Das Ubiquitin-Proteasom-System gewährleistet in eukaryontischen Zellen den regulierten Abbau der meisten intrazellulären Proteine und ist mit der Generierung von T-Zell-Epitopen grundlegend an der Immunantwort beteiligt. Wegen der Komplexität des Systems stand ein in vitro Verfahren zur 26S proteasomalen Prozessierung eines ubiquitinierten Modellsubstrates erstmals im Jahr 2000 zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit gelang es, diese von Thrower et al. publizierte Methode hinsichtlich einer größeren Proteinquantität zu optimieren und auf die in vitro Ubiquitinierung und Degradation von Proteinen anzuwenden, deren proteasomaler Abbau unter dem Aspekt der Epitopgenerierung immunologisch von besonderer Relevanz ist. Die biochemische und massenspektrometrische Analyse der 26S proteasomalen Degradation von penta-ubiquitinierten Derivaten des tumorassoziierten Glykoproteins Mucin1 zeigte erstens, dass die Prozessierung der Substrate zu einem 26S proteasomalen gating-Effekt führt, der von Substratbindung und -deubiquitinierung sowie von ATP-Hydrolyse abhängig ist. Zweitens ließ sich als Folge der Substratprozessierung eine Instabilisierung des 26S Proteasoms beobachten, die auf einen Assoziations-Dissoziations-Zyklus hindeutet. Drittens ergab die Untersuchung zum Einfluss des Proteasom-Aktivators PA28 auf den Abbau eines Mucin1-Polyepitops, dass PA28 eine erhöhte Quantität an 26S proteasomal generiertem Epitop verursacht. Viertens war unter Zuhilfenahme des Inhibitors clasto-Lactacystin und anhand der ubiquitinierten Mucin1-Derivate erstmals für ubiquitinierte Substrate nachweisbar, dass die proteasomale katalytische Untereinheit beta5 für die Proteindegradation durch den 26S-Komplex nicht essentiell ist. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Abbausystem hat zudem sein Potential unter Beweis gestellt, als ein in vivo-nahes in vitro Testsystem zu fungieren, um die Wirksamkeit von Proteasom-Inhibitoren sowie die Prozessierbarkeit von Polyepitop-Vakzinen zu bewerten. / The ubiquitin-proteasome pathway plays a major role in cellular protein degradation. By generating T-cell epitopes it contributes essentially to the immune response. The complexity of the system impeded the establishment of an in vitro approach that would make a detailed analysis of the protein degradation by the 26S proteasome possible. Finally, in 2000 Thrower et al. published an in vitro method enabling the synthesis and degradation of an ubiquitinated model substrate by the 26S proteasome. In the study presented here the approach of Thrower et al. was improved by scaling up and by the synthesis of substrates the degradation of which by the 26S proteasome is of great importance immunologically, mainly in regard to the generation of T-cell epitopes. In vitro synthesised penta-ubiquitinated versions of the tumor-associated glycoprotein mucin1 were processed by purified 26S proteasomes. The analysis of substrate degradation and product generation by biochemistry and mass spectrometry showed firstly, that substrate processing initiated a 26S proteasomal gating effect which depends on substrate binding to the proteasome, deubiquitination and proteasomal ATP-hydrolysis. Secondly, a disassembly of the 26S proteasome was observed following substrate processing which suggests a regulated association-dissociation cycle of the proteasome. Thirdly, supplementation of the degradation approach with the proteasome activator PA28 led to a higher quantity of epitope generated by the 26S proteasome out of a mucin1 polyepitope string. Fourthly, use of the proteasome inhibitor clasto-Lactacystin revealed, for the first time, that the catalytic proteasome subunit beta5 is not essential for the degradation of ubiquitinated protein substrates by the 26S proteasome. In addition, the in vitro approach established in the presented study has shown its potential to function as an in vivo-like system which helps to assess proteasome inhibitors and potential polyepitope vaccines.

