTX-III of B. pirajai venom would be the components accounting for the myotoxic activity of venom despite a distinct mechanism of action could be implied. Additionally, these preliminary results suggest a potent neurotoxic activity, also observed with the whole venom. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_DanieladeOliveira_D.pdf: 11046039 bytes, checksum: b59847c8c17a448c14ff005914cccd57 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Nesta tese foram apresentados os resultados da purificação de várias proteínas biologicamente ativas do veneno de serpentes crotálicas (CrotaJus durissus temfjcus, Crotalus durissus cascavel Ia, Crotalus durissus ruruima e CrotaJus durissus colliJineatus); botrópica (Bothrops pirajal) e coral (Mícrurus dumerilíi carínícauda). Muitas destas frações foram purificadas e caracterizadas do ponto de vista biológico, bioquímico e farmacológico. FraçOes como: crotamina, fosfolipase A2 (PLA2), crotapotinas e outras mostraram uma significativa atividade antibacteriana contra bactérias frtopatogênicas e patogênicas. As análises ultraestruturais e outros dados bioquímicos indicam que estas frações exercem essa atividade de formas diferenciadas. Foram observados quatro mecanismos de ação: 1.interação das frações com a membrana bacteriana, induzindo a ruptura e desorganização da mesma com posterior lise celular, 2. desorganização citoplasmática através da entrada das frações por poros na membrana causando lise celular, 3. digestão da membrana com posterior extravasamento do conteúdo interno bacteriano com lise celular, 4.1ise da membrana através dos radicais livres gerados pela reação enzimática do veneno com a membrana bacteriana. Durante o desenvolvimento da tese foram publicados e submetidos à publicação os seguintes artigos: 1.0liveira et aI., 2002 apresentaram o fracionamento do veneno de CrotaJus durissus terrificus em HPLC de fase reversa, com obtenção das frações: crotapotinas (F5 e F7) e PLA2 (F15, F16 e F17). As frações apresentaram atividade antibacteriana contra Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. A fração F17 apresentou atividade anticoagulante e foi seqüenciada apresentando uma homologia estrutural com outras PLA2 em tomo de 60-90%. Sua massa molecular de 14,6kDa foi determinada através de tricina SDS-PAGE, eletroforese de duas dimensões e MALDI TOFF. 2. T oyama at aI., 2003 verificaram a atividade enzimática, neurotóxica e antibacteriana da fração PLA2 (F15) isolada do veneno de CrotaJus dirissus teTTificus. 3.0liveira et aI., 2003 isolaram, purificaram, seqüenciaram a fração crotapotina, um componente ácido da crotoxina do veneno de Crotalus duríssus cascavel Ia, e realizaram testes para verificar a atividade antibacteriana em bactérias fitopatogênicas Gram-positivas e Gram-negativas, além de testes inflamatórios e nefrotóxicos. 4.Havt et aI., 2005 isolaram uma nova lectina tipo C (BPL) de Bothrops pirajai que foi caracterizada biológica e bioquimicamente. Esta fração também mostrou um efeito nefrotóxico em perfusão em rins isolados de ratos. 5. Toyama et al.,2004 isolaram, purificaram e caracterizaram bioquimicamente uma nova crotamina símile do veneno de Crotalus durissus cascavel/a. Foram identificados os peptídeos biologicamente ativos da crotamina, os quais foram responsáveis pela estimulação de secreção de insulina. . 6.Gandhi et aI., 2004 purificaram uma nova lectina tipo C (crotacetin), obtida do veneno de Crotalus durissus cascavel/a. Esta nova lectina induziu a agregação plaquetária, a aglutinação eritrocitária e também mostrou uma atividade antibacteriana. 7. Cavada et aI., 2004 purificaram e caracterizaram uma nova lectina da semente de Lonchocarpus sericeus, com alta especificidade por N-acetilglicosamina. 8. Cháriston et ai, 2004 isolaram e determinaram a estrutura primária de uma nova PLA2 de Micrurus dumerilli carinicauda. 9.Toyama et aI., 2004 isolaram, purificaram e caracterizaram uma nova isoforma da crotamina do veneno de Crotalus durissus ruruima e mostraram seu efeito antibacteriano. 10.Toyama et aI., 2004 isolaram, purificaram e caracterizaram uma nova PLA2 do veneno de Crotalus durissus collilineatus. Nestes trabalhos foram determinadas as regiões moleculares responsáveis pela atividade antibacteriana. 11. Toyama et a/., 2004 purificaram e caracterizaram uma nova L-amino oxidase do veneno de Crotalus durissus cascavel Ia (Casca LAO) através de exclusão molecular e HPLC de troca iônica. Casca LAO apresentou uma grande inibição bacteriana em bactérias Gram-negativas (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae) e Gram-positivas (Streptococcus mutans). Os estudos destas frações apresentam perspectivas futuras na aplicação terapêutica, como agentes antibacterianos, de novos peptídeos sintéticos ou naturais / Abstract: In this dissertation we present the results of purification of several biologically active protein from the crotalic rattlesnake venom (Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus cascavel/a, Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus collilineatus); from bothropic (Bothrops piraja) and coral (Micrurus dumerilli camicauda). Many of these fractions were purified and biochemical, biologically and pharmacologically characterized, some were reported and other submitted for publication in specialized joumals. Some fraction as crotamine, phospholipase A2 (PLA2), crotapotins and other showed a significant antibacterial activity against phytopatogenical and pathogenic bacterium. Ultra structural and biochemical analyses suggest that this fraction exert this antibacterial activity by different ways, which are grouped according to the mode action into four different mechanisms: 1.interaction of some fractions with the bacterial membrane inducing cellular Iyses by membrane rupture and disorganization. 