Na fase ativa da leishmaniose visceral (LV) ocorrem alterações no metabolismo de lipoproteínas com redução dos níveis de HDL e aumento de triglicérides. A partir desses dados, focamos neste projeto essas alterações na progressão da infecção e apontamos alguns elementos como seus possíveis desencadeantes. Como essas alterações poderiam resultar de redução de atividade e expressão da lipoproteína lipase (LPL), do receptor alfa do proliferador ativado de peroxissoma (PPAR?) e da proteína transferidora de ésteres de colesteril (CETP), a sua expressão foi avaliada durante a progressão da LV em hamster. Em hamsteres infectados com 2 x 107 amastigotas de L. (L.) infantum observamos aumento de triglicérides nos hamsteres com 55 dias (mediana = 294,0 mg/dL) e 90 dias (303,0 mg/dL ) de infecção comparados aos controles de 55 dias (119,0 mg/dL) e de 90 dias (117,0 mg/dL) (p <= 0,05). Os níveis de colesterol total e de HDL não apresentaram diferença significante entre controles e infectados com 30, 55 e 90 dias de infecção. A expressão de mRNA de PPAR? no fígado com 55 e 90 dias de infecção apresentou tendência de redução nos infectados. Já de CETP no fígado dos hamsteres com 55 dias de infecção, a expressão relativa (CT) estava reduzida nos infectados (0,08) comparados aos controles (1,69) (p <= 0,05) e de LPL no coração dos hamsteres com 90 dias de infecção também estava reduzida (1,43) com relação aos controles (2,61) (p <= 0,05). Há dados na literatura sugerindo a importância de lipídios para o desenvolvimento de amastigotas no hospedeiro vertebrado e é possível que as alterações dos níveis de lipoproteínas contribuam na progressão da infecção. Assim, avaliamos neste estudo o efeito da droga hipolipemiante ciprofibrato no controle do parasitismo na LV em hamster, sabendo-se que ciprofibratos atuam aumentando a expressão de PPAR? e a produção e atividade de LPL. O tratamento com ciprofibrato nos hamsteres com 55 dias de infecção gerou redução de triglicérides (123,0 mg/dL) em relação aos infectados não tratados (294,0 g/dL) (p <= 0,05), além dos níveis de triglicérides nos animais infectados não tratados terem aumentado quando comparados aos controles não tratados (119,0 mg/dL) (p <= 0,05). Houve também, redução de triglicérides nos animais não infectados tratados com ciprofibrato (89,0 mg/dL) comparando-se aos infectados não tratados (p <= 0,05). Os níveis de colesterol nos hamsteres não infectados tratados com ciprofibrato reduziram (53,5 mg/dL) em comparação aos infectados não tratados (93,0 mg/dL) (p <= 0,05). Já naqueles que foram infectados e tratados com ciprofibrato, constatamos redução de colesterol (53,5 mg/dL) quando comparados aos infectados não tratados (p <= 0,05). Os níveis de HDL não aumentaram com ciprofibrato e foram similares entre os hamsteres infectados não tratados e os controles não tratados. A carga parasitária no baço e no fígado não foi reduzida com ciprofibrato. Na leishmaniose visceral em hamster ocorrem alterações do metabolismo lipídico com aumento de triglicérides e redução da expressão da mRNA de LPL e CETP. O tratamento com ciprofibrato foi eficaz no controle das alterações de níveis de lipoproteínas. / In the active phase of visceral leishmaniasis (VL) changes occur in lipoprotein me-tabolism with reduction in HDL and increase in triglyceride (TG) levels. From these data, in this project we focused these changes during the progression of the infection and we approached some elements as their underlying factors. Since these changes may result from the reduction of the activity and the expression of the lipoprotein lipase (LPL), of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR?) and of the cholesteryl ester transfer protein (CETP), their expression were evaluated during VL progression in hamster. In 2 x 107 L. (L.) infantum amastigote-infected hamsters we observed an increase in the triglycerides in hamsters with 55 days (median = 294.0 mg/dL) and 90 days (303.0 mg/dL) of infection compared with controls of 55 days (119.0 mg/dL) and of 90 days (117.0 mg/dL) (p <= 0.05). The total cholesterol and the HDL levels did not present significant differences between control and in-fected groups at 30, 55 and 90 days of infection. The expression of mRNA of the PPAR in the liver with 55 and 90 days of infection tended to be reduced in infected animals. However the relative expression (CT) of CETP in the liver of hamsters with 55 days of infection was signicantly reduced in infected (0.08) compared with control animals (1.69) (p <= 0.05). The relative expression (CT) of LPL in the heart of hamsters with 90 days of infection was also reduced (1.43) in relation to controls (2.61) (p <= 0.05). There are data in the literature suggesting the importance of lipids for the development of amastigotes in vertebrate host and it is possible that the changes in the lipoprotein levels contribute for the infection progression. Therefore, we evaluated in this study the effect of the lipid-lowering drug ciprofibrate in the control of parasitism in VL in the hamster, knowing that ciprofibrate acts increasing the expression of the PPAR? and of the LPL production and activity. The treatment with ciprofibrate in infected hamsters at 55 days lead to the reduction of triglyceride level (123.0 mg/dL) in relation to non-treated infected animals (294.0 g/dL) (p <= 0.05). Further the triglyceride levels in the non-treated infected animals were in-creased when compared with untreated controls (119.0 mg/dL) (p <= 0.05). There was also reduction of triglyceride in ciprofibrate treated-non infected animals (89.0 mg/dL) compared with non-treated infected animals (p <= 0.05). The cholesterol lev-els were reduced in the ciprofibrate-treated non-infected hamsters (53.5 mg/dL) in comparison to the non-treated infected ones (93.0 mg/dL) (p <= 0.05). In the ciprofibrate-treated infected ones we found a reduction of cholesterol level (53.5 mg/dL) when compared with non treated infected animals (p <= 0.05). The HDL lev-els did not increase with ciprofibrate and they were similar between the non-treated infected hamsters and non-treated controls. The parasite load in the spleen and liver were not reduced with ciprofibrate. In the visceral leishmaniasis in hamster changes occur in the lipid metabolism with increase in the triglyceride level and the reduction of expression of mRNA of LPL and CETP. The treatment with ciprofibrate was ef-fective in the control of changes in the lipoprotein levels.