Der radiale Wasserfluss durch die feinen Seitenwurzeln von Schilf- und Mais ist vom radialen Teilchenfluss entkoppelt. Der radiale Wasserfluss wird bereits im Kortex der Wurzel durch den Protoplasten kontrolliert, da die Strömung auf dem apoplastischen Zellwandweg um die Protoplasten herum gegenüber der Strömung durch die Protoplasten nicht signifikant ist. Der radiale Reflexionskoeffizient der Wurzeln wird durch den Reflexionskoeffizient der Plasmamembran bestimmt. Die Feinwurzeln von Schilf- und Mais besitzen einen Reflexionskoeffizienten für Salze, Zucker, Zuckeralkohole und Polymere der sich nicht signifikant von eins unterscheidet. An intakten Wurzeln wurde dies durch die Abwesenheit von solvent drag für NaCl und Mannitol bei der Steigerung des Wasserflusses und der gleich großen hydraulischen Wirkung von osmotischen und hydrostatischen Kräften auf die Exsudation nachgewiesen. Die radialen Wände der Endodermis von Schilf- und Maiswurzeln sind keine perfekte Diffusionsbarriere. Liegen die genannten Stoffe in einer signifikanten Konzentration in der Zellwand vor permeieren sie passiv unter Umgehung der Protoplasten durch die Endodermis in die Xylemgefäße. Auch die Epidermis/Hypodermis der untersuchten Wurzeln hat die Eigenschaft einer semipermeablen Membran in der osmotische Druckgradienten einen Volumenfluss erzeugen. Es wurden zwei Methoden etabliert, mit denen sich der osmotische Druck des Xylemsaftes in isolierten Feinwurzeln bestimmen lässt. Die Feinwurzeln unterschieden sich hinsichtlich des osmotischen Druckes ihres Xylemsaftes und ihrer radialen hydraulischen Leitfähigkeit stark. Die bekannte Fähigkeit der Schilfpflanzen Natriumionen an der Sprossbasis aus dem Xylem zu eliminieren muss um Chloridionen erweitert werden. Die hohe Permeabilität der Endodermis für NaCl verringert die osmotische Wirkung des Brackwassers auf die Wasseraufnahme. Die Entkopplung der Salzaufnahme vom Wasserfluss vermeidet eine exzessive Salzbelastung des Sprosses. / Radial Water fluxes are not coupled to the radial solute fluxes in fine lateral roots of mays and reed. The radial water flow is already controlled by the protoplast in the cortical parenchyma as the hydraulic conductivity of the cell wall path circumventing the protoplasts is negligible compared to hydraulic conductivity of the pathway through the protoplast. The radial reflection coefficient of the root is defined by the reflection coefficient of the plasma membrane. Therefore fine laterals of the common reed (Phragmites australis) and maize (Zea mays) therefore exhibit a reflection coefficient for salts, sugars, alditols and polymers that is not significantly different from unity. This conclusion was drawn from the absence of solvent drag for NaCl and mannitol with increasing water flux and by the observation of equality of the hydraulic effect of both osmotic and hydrostatic forces on the exudation flow in intact roots of both plants. The radial walls of the endodermis are no absolute barrier for diffusion of small osmolytes. In the presence of high cell wall concentrations, the abovementioned osmolytes passively permeated into the xylem vessels at high rates circumventing the protoplast. The epidermis/hypodermis exhibits a semipermeable barrier as well wherein osmotic forces can create a radial volume flux. Two methods were established that allow for the determination of the flow direction and the osmotic pressure of the xylem sap in isolated fine laterals. Laterals differed strongly regarding their hydraulic conductivity and the osmotic pressure of their xylem sap. The known ability of the reed plant to remove sodium ions from the ascending sap has to be expanded for chloride. The high permeability of the endodermis for NaCl reduces the osmotic force of the brackish medium on water uptake. Uncoupling of radial water from the solute fluxes avoids the excessive permeation of NaCl and its accumulation in the assimilating leaves at high rates of transpiration.

Spargelanlagen werden fast ausschließlich durch Pflanzung einjähriger Kronen im Frühjahr etabliert. Die spätere Ertragsleistung wird neben verschiedenen Maßnahmen in der Kulturführung auch maßgeblich vom Wachstum der Pflanzen im ersten Standjahr beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss unterschiedlicher Merkmale und Maßnahmen bei Spargeljungpflanzen anhand von Feld- und Gefäßversuchen auf das Wachstum im ersten Standjahr untersucht. Als wichtigstes Kriterium zur Beurteilung der Qualität von Spargeljungpflanzen hat sich eine hohe Pflanzmasse im Frühjahr herausgestellt. Jeweils im Vergleich zu 100-g-Pflanzen im Frühjahr war bei 50g der Verlust an Zuwachs jedoch größer, als der Zugewinn bei 150g. Aus diesem Grund ist nicht nur die durchschnittliche Pflanzmasse für eine gute Etablierung von Interesse, sondern auch der Anteil kleinerer Pflanzen. Ein Verlust an Wurzelmasse brachte bis auf die Auswirkungen der geringeren Pflanzmasse keine zusätzlichen Effekte auf die Etablierung. Auch der Gehalt löslicher Reservekohlenhydrate im Frühjahr erwies sich von eher untergeordneter Rolle. Bezüglich unterschiedlicher Behandlungen vor der Pflanzung konnten keine ausgeprägten Effekte der Temperatur bei einer kurzfristigen Lagerung und eines unterschiedlichen Pflanztermins bzw. der Lagerdauer nachgewiesen werden. Zwar zeigte sich bei einer Lagerung von über zwei Monaten eine Reduktion der Laub- und Kronenmasse im Herbst, jedoch ist die Ursache hierfür eher in der Verkürzung der Vegetationszeit zu suchen. Als ein wichtiges