2. Bacterial cell Iyses by action of fraction from the venom that form pore on the membrane and consequently cytoplasmatic disorganization and membrane rupture. 3. Membrane cell digestion induced by protein from the venom and consequently lost of cytoplasmatic content and cellular Iyses. 4. Membrane cel! Iyses induced by free radical generated by enzymatic action of protein form the venom. During the development of this thesis we reported and submitted some articles listed below: 1. Oliveira et aI., 2002 presents the purification of crotapotins (F5 and F7) and PLA2 (F15, F16 and F17)from the Crotalus durissus terrificus venom by reverse phase HPLC. These fraction showed significant antibacterial activity against Xanthomonas axonopodis pv. Passiflorae. Fraction F17 also showed an anticoagulant activity and its amino acid sequence showed high amino acid sequence identity with.60-90% with other PLA2 from different sources. Its molecular mass was 14,6kDa determined by Tricine PAGE-SDS, two dimensional electrophoresis and MALDI TOFF. 2. Toyama et aI., 2003 showed the enzymatic, neurotoxic and antibacterial activities of PLA2 isoform (F15) from the Crotalus durissus terrificus venom. 3. Oliveira et aI., 2003 isolated, purified and determined the amino acid sequence of crotapotin fraction, an acid compound of crotoxin from the Crotalus durissus cascavel/a, and detennined its antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative phytopathogenic baderium, intlammatory and nephrotoxicity. 4. Havt et aI., 2005 isolated a new type C-Iectin (SPL) trom the Bothrops pirajaithat was biologically and biochemical characterized. This fraction also showed a nephrotoxic effect on the isolated perfused kidney. 5. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and characterized biochemical a new crotamine like from Crotalus durissus cascavella venom. In this work we identified the biologically active peptide from this crotamine, which were responsible for increasing insulin secretion. 6. Gandhi et aI., 2004 purified a new lectin type C (crotocetin) trom the Crotalus durissus cascavella venom. This lectin induced platelet aggregation, erythrocyte agglutination and also showed an antibacterial activity. 7. Cavada et aI., 2004 purified and characterized a new lectin from the Lonchocarpus serieus seed that showed high specific binding against N-acetyl glucosamine. 8. Cháriston et aI., 2004 isolated and determined the amino acid sequence of new PLA2 from Micrurus dumerilli carinicauda. 9. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and characterized a new crotamine isofonn from the Crotalus durissus ruruima venom and showed its antibacterial activity. 10. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and charaderized a new PLA2 trom the Crotalus durissus collilineatus venom. In this work we determined the molecular region of the PLA2 responsible for the antibacterial activity. 11. Toyama et aI., 2004 purified and characterized a new L-amino acid oxidase from the Crotalus durissus cascavella whole venom (Casca LAAO) by molecular exdusion and cation exchange HPLC. Casca LAAO inhibited strongly the bacterial growth rate of Gram-negative (Xanthomonas axonopodis pv passiflorae) and Gram-positive (Streptococcus mutans). These studies presented here showed a future perspective to therapeutic application of these peptides, synthetical/y or natural/y obtained as potential antibacterial substances / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A espécie Bothrops atrox é responsável por grande parte dos acidentes no estado do Amazonas. No entanto, ainda são poucos os estudos sobre as toxinas que compõem o veneno dessa serpente, os mecanismos envolvidos na sintomatologia dos acidentes, bem como de formas de inibição. Os soros antiveneno utilizados atualmente com o objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos mostraram reatividade cruzada entre componentes dos venenos de serpentes do gênero Bofhrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). No entanto alguns componentes do veneno não apresentaram essa reatividade (SILES-VILARROEL et al.., 1974), mostrando a existência de toxinas espécie específicas.Os venenos de serpentes estão sujeitos a grandes variações induzidas por diversos aspectos ontogenéticos e influencia do habitat. Assim, essas variações podem gerar toxinas espécie específicas cujos mecanismos de ação ainda são desconhecidos e que os anticorpos presentes nos antivenenos