Orientador: Maria Palmira Daflon Gremião / Coorientador: Cristina Helena Bruno / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Heloisa Sobreiro Selistre de Araujo / Resumo: Venenos de serpentes possuem propriedades que têm sido exploradas como alternativas terapêuticas. Entre as diversas classes de proteínas de venenos de serpentes que têm sido estudadas destacam-se as desintegrinas. Os efeitos biológicos das desintegrinas relacionam-se com suas ligações a receptores celulares sendo consideradas potentes inibidores de adesão celular, podendo ser utilizadas no combate de diversas patologias como, por exemplo, o câncer, trombose e osteoporose. A desintegrina-RGD monomérica, DisBa-01, foi recentemente identificada a partir de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno de Rhinocerophis alternatus. É uma proteína recombinante que interage especificamente com as integrinas αVβ3, α5β1 e αIIbβ3 exibindo potentes propriedades antimetastática, antiangiogênica e antitrombótica. Entretanto a aplicação de proteínas na terapêutica é limitada por diversas dificuldades que inclui a baixa estabilidade em fluídos fisiológicos, potencial imunogênico e alergênico, assim como a baixa biodisponibilidade. Para contornar estes problemas, tem-se buscado novos sistemas de liberação, como as nanopartículas de quitosana e vias alternativas para administração de proteínas, como por exemplo, a via nasal. Portanto neste trabalho estudou-se o desenvolvimento e a caracterização de nanopartículas de quitosana para potencial administração nasal de DisBa-01. Para isso as nanopartículas de quitosana foram desenvolvidas pelo método de gelificação ionotrópica, através da reticulação da quitosana com tripolifosfato de sódio. A caracterização físico-química demonstrou que a presença do quitosana 0,2 % (NPQS2); 0,3 % (NPQS3) e 0,5 % (NPQS5) (m/v) influenciou o diâmetro médio, a eficiência de encapsulação, assim como o potencial de superfície das partículas. O diâmetro médio e o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snake venoms have properties that have been exploited as therapeutic alternatives. Among the various classes of proteins from snake venoms that have been studied stand out the disintegrins. The biological effects of disintegrins relate to their connections to cellular receptors being considered inhibitors potent of cell adhesion, can be used in the diseases various combat, such as, cancer, thrombosis, and osteoporosis. The RGD-monomeric disintegrin, DisBa-01, was recently identified from a cDNA library made with RNAs from the venom gland of Rhinocerophis alternatus. It is a recombinant protein that interacts specifically with the αVβ3, α5β1 and αIIbβ3 integrins showing potent properties antimetastatic, antithrombotic and antiangiogenic. However, the use of protein in the therapeutic is limited by several difficulties which includes the low stability in physiological fluids, immunogenic and allergenic potential, as well the low bioavailability. To overcome these problems, researchers have tried to new delivery systems, such as chitosan nanoparticles and alternative routes for administration of proteins, for example, nasal route. In this work we studied the development and characterization of chitosan nanoparticles for potential administration nasal of DisBa-01. For this, the chitosan nanoparticles have been developed by ionotropic gelation method, across crosslinking of chitosan with sodium tripolyphosphate. The physico-chemical characterization showed that the presence of chitosan influences the mean diameter, encapsulation efficiency and superficial charge of the nanoparticles. The nanoparticles shape varied in function of chitosan concentration, the better results being obtained with the lowest chitosan concentration. The mean... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-29Bitstream added on 2014-06-13T20:12:08Z : No. of bitstreams: 1 kiil_cp_me_arafcf.pdf: 1039497 bytes, checksum: 4a6fc7744bc9f14fead95f2bc8c22bc8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Venenos de serpentes possuem propriedades que têm sido exploradas como alternativas terapêuticas. Entre as diversas classes de proteínas de venenos de serpentes que têm sido estudadas destacam-se as desintegrinas. Os efeitos biológicos das desintegrinas relacionam-se com suas ligações a receptores celulares sendo consideradas potentes inibidores de adesão celular, podendo ser utilizadas no combate de diversas patologias como, por exemplo, o câncer, trombose e osteoporose. A desintegrina-RGD monomérica, DisBa-01, foi recentemente identificada a partir de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno de Rhinocerophis alternatus. É uma proteína recombinante que interage especificamente com as integrinas αVβ3, α5β1 e αIIbβ3 exibindo potentes propriedades antimetastática, antiangiogênica e antitrombótica. Entretanto a aplicação de proteínas na terapêutica é limitada por diversas dificuldades que inclui a baixa estabilidade em fluídos fisiológicos, potencial imunogênico e alergênico, assim como a baixa biodisponibilidade. Para contornar estes problemas, tem-se buscado novos sistemas de liberação, como as nanopartículas de quitosana e vias alternativas para administração de proteínas, como por exemplo, a via nasal. Portanto neste trabalho estudou-se o desenvolvimento e a caracterização de nanopartículas de quitosana para potencial administração nasal de DisBa-01. Para isso as nanopartículas de quitosana foram desenvolvidas pelo método de gelificação ionotrópica, através da reticulação da quitosana com tripolifosfato de sódio. A caracterização físico-química demonstrou que a presença do quitosana 0,2 % (NPQS2); 0,3 % (NPQS3) e 0,5 % (NPQS5) (m/v) influenciou o diâmetro médio, a eficiência de encapsulação, assim como o potencial de