Qualitätsmerkmal sind in Fungizidlösungen getauchte Pflanzen (Beizung) zu nennen. Zwar ergaben sich je nach Pflanzbedingungen nicht in jedem Fall fördernde Effekte, in der Summe der Versuchsauswertungen über mehrere Jahre und Mittel war aber eine deutliche Steigerung des Wachstums durch Tauchbehandlungen nachzuweisen. Da auch die alleinige Tauchung der Jungpflanzen in Wasser zu einer Vitalitätssteigerung führte, sollte die Beizung möglichst direkt vor der Pflanzung durchgeführt werden. Als Fazit der vorliegenden Untersuchungen ist bezüglich der Jungpflanzenqualität bei Spargel vornehmlich auf gleichmäßig hohe Pflanzmassen sowie einer kurz vor der Pflanzung erfolgten Beizung Wert zu legen. / Asparagus plantings are usually established by planting one year old crowns in the spring. The later yield potential is influenced by culture practical measurements and the growth of the plants in the first year. This work deals with the influence of different characters and measurements of young asparagus plants on the growth in the first year by trials in the field and pots. The most important criterion of the evaluation of the quality of asparagus plants had been the weight of the plants in spring. Comparing with 100-g-plants in the spring the lack of growing of plants with 50g was higher than the better growing with 150g. So it is not only interesting to have a high average plant weight for a good establishment of an asparagus planting but although the part of smaller plants. A lack of root weight showed not more effects than only the lack of plant weight. Although the content of soluble concentration of carbohydrates in the spring showed no to be important. Due to different treatments before planting there were no strange effects of the temperature during a short storage and a different time of planting or period of storage. There was a reduction of fern- and crown weight in autumn after storage before planting over a period of two months, but the reason seems to be the reduction of the vegetation period. An important criterion of quality is a preplant fungicide dip for asparagus crowns. Although because of different conditions after planting there was not every time a better establishment of the plants, but in consideration of all trials in different years and fungicides there was a significant increase of the growth because of dipping treatments. Because the dipping of the crowns only in water before planting showed effects of a better vitality the fungicide dips should be done directly before planting. The result of this work concerning the quality of asparagus crowns is a constant high crown weight and a fungicide dip just before planting.

In photosynthetischen Organismen vermitteln Tetrapyrrole während der Chloroplastenbiogenese und als Antwort auf Veränderungen des Entwicklungszustandes sowie wechselnder Umweltbedingungen retrograde Signale zur Kontrolle der Expression von Kerngenen (NGE). In der vorliegenden Arbeit wurde ein induzierbares RNAi-System in Arabidopsis eingesetzt, um enzymatische Schritte des Mg-Zweigs der Tetrapyrrolbiosynthese (TPBS) zu inaktivieren. Es sollte gezeigt werden, inwiefern Tetrapyrrole zu einer kontinuierlichen Regulation der NGE beitragen, um abhängig von durch wechselnde Umweltbedingungen bedingte Veränderungen der TPBS, die Homöostase der Chloroplasten zu justieren. Die Untersuchungen zur Kurzzeitinduktion zeigten, dass veränderte Gehalte an Mg Protoporphyrin IX (MgP), Mg-Protoporphyrin IX-monomethylester (MgPME) und Protochlorophyllid (Pchlid) als Folge verminderter Enzymaktivitäten nicht primär zu einer Anpassung der NGE innerhalb der ersten 24 h führen. Vielmehr weisen die Ergenisse dieser Arbeit auf ein komplexes, vielschichtiges Signalnetzwerk aus retrograden und anterograden Signalwegen unter der Mitwirkung transkriptionellen und posttranslationalen Regulationsmechanismen hin. Es wird angenommen, dass Veränderungen der TPBS über ROS-Signalwege oder Redox-vermittelte Signale zur Regulation der NGE beitragen. Diese Signale könnten aus beeinträchtigten Photosystemen stammen, welche eine Folge der Akkumulation von photoreaktiven Intermediaten und unzureichenden Mengen an Chlorophyll sein können. / In photosynthetic organisms, tetrapyrroles are known to mediate retrograde control of nuclear gene expression (NGE) during chloroplast biogenesis in response to developmental and environmental changes. In these studies, an inducible RNAi system was used in Arabidopsis plants to inactivate enzymatic steps in the Mg-branch of tetrapyrrole biosynthesis (TPBS). It was intended to proof whether tetrapyrroles contribute to a permanent regulation of NGE due to changes in the TPBS and in response to environmental changes to achieve an adjustment of chloroplast homeostasis. The investigations of short-term responses due to altered levels of Mg protoporphyrin (MgP), Mg protoporphyrin monomethylester (MgPME) and protochlorophyllide (Pchlid) caused by a robust down-regulation of enzyme activity within the first 24 h reveal that these Mg porphyrins do not primarily contribute to the modulation of NGE. All results together indicate a complex multi-layered signaling network of anterograde and retrograde control and contributions of transcriptional as well as posttranslational regulation mechanisms. It is proposed that changes in the TPBS mediate the regulation of NGE via ROS-signaling pathways or redox signals deriving from disturbed photosystems due to accumulation of photoreactive intermediates and the lack of chlorophyll.