Introdução: coinfecção Leishmania/HIV representa um grande problema de saúde visto que há maior recidiva e letalidade por leishmaniose visceral na população de pacientes vivendo com HIV/aids. No entanto, pouco se sabe a respeito da frequência da infecção por Leishmania em pacientes assintomáticos com HIV, que podem futuramente desenvolver doença plenamente manifesta. Ademais poucas informações sobre o desempenho dos métodos de diagnóstico laboratorial de leishmaniose em pacientes coinfectados estão disponíveis no Brasil e na América Latina. Objetivos: avaliar a frequência da infecção por Leishmania spp. em pacientes com HIV/aids em uma coorte de São Paulo/SP, a positividade dos métodos sorológicos e moleculares em pacientes com HIV/aids e as possíveis associações da positividade dos diferentes métodos laboratoriais com variáveis clínicas, laboratoriais e epidemiológicas. Material e métodos: estudo transversal, realizado com pacientes atendidos no Instituto de Infectologia Emílio Ribas com diagnóstico de infecção pelo HIV. A amostra foi calculada com base na prevalência da infecção por Leishmania spp. em pacientes com HIV/aids, estimada em estudos prévios. Foram incluídos 240 pacientes nesta amostragem, os quais foram submetidos à coleta de sangue periférico em dois tubos: um tubo seco para análise sorológica; um tubo contendo EDTA, para o diagnóstico molecular. As amostras foram submetidas aos seguintes testes diagnósticos: ELISA usando antígenos de L. major-like (ELISA L. major-like); ELISA usando antígenos de Leptomonas seymouri (ELISA Leptomonas); ELISA usando antígenos rk39 (ELISA rK39); ELISA usando antígenos rK28 (ELISA rK28); Reação de imunofluorescência indireta (RIFI); Teste de Aglutinação Direta (DAT); Reação em cadeia da polimerase (PCR) com os seguintes genes alvos: kDNA (PCR kDNA) e ITS-1 (PCR ITS-1). Resultados: a frequência, levando-se em consideração a positividade em pelo menos um dos métodos empregados, foi de 34,6%. Sessenta pacientes (25%) foram positivos para ELISA L. major-like; nove (3,8%) para ELISA Leptomonas; três (1,3%) para ELISA rK39; seis (2,5%) para ELISA rK28; onze (4,6%) para RIFI; quatro (1,7%) para PCR kDNA; 10 (4,2%) para PCR ITS-1. Nenhuma amostra foi positiva para DAT. Não houve associação da positividade dos testes com contato com área endêmica para LV ou presença de sintomas sugestivos de LV. Para ELISA L.major-like, ELISA Leptomonas e RIFI, houve associação entre valores de contagem de linfócitos T CD4+ e positividade dos testes. Conclusões: Houve uma alta prevalência da infecção por Leishmania spp. em pacientes infectados pelo HIV na amostra estudada, principalmente utilizando-se ELISA com antígeno total de L. major-like. Apesar de existir a possibilidade de reação cruzada com outros antígenos que possam ter influenciado na positividade de alguns testes, especialmente ELISA L. major-like, outros testes considerados altamente específicos para o diagnóstico de infecção por Leishmania também se apresentaram positivos, o que pode demonstra a magnitude da coinfecção Leishmania/HIV na amostra estudada. Houve associação entre positividade de alguns testes estudados e os valores de linfócitos T CD4+, com maior positividade destes testes em pacientes mais imunodeprimidos. Presença de sintomatologia ou epidemiologia para LV não tiveram influência na positividade dos testes diagnósticos / Introduction: Leishmania/HIV coinfection represents a major health problem since there is greater relapse and lethality due to visceral leishmaniasis in HIV infected population. However, there are few information about the frequency of Leishmania infection in asymptomatic HIV infected individuals, who may develop full-blown symptomatic disease in the future. In addition, few information about the performance of laboratory diagnostic methods for leishmaniasis in coinfected patients are available in Brazil and Latin America. Objectives: The main objective is evaluate the frequency of Leishmania spp. infection in HIV infected patients in a patient cohort from São Paulo/SP. This study also aims to evaluate the positivity of the serological and molecular methods in HIV/AIDS patients and the possible associations of the positivity of the different laboratory methods regarding to clinical, laboratory and epidemiological variables. Material and methods: a cross-sectional study including HIV infected patients treated at Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas. The sample was calculated considering the frequency of Leishmania spp. infection in HIV infected patients estimated in previous studies. Two hundred and forty patients were included, whose were submitted to peripheral blood collection in two tubes: a dry tube for serological analysis; a tube containing EDTA, for molecular diagnosis. The samples were submitted to the following diagnostic tests: ELISA using L. major-like antigens (ELISA L. major-like); ELISA using Leptomonas seymouri antigens (ELISA Leptomonas); ELISA using rk39 antigens (ELISA rK39); ELISA using rK28 antigens (ELISA rK28); indirect fluorescent-antibody test (IFAT); direct agglutination test (DAT); polymerase chain reaction (PCR) with the following target genes: kDNA (kDNA PCR) and ITS-1 (ITS-1 PCR). Results: the frequency considering at least one test positive was 34.6%. Sixty patients (25%) were positive by ELISA L. major-like; nine (3.8%) by ELISA Leptomonas; three (1.3%) by ELISA rK39; six (2.5%) by ELISA rK28; eleven (4.6%) by IFAT; four (1.7%) by kDNA PCR; 10 (4.2%) by ITS-1 PCR. No sample was positive by DAT. There was no association between the positivity of the tests and history of having lived in a VL transmission area or presence of symptoms suggestive of