superfície das partículas. O diâmetro médio e o... / Snake venoms have properties that have been exploited as therapeutic alternatives. Among the various classes of proteins from snake venoms that have been studied stand out the disintegrins. The biological effects of disintegrins relate to their connections to cellular receptors being considered inhibitors potent of cell adhesion, can be used in the diseases various combat, such as, cancer, thrombosis, and osteoporosis. The RGD-monomeric disintegrin, DisBa-01, was recently identified from a cDNA library made with RNAs from the venom gland of Rhinocerophis alternatus. It is a recombinant protein that interacts specifically with the αVβ3, α5β1 and αIIbβ3 integrins showing potent properties antimetastatic, antithrombotic and antiangiogenic. However, the use of protein in the therapeutic is limited by several difficulties which includes the low stability in physiological fluids, immunogenic and allergenic potential, as well the low bioavailability. To overcome these problems, researchers have tried to new delivery systems, such as chitosan nanoparticles and alternative routes for administration of proteins, for example, nasal route. In this work we studied the development and characterization of chitosan nanoparticles for potential administration nasal of DisBa-01. For this, the chitosan nanoparticles have been developed by ionotropic gelation method, across crosslinking of chitosan with sodium tripolyphosphate. The physico-chemical characterization showed that the presence of chitosan influences the mean diameter, encapsulation efficiency and superficial charge of the nanoparticles. The nanoparticles shape varied in function of chitosan concentration, the better results being obtained with the lowest chitosan concentration. The mean... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-10-24T14:14:09Z No. of bitstreams: 1 2014_NelsonGomesdeOliveiraJunior.pdf: 8361079 bytes, checksum: b75992b75e9b38333265338ebf305382 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:18:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_NelsonGomesdeOliveiraJunior.pdf: 8361079 bytes, checksum: b75992b75e9b38333265338ebf305382 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-24T15:18:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_NelsonGomesdeOliveiraJunior.pdf: 8361079 bytes, checksum: b75992b75e9b38333265338ebf305382 (MD5) / Potamotrygon falkneri e Potamotrygon motoro consistem em espécies de arraias da família Potamotrygonidae. Estas famílias são caracterizadas por terem um ferrão retro-serrilhado coberto por um epitélio glandular produtor de peçonha. A sintomatologia desses acidentes se dá por processos inflamatórios podendo progredir até a necrose e úlceras. O conhecimento acerca dos componentes proteicos desta peçonha ainda é muito limitado. No presente estudo, ferramentas transcritômicas foram utilizadas afim de melhor compreender o conteúdo proteico do ferrão das espécies P. falkneri e P. motoro. Primeiramente, uma extração de RNA com trizol foi realizada com subsequente análise por eletroforese em gel de agarose. Os RNAs obtidos foram sequenciados através da plataforma Illumina MiSeq. Para as análises do perfil transcritômico, as sequências foram montadas de novo através do programa Trinity. Após, para caracterização funcional, os dados foram submetidos à ferramenta BLAST contra base de dados UniProt seguida de subsequente análise na base de dados do KEGG Orthology. Posteriormente, um diagrama de Venn foi elaborado indicando o grau de semelhança entre as espécies. Após análise no KEGG, os transcritos foram divididos em grandes categorias, onde, a mais expressa das categorias correspondeu aos transcritos não relacionados a nenhuma via biológica aparente, representando 30% para P. falkneri e 31% para P. motoro, em seguida a categoria mais abundante e com grande importância foi a de metabolismo com 15% para P. falkneri e 14% para P. motoro. Vale ressaltar também a categoria de processos celulares com 10% para ambas as espécies. Após essa separação de classses, análises das vias relacionadas ao metabolismo e possíveis proteínas relacionadas aos sintomas observados nos acidentes ocasionados por arraias, foram discutidas, tais como, fosfolipases, metaloproteinases e desintegrinas. Em suma, as análises transcritoma ajudarão a elucidar como se dá o processo de envenenamento e quais as possíveis moléculas responsáveis pelos danos causados nesses acidentes, esse estudo permitirá ainda, entender como podemos minimizar os danos causados nesses acidentes, amenizando assim, os danos socioeconômicos causados a essas populações ribeirinhas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Potamotrygon falkneri and Potamotrygon motoro are stingray species from Potamotrygonidae family. This family has a typical aliasing sting covered by glandular epithelium producer venom. The symptomatology of such accidents occurs by inflammatory processes and may lead to necrosis and ulceration. The knowledge about the protein venom components of this, are still very limited. In the present study, transcriptomic tools were used in order to better understand the protein content of P. falkneri and P. motoro sting. Firstly, a RNA extraction was performed using trizol with subsequent agarose gel electrophoresis analysis. The obtained RNAs were sequenced using the Illumina MiSeq platform. For the transcriptome profile analysis, the sequences were de novo assembled by Trinity program. Furthermore, functional characterization was performed, where, data were submitted to BLAST against UniProt database, followed by KEGG Orthology database analysis. Subsequently, a Venn diagram was prepared, indicating the similarity between species. After the KEGG analysis, the transcripts were divided into