Das Leben auf der Erde wird maßgeblich durch die Kraft der oxygenen Photosythese bestimmt, die Sonnen- in chemische Energie umwandelt. Cyanobakterien wie Prochloro- und Synechococcus zählen zu den wichtigsten primären Produzenten der Ozeane und werden zunehmend als Modelle für photosynthetische Organismen genutzt. Um die Regulationsmechanismen dieser Picocyanobakterien besser zu verstehen, wurde hier die Information von vier Genomen hochgradig verwandter aber dennoch ökologisch unterschiedlich angepasster mariner Stämme genutzt in einer Kombination aus computer-gestützten und experimentellen Untersuchungen. Sequenzsignale und RNA-kodierende Gene wurden als neuartige Regulationselemente identifiziert und entlang des phylogenetischen Gradienten verglichen. Mittels ''phylogenetic footprinting'' konnte ein minimales, konserviertes Set möglicher Transkriptionsfaktoren, deren Bindestellen und Regulons aufgedeckt werden. NtcA-, LexA- und ArsR-ähnliche Motive wurden ebenso gefunden wie neue regulatorische Elemente. Mit Hilfe von RACE Experimenten wurden einige der vorhergesagten Bindestellen Promotorregionen zugeordnet. Eine Suche nach konservierten Sekundärstrukturen detektierte mehrere nicht-kodierende RNAs, benannt Yfr für cYanobacterial Functional RNA. Eine vergleichende Analyse von Yfr7 innerhalb der cyanobakteriellen Linie ergab, dass diese RNA wahrscheinlich ein Homolog der E. coli 6S RNA ist. Zwei verschiedene Yfr7 Transkripte mit einem zirkadianen aber zeitversetzten Akkumulationsmuster lassen eine Verknüpfung ihrer Expression mit dem zirkadianen Rhythmus oder der Lichtintensität vermuten. Experimente in Synechocystis deckten einen neuartigen Regulationsmechanismus durch eine antisense RNA auf, welche die Menge der isiA mRNA kontrolliert und die Assemblierung von IsiA-Superkomplexen beeinflusst. Die funktionelle Zuordnung dieser neuen Elemente wird zu einem besseren Verständnis regulatorischer Netzwerke in marinen Cyanobakterien und darüber hinaus führen. / Life on Earth is driven by the power of oxygenic photosynthesis transforming solar into chemical energy. Cyanobacteria such as Prochlorococcus and Synechococcus belong to the most important primary producers within the oceans and increasingly serve as models for photosynthetic organisms. To better understand the regulatory mechanisms in these picocyanobacteria, here the information from four genomes of closely related and even so ecologically divergent marine strains was used in a combined computational and experimental approach. Sequence signals and RNA-coding genes as novel elements in the regulation of gene expression were identified and their distribution along the phylogenetic gradient compared. Phylogenetic footprinting revealed a minimal conserved set of putative transcription factors, their binding sites and regulons. Sites for NtcA, LexA and ArsR-like regulators were found as well as new cis elements. RACE experiments verified several of these predicted sites belonging to the promoter region. A search, focussing on conserved secondary structures, detected several non-coding RNAs named Yfr for cYanobacterial Functional RNA. A comparative analysis of Yfr7 structures, transcript types and accumulation throughout the cyanobacterial radiation indicated this RNA as the likely homologue of the E. coli 6S RNA. Two distinct Yfr7 transcripts with a circadian but time-shifted expression pattern suggested a coupling of their expression to the circadian rhythm or light intensity. Experiments in Synechocystis discovered a novel antisense RNA-mediated regulatory mechanism that controls isiA mRNA abundance and assembly of IsiA-photosystem I supercomplexes. Functional assignments of these new elements in the future will contribute to a deeper understanding of the regulatory network of marine cyanobacteria and promote new studies on bacterial ncRNAs.

Diese Arbeit befasst sich mit dem bisher noch nicht untersuchten Mechanismus der Cyanophycinbiosynthese. Hierzu wurden verschiedene kurze Cyanophycinmoleküle chemisch synthetisiert, die als definierte Primer in in vitro Experimenten verwendet wurden. Die Verwendung dieser Primer ermöglichte erstmals die Richtung der Verlängerung des Cyanophycinmoleküls aufzuklären. Die durchgeführten Experimente zeigten, dass der Einbau der konstituierenden Aminosäuren sukzessiv vom Carboxyterminus aus erfolgt. Weiterhin wurde gezeigt, dass auch die nicht proteinogenen Aminosäuren Ornithin und Citrullin vom Enzym eingebaut werden. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde zudem eine Zuordnung unterschiedlicher Abschnitte der Cyanophycin-Synthetase zu den verschiedenen vom Enzym katalysierten Teilreaktionen versucht. Mutationen im N-terminalen Bereich der Cyanophycin-Synthetase aus Anabaena variabilis ATCC 29413 führten dazu, dass Aspartat nicht mehr in Cyanophycin eingebaut wurde, eine Mutation im C-terminalen Bereich bewirkte, dass Arginin nicht mehr mit Cyanophycin verknüpft werden konnte. Als Reaktionsmechanismus wird für die Bindung beider Aminosäuren jeweils eine Phosphorylierung des C-terminalen Aspartatrestes von Cyanophycin als Acylphosphat vorgeschlagen, wobei die Phosphorylierung der beta-Carboxylgruppe mittels gamma-[³²P]-ATP nachgewiesen werden konnte, die Phosphorylierung der alpha-Carboxylgruppe jedoch nicht. Durch Vergleiche mit Enzymen ähnlicher Aminosäuresequenz und bekannter Raumstruktur wird eine mögliche Begründung für diese unterschiedlichen Befunde gegeben. / This work is occupied with the till now uninvestigated mechanism of the biosynthesis of cyanophycin. Therefore different short cyanophycin molecules were synthesized chemically, which were employed as defined primers for in vitro experiments. The usage of these primers made it possible to clear up the direction of the elongation of the cyanophycin molecule. Experiments showed that the incorporation of the constituent amino acids happens successively starting from the carboxy-terminus. Further it was shown that the nonproteinogenic amino-acids ornithine and citrulline are incorporated by the enzyme. Using site-directed mutagenesis an assignment between segments of the cyanophycin synthetase to different parts of the reactions catalyzed by the enzyme was carried out. Mutations in the N-terminal part of cyanophycin synthetase of Anabaena variabilis ATCC 29413 lead to the finding, that aspartate was not incorporated into cyanophycin anymore. A mutation in the C-terminal part resulted in the disability of the enzyme to incorporate arginine into cyanophycin. As reaction mechanism for the attachment of both of the amino acids a phosphorylation of the C-terminal aspartate as an acylphosphate was proposed. The phosphorylation of the beta-carboxylic-group could be shown by using gamma-[³²P]-ATP, the phosphorylation of the alpha-carboxylic group could not be shown. By comparison with enzymes that share a similar amino acid sequence and have a solved crystal structure a possible explanation for this finding is given.

Zusammenfassung Transgene Tabakpflanzen, in denen wegen der Expression von Antisense-RNA für zwei Enzyme der Tetrapyrrolbiosynthese die Aktivität der Uroporphyrinogen-Decarboxylase bzw. Coproporphyrinogen-Oxidase vermindert ist, akkumulieren in starkem Ausmaß die Substrate der betroffenen Enzyme. Diese Porphyrinogene werden bei Anwesenheit von Sauerstoff autoxidativ oder durch unspezifische Peroxidasen in ihre photosensibilisierenden Derivate (Porphyrine) umgewandelt, welche die Ursache für zelluläre Schäden darstellen, die sich makroskopisch in Form von Blattläsionen zeigen. Im Verlauf der durch die angehäuften Porphyrine ausgelösten Reaktionen, die u.a. den Folgen der Behandlung von Pflanzen mit photodynamisch wirksamen Herbiziden und auch den Symptomen von Porphyria-Erkrankungen des Menschen ähneln, werden Membranlipide durch Peroxidation geschädigt und alle lichtexponierten Zellen massivem oxidativem Streß ausgesetzt. Dieser läßt sich anhand der kompartiment-übergreifenden und alle Ebenen der Expression umfassenden Aktivierung des antioxidativen Schutzsystems belegen. So können die Transkriptakkumulation und verstärkte Anhäufung der Proteine sowie der damit verbundene Anstieg der Aktivität von Superoxid-Dismutase und Ascorbat-Peroxidase nachgewiesen werden. Die erhöhte Aktivität der Schutzenzyme führt zu beschleunigtem Umsatz und größerem Bedarf an niedermolekularen Antioxidantien wie Ascorbat und Tocopherol. Gleichzeitig kommt es lokal beschränkt auf Blattgewebe in der Umgebung von Nekrosen zur Kreuzinduktion von pathogenese-assoziierten Prozessen, wie der Akkumulation von "pathogenesis related" (PR)-Proteinen, von Salicylsäure und der antimikrobiell wirksamen phenolischen Verbindung Scopolin. Diese Aktivierung der Pathogenabwehr wird durch die verminderte Ausbreitung einer Infektion der Pflanzen mit dem Tabak Mosaikvirus (TMV) widergespiegelt. Der Prozeß der Photosensibilisierung ist stark licht- und sauerstoffabhängig und wird außerdem durch erhöhte Temperaturen beschleunigt. Wird eine bestimmte Lichtdosis überschritten, werden die Porphyrine durch die dann rasch irreversibel geschädigten Plastiden freigesetzt, und es kommt wegen des nachfolgenden Absterbens von Gewebe zur Ausbildung der Blattläsionen. Dieser Effekt wurde ausgenutzt, um die Kinetik von Prozessen der antioxidativen und Pathogenabwehr in den Pflanzen zu untersuchen. Mittels Subtraktiver Suppressions-Hybridisierung (SSH) wurde eine subtrahierte cDNA-Bank angelegt, in der Gene vertreten sind, deren Expression bereits sehr früh als Reaktion auf die Photosensibilisierung induziert wird. Unter diesen Genen sind auch vermutete Komponenten von Signaltransduktionskaskaden einschließlich Transkriptionsfaktoren. Etwas überraschend war die Erkenntnis, daß vor allem pathogenese- und zelltod-assoziierte Prozesse frühzeitig aktiviert werden, die klassischen Enzyme der antioxidativen Streßabwehr aber erst später reagieren. Bei letzteren kommt es vor Veränderungen in der Expression zuerst zu einem Anstieg der Aktivität, der sich in verändertem Gehalt und Redoxstatus der niedermolekularen Antioxidantien niederschlägt. Insgesamt stellt sich die durch Antisense-Expression verursachte Deregulation der Tetrapyrrolbiosynthese und die daraus resultierende Photosensibilisierung als komplexes System dar, in dem antioxidative und Pathogenabwehr kreuzinduziert werden und welches als Modell zur Aufklärung von Mechanismen der Streßabwehr wertvolle Aussagen liefert. / Abstract Transgenic tobacco plants expressing antisense RNA for two enzymes of the tetrapyrrole biosynthetic pathway are characterized by decreased enzyme activity of either uroporphyrinogen decarboxylase or coproporphyrinogen oxidase and