disponíveis não sejam capazes de reconhecer e neutralizar eficientemente. O gênero Bothrops possui espécies extremamente variáveis, algumas de difícil classificação taxonõmica, e novas espécies têm sido descobertas recentemente. Como contribuição para o acúmulo de informações a respeito das diferentes composições do veneno do gênero Bothrops, e para o conhecimento de toxinas já isoladas e as ainda não isoladas na espécie tipo Bothrops atrox, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno.Os dados obtidos são importantes para a elaboração de um painel da expressão gênica dessa espécie e permitirá a identificação de toxinas que podem ser comuns ou não ao veneno de outras espécies do gênero. Aliado a isso, esses dados permitirão a correlação com o estudo proteõmico, e possivelmente fornecerão subsídios para a melhoria da terapêutica empregada no tratamento dos casos envenamento na região. / The species Bothrops atrox is responsible for most accidents in state of Amazonas. However, there are few studies on toxins that make up the venom of this snake, mechanisms involved in symptomatology of accidents, as well as inhibition forms. Sera antivenom currently used in order to neutralize the systemic and local activities of the venoms showed cross-reactivity between components of the venom of Bothrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). However some components of the venom showed no reactivity (SILES-VILARROEL et al., 1974), indicating the existence of species-specific toxins. Snake venoms are subject to large variations induced by several aspects and influences of ontogenetic habitat. Thus, these variations can produce toxins whose mechanisms of species-specific action are still unknown and antibodies present in available antivenoms maybe not are capable to recognize and neutralize some toxins efficiently. Bothrops species have highly variable, some of difficult taxonomic classification and new species have been discovered recently. As a contribution to gain of information about of different compositions of Bothrops venom and to knowledge of toxins not yet isolated and the isolated in Bothrops atrox type species we constructed a venom gland cDNA library . The data obtained are important for the development of gene expression panel of this species and enable the identification of toxins common or not in the venom of other species. These data will allow correlation with the proteomic study, and possibly provide input for improving the therapeutic used in the treatment of accidents cases in the region.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-02-23T11:42:33Z No. of bitstreams: 1 JOSÉ RODRIGUES DE SÃO JOÃO.pdf: 957697 bytes, checksum: d5f6ce36eb4d06421430fe24848a1cef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-23T11:42:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JOSÉ RODRIGUES DE SÃO JOÃO.pdf: 957697 bytes, checksum: d5f6ce36eb4d06421430fe24848a1cef (MD5) Previous issue date: 2016-12-05 / The study consists of analyzing the novel Venenos de Deus, remédios do Diabo, by Mia Couto, a work that has led us to realize that the characters are inscribed in the interlude, revealing their characteristics and their dreams. The pretension is to identify effects of meaning provided by a hybrid narrative that inscribes pluralism of the images inscribed in the intertempor and interlude of the vagrant subject. This presupposes establishing a contrast between the real and the imaginary, in a supposed trip that the subject makes within itself, which allows to verify that the discourse inhabits a kind of diasporic imagination that enlivens and illuminates spaces, moving the life of the characters that carry in If the inspiration of a human with its natural habitat violated. Narrative discourse supports the coming and going, of those who seem to live interdicts that instigate "dreams". The striking feature of discourse is the reversal of what is known about the relationship between signs: poisons and remedies, in an inverted combination of good and demonic, life and death, dream and hopelessness. / O estudo consiste em analisar o romance Venenos de Deus, remédios do Diabo, de Mia Couto, obra que nos levou a perceber que as personagens se inscrevem no entrelugar, desvelando suas características e seus sonhos. A pretensão é a de identificar efeitos de sentido proporcionados por uma narrativa híbrida que inscreve pluralismo das imagens inscritas no entretempo e no entrelugar do sujeito vagante. Isso pressupôs estabelecer contraste entre o real e o imaginário, em uma suposta viagem que o sujeito faz dentro de si, o que permite constatar que o discurso habita uma espécie de imaginação diaspórica que aviva e ilumina espaços, movimentando a vida dos personagens que carregam em si a inspiração de um humano com seu habitat natural violado. O discurso narrativo suporta o ir e vir, daqueles que parecem viver interditos que instigam “sonhos”. A característica marcante do discurso é a inversão do que se conhece da relação entre os signos: venenos e remédios, numa combinação invertida do bem e do demoníaco, da vida e da morte, do sonho e da desesperança.

Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases. / Despite the constant advances in the treatment of cancer, this disease remains one of the main causes of mortality worldwide. So, the development of new treatment modalities is imperative. Snake venom causes a variety of biological effects because they constitute a complex mixture of substances as disintegrins, proteases (serine and metalo), phospholipases A2, L-amino acid oxidases and others. The goal of the present work is to evaluate a anti-tumor activity of some snake venoms fractions. There are several studies of components derived from snake venoms with this kind of activity. After fractionation of snake venoms of the families Viperidae and Elapidae, the fractions were assayed towards murine melanoma cell line B16-F10 and fibroblasts L929. The results showed that the fractions of venom of the snake Notechis ater niger had higher specificity and potential antitumor activity on B16-F10 cell line than the other studied venoms. Since the components of this venom are not explored yet coupled with the potential activity showed in this work, we decided to choose this venom to develop further studies. The cytotoxic fractions were evaluated to identify and characterize the components that showed antitumoral activity. Western blot assays and zymography suggests that these proteins do not belong to the class of metallo and serine proteinases.

As doenças neurodegenerativas (DN), incluindo doença de Alzheimer e doença de Parkinson, estão entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos países ocidentais. Não há ainda um tratamento definitivo para estas neuropatias, mas os estudos têm apontado para mecanismos comuns de toxicidade, que incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e apoptose. Assim, as mitocôndrias constituem alvos importantes para futuras estratégias de neuroproteção visando tratar, prevenir ou retardar a neurodegeneração. A biodiversidade da fauna brasileira representa uma fonte promissora e ainda pouco explorada de novas moléculas com (i) atividade neuroprotetora e, portanto, potencial para originar novos fármacos para o tratamento destas doenças; ou ainda com (ii) atividade neurotóxica, podendo ser utilizadas como ferramentas de estudo de mecanismos de neurotoxicidade. O presente estudo teve por objetivo investigar o possível potencial neuroprotetor e/ou neurotóxico de peptídeos de baixo peso molecular, obtidos a partir do veneno de diferentes espécies de serpentes do gênero Bothrops por meio da investigação dos efeitos destes compostos na função mitocondrial de cérebro de rato. Duas das frações estudadas (obtidas a partir do veneno da B. atrox e da B. jararaca) apresentaram um interessante potencial protetor contra o intumescimento osmótico mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), eventos associados à transição de permeabilidade mitocondrial e à morte celular. Por outro lado, outra fração, obtida a partir do veneno da B. pirajai, apresentou potencial neurotóxico. Estes achados podem ser úteis para estudos mecanísticos e também no estabelecimento de futuras estratégias de tratamento das doenças neurodegenerativas, tendo as mitocôndrias como alvos terapêuticos (terapia alvo). / The neurodegenerative diseases, including Alzheimer\'s and Parkinson\'s diseases, are among the main causes of morbidity and mortality in Western countries. A definitive treatment for these neuropathies has not yet been found, but studies have indicated common mechanisms of toxicity, including mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis. Therefore, mitochondria represent important targets for the future neuroprotective strategies aimed to treat, prevent or delay the neurodegeneration. The Brazilian fauna biodiversity represents a promising and under explored source of new molecules with (i) neuroprotective activity and potential to originate new drugs for the treatment of these diseases; or yet, with (ii) neurotoxic activity, representing tools to study neurotoxicity mechanisms. The present study aimed to investigate the possible neuroprotective and/or neurotoxic potential of low-molecular-mass peptides extracted from the venom of different species of Bothrops genus snakes by investigating their effects on rat brain mitochondrial function. Two of the studied fractions (from B. atrox and B. jararaca venoms) presented an interesting protective potential against both the mitochondrial swelling and reactive oxygen species (ROS) production, events associated with mitochondrial permeability transition and cell death. On the other hand, other fraction (from B. pirajai venom) presented a neurotoxic potential. These findings might be useful for mechanistic studies and also for the establishment of future strategies of neurodegenerative diseases treatment, using mitochondria as therapeutic targets (targeted therapy).