categories, where the most explicit category was the category with transcripts unrelated to any apparent biological pathways corresponding to 30% for P. falkneri and 31% for P. motoro, in sequence, the most abundant and very important category was metabolism with 15% for P. falkneri and 14% for P. motoro, it is also worth mentioning the category of cellular processes with 10% for both species. After this separation, subsequent analysis of pathways related to metabolism and possible proteins related to symptoms observed in accidents caused by stingrays were discussed, such as, phospholipases, metalloproteinases and disintegrins. In short, the transcriptome analyzes will help elucidate how is the process of poisoning, and what the possible molecules responsible for the damage caused in these accidents, in addition, this study also allow, to understand how we can minimize the damage caused in such accidents, thus mitigating the physical and socio-economic damage to these riverine populations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-08T20:32:58Z No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / O escorpião Tityus fasciolatus faz parte da família Buthidae, que contém espécies causadoras de envenenamentos graves em humanos. As moléculas responsáveis pelos efeitos mais severos são conhecidas como neurotoxinas que, em sua maioria, são componentes peptídicos cujos principais alvos são os canais iônicos, os quais são relevantes para o funcionamento dos diversos sistemas orgânicos. Os compostos relacionados aos envenenamentos por peçonhas de escorpiões são conhecidos por agirem com especificidade nos canais iônicos. Os constituintes proteicos de T. fasciolatus foram caracterizados com o auxílio de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), com coluna C18 analítica, espectrometria de massa MALDI/ TOF-MS e uma biblioteca transcritômica da glândula de peçonha. Mais de 200 diferentes massas moleculares foram identificadas nas frações cromatográficas, assim como 9.130 transcritos na biblioteca transcritômica, dentre os quais foram identifcados 278 que codificam toxinas. A atividade biológica de três toxinas e de uma fração foram testadas com canais iônicos expressos em oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de Voltage clamp de dois eletrodos. Foram utilizados canais de Na+ de mamíferos hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 e rNav1.8/1. Duas toxinas (Tf3 e Tf4) foram classificadas como -NaScTx (Sodium Scorpion Toxins), por causarem aumento da corrente de Na+ e retardo da inativação rápida do canal. A Tf3 foi ativa em hNav 1.1 à hNav1.7, enquanto a Tf4 agiu apenas nos hNav1.2 e hNav1.7. A fração 63 também apresentou atividade α, sendo sua atividade significativa em hNav1.7. A toxina Tf2 foi identificada como -NaScTx, cuja característica é a ativação dos canais de Na+ em potenciais onde antes os canais estavam em repouso. Dentre os oito canais de Na+ de mamífero testados, a Tf2 foi seletiva para hNav1.3, à concentração de 1M. Além da descrição da atividades dessas toxinas de Na+, este trabalho gerou um acervo de sequências de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, um perfil das massas moleculares associadas aos seus respectivos tempos de retenção, 18 sequências de prováveis NaScTxs e 15 sequências de prováveis KTxs. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tityus fasciolatus is a scorpion belonging to the Buthidae family, known by the species that cause severe evenomation in humans. The molecules responsible for the most severe effects are known as neurotoxins, which are mostly peptide components, targeting ion channels, which are relevant to the functioning of the various organ systems. The compounds responsible for envenomation are usually known to act with specificity on ion channels. The proteic components of T. fasciolatus venom were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), MALDI/TOF mass spectrometry and a transcriptomic library of the venom gland. More than 200 different molecular masses were detected in chromatographic fractions, as well as 9,130 transcripts that encode compounds, among them 278 encode toxins. Two Electrodes Voltage Clamp was used to test the biological activity of three toxins and a fraction in Xenopus laevis oocytes expressing ion channels. The Nav channels used were all mammals, hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 and rNav1.8/1. Two toxins (Tf3 and Tf4) were classified as -NaScTx (Sodium Scorpion toxins), since they cause an increase in Na+ currents and a delay in the rapid inactivation of the channel (Tf3 and Tf4). The Tf3 was active in hNav 1.1 to hNav1.7, while Tf4 affected only hNav1.2 and hNav1.7. Fraction 63 also showed α activity in hNav1.7. Tf2 was identified as β-NaScTx, whose characteristic is the activation of Nav channels at more negative potentials. Among the eight mammal Nav channels tested, Tf2 was hNav1.3 selective, at 1μM. This work led to a collection of sequences of nucleotides and amino acid residues, a molecular mass profile with their respective retention times, and 18 putative NaScTxs and 15 putative KTxs sequences.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Itens 3.4, 4.1, 4.2 e 4.3. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-05-15T10:49:00Z No. of bitstreams: 1 2013_FabiolaFernandesdosSantosCastro_Parcial.pdf: 6574803 bytes, checksum: 704abe7ea9a67b0a5cc45d5fb569ed9d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-15T13:36:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FabiolaFernandesdosSantosCastro_Parcial.pdf: 6574803 bytes, checksum: 704abe7ea9a67b0a5cc45d5fb569ed9d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-15T13:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FabiolaFernandesdosSantosCastro_Parcial.pdf: 6574803 bytes, checksum: 704abe7ea9a67b0a5cc45d5fb569ed9d (MD5) / O surgimento de bactérias resistentes pode ser observado desde a introdução na prática clínica, dos primeiros agentes antimicrobianos. Desde então, a rápida disseminação destes patógenos multirresistentes tem representado uma séria ameaça, considerando-se fatores como as altas taxas de mortalidade, a restrição de tratamentos e a alta prevalência de bactérias resistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar. Até o momento, são considerados, pela comunidade científica internacional, patógenos multirresistentes causadores de infecções/colonizações relacionadas à assistência em saúde: Enterococcus spp resistente aos glicopeptídeos, Staphylococcus spp.resistente ou com sensibilidade intermediária a vancomicina, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, e Enterobactérias resistentes a carbapenêmicos (ertapenem, meropenem ou imipenem), destacando-se entre estas a Klebsiella pneumoniae e as espécies de Enterobacter,spp. Os peptídeos antimicrobianos (PAM), são capazes de exercer uma atividade antimicrobiana potente contra diferentes e numerosos micro-organismos, além da grande vantagem de não apresentar nenhuma toxicidade às células animais, ou uma toxicidade extremamente baixa. Neste contexto, o estudo de peptídeos isolados da peçonha de artrópodes peçonhentos tem apresentado um grande potencial.Vespas sociais produzem peptídeos com atividade muito superior, até dezoito vezes maior, que espécies solitárias, os quais agem como barreira inicial contra a invasão microbiana das colônias. A peçonha de vespas sociais é constituída por uma variedade de compostos bioativos, com diversas ações farmacológicas, entre elas a antimicrobiana. Neste trabalho foi feita uma avaliação da atividade antimicrobiana de um novo peptídeo isolado da peçonha da vespa social Polybia dimorpha, em testes de inibição do crescimento bacteriano de cepas sensíveis e multirresitentes, gram negativas e gram positivas, por metodologia de disco difusão e microdiluição em caldo, comparando os resultados aos do desempenho de antimicrobianos convencionais utilizados na última linha de tratamento de infecções graves. Isolou-se um peptídeo de pequeno tamanho, de cadeia linear, que demonstrou potente atividade antimicrobiana contra bactérias gram positivas e gram negativas. O peptídeo descrito nesta pesquisa apresenta atividade contra bactérias padrão, conhecidamente sensíveis aos antibióticos comerciais, não portadoras de genes de resistência, e também sobre cepas multirresistentes, nestas últimas em concentrações inferiores a 1μg/mL. A capacidade de inibição do crescimento bacteriano foi maior e mais potente nas cepas com expressão de elaborados mecanismos de resistência. O estudo da peçonha de vespas tem proporcionado uma gama de novos compostos, com ações farmacológicas diferenciadas e que podem ser utilizados como fármacos modelo para o desenvolvimento de novos antimicrobianos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The emerging of multi-drug resistant bacteria can be observed since the introduction of clinical practice of the first antimicrobial agents. Ever since, the rapid spread of these multi-drug resistant pathogens is representing a serious threat, considering factors such as high rates of mortality, treatment restrictions and high prevalence of multi-drug resistant bacteria into the hospital environment. Nowadays, the scientific community considers as multi-drug resistant, the pathogens which are able to cause infections/colonizations related to health assistance: glycopeptides resistant Enterococcus spp; vancomycin resistant or reduced susceptibility Staphylococcus spp; Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii and carbapenem-resistant enterobacterias (ertapenem, imipenem or meropenem), among those, highlighting Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. The antimicrobial peptides (PAM) are capable of produce a powerful antimicrobial activity against different and various microorganisms, also presenting the great advantage of having no toxicity consequences to animal cells, or an extremely low toxicity. In this sense, the study of those peptides isolated from the venom of poisonous arthropods has shown a great potencial. Social wasps can produce peptides with a much higher superiority, up to eighteen times more, than lonely species, which act as an initial barrier against microbial invasion of the colonies. The venom of social wasps comprises a variety of bioactive compounds, with many pharmacologic actions, including antimicrobial. In this study, an evaluation of the antimicrobial activity of a new peptide isolated from the venom of the social wasp Polybia dimorpha was made, with bacterial inhibition of growth tests using strains of multi-drug resistant gram-negative and gram-positive bacteria, by disk-diffusion and microdilution methodology, comparing the results with the performance from conventional antimicrobial used in the last line treatment for severe infections. An small-sized, straight chained peptide was isolated, demonstrating a powerful antimicrobial activity against both gram-negative and gram-positive bacteria. The described peptide in this research represented activity against standard strains (noncarriers of multi-resistance genes), recognizably sensible against commercialized antimicrobials, and also against multi-drug resistant strains, at concentrations less than 1μg/mL. The bacterial growth inhibition capacity was greater and more powerful in the strains representing more elaborated resistance mechanism expression. The study of the wasps venom is providing a series of new compounds, with differentiated pharmacology actions which can be used as model drugs for the development of new antimicrobials.