accumulate the substrates of these enzymes in large amounts. If oxygen is present the accumulated porphyrinogens are transformed either by autoxidation or unspecific peroxidases into their photosensitizing derivatives (porphyrins). They are the molecular basis for cellular damage which eventually becomes visible as leaf lesions. During photosensitization membrane lipids are damaged due to peroxidation reactions and most of the symptoms observed are similar to the effects caused by the treatment of plants with photodynamic herbicides, or resemble the characteristics of porphyria diseases in human. These plants suffer from oxidative stress which is concluded from the general and intercompartimental activation of the antioxidative stress defense system. Transcripts and proteins of superoxide dismutase and ascorbate peroxidase accumulate and the corresponding enzyme activities are increased. This increase leads to accelerated turnover and enhanced demand of low molecular weight antioxidants like ascorbate and tocopherol. Simultaneously, cross induction of pathogenesis-related responses is observed in the plants, like the accumulation of PR proteins, salicylic acid and the antimicrobial phenolic compound scopolin. The activation of the pathogen defense system leads to restricted spread of Tobacco Mosaic Virus (TMV) infection in the transgenic plants. Photosensitization strongly depends on light and oxygen and is enhanced by elevated temperature. Porphyrins are only released from rapidly damaged plastids into other cellular compartments if a certain light dose is exceeded. Then cell death commences and dead tissue becomes visible as leaf lesions. This light dosage effect was exploited to investigate the kinetics of antioxidative and pathogen defense responses upon light shift. By the use of Suppression Subtractive Hybridization (SSH) a subtracted cDNA library was established that contains genes which are early induced in response to photosensitization. The library also contains putative components of signal transduction chains and transcription factors. Unexpectedly, the expression of genes related to pathogenesis and cell death is rather early induced while the cellular antioxidative stress defense system responds later. The activity of antioxidative enzymes is increased before changes in transcript or protein accumulation occur, resulting in changes of content and redox ratio of low molecular weight antioxidants. In summary, photosensitization caused by the expression of antisense RNA and resulting in the deregulation of tetrapyrrole biosynthesis is a complex model system in which antioxidative and pathogen defense responses are induced. The approach can be used to further elucidate mechanisms of stress response.

PPR-Proteine bilden die größte Familie von RNA-Bindeproteinen in Pflanzen und sie werden fast ausschließlich in die Mitochondrien oder Plastiden importiert, wo sie eine wesentliche Rolle im RNA-Metabolismus spielen (Lurin et al., 2004). Doch die Funktionsweise der Proteine ist noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde das plastidäre PPR-Protein PPR5 in Zea mays funktionell charakterisiert, dessen Ortholog in Arabidopsis thaliana essentiell für die Embryogenese ist (Cushing et al., 2005). Mittels PPR5-Immunopräzipitation und einer Analyse der kopräzipitierten RNA konnte in vivo eine spezifische Assoziation mit der ungespleißten tRNA-Glycin (UCC) nachgewiesen werden. Analysen von ppr5-Mais-Mutanten offenbarten einen Stabilitätsverlust dieser RNA. Es wurde gefolgert, dass PPR5 das Transkript vor einem endonukleolytischen Abbau schützt. Die weiteren Projekte der Arbeit widmeten sich der Evolution der Familie. Um Erkenntnisse zur Funktion und Spezifität nahe verwandter PPR-Proteine zu erhalten, wurden die drei nächsten Verwandten von PPR5 identifiziert und Mais-Mutanten isoliert. Weiterhin wurde PPR54 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PPR54 in Mais – wie in Arabidopsis (Tillich, nicht publiziert) – für das Spleißen des ndhA-Introns benötigt wird. Damit wurden erstmalig orthologe PPR-Proteine in einer Mono- und einer Dikotylen funktionell analysiert. Die vorgelegten Analysen mündeten in drei allgemeingültigen Schlussfolgerungen zur Funktion der PPR-Proteine. 1) Plastidäre PPR-Proteine, die in Dikotylen wie Arabidopsis für die Embryogenese notwendig sind, üben eine Funktion in der plastidären Translation aus. 2) Die vorgeschlagene Funktionsweise von PPR5 erfordert nicht die Rekrutierung anderer, katalytisch aktiver Proteine, sondern ihr liegt ein passiver, auf der Bindung einer RNA beruhender Mechanismus zugrunde. 3) Die Funktion orthologer PPR-Proteine ist in Mono- und Dikotylen konserviert, wie am Beispiel von PPR54 experimentell nachgewiesen wurde. / PPR proteins are the largest family of RNA binding proteins in plants and the vast majority of them is localized to mitochondria or chloroplasts, where they are major players in the RNA metabolism of defined transcripts (Lurin et al., 2004). However, the mechanistic function of these proteins is still not clear. In this study, the plastid PPR protein PPR5, whose ortholog in Arabidopsis thaliana is embryo-essential (Cushing et al., 2005), was functionally characterized in Zea mays. By PPR5 immunoprecipitation and analyses of the coimmunoprecipitated RNA, a specific association to the unspliced tRNA glycine (UCC) was shown in vivo. The analysis of ppr5 maize mutants demonstrated a loss of stability of the tRNA precursor in mutants. It was concluded that the interaction with PPR5 protects the unspliced tRNA from endonucleolytic decay. In addition, close relatives of PPR5 were identified in maize (PPR2, PPR50, and PPR51) by phylogenetic means and maize mutants were isolated. A future characterization of four paralogous PPR proteins might answer whether closely related PPR proteins have similar functions or RNA targets. The analysis of PPR54 in maize demonstrated that PPR5 is needed for the splicing of the ndhA intron in maize as it is in Arabidopsis (Tillich, not published). Three important conclusions concerning the function of PPR proteins in general were drawn from the studies of chosen PPR proteins presented here. First, plastid PPR proteins that are essential in embryo development in eudicots like Arabidopsis should be necessary for plastid translation in most cases. Second, the characterization of PPR5 revealed a possibly ancient functional mechanism of PPR proteins which does not invoke the recruitment of additional catalytic factors but relies on the passive binding of RNA elements. Last, the conservation of function of orthologous PPR proteins in monocots and eudicots, which was shown in the case of PPR54, was demonstrated experimentally for the first time.

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 besitzt einen beeindruckenden Effekt zur Verbesserung des Pflanzenwachstums. Um die Mechanismen, vor allem auf molekularer Ebene, zu verstehen, wurde das komplette Genom von FZB42 in dieser Arbeit sequenziert. Abwesenheit von der weit verbreiteten Phagen-verwandten Genen im Genom von B. subtilis 168, der in enger Verwandtschaft zum FZB42 steht, ist ein besonderes Merkmal. Dagegen enthält das Genom von FZB42 viele DNA-Inseln, in denen unikale Gene in FZB42 als Cluster gefunden wurden. Viele Gene, die möglicherweise zur Pflanzenwachstumsförderung beitragen, wurden in dieser Arbeit identifiziert. B. amyloliquefaciens FZB42 ist natürlich kompetent. Das kompetente Stadium in FZB42 kommt früher als in B. subtilis 168, nämlich während der späten exponentiellen Wachstumsphase. Das FZB42-Genom enthält den kompletten Satz von Genen, die für die Entwicklung der genetischen Kompetenz nötig sind. Ausgenommen von Gene für Quorum-Sensing-System ist die Mehrzahl der Kompetenz-Gene von FZB42 sehr ähnlich zu denen in B. subtilis 168. Das FZB42 Genom birgt ein enormes Potential zur Produktion von sekundären Metaboliten. Genetische Manipulationen wurden durchgeführt, um die Funktionen der trans-AT Domänen und der Modifikationsdomänen in den PKS-Gen-Clustern zu erklären. Mit Ausnahme von fünf Gen-Clustern in B. subtilis 168 (Surfactin, Fengycin, Bacillibactin, Bacillaene und Bacilysin), sind Bacillomycin D, Difficidin, Macrolactin und ein hypothetisches Tripeptid einzigartig im Genom der FZB42. FZB42 kann kein bekanntes ribosomal synthetisiertes Bacteriocin produzieren kann. Gleichzeitig beinhaltet sein Genom ein Gen-Cluster, das wahrscheinlich für die Produktion eines neuartigen Bacteriocins verantwortlich ist. Die eindrucksvolle genetische Kapazität zur Herstellung von antagonistischen sekundären Metaboliten ermöglicht es FZB42, nicht nur erfolgreich neben konkurrierenden Organismen innerhalb seiner natürlichen Umgebung zu überleben, sondern auch Pflanzen gegen pathogene Bakterien und Pilze zu schützen. / Bacillus amyloliquefaciens FZB42 has an impressive effect to improve plant growth. In order to understand the mechanisms, especially at the molecular biological level, the whole genome of FZB42 was sequenced in this work. The absence of extended phage insertions which are typical for the closely related B. subtilis 168 genome is a particular feature. On the other hand, several DNA islands where unique genes in FZB42 were found clustered. Many candidate genes that may contribute to the plant growth promotion were identified in this works. B. amyloliquefaciens FZB42 is naturally competent. FZB42 exhibited its maximal competence earlier than B. subtilis, during late exponential growth. Not surprisingly, the FZB42 genome harbors the complete set of genes necessary for development of genetic competence. The majority of competence genes are highly homologous to their counterparts in B. subtilis 168, excluded from genes for the quorum-sensing system. The FZB42 genome harbors enormous potential for producing secondary metabolites. Genetic manipulation was carried out to investigate the trans-AT domains and some modification domains in the pks gene clusters. With the exception of five gene clusters in B. subtilis 168 (Surfactin, Fengycin, Bacillibactin, Bacillaene and Bacilysin), Bacillomycin D, Difficidin, Macrolactin and a hypothetical tripeptide are unique in the genome of the FZB42. A remarkable feature of the FZB42 genome is that it does not produce any known ribosomally synthesized bacteriocin, whereas a gene cluster probably responsible for production of a new bacteriocin was identified in this work. The impressive genetic capacity to produce antagonistic acting secondary metabolites not only enables FZB42 to cope successfully with competing organisms within its natural environment, but also to protect plants from pathogenic bacteria and fungi.