VL. For ELISA L.major-like, ELISA Leptomonas and IFAT, there was an association between CD4+ T-lymphocyte counts and test positivity. Conclusions: there was a high prevalence of Leishmania spp. in HIV-infected patients included, mainly using ELISA with total L. major-like antigen. Although there is a possibility of cross-reaction with other antigens that can influence the positivity of some tests, especially ELISA L. major-like, other tests considered to be highly specific for the diagnosis of Leishmania infection were also positive, which may demonstrate the magnitude of Leishmania/HIV coinfection in the sample studied. There was an association between the positivity of some tests studied and the values of T CD4+ lymphocytes, with a higher positivity of these tests in more immunosuppressed patients. Presence of symptoms or epidemiology for VL had no influence on the positivity of the diagnostic tests

Infection is the major complication for neutropenic patients, and cause of morbidity and mortality. Clinical signs are nonspecific and fever may be a late marker for the early use of antibiotics, which may complicate the prognosis. The approaches of most protocols focus on adult patients. Thus, to improve safety in the clinical approach in pediatric neutropenic patients, this work was performed in order to evaluate biomarkers involved in the inflammatory response in pediatric patients. In the period 2010 to 2012 were included 70 children with neutropenia with neutrophil count ≤ 1000 cells / mm ³, 35 pediatric patients with visceral leishmaniasis (VL) and 35 patients with onco-hematological disease, ranging in age from 0 to 18, from the oncology service of the Hospital Emergency ward Segipe and Pediatrics Diseases, University Hospital of Sergipe. Serum levels of biomarkers were evaluated following: Interferon gamma (IFN-γ), interleukin-5 (IL-5), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), lactate, ultrasensitive CRP (hsCRP), nprocalcitonina (PCT) and Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α). The results showed that the average of the groups was no significant difference with biomarkers IFN-γ, IL-10 and TNF-α with p <0.001, IL-5 and p = 0.020, p = 0.002 with lactate and p = 0.011 PCT The hsCRP and IL-6 did not show statistical significance. Correlating CAN groups with the average of biomarkers, there was no statistical significance. This study suggests that biomarkers biomarkers that IFN-γ, IL-5, IL-10, lactate, procalcitonin and TNF-α, laboratory values showed a significant difference between the group of patients neutropenic patients with LV disease and onco- hematologic, this is not happening with the results presented by biomarkers IL-6 and hsCRP, leading us to observe that although the groups have in common neutropenia, interpretation of these biomarkers should be performed separately for each group. Except for lactate and procalcitonin, all other biomarkers showed increased results when comparing the mean of the two groups, which leads us to conclude that studies with larger numbers of subjects are important to verify the use of IFN-γ biomarkers, IL- 5, IL-6, IL-10 and TNF-α in the diagnosis of infection in neutropenic patients. / A infecção constitui a maior complicação para o paciente neutropênico, sendo causa de morbidade e mortalidade. Sinais clínicos são inespecíficos e febre pode ser um marcador tardio para início do uso de antibióticos, podendo complicar o prognóstico. As abordagens da maioria dos protocolos focam-se em pacientes adultos. Desta forma, para reforçar a segurança na abordagem clínica em pacientes neutropênicos pediátricos, foi realizado este trabalho com o objetivo de avaliar os biomarcadores envolvidos na resposta inflamatória em pacientes pediátricos. No período de 2010 a 2012 foram incluidos 70 crianças portadoras de neutropenia, com contagem de neutrófilos ≤ 1000 cel/mm³, sendo 35 pacientes pediatricos portadores de Leishmaniose visceral(LV) e 35 portadores de doença onco-hematológica , com idade variando de 0 a 18 anos, oriundos do serviço de oncologia do Hospital de Urgência de Sergipe e da enfermaria de Pediatria do Hospital Universitário de Sergipe. Os níveis séricos dos seguintes biomarcadores foram avaliados: Interferon gamma (IFN-γ), Interleucina-5(IL-5), interleucina-6(IL-6), interleucina-10(IL-10), lactato, Proteina C Reativa ultrassensível(PCR-US),procalcitonina(PCT) e Fator de Necrose Tumoral alfa(TNF-α) . Os resultados mostraram que na média dos grupos estudados houve diferença significativa com os biomarcadores IFN-γ, IL-10 e TNF-α com p <0,001, IL-5 com p=0,020, lactato com p=0,002 e PCT com p=0,011 A PCR-US e a IL-6 não apresentaram estatiscamente significância. Correlacionando a CAN dos grupos com a média dos biomarcadores, não foi observado significancia estatística. Este trabalho sugere que os biomarcadores que os biomarcadores IFN-γ, IL-5, IL-10, lactato, procalcitonina e TNF-α, apresentaram valores laboratoriais com diferença significativa entre o grupo de pacientes neutropênicos portadores de LV e doença onco-hematológica, o mesmo não acontecendo com os resultados apresentados pelos biomarcadores IL-6 e a PCR-US, levando-nos a observar que apesar dos grupos terem a neutropenia em comum, a interpretação destes biomarcadores deve ser realizada de forma distinta para cada grupo. Excetuando-se o lactato e a procalcitonina, todos os demais biomarcadores apresentaram resultados aumentados quando comparadas as médias dos dois grupos, fato que nos faz concluir que estudos com um número maior de indivíduos são importantes para verificar o uso dos biomarcadores IFN-γ, IL-5, IL-6, IL-10 e TNF-α no diagnóstico de infecção em pacientes neutropênicos.