Dissertação(mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-03-18T18:33:28Z No. of bitstreams: 1 2010_SolangeCristinaRegoFernandes.pdf: 3140317 bytes, checksum: 5132f0dfcdca97c725e1888ea71940f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-03-21T11:56:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_SolangeCristinaRegoFernandes.pdf: 3140317 bytes, checksum: 5132f0dfcdca97c725e1888ea71940f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-21T11:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_SolangeCristinaRegoFernandes.pdf: 3140317 bytes, checksum: 5132f0dfcdca97c725e1888ea71940f7 (MD5) / A peçonha de aranhas tem provado ser uma fonte valiosa de componentes farmacologicamente ativos capazes de exercer as mais diversas funções. Por atuarem em diferentes sistemas biológicos, a caracterização de componentes bioativos desperta grande interesse na prospecção de novos fármacos. Poucos trabalhos com aranhas caranguejeiras brasileiras têm sido desenvolvidos nessa área e nenhum até o momento foi realizado com a peçonha de Nhandu coloratovillosus. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a composição bioquímica da peçonha de N. coloratovillosus visando à identificação de compostos bioativos. A peçonha bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC e 35 frações foram eluídas. Análises por MALDI-TOF MS detectaram a presença de 46 componentes de massas moleculares distintas. Por meio de eletroforese foi possível visualizar a presença de componentes de alta massa molecular. Um componente com atividade hialuronidásica foi identificado e purificado, apresentando aproximadamente 42 kDa. Foi possível determinar a concentração inibitória mínima da peçonha bruta de N. coloratovillosus contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Foi identificada atividade antibacteriana em quatro frações cromatográficas e um grupo de frações com baixa massa molecular (GF1), entretanto não foi possível a determinação de MIC. A aplicação de 1,5 mg da peçonha bruta de N. coloratovillosus apresentou um efeito neurotóxico irreversível em nervo ciático de rã, enquanto que GF1 apresentou um leve efeito reversível. Um peptídeo teve sua estrutura primária parcialmente elucidada e análises por alinhamento revelaram 90% de identidade com LTx2, uma toxina isolada de Lasiodora sp. que interfere nas correntes de Ca++ em canais para Ca++ voltagem-dependentes. A utilização de 365 nM desse peptídeo em ensaio cardiotóxico não causou efeito significativo na ampitude do estímulo. O estudo e caracterização de componentes bioativos presentes na peçonha de aranhas são de extrema relevância, uma vez que podem auxiliar no esclarecimento de questões taxonômicas, na identificação de potenciais drogas terapêuticas e no entendimento da biologia desses animais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Spiders venoms has proved to be a valuable source of pharmacologically active compounds, capable of performing diverse functions. By acting on different biological systems, the characterization of such compounds exerts grest interest in prospecting for new drugs. Few studies with Brazilian spiders have been developed in this area and none so far has been conducted with the venom of Nhandu the venom of N. Coloratovillosus, aiming at the identification of biologically active compounds. The crude venom was frationated by RP-HPLC, and 35 fractions were eluted. Analysis by MALDI-TOF MS detected the presence of 46 compounds with different molecular weights. The presence of components with high molecular weights was visualized by SDS-PAGE. One component with hyaluronidase activity was identified and purified, with a molecular mass of approximately 42 kDa. The minimal inhibitory concentration (MIC) of the crude venom of N. Coloratovillosus was determined against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ntibacterial activity was identified in four chromatographic fractions and a group of low molecular weight fractions (GF1), however it was not possible to determine their MIC. The application of 1,5 mg of the crude venom of N. Coloratovillosus showed an ireversible neurotoxic effect in frog sciatic nerce, whereas GF1 showed a mild reversible effect. The primary structure of one peptide was partially elucidated, and alignment analysis eveled 90% identity with LTx2, a toxin isolated from Lasiodora sp. Wich modulates Ca++ currents in Ca++ voltage-dependent channels. The utilization of 365 nM of this peptide in a cardiotoxic test caused no significant effect at the amplitude of the stimulus. The study and characterization of bioactive compounds present in the venom of spiders is of utmost importance since it may help in the understanding of taxonomic issues, the biology of these animals and in the identification of potential therapeutic drugs.

Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2011-06-28T17:16:33Z No. of bitstreams: 1 2011_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 2293994 bytes, checksum: e7e90ab7ad78952c1b1ecab8c28f79cc (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-29T16:49:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 2293994 bytes, checksum: e7e90ab7ad78952c1b1ecab8c28f79cc (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-29T16:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 2293994 bytes, checksum: e7e90ab7ad78952c1b1ecab8c28f79cc (MD5) / Aproximadamente 90% dos constituintes da peçonha botrópica e botropóica são protéicos, tratando-se de uma mistura com enorme variedade de substâncias farmacologicamente ativas que atuam na indução de alterações fisiopatológicas. Pesquisas demonstram uma grande diversidade funcional e estrutural de componentes isolados da peçonha de serpentes capazes de fornecer informações biológicas, com várias aplicações biotecnológicas como, por exemplo, antimicrobianos e antitumorais. O presente trabalho descreve a purificação, identificação e caracterização bioquímica e biológica de proteínas com atividade antimicrobiana e/ou antitumoral provenientes da peçonha de Bothropoides marmoratus. A peçonha de B. marmoratus foi fracionada com o emprego de cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa C18. Os ensaios para avaliação de atividade biológica foram realizados com a peçonha bruta e com todas as frações cromatográficas obtidas. A atividade citotóxica foi avaliada contra as linhagens celulares HeLa (câncer cervical), B16F10 (câncer de pele) e NHI3T3 (fibroblastos normais). Os ensaios para avaliação dos efeitos inibitórios sobre a proliferação de bactérias foram realizados com cinco linhagens de bactérias Gram-negativas e quatro Gram–positivas. As frações bioativas foram submetidas à recromatografia em sistema RP-HPLC para purificação dos componentes e, em seguida, analisadas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF/TOF. Os resultados indicam que a peçonha bruta de B. marmoratus, bem como algumas frações cromatográficas, apresentaram efeitos citotóxicos sobre as linhagens celulares e bactérias utilizadas. As análises por espectrometria de massa de quatro frações de interesse revelaram similaridade com uma fosfolipase A2, uma lectina do tipo-C, uma serinoprotease e com uma metaloprotease. Os resultados apontam para o potencial terapêutico da peçonha de B. marmoratus e evidencia a necessidade de estudos mais aprofundados acerca dos componentes moleculares presentes nessa peçonha. Alguns desses compostos apresentam potencial biotecnológico podendo vir a servir como modelos para o desenvolvimento de novas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Approximately 90% of the bothropic and bothropoic constituents of the venom are proteins, and it is a mixture with a variety of pharmacologically active substances that act to induce pathophysiological changes. Research shows a wide variety of functional and structural components isolated from the venom of snakes capable of providing biological information, with various biotechnological applications, for example, antimicrobial and antitumoral. This work describes the purification, identification and biochemical and biological characterization of proteins with antimicrobial and/or antitumoral activity from the Bothropoides marmoratus venom. Fractionation was performed by HPLC using a C18 reverse phase. The biological activities were carried out with crude venom and with all the chromatographic fractions obtained. The antitumor activity was tested by MTT method against the HeLa (cervical cancer), B16F10 (skin cancer) and against normal lineage NHI3T3 (fibroblasts). The antimicrobial activity assays were performed with five strains of gram-negative and four Gram-positive and all fractions of interest were subjected to a second chromatography for separation of the components present and then were analyzed by mass spectrometry MALDI TOF-TOF . The results show that the crude venom and some fractions caused the death of the cell lines tested and also the bacteria. Analysis by mass spectrometry revealed that the four fractions of interest have a similarity to phospholipase A2, a C-type lectin, a serineprotease and a metalloprotease. The results indicate the therapeutic potential of venom from B. marmoratus and shows the need to better study its components separately. Some components may be unsuitable for immediate use, but have great biotechnological potential serving as models for the development of new drugs.

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T07:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 OliveiraeSilva_SaraguaciHernandezde_D.pdf: 978243 bytes, checksum: 7e35557ec13bc4cdfff9957cdfcaf502 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Este trabalho está dividido em três momentos, o primeiro trata-se de um estudo comparativo do efeito dos venenos brutos de Crotalus durissus terrificus; C. d. ruruima; C. d. cascavella e C. d. collilineatus, bem como da crotoxina e da crotamina sobre a junção neuromuscular. O veneno C. d. ruruima foi purificado pela primeira vez através de HPLC em uma coluna Protein Pack SW 300, onde foi obtida a crotoxina e a crotamina (os demais venenos já foram purificados e os dados publicados). O estudo neurotóxico foi realizado em duas preparações nervo-frênico diafragma de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Dos experimentos realizados em mamíferos e aves obteve-se o efeito neurotóxico esperado nas concentrações de 10 mg/ml. Os venenos brutos e as crotoxinas das serpentes C. d. terrificus e C. d. ruruima em preparações de mamífero produziram aumento da amplitude seguido de bloqueio total da resposta contrátil, diferentemente dos venenos e das crotoxinas das serpentes C. d. cascaavella e C. d. collilineatus, que causaram apenas bloqueio total neuromuscular. Em preparações de aves os quatro venenos e crotoxinas estudados induziram bloqueio total, porém sem causar facilitação. As crotaminas-positivas, estudadas em nervo-frenico