Wasserknappheit und Dürre sind große Herausforderungen für die Pflanzenproduktion auch in Teilen Mitteleuropas. Weizen aus dem mediterranen Klima sind wegen ihrer Anpassung an dortige Bedingungen eine potenzielle Quelle für eine verbesserte Dürreresistenz. In 2-faktoriellen Gefäßversuchen und 1-faktoriellen Feldversuchen wurden daher Wassernutzung, Biomasseproduktion, Kornertrag, Ertragsstruktur und Stickstoff-Nutzung von zwei mediterranen (Golia, Gönen) und 8 mitteleuropäischen Sommerweizensorten (Triticum aestivum L.) auf der Versuchsstation der Humboldt-Universität in Berlin-Dahlem untersucht. In den Gefäßversuchen (3 Jahre), unter Freilandbedingungen mit Regenschutz, sollte der Effekt von zwei Bewässerungsvarianten (optimale Bewässerung, restriktive Bewässerung nach Ährenschieben) erfasst und mögliche Sortenunterschiede identifiziert werden. Kornertrag und Biomasseproduktion zeigten starken genotypischen Einfluss und eine Reduktion durch das Wasserdefizit (2 Jahre). Die höchsten Kornerträge erreichten die mitteleuropäischen Sorten, gefolgt von Golia aus Italien mit höheren Erträgen als Gönen aus der Türkei. Bezüglich der Wassernutzungseffizienz (WNE) zeigten die Sorten des gemäßigten Klimas höhere Werte aufgrund von gleichzeitig höherer Evapotranspirationseffizienz (ETE) und Ernte-Index (EI). Auch in den Feldversuchen (2 Jahre) konnte für Biomasseproduktion und Kornertrag ein starker Sorteneinfluss gefunden werden, wobei wiederum die mitteleuropäischen Sorten höhere Erträge erzielten als Gönen. Dasselbe gilt für die WNE, wobei die Ursache in höherer ETE und EI bei den mitteleuropäischen Sorten liegt. Golia erreichte hinsichtlich Biomasse, Kornertrag, WNE und ETE das Niveau der mitteleuropäischen Sorten. Die frühe Trockenheit (2011) reduzierte den Kornertrag nur bei den Sorten aus dem mediterranen Raum verglichen mit der späten Trockenheit in 2010. Der Kornertrag der mitteleuropäischen Sorten war stabil zwischen den Jahren. / Water scarcity and drought are big challenges in agricultural production even in parts of Mid-Europe. Wheats from Mediterranean climate with their adaption to the local conditions may be considered a potential source of enhanced drought resistance. Therefore, in two-factorial pot experiments and one-factorial field experiments water use, biomass accumulation, grain yield, yield structure and nitrogen utilization of 2 Mediterranean (Golia, Gönen) and 8 mid-European spring wheat cultivars (Triticum aestivum L.) were studied on the experimental station of the Humboldt-University at Berlin. Pot experiments (3 years) were carried out under field site conditions with rain shelter to quantify effects of two watering regimes (well watered, water deficit after heading) and to identify possible differences between cultivars. Grain yield and biomass accumulation showed strong genotypic influence and were significantly reduces by water deficit in two years. Mid-European cultivars out yielded Mediterranean ones with Italian cultivar Golia showing higher grain yield than Turkish cultivar Gönen. Crude protein values were higher in Mediterranean cultivars with higher nitrogen amount in those from temperate climate. Clear differences between cultivars were found in water use efficiency (WUE) with higher values in mid-European cultivars due to simultaneously higher Evapotranspiration Efficiency (ETE) and Harvest Index (HI). In field experiments (2 years) biomass and grain yield were strongly influenced by cultivar with higher values in Mid-European cultivars than in Gönen. Similar results were found for WUE which was higher in cultivars from temperate climate because of higher ETE and HI. Italian cultivar Golia reached level of mid-European cultivars either in biomass and grain yield but also WUE and ETE. Early drought in 2011 lowered yield only in Mediterranean cultivars compared to terminal drought in 2010. Yield in cultivars from temperate climate was stable between years.