Introduction: Human Visceral Leishmaniasis (HVL) is a major public health problem in Brazil with more than 3,500 new cases per year and can lead to death if not treated. The gold standard for diagnosis is the parasitological test, but it is an invasive, expensive technique, and does not present ideal sensitivity. The serologic Indirect Immunofluorescence test is available in the public health system, however, this low sensitive that technique that requires time, equipment. Currently, there has been an investment in the development of rapid immunochromatographic tests that show good sensitivity and specificity, in addition to being faster, practical and economical. The rK39 is the immunoassay currently used for the diagnosis of HVL and has international production. Methodology: This study evaluated three new rapid immunochromatic tests (TRs) for screening of HVL, these tests were produced by Gonçalo Moniz Research Center (Fiocruz). The three tests were identified as: Test 1, comprising the recombinant antigen Lci1A; Test 2, formed by the recombinant antigen Lci2B; and Test 3, comprising the conjugate of the two antigens. A total of 159 sera from different individuals were used. The group "cases" consisted of 79 sera from patients diagnosed with VL, it considered compatible clinical symptoms (fever associated with splenomegaly and hepatomegaly), bone marrow culture and / or rK39 positive test, pancytopenia and therapeutic success. The group of "non-cases" consisted of 90 sera from patients with other diseases and healthy people. Results: The sensitivity values were good for the three tests (over 90%), but the specificity of test 1 was very low (10,0%). As for tests 2 and 3, the specificities were 90.0% and 83.3%, respectively. Conclusion: The results indicate that both test 2 has potential for use as diagnostic screening for VL in humans. / Introdução: A leishmaniose visceral humana (LVH) é um importante problema de saúde pública no Brasil com mais de 3.500 novos casos anuais e pode ser fatal quando não tratada. O padrão-ouro para diagnóstico é o teste parasitológico, porém é uma técnica invasiva, dispendiosa, além de não apresentar sensibilidade ideal. No Sistema público de Saúde é disponibilizado o teste sorológico Imunofluorescência Indireta, entretanto, é uma técnica que demanda tempo, equipamentos, pessoal treinado e também apresenta sensibilidade limitada. Os testes imunocromatográficos rápidos, apresentam boa sensibilidade, especificidade, além de práticos, rápidos e econômicos. O mais utilizado é o rK39 (produto importado). Portanto, é de grande valia ter outro teste equivalente com produção nacional, a fim de ter outra alternativa com igual eficiência e com menor custo. Metodologia: no estudo atual foram avaliadostrês testes imunocromatográficos rápidos (TRs) para o diagnóstico da LVH. Os testes foram produzidos pelo Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz (Fiocruz) e identificados como teste 1, constituído pelo antígeno recombinante Lci1A; teste 2, formado pelo antígeno recombinante Lci2B e teste 3 composto pelo conjugado dos antígenos citados. O grupo de casos foi composto por 79 soros de pacientes com diagnóstico de LV, a partir de clínica compatível (febre associada a esplenomegalia e hepatomegalia), mielocultura e/ou rK39 positivos, pancitopenia e sucesso terapêutico. O grupo de não casos foi formado por 90 soros de pacientes com outra patologia e pessoas sadias. Resultados: os valores de sensibilidade foram bons para os três testes (acima de 90%), porém a especificidade do teste 1 foi muito baixa (10,0%), já para os testes 2 e 3, as especificidades foram 90,0% e 83,3%, respectivamente. Conclusão: Os resultados mostram que o teste 2 apresenta potencial para utilização como triagem diagnóstica da LVH.

Leishmaniasis is a serious public health problem worldwide, requiring effective measures for its control and treatment. Visceral leishmaniasis is the most severe form and has a lethal potential. Depending on the interaction between the parasite and the host immune response, different clinical manifestations may develop: asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic. Macrophages play a central role in immune response. However, their microbicidal activity may be impaired, leading to the survival and proliferation of the parasites inside them. The objective of this study was to evaluate the leishmanicidal activity of macrophages isolated from treated and asymptomatic visceral leishmaniasis subjects after infection by Leishmania chagasi. Our hypothesis was that macrophages isolated from treated subjects were more susceptible to infection by Leishmania chagasi in relation to asymptomatic patients. From a cross-sectional study, 05 symptomatic patients and 02 asymptomatic were investigated at University Hospital. Mononuclear cells were isolated from peripheral blood of 07 patients in order to obtain monocytes and further differentiation into macrophages. These were infected with the isolated LVHSE-07 from L. chagasi for 2, 72 and 96 hours in conditions with and without stimulus of LPS and IFN-. To examine whether macrophages responded differently to the symptomatic patient's own Leishmania, 03 symptomatic and 02 asymptomatic patients were reconvened, so that their macrophages would be infected with Leishmania from symptomatic patients (LVHSE-24, LVHSE-28, LVHSE-37). Leishmanicide response of macrophages was assessed by determining the percentage of infected macrophages and the number of amastigotes inside macrophages. The results suggest that the macrophages of the symptomatic patients were more infected, especially when used patient's own Leishmania, and they did not control infection, even in the presence of stimulus, unlike asymptomatic's macrophages, which controlled infection, independently of what Leishmania was used. This study demonstrated that macrophages from symptomatic patients are more susceptible to infection by Leishmania chagasi, when compared with macrophages from asymptomatic patients; macrophages from symptomatic patients are more infected with their own isolated of L. chagasi; macrophages from asymptomatic patients are less infected with L. chagasi and have a parasitic load lower than the macrophages of symptomatic patients, regardless of the Leishmania isolated used in infection. It follows that macrophages are related to susceptibility or resistance to infection by Leishmania chagasi. / As leishmanioses são um grave problema de saúde pública no mundo, demandando medidas eficazes no seu controle e tratamento. A leishmaniose visceral é a forma mais grave e pode ser letal, caso não seja tratada. A depender da interação entre o parasita e a resposta imune do hospedeiro, podem-se desenvolver diferentes manifestações clínicas: forma assintomática, oligossintomática e sintomática. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune. Entretanto, suas atividades leishmanicidas podem estar prejudicadas, levando à sobrevivência e proliferação dos parasitas no seu interior. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a atividade leishmanicida de macrófagos infectados por Leishmania chagasi isolados de indivíduos tratados e assintomáticos para Leishmaniose visceral. A nossa hipótese era que macrófagos isolados de indivíduos tratados eram mais susceptíveis à infecção por Leishmania chagasi em relação aos de pacientes assintomáticos. A partir de um estudo transversal, foram investigados 05 indivíduos tratados e 02 assintomáticos do Hospital Universitário. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas dos 07 pacientes para obtenção de monócitos e posterior diferenciação em macrófagos. Estes foram infectados com o isolado LVHSE-07 de L. chagasi durante 2, 72 e 96 horas em condições sem e com estímulo de LPS e IFN-. Para analisar se os macrófagos respondiam de maneira diferenciada com a Leishmania do próprio indivíduo tratado, foram reconvocados 03 tratados e 02 assintomáticos para infectar seus macrófagos com as Leishmanias dos tratados (LVHSE-24, LVHSE-28, LVHSE-37). A resposta leishmanicida dos macrófagos foi analisada determinando-se o percentual de macrófagos infectados e o número de amastigotas no interior dos macrófagos. Os resultados sugerem que os macrófagos dos indivíduos tratados foram mais infectados, principalmente quando utilizada a Leishmania do próprio indivíduo, e não controlaram a infecção mesmo na presença do estímulo, ao contrário dos macrófagos dos assintomáticos que sugerem um controle da infecção independente da Leishmania utilizada. Este estudo mostrou que macrófagos de indivíduos tratados são mais susceptíveis à infecção por Leishmania chagasi quando comparados com macrófagos de pacientes assintomáticos; macrófagos indivíduos tratados são mais infectados com seus próprios isolados de L. chagasi; macrófagos de pacientes assintomáticos são menos infectados por L. chagasi e apresentam uma carga parasitária menor que os macrófagos de indivíduos tratados independente do isolado de Leishmania utilizado na infecção. Conclui-se que os macrófagos estão relacionados com a susceptibilidade ou resistência à infecção por Leishmania chagasi.

Orientadora: Profa. Dra. Mirela Inês de Sairre / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / As licochalconas estão naturalmente presentes na raiz de Glycyrrhiza inflata (alcaçuz) e apresentam atividades biológicas, como antitumoral, antiparasitária, anti-oxidativa e bactericida. A licochalcona "A" apresentou atividade anti-leishmania, o que despertou o interesse em investigar e testar o uso para tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC), uma zoonose grave que atinge os cães domésticos, os quais são sacrificados em virtude da falta de uma terapia eficiente. O objetivo deste trabalho é realizar a síntese total da Licochalcona "A" a partir de um reagente comercial de baixo custo, empregando uma rota sintética de quatro etapas. A síntese inclui uma reação de rearranjo sigmatrópico e a clássica condensação de Claisen-Schmidt, etapas que foram estudadas para encontrar condições reacionais catalíticas apropriadas e de grande viabilidade de execução. Além da licochalcona A, diferentes análogos poderiam ser obtidos. Este trabalho está vinculado à empresa Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda e, portanto, se insere dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico com vínculos estreitos aos interesses da indústria farmacêutica, da medicina veterinária e do setor produtivo. Realizou-se um estudo detalhado das quatro etapas da rota, testando diferentes condições reacionais. A etapa de reação de prenilação foi realizada empregando diversos substratos para, em seguida, desenvolver um estudo sobre condições reacionais em rearranjos sigmatrópicos-[3,3]. Os produtos das reações de prenilação foram obtidos com sucesso e rendimentos moderados (47- 68%). Na etapa de condensação de Claisen-Schmidt, uma chalcona prenilada desejada foi obtida com sucesso, para a síntese de um análogo da Licochalcona A, mas a etapa final de rearranjo não foi conclusiva. / Licochalcones are naturally present in the root of Glycyrrhiza inflata (licorice) and have many biological activities, such as antitumor, antiparasitic, anti-oxidative and bactericidal. Licochalcone "A" showed anti-leishmania activity, which aroused interest in investigating and testing it for the treatment of canine visceral leishmaniasis (LVC), a serious zoonosis that affects domestic dogs, which are sacrificed due to the lack of an effective therapy. This work aimed to perform the total synthesis of Licochalcone "A" from a low cost commercial reagent using a four step synthetic route. The synthesis includes a sigmatropic rearrangement reaction and the classical Claisen-Schmidt condensation, steps that were studied to find suitable catalytic reaction conditions and viable execution. Besides licochalcone A, different analogues could be obtained. This work is linked to the Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda company and, therefore, falls within a perspective of promoting scientific and technological development with close links to the interests of the pharmaceutical industry, veterinary medicine and the productive sector. A detailed study of the four stages of the route was carried out, testing different reaction conditions. The prenylation reaction step was performed employing several substrates to then develop a study on reaction conditions in sigmatropic rearrangements-[3,3]. The products of the prenylation reactions were obtained with success and moderate yields (47-68%). In the condensation step of Claisen-Schmidt, a desired prenylated chalcone was obtained for the synthesis of an analogue of Licochalcone A, but the final step of rearrangement was not conclusive.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In the present study, the sera levels of soluble CD40 ligand (sCD40L) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) were quantified by Luminex assay in Visceral leishmaniasis patients before and during treatment follow-up and after regular antimony treatment and also in individuals exposed to infection, living in endemic areas. Different from the other molecules present in sera from classic VL patients, sCD40L and MMP-9 are fairly increased, and increase over time during the follow-up of VL patients undergoing antimony treatment. sCD40L and MMP-9 sera levels were also high in individuals living in endemic settings at high risk of infection (endemic controls). On the other hand, sCD40L and MMP-9 were not observed in sera from non-endemic controls, which are not exposed of infection. Additionally, negative correlations were found between spleen sizes and MMP-9 before treatment and sCD40L at day 15 of treatment. Negative correlations were also found between parasite load with both sCD40L and MMP-9. These findings indicate that both molecules can be used in monitoring therapeutic efficacy in VL. Furthermore, these data suggest a protective effect of these molecules, since the individuals exposed to infection without the symptoms of disease have high sera levels of sCD40L and MMP-9. These data were published in BMC Infectious diseases journal [1]. To confirm the protective effect of sCD40L present in sera of VL patients and determine if this molecule had biological activity, the ability of sera from patients containing high levels of this molecule sCD40L to control infection in vitro in Leishmania infantum infected macrophages, and the ability to induce cytokines production. Thereby, macrophages from of healthy donor were infected with Leishmnia infantum, and later incubated in presence of sera from individuals exposed to infection in presence of anti-CD40L. The infection was evaluated by counting of the number of infected macrophages/100 and the number of intracellular amastigotes/100 macrophages. The data showed that serum sCD40L decrease the number of infected macrophages and the number of intracellular amastigotes. The blockage of sCD40L activity with specific antibody, increase the infection. Moreover, the analysis of cytokines in supernatant of these macrophage cultures by Luminex assay demonstrated that sCD40L induces the IL-12, IL-23, IL-27, IL-15 e IL-1 production. The levels of these cytokines is inversely correlated with infection rate and the number of intracellular parasites from infected macrophages. A second manuscript with these data were published in PLOS One [2] . These results demonstrated that serum sCD40L from individuals exposed to VL improve the microbicide effect and the inflammatory cytokine production, suggesting its potential use in VL immunotherapy. Nevertheless, there is still a long way to be approached in future experimental and clinical studies. / No presente estudo, os níveis séricos dos marcadores inflamatórios CD40 ligante solúvel (sCD40L) e da metaloproteinase de matrix-9 (MMP-9) foram quantificados por Luminex nos pacientes com leishmaniose visceral antes, durante e após o tratamento com antimonial, e em indivíduos controles expostos à infecção, residindo em áreas endêmicas. Ao contrário das outras moléculas inflamatórias presentes nos soros de pacientes com LV, as moléculas sCD40L e MMP-9 apresentaram elevação moderada, havendo um aumento significativo de ambas no decorrer do tratamento com antimonial. Níveis séricos elevados de sCD40L e MMP-9 também foram encontrados nos indivíduos controles sem doença, provenientes de áreas endêmicas e expostos a infecção. Entretanto, o sCD40L e a MMP-9 não foram detectados nos soros de indivíduos de áreas não endêmicas, os quais não estão expostos a infecção. Adicionalmente, correlações negativas entre o tamanho do baço com a MMP-9 antes do tratamento e com o sCD40L 15 dias após o início do tratamento foram observadas, bem como correlações negativas entre ambas as moléculas com a carga parasitaria dos pacientes. Estes resultados indicam que estas moléculas podem ser utilizadas no monitoramento da eficácia terapêutica na leishmaniose visceral. Além disso, estes dados nos sugerem um efeito protetor dessas moléculas contra a doença, desde que os indivíduos expostos e sem a doença apresentaram concentrações elevadas dessas moléculas. Estes dados foram publicados no BMC Infectious diseases [1]. Para confirmar o efeito protetor do sCD40L e investigar se a molécula presente nos soros dos pacientes com LV tinha atividade biológica, foi avaliado se o sCD40L presente no soro dos indivíduos infectados teria ação na resposta leishmanicida e na produção de citocinas por macrófagos infectados por Leishmania infantum. Dessa forma, macrófagos de doadores normais foram infectados com L. infantum e posteriormente incubados com soro de indivíduos expostos a infecção na presença de anti-CD40L. A avaliação da infecção através da contagem de células infectadas e do número de parasitas intracelulares demonstrou que a presença do sCD40L sérico diminui o número de macrófagos infectados e o número de amastigotas intracelulares. O bloqueio da atividade do sCD40L com anticorpo específico reverteu este efeito, aumentando a infecção. Além disso, a análise de citocinas no sobrenadante das culturas de macrófagos por Luminex mostrou que a adição de sCD40L induziu a produção de IL-12, IL- 23, IL-27, IL-15 e IL-1. As concentrações destas citocinas correlacionaram-se inversamente com as taxas de infecção e com o número de parasitas intracelulares nos macrófagos infectados. Um segundo artigo com estes resultados foi publicado na PLOS One [2]. Estes resultados demonstram que o sCD40L sérico dos indivíduos expostos à LV melhora a capacidade microbicida e a produção de citocinas inflamatórias, sugerindo seu potencial uso na imunoterapia na LV humana, embora este seja um longo caminho a ser abordado em estudos futuros experimentais e clínicos.

Visceral leishmaniasis constitutes a serious public health problem in the world, demanding effective measures for its control and treatment. The current treatments are far from ideal for the need for prolonged treatment, development of drug resistance and significant side effects. Thus the search for new therapeutic options in addition to evaluating the effectiveness of adjuvant therapy is very important. The aim of this study was to evaluate biomarkers sCD40L and clinical outcome in the adjuvant treatment of human visceral leishmaniasis with N-acetylcysteine. From an intervention study, kind clinical trial, blinded, randomized, were investigated 60 patients from the University Hospital with a positive diagnosis for acute visceral leishmaniasis. These patients were divided into two groups of 30: Study Group - which made use of antimony penta valent standard dose supplemented with N-acetyl-L-cysteine and the control group - which only used the standard dose antimony. The serum levels of soluble ligand sCD40L were significantly higher elevation and steeper over time in SbV + NAC group compared to the Sb group. Furthermore, the distribution of values sCD40L significantly increased in both groups after 15 days of treatment, thereafter no significant change over time. Likewise the size of the spleen, and serum cytokine levels (TNF-α, IL-10, IL-12p40) decreased during treatment in both groups while the number of neutrophils, eosinophils and platelets increased. Several published studies indicate the importance of CD40 / sCD40L interaction for an effective immune response and that this interaction occurs via reciprocal signaling through protein kinase-induced phosphorylation of MAPK p38 and ERK1 / 2 mitogen. Other studies show as a strategy of evading the immune response and the establishment of infection, Leishmania inhibits p38 MAPK signaling triggered by CD40. And the glutathione redox system regulates the production of IL-12 induced by LPS through the activation of p38 MPAK, and furthermore, the effect initiation of IFN-γ and IL-12 is in part a consequence of the equilibrium glutathione redox. NAC was able to increase serum sCD40L concentrations throughout treatment. Treatment with NAC improved the patients´ clinical parameters associated with the prognosis of the patients: reduced spleen size increased number of neutrophils / lymphocytes and eosinophils faster. The results suggest that the addition of NAC to conventional therapy improves the immune response of patients, particularly in the reduction of serum IL-10, IL-12p40 and increase in sDC40L that this response occurs as early as two weeks. It is likely that increased levels of sCD40L the NAC occurs through the activation of p38 MAPK pathway glutathione redox system. / A leishmaniose visceral constitui-se um grave problema de saúde pública no mundo, demandando medidas eficazes no seu controle e tratamento. A terapêutica atual está longe de ser a ideal pela necessidade de tratamentos prolongados, desenvolvimento de resistência aos medicamentos e efeitos colaterais significativos. Desse modo a busca de novas opções terapêuticas além de avaliação da eficácia de terapêutica adjuvante é muito importante. O objetivo deste trabalho foi avaliar biomarcadores de evolução clínica e CD40 ligante solúvel (sCD40L) no tratamento adjuvante da leishmaniose visceral humana com N-acetilcisteína. A partir de um estudo de intervenção, tipo ensaio clínico, cego, aleatorizado, foram investigados 60 pacientes do Hospital Universitário com diagnóstico positivo para leishmaniose visceral aguda. Esses pacientes foram distribuídos em dois grupos de 30: Grupo Estudo que fez uso do antimônio penta valente dose padrão complementado com o N-acetil-L-cisteína e o Grupo Controle - que fez uso apenas do antimônio dose padrão. Os níveis séricos do sCD40L foram significativamente maiores e com elevação ao longo do tempo mais acentuada no grupo SbV + NAC em relação ao grupo SbV. Além disso, a distribuição dos valores de sCD40L aumentaram significativamente em ambos os grupos a partir de 15 dias de tratamento, a partir de então sem variação significativa ao longo do tempo. Do mesmo modo a dimensão de baço e níveis séricos de citocinas (TNF-α, IL-10, IL-12p40) diminuíram ao longo do tratamento nos dois grupos enquanto o número de neutrófilos, eosinófilos e plaquetas aumentaram.Vários estudos da literatura assinalam a importância da interação CD40/sCD40L para uma efetiva resposta imune e que essa interação ocorre por meio de sinalização recíproca através de fosforilação da proteína quinase mitógeno induzida de MAPK p38 e ERK1/2. Outros estudos mostram como uma estratégia de evasão da resposta imune e o estabelecimento de infecção, a Leishmania inibe a sinalização p38MAPK acionada pelo CD40. E que o sistema redox de glutationa regula produção de IL-12 induzida pela LPS através da ativação da p38 MPAK e, além disso, o efeito de iniciação de IFN-γ e a produção de IL-12 é em parte uma conseqüência do equilíbrio redox da glutationa. O NAC foi capaz de aumentar as concentrações séricas de sCD40L ao longo do tratamento. O tratamento com NAC melhorou os parâmetros clínicos dos pacientes associados com o prognóstico dos pacientes: reduziu tamanho do baço, aumento do número de neutrófilos/linfócitos e eosinófilos mais rapidamente. Os resultados sugerem que a adição do NAC ao tratamento convencional melhora a resposta imunológica dos pacientes, sobretudo na diminuição dos níveis séricos de IL-10, IL-12p40 e na elevação da sDC40L que essa resposta ocorre já a partir de duas semanas. É provável que o aumento dos níveis de sCD40L pelo NAC ocorra através da ativação do MAPK p38 via o sistema redox de glutationa.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious infectious disease and is increasing geographical expansion and urbanization. patterns of transmission of the disease are altered due to human actions. The dog is considered the main reservoir of the parasite. The development of the disease depends in part on the host immune system. Neutrophils are considered the first line of defense against pathogens and important agents in the control of LV. These cells have an additional mechanism to eliminate microorganisms that occur with the release of extracellular networks (Neutrophil Extracellular Traps -NETs). This work has two overall objectives, the first being an epidemiological study of LV in Sergipe and the second evaluation of NETs formation in human neutrophils and dogs with LV stimulated with L. infantum, so this thesis was divided into chapters, for better understanding. Epidemiological evaluation were used SINAN data and serosurveys canines Zoonosis Aracaju-SE. A descriptive analysis of the data and construction of distribution maps of disease was performed. Sergipe Aracaju and from 2008 to 2014 the incidence rate in humans with LV increased and the percentage of infected dogs has doubled in the capital. The percentage of cases positive for human VL by sex, according to the age of the patient group, showed that over 15 years the disease affects more males. The spatial distribution analysis allowed to view areas of the city with the highest concentration of human and canine VL. The neighborhoods located in poor areas or growing areas were those with the highest incidence of the disease in humans and dogs. The results show that presents endemicity for human and canine VL. In order to evaluate the formation of NETs were used human groups: Control; LV treated and positive DTH. The dogs were divided into control; Asymptomatic and symptomatic. Neutrophils were isolated from patients with LV University Hospital / UFS and dogs diagnosed with VT by Zoonoses were incubated with and without stimulation of parasite and NETs measures in the supernatant of the cultures after 90 minutes. The parasitic load determined after 24 and 48 hours of interaction with neutrophils treated by the limiting dilution technique. In the evaluation of NETs induction of human neutrophils and release dogs with LV greater amount of NETs when stimulated with L. infantum. When compared between the groups individuals positive DTH release fewer NETs stimulated or not with the parasite. At 24 and 48 hours LV treated subjects have a higher parasite load and showed positive DTH fewer parasite than the other groups tested. Dogs with LV release signals greater amount of NETs when stimulated with L. infantum and have higher parasitic load after 48 hours. It is observed that the release of NETs and control of parasitic load by neutrophils varies according to the clinical form of the LV, in humans and dogs. / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença infecciosa grave e está em crescente expansão geográfica e urbanização. Os padrões de transmissão da doença são alterados devido às ações antrópicas. O cão é considerado o principal reservatório do parasito. O desenvolvimento da doença depende em parte do sistema imune do hospedeiro. Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do organismo contra agentes patogênicos e importantes no controle da LV. Estas células têm um mecanismo adicional para eliminar microorganismos que ocorre com a liberação de redes extracelulares (Neutrophil Extracelular Traps -NETs). Este trabalho teve dois objetivos gerais, sendo o primeiro um estudo epidemiológico da LV em Sergipe e o segundo a avaliação da formação de NETs em neutrófilos de humanos e cães com LV estimulados com L. infantum, assim essa tese foi dividida em capítulos, para melhor compreensão. Na avaliação epidemiológica foram utilizados dados do SINAN e inquéritos sorológicos caninos do Zoonoses de Aracaju-SE. Foi realizada uma análise descritiva dos dados e construção de mapas de distribuição da doença. Em Sergipe e Aracaju de 2008 a 2014 o coeficiente de incidência em humanos com LV aumentou e o percentual de cães infectados dobrou na capital. A porcentagem de casos positivos para LV humana por sexo, de acordo com a faixa etária do paciente, mostrou que acima de 15 anos a doença acomete mais o sexo masculino. A análise de distribuição espacial permitiu visualizar áreas da cidade com maior concentração de LV humana e canina. Os bairros situados em áreas com situação econômica desfavorável ou em zonas de expansão foram os que apresentaram maior incidência da doença em humanos e cães. Os resultados demonstram que apresenta caráter endêmico para a LV humana e canina. Com a finalidade de avaliar a formação de NETs foram utilizados grupos humanos: Controle; Tratados LV e DTH positivos. Os cães foram divididos em: Controle; Assintomáticos e sintomáticos. Foram isolados neutrófilos de pacientes com LV do Hospital Universitário/UFS e de cães diagnosticados com LV pelo Zoonoses foram incubadas, com e sem estímulo do parasito e NETs medidas no sobrenadante das culturas após 90 minutos. A Carga parasitária determinada após 24 e 48 horas de interação com neutrófilos tratados, através da técnica de diluição limitante. Na avaliação da indução de NETs, os neutrófilos de humanos e cães com LV liberam maior quantidade de NETs quando estimulados com L. infantum. Quando comparado entre os grupos indivíduos DTH positivos liberam menor quantidade de NETs estimulados ou não com o parasito. Em 24 e 48 horas indivíduos tratados com LV apresentam maior carga parasitária e os DTH positivos demonstraram menor quantidade do parasito do que os outros grupos testados. Os cães com sinais de LV liberam maior quantidade de NETs quando estimulados com L. infantum e apresentam maior carga parasitária após 48 horas. Observa-se que a liberação de NETs e o controle da carga parasitária através dos neutrófilos variam de acordo com a forma clínica da LV, em humanos e cães.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Search for new therapeutic alternatives for leishmaniasis is considered essential by the World Health Organization, due to the high toxicity of the drugs currently used, its high cost and the risk of resistance. In Brazil, it is used three drugs to treat leishmaniasis: meglumine antimoniate and two formulations of amphotericin B (deoxycholate and liposomal). This study is a piggy-back evaluation linked to a multicentric clinical trial with the objective to perform a decision analysis between the treatment regimens for visceral leishmaniasis, for both adults and children. For this end, it was performed analysis of the data obtained in the state of Sergipe from 62 patients randomized to treatment with meglumine antimoniate (group A), considered the first line treatment in Brazil, amphotericin B deoxycholate (group B), liposomal amphotericin B (group C) and the combined regimen of meglumine antimoniate with liposomal amphotericin B (group D), in order to conduct a decision analysis from among these therapeutic regimens for both adults and children. To this end, two scenarios were considered: scenario 1 is the currently prevailing in Brazil, where patients are always treated as possible on an outpatient basis with meglumine antimoniate, although with a smaller monitoring on its potentially lethal side effects and a possible lower adherence to treatment. In the scenario 2, patients are hospitalized during the treatment period, with a better monitoring of clinical and laboratory parameters of the patient, although with a higher risk of nosocomial infections and increasing treatment costs. In terms of security, there is an emphasis on amphotericin B deoxycholate as the one that presents a greater amount of serious and potentially lethal adverse reactions, with an average of 2 severe reactions per patient. From the viewpoint of cost-efficacy, for scenario 1 the meglumine antimoniate remains the treatment of choice for both adults and children. However, in scenario 2, the combination of drugs (group D) presented itself as the most costeffective for both adults and children. From this study it became clear, from a safety point of view for the patient, the need to evaluate both therapeutic regimens, particularly amphotericin B deoxycholate, such as the treatment scenarios for visceral leishmaniasis. / A busca por novas alternativas terapêuticas para as leishmanioses é considerada essencial pela Organização Mundial da Saúde, em virtude da elevada toxicidade dos medicamentos atualmente utilizados, seu alto custo e o risco de resistência. No Brasil, utilizam-se três drogas para o tratamento da leishmaniose: o antimoniato de meglumina e as formulações de anfotericina B (desoxicolato e lipossomal). Este estudo é uma análise econômica atrelada a um ensaio clínico multicêntrico, com o objetivo de se realizar uma análise de decisão entre os esquemas terapêuticos para a leishmaniose visceral, tanto para adultos como para crianças. Para tal, foram utilizados os dados obtidos do estado de Sergipe, onde foram acompanhados 62 pacientes, randomizados para tratamento com antimoniato de meglumina (grupo A), considerado o esquema de primeira escolha no Brasil, anfotericina B desoxicolato (grupo B), anfotericina B lipossomal (grupo C) e o esquema terapêutico combinado de antimoniato de meglumina com anfotericina B lipossomal (grupo D). Na análise de decisão, foram considerados dois cenários: o cenário 1, atualmente existente no Brasil, no qual os pacientes são tratados sempre que possível ambulatorialmente com o antimoniato de meglumina, porém com um menor acompanhamento de suas reações adversas potencialmente letais e uma possível menor adesão ao tratamento. Já no cenário 2, os pacientes são internados durante todo o período do tratamento, com um melhor monitoramento dos parâmetros clínicos e laboratoriais do paciente, porém com um risco maior de infecções hospitalares e aumento de custos do tratamento. No quesito segurança, há um destaque para a anfotericina B desoxicolato como sendo a que apresenta uma maior quantidade de reações adversas graves e potencialmente letais, com uma média de 2 reações graves/paciente. Já no ponto de vista de custo-eficácia, para o cenário 1 o antimoniato de meglumina continua sendo o tratamento de primeira escolha, tanto para adultos como para crianças. Porém, no cenário 2, a combinação de medicamentos (grupo D) se apresentou como o mais custo-eficaz tanto para adultos como para crianças. Deste estudo evidenciou-se, do ponto de vista de segurança ao paciente, a necessidade de reavaliação tanto dos esquemas terapêuticos, particularmente a anfotericina B desoxicolato, como dos cenários de tratamento para a leishmaniose visceral.