diafragma de camundongo das serpentes C. d. terrificus e C. d. ruruima, na concentração de 10 mg/ml, causaram efeito facilitatório retornando à amplitude controle após 120 min de incubação. Ao recombinar a crotoxina 10 mg/ml e crotamina 5 mg/ml houve o aumento da amplitude seguido de bloqueio total da resposta contrátil. Nas preparações ensaiadas em aves, apresentou um efeito facilitatório fugaz seguido de bloqueio neuromuscular total. No segundo momento, as isoformas de crotapotina e PLA2 isoladas a partir da crotoxina dos venenos das serpentes de C. d. terrificus, C. d. cascavella e C. d. collilineatus, foram ensaiadas em mamíferos e aves nas concentrações de 10 mg/ml. As crotapotinas e PLA2 isoladas não causaram diferenças significativas em relação ao controle em preparações de mamíferos. O mesmo não ocorrendo com as PLA2 testadas em aves que causaram bloqueio neuromuscular, efeito este não esperado. Após a recombinação (5 mg/ml crotapotina) + (5 mg/ml PLA2), o complexo crotoxina causou bloqueio neuromuscular total em ambas preparações. Na terceita etapa deste trabalho, foram produzidos antivenenos específicos contra o veneno bruto e crotoxina do veneno C. d ruruima e PLA2 do veneno de C. d. collilineatus. O título de anticorpos e a especificidade dos antivenenos produzidos foram avaliados por ELISA. A neutralização da atividade neurotóxica foi avaliada em preparações biventer cervicis de pintainho. A capacidade neutralizante dos antivenenos produzidos em coelhos foi comparável ao soro anticrotálico comercial contra o veneno e crotoxina na proporção 1:1. O veneno, a crotoxina e os antivenenos estudados induziram liberação de CK significativamente diferente do controle / Abstract: This work is divided at three moments, the first one if terrificus deals with a comparative study of the effect of the crude venoms of Crotalus durissus; C. d. ruruima; C. d. cascavella and C. d. collilineatus, as well as of the crotoxin and the crotamine on the junction neuromuscular. Venoms C. d. ruruima was purified for the first time through HPLC in a column Protein Pack sw 300, where it was gotten the crotoxin and the crotamine (the too much venoms already had been purified and the published data). The neurotoxic study nerve-frênico was carried through in two preparations diaphragm of mouse and to chick biventer cervicis. The experiments carried through in mammals and birds the waited neurotoxic effect in the was gotten concentrations of 10 mg/ml. The crude venoms and the crotoxin of rastnaks C. d. terrificus and C. d. ruruima in preparations of mammal had produced increase of the followed amplitude of complete blockade of the contractil reply, differently of the venoms and the crotoxin of rastnakes C. d. cascavella and C. d. collilineatus, that they had caused only complete blockade to neuromuscular. In preparations of birds the four studied venoms and crotoxin had induced complete blockade, however without causing facilitation. The crotamine-positive, studied in nerve-frenico diaphragm of mouse of snakes C. d. terrificus and C. d. ruruima, in the concentration of 10 mg/ml, had caused facilitatori effect returning to the 120 after amplitude have controlled min of incubation. When crotoxin being recombined 10 mg/ml and 5 crotamine mg/ml had the increase of the followed amplitude of complete blockade of the contractil reply. In the preparations assayed in birds, fast followed of blockade presented a facilitatori effect to neuromuscular complete. At as the moment, isoforms of isolated crotapotin and PLA2 from the crotoxin of the venoms of the rastnakes of C. d. terrificus, C. d. cascavella and C. d. collilineatus, had been assayed in mammals and birds in the concentrations of 10 mg/ml. Isolated crotapotin and PLA2 had not caused significant differences in relation to the control in preparations of mammals. The same not occurring with the PLA2 tested in birds that blockade caused to neuromuscular, effect this not waited. After the recombination (5 mg/ml crotapotin) + (5 mg/ml PLA2), the crotoxin complex caused blockade to neuromuscular complete in both preparations. In the third stage of this work, specific antivenoms against crotoxin the crude venoms and of C. d. ruruima had been produced and PLA2 of the poison of C. d. collilineatus. The heading of antibodies and the especific of the produced antivenoms had been evaluated by ELISA. The neutralization of the neurotoxic activity was evaluated in preparations to chick biventer cervicis. The neutralizing capacity of the antivenoms produced in rabbits was comparable to commercial the anticrotalic serum against the venoms and crotoxin in ratio 1:1. The venoms, the crotoxin and the antivenoms, studied had induced significantly different release of CK of the control / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Submitted by Marcelo Andrade Silva (marcelo.andradesilva@ufpe.br) on 2015-03-05T13:00:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) klsm.pdf: 1468744 bytes, checksum: af744034025d14f7679b8734d13ead88 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T13:00:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) klsm.pdf: 1468744 bytes, checksum: af744034025d14f7679b8734d13ead88 (MD5) Previous issue date: 2012 / A racionalidade mecânico-reducionista, decorrente do mau uso da técnica concebida por Descartes, aliada à absoluta supremacia garantida ao viés econômico dos modelos de desenvolvimento das nações, notadamente as pertencentes ao ocidente, promovem no homem uma racionalidade que o isola e afasta da natureza durante o processo de significação social das relações ambientais. Nessa ótica, os elementos do ecossistema são concebidos como insumos infinitos e instrumentos de acúmulo de riqueza e domínio político. As práticas agrícolas remontam à primeira interferência do homem no meio ambiente e traduzem a própria evolução do conceito social de natureza. A industrialização no mundo incita a produção em larga escala e as petroquímicas apresentam o uso de agrotóxicos como solução para a ampliação e aceleramento dos cultivos. Ocorre que as incertezas, reconhecidas pela própria ciência, e as catástrofes ambientais revelam nas atividades humanas as causas de impactos e conflitos. Com isso, o homem se vê inserido em uma sociedade de constante risco e, na busca por soluções, se instaura uma crise de percepções. O que antes era considerado isoladamente e em função do capital, agora, mostra-se complexo, interdisciplinar e sistêmico, reunindo as principais características do paradigma emergente. Neste contexto, todas as ciências são revistas, inclusive o Direito e suas normas. Com atenção à legislação sobre venenos, evidencia-se que o produto químico tóxico não é tratado como resíduo e, portanto, seu uso contínuo contamina gradativamente o solo, a atmosfera, as águas, a fauna e a flora. O novo paradigma atinge também o Estado e os poderes que o compõem. O Poder Judiciário, em especial análise, ao acompanhar este processo evolutivo se despe das suas práticas exclusivamente positivistas e legalistas para redefenir a função jurisdicional com finalidades não só de dizer o direito, mas aplicar a justiça por meio de decisões com cunho pedagógico e criativo. A medida é necessária, mas requer do juiz uma postura consequencialista em que preveja os efeitos da sentença proferida. O uso de agrotóxicos, por constituir-se, principalmente nos países em desenvolvimento, eminentemente injusto, conflitivo e danoso chega ao Judiciário sob a forma de ações judiciais. É neste momento que o juiz deve praticar o exercício hermenêutico em consonância com as novas configurações de um Estado de Direito Ambiental, previsto nos princípios e preceitos da ambientalização das constituições. Com efeito, os direitos à informação, à comunicação e ao acesso à justiça se revelam essenciais para adoção de práticas efetivamente sustentáveis. Para se chegar a estas conclusões, o presente estudo adotou método dialético para uma pesquisa social crítica, instruindo-se os procedimentos metodológicos com a análise bibliográfica, de processo judicial e de acervo jurisprudencial. A proposta que se pretende construir é a de inclusão das indústrias e das ciências em um novo momento, no qual se consideram que os instrumentos de comando/controle sobre o uso de agrotóxicos e a destinação de suas embalagens são insuficientes quando aliados a políticas de incentivo ao consumo dos produtos. A questão deve envolver processos democráticos de participação pública, essenciais para uma consistente governança ambiental.

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:29:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 OliveiraeSilva_SaraguaciHernandezde_M.pdf: 16002051 bytes, checksum: 69aaf9e7548d45f0055550ca8af3b69d (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: As espécies Crotalus durissus, popularmente conhecidas como cascaveis, são serpentesde grande importância médica na Américado Sul, principalmente no Brasil.A peçonhadessa serpentetem sido objetode estudos por maisde um século,como mostrado pelos estudos realizadospor BRAZIL,1903, SLOTTA & FRAENKEL CONRAT, 1938, VITAL BRAZIL, 1966 e muitos outros. A peçonha crotalica isolada através de gel filtração do veneno bruto em coluna de SephadexG 75, mostraa presença de quatropicos, (pico I) convulxina, (pico II)giroxina, (pico III) crotoxina e (pico IV) crotamina. O pico III foi testado, mostrou seu característico bloqueio neuromuscular em preparação nervo-frênico diafragma de camundongo. Na purificação do veneno bruto crotálico em HPLC de exclusão molecular, usando uma coluna Protein Pack SW 300, obteve-se além dos picos principais três novos componentes do complexo crotoxina picos: cdty III; cdty V e cdty VI, sendo a crotoxina identificada como pico cdty IV. O uso desta cromatografia determinou a dissociação dos efeitos facilitadores e bloqueadores neuromusculares característicos da crotoxina .Assim, o pico cdty III e cdty V exibiram praticamente somente o efeito facilitador da crotoxina (pico cdty IV) nos 120 min de observação. A repurificação da crotoxina em HPLC de fase reversa em coluna µ- Bondapack c 18, resultou em duas isoformas de crotapotina (F 5 e F 7) e três de fosfolipase A2 (F15, F16 e F17). Foram escolhidas as isoformas F7 (crotapotina) e as F16 e F17 (PLA2), as quais foram recombinadas em três diferentes proporções: 1: 1; 1:2 e 2: 1. Ao associarmosa crotapotina(F7) com a PLA2(F16), obtivemos o efeito "chaperone' descrito na literatura ou seja, a inibição da resposta contrátil, o efeito bloqueador irreversível. O mesmo não ocorreu ao recombinarmos crotapotina (F7) com PLA2(F17), o qual não determinou qualquer alteração na resposta contrátil, isto é, mostrou-se destituída de atividade biológica. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The species Crotalus durissus, popularly known as rattle snakes,includis serpents of great medical importance in South America. The poison of that serpent has been object of studies for more than a century, as shown by the studies accomplished by BRAZIL, 1903, SLOTTA & FRAENKELCONRAT, 1938 and VITAL BRAZIL, 1966 and so many others. Through gel filtration of the crude poison in a column SephadexG 75, shows the presence of four picks, (pick I) convulxin, (pick 11)gyroxin, (pick III) crotoxin and (pick IV) crotamine were obtained. Whem the (pick III)crotoxin was tested, in the phrenic nerve-diaphragm preparation it showed the characteristic block neuromuscular effect. Whem Crotalus durissus terrificus (cdty) was subjected to the molecular exclusion chomatograpy (protein pack SW 300) at isocratic conditions, besides the main picks three new components were obtained pick: III V; and VI. Crotoxin was there identified, as pick IV. Able of inducing initial facilitation followed by an irreversible block. Peak cdty III showed a facilitation effect that dures at least 120 mino The Pick V presented a light facilitation and a decrease of the contradile response during the course time of experiments. The use of this chomatograpy determined the dissociation of the facilitatory effects and blocking characteristic neuromuscular of the crotoxin. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia