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Leprosy in biblical times was a stigmatised skin disease. It was not an easily recognisable skin disease because any skin disease was suspected of being leprosy . However leprosy as a skin disease could not be hidden , because it showed quite easily . People who had contracted leprosy were considered impure and unclean and were cast out of society. Today however, we have a cure for people with leprosy and it is not considered a terminal disease. However, we have indeed an incurable disease, namely AIDS. My question is, how do we consider people with AIDS today, especially women. Are they being treated as unclean, even though we cannot see the disease, or are they also the outcasts of our society today? My guess is that women are the victims today, as much as they were in biblical times, rather than the perpetrators. Women living with AIDS today is what motivated me to investigate the ancient biblical times to see how women at that time coped with an incurable disease in a society that treated them as outcasts. Thus , my study will focus on women with leprosy in ancient biblical times , but also will include a section on women with AIDS today for the sake of relevance. / Thesis (M.Th.)-University of Natal, Pietermaritzburg, 2003.

Die Endprodukte der Tetrapyrrolbiosynthese sind essentiell für die Schwefel- und Stickstoffassimilation (Sirohäm), der von Photorezeptoren abhängigen Genexpression (Phytochromobilin), Elektronenübertragungsreaktionen (Häm) und der Photosynthese (Chlorophyll). Die Synthese von Chlorophyllen wird durch eine Mg-Chelatase (MgCh) eingeleitet, die durch das GENOMES UNCOUPLED 4 (GUN4) Protein stimuliert wird. GUN4 ist essentiell für die Aktivierung der MgCh und die Synthese von Chlorophyllen. Das GUN4 aus Arabidopsis thaliana wird ausschließlich an der vorletzten Aminosäure (S264) des C-Terminus phosphoryliert. Die in vitro und in vivo MgCh-Aktivität wird hingegen durch phosphoryliertes GUN4 nicht mehr stimuliert. De-phosphoryliertes GUN4 bewirkt die lichtabhängige Aktivierung der MgCh im Übergang von der Nacht zum Tag in Angiospermen. Im Laufe der Evolution photosynthetisch aktiver Organismen hat sich die in den Angiospermen hochkonservierte Phosphorylierungsstelle entwickelt. GUN4-Homologe aus Synechocystis oder Chlamydomonas werden nicht phosphoryliert. Im Rahmen der Suche nach der GUN4-spezifischen Proteinkinase wurden vier in den Plastiden lokalisierte PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION identifiziert. In dieser Arbeit wurden zusätzlich Experimente zum durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Signalweg durchgeführt. gun Mutanten sind durch eine defizitäre cytosolische Anthocyan-/Flavonoidbiosynthese charakterisiert. Auf der Suche nach Hinweisen für einen Zusammenhang zwischen Anthocyanen und der De-repression von PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES wurde eine neue gun Mutante identifiziert. Der knockout der durch TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) kodierten CHALCON SYNTHASE führte zu einer mit den gun Mutanten vergleichbaren De-repression der PHANGs nach Norflurazon-Behandlung. Pharmakologische Experimente belegen eine mögliche Funktion der Phenylpropanoidbiosynthese in der durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Kommunikation. / Endproducts of the tetrapyrrole biosynthesis pathway are essential for the assimilation of sulfur and nitrogen (siroheme), photoreceptor mediated control of nuclear gene expression (phytochromobilin), electron transfer reactions (heme) and photosynthesis (chlorophyll). The synthesis of chlorophyll is initiated by a Mg-chelatase (MgCh) which is stimulated by the GUN4 protein. GUN4 is essential for the activation of MgCh and synthesis of chlorophyll. GUN4 from Arabidopsis thaliana is exclusively phosphorylated at the next-to-last amino acid of the C-terminus (S264). The stimulatory impact towards MgCh is reduced upon GUN4 phosphorylation. De-phosphorylated GUN4 stimulates MgCh activity during the transition from night to daytime. The phosphorylation site of GUN4 has evolved in the clade of angiosperms. GUN4 homologs of Synechocystis or Chlamydomonas are not phosphorylated. In an attempt to isolate the GUN4-kinase four formerly unknown PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION were identified. In addition to the elucidation of the post-translational GUN4 modifications, experiments concerning the GUN-dependent retrograde signaling pathway were performed. Under conditions which lead to a block of chloroplast development the de-repression of PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES is paralleled by a reduced accumulation of anthocyanins in the gun mutants. When searching for a correlation between anthocyanin biosynthesis and expression of PHANGs a new gun mutant was identified. The knockout of CHALCONE SYNTHASE encoded by TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) leads to a comparable de-repression of PHANGs after norflurazon treatment as it was observed for the gun mutants. Pharmacological modification of phenylpropanoid biosynthesis revealed that an intermediate of the pathway is a component of chloroplast-to-nucleus communication. Hence, first evidences for a function of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in mediating the GUN-dependent retrograde signal were obtained.

Das COP9 Signalosom (CSN) ist ein hoch konservierter Proteinkomplex, der an der Regulation des Ubiquitin (Ub)-26S Proteasomsystems (UPS) beteiligt ist. Das UPS ist die wichtigste Proteolysemaschinerie in eukaryotischen Zellen, bei der Proteine über eine dreistufige Kaskade der Enzyme E1-E3 mit einer Ub-Kette markiert werden, die als Erkennungssignal für den Abbau durch das 26S Proteasom dient. Das CSN gilt als Paralog zum Lid, einem Subkomplex des 26S Proteasoms, und interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen, unter anderem mit E3-Ligasen und Kinasen. In dieser Arbeit konnte die direkte Bindung des CSN an das 26S Proteasom gezeigt werden, was zu einem Einfluss auf die Peptidaseaktivität des 26S Proteasoms in vitro führt. In Flag-Pulldown-Experimenten aus B8 Mausfibroblasten, die stabil mit Flag-CSN2 transfiziert waren, wurde ein vollständiger Flag-CSN-Komplex nachgewiesen, der mit dem 26S Proteasom assoziiert vorliegt. Co-Immunpräzipitationen beider Komplexe in vitro wiesen auf eine konzentrationsabhängige Verdrängung des Lid-Subkomplexes durch das CSN hin. Diese Interaktion führte zur Reduktion der proteolytischen Aktivität des 26S Proteasoms. Darüber hinaus wurde eine assoziierte deubiquitinierende Aktivität am CSN entdeckt und als USP15 identifiziert. Die Charakterisierung von USP15 zeigte, dass es durch die am CSN assoziierte Kinase CK2 phosphoryliert und stabilisiert wird. Erstmalig konnte durch Inhibitorstudien mit ortho-Phenanthrolin eine Metallabhängigkeit der Aktivität von USP15 nachgewiesen werden, die zur Identifizierung eines bisher unbekannten Zn-Fingers führte. Mutationsanalysen des Zn-Fingers zeigen, dass dieser für die Bindung und Spaltung von Ub-Ketten, nicht aber von linearen Ub-Konstrukten, notwendig ist. In Zellexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass USP15 die E3 Ligase Rbx1 stabilisiert, was vermutlich auf eine Umkehr der Autoubiquitinierung zurückzuführen ist. Das CSN scheint somit sowohl das 26S Proteasom als auch die E3-Ligasen direkt zu beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen eine Vertiefung der Erkenntnisse über das CSN als Regulator des UPS dar. / The COP9 signalosome (CSN) is a conserved protein complex that is involved in the regulation of the ubiquitin (Ub)/26S proteasome system (UPS). The UPS is the most important degradation machinery in eukaryotic cells. By the concerted action of three enzymes, E1-E3, proteins are labelled with a Ub-chain that serves as a recognition signal for the degradation by the 26S proteasome. The CSN is homologous to the lid, a subcomplex of the 26S proteasome, and interacts with numerous proteins, including E3 Ub ligases and kinases. In this study a direct interaction of the CSN with the 26S proteasome could be shown which has consequences for the peptidase activity of the 26S proteasome in vitro. In Flag-pull-down experiments from mouse B8 fibroblasts, that permanently expressed Flag-CSN2, an intact Flag-CSN complex was detected that is associated with the 26S proteasome. Co-immunoprecipitation of both complexes in vitro indicated a concentration-dependent replacement of the lid subcomplex by the CSN. This interaction led to a decrease of the proteolytic activity of the 26S proteasome. Moreover, a deubiquitinating activity associated with the CSN was discovered and identified as USP15. The USP15 was phosphorylated by the CSN-associated kinase CK2 that stabilised the enzyme. For the first time inhibitor studies with ortho-phenanthroline demonstrated a metal-dependency for the activity of USP15 that could be attributed to a formerly unidentified Zn-finger. Mutational analysis of the Zn-finger showed that it is necessary for the binding and cleavage of poly-Ub-chains but not for linear Ub-constructs. Cell culture experiments demonstrated a stabilisation of the E3 ligase Rbx1 by USP15 most likely by reversing its autoubiquitination. Therefore the CSN seems to directly influence the 26S proteasome as well as E3 ligases in their functions. These results expand the present knowledge on the CSN as a regulator of the UPS.

Fluorescence in blue light (FLU) ist ein negativer Feedbackregulator der Chlorophyllbiosynthese, welcher an der Dunkelrepression der 5-Aminolävulinsäure (ALA)-Synthese beteiligt ist. FLU ist Teil eines Komplexes, der die Enzyme umfasst, welche an der Katalyse der finalen Schritte der Chlorophyllbiosynthese beteiligt sind. Drei funktionelle Domänen wurden für das Arabidopsis FLU Protein postuliert: eine Tetratricopeptid-Wiederholungsdomäne (TPR) befindet sich am C-Terminus; eine Transmembrandomäne (TM) ist am N-Terminus lokalisiert; eine Coiled-coil-Domäne (linker) liegt dazwischen. Die TPR-Domäne von FLU Domäne interagiert mit dem C-terminalen Ende der Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der ALA-Synthese. Diese Arbeit zur Erweiterung des Wissen über die Funktion von FLU im Licht sowie über die Rolle der funktionellen Domänen von FLU bei der Inaktivierung der ALA-Synthese bei. / Fluorescence in blue light (FLU), a negative feedback regulator of chlorophyll biosynthesis, is involved in dark repression of 5-aminolevulinic acid (ALA) synthesis. FLU is part of a complex comprising the enzymes catalyzing the final steps of chlorophyll synthesis. Three functional domains were proposed in the Arabidopsis FLU protein: a tetratricopeptide repeat (TPR) domain is at the C-terminus; a transmembrane domain (TM) is at the N-terminus; a coiled-coil domain (linker) is in between. The TPR(FLU) domain interacts with the C-terminal end of glutamyl-tRNA reductase (GluTR), the rate-limiting enzyme of ALA synthesis. This thesis contributes to the extended knowledge about the function of FLU in light as well as the role of the structural domains of FLU in the inactivation of ALA synthesis.

Cyanobakterien sind die einzig bekannten Prokaryoten, die in der Lage sind oxygene Photosynthese zu betreiben. Sie besitzen ein großes Potenzial als nachhaltige Ressourcen für die Herstellung zahlreicher industriell und medizinisch relevanter Wirkstoffe. Trotz ihrer essentiellen Bedeutung ist jedoch das Wachstum von Cyanobakterien bis jetzt nur unzureichend verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich daher ein mathematisches Modell entwickelt, das das Wachstum von Cyanobakterien auf der Grundlage von intrazellulärer Proteinverteilung beschreibt. Dabei wurde das Proteom in wenige relevante Protein-Klassen unterteilt, die an fundamentalen zellulären Prozessen beteiligt sind, darunter Kohlenstoffaufnahme, -fixierung und -stoffwechsel, sowie Photosynthese und Proteintranslation. Besonders interessant sind die aus dem Modell resultierenden sogenannten mikrobiellen Wachstumsgesetze, sprich die Korrelationen zwischen der Wachstumsrate und der Proteinverteilung, die im stationären Zustand des Wachstums beobachtet werden. Das Modell prognostiziert eine charakteristische Krümmung für die Wachstumsgesetze jener Proteine, welche mit Lichtabsorption und Proteintranslation assoziiert werden. Verursacht wird diese Krümmung durch hohe Lichtintensitäten, die eine Abnahme der Wachstumsrate zur Folge haben. Die prognostizierten Wachstumsgesetze werden durch Proteindaten, die mittels Massenspektrometrie erhoben wurden, vom Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 gestützt. Des Weiteren bietet das Modell einen geeigneten Ausgangspunkt für die Erweiterung von der Charakterisierung von Einzelzellen zu einer Population von Zellen in einem lichtlimitierten Chemostat. Das erweiterte Modell stellt einen Zusammenhang her zwischen intrazellulärer Proteinverteilung, Wachstum der Population und Kultivierungseigenschaften, und bietet somit einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung und Verbesserung der Kultivierung von phototrophen Organismen und die Optimierung der photosynthetischen Produktivität. / Cyanobacteria are the only known prokaryotes that perform oxygenic photosynthesis, and therefore, hold significant potential as sustainable resources for the production of numerous industrially and medically relevant compounds. Despite their importance, however, the (molecular) limits and cellular economy of photoautotrophic growth are still insufficiently understood. In this thesis, I present a mathematical model based on a coarse-grained description of cellular protein allocation to describe cyanobacterial growth. The model describes cellular trade-offs considering only proteins that are involved in key cellular processes (carbon uptake, fixation, and metabolism, as well as photosynthesis and protein translation). Of particular interest are the resulting microbial growth laws, i.e., correlations between the growth rate and the protein distribution observed during balanced growth. The model predicts a characteristic kink for the growth laws of the light harvesting components and the translational machinery induced by photoinhibition, a decrease in growth rate due to high light intensities. The resulting growth laws are supported by quantitative mass spectrometry-based proteomics data of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The proteomics data shows that the mathematical model has intrinsic predictive power, and thus, provides a suitable starting point for extending it from describing single cells to describe a growing population in a light-limited chemostat. The extended modeling framework goes beyond current models using phenomenological growth equations and establishes a mechanistic link between intracellular protein allocation, population growth and cultivation properties. The extended model provides a novel approach to study and guide phototrophic cultivation improvements that maximize photosynthetic productivity.

Eisen (Fe) liegt an vierter Stelle in der Fülle von Elementen in der Erdkruste, aber Fe-Mangel ist ein weit verbreitetes Problem bei Pflanzen und Tieren, da die Fe-Oxide unlöslich sind. Fe-Mangel führt zu einer Verringerung der Pflanzenproduktivität und am deutlichsten zu einer erhöhten Fe-induzierten Anämie beim Menschen. Es wurde angenommen, dass die Biofortifizierung von Fe ein praktischer Ansatz zur Verbesserung der Nährstoffqualität in Pflanzen und damit auch in Lebensmitteln oder Tierfutter ist. In dieser Arbeit wurden neue Strategien zur Erhöhung des Fe-Gehalts in der Modellpflanze Arabidopsis getestet. Vakuoläre Fe-Transportgene der VTL-Familie wurden in Kombination mit dem neu entdeckten Fe-Regulierungsprotein IMA1oder dem Fe-Bindungspeptid NAS3 überexprimiert. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die Überexpression von VTL1, 2, 3, 4 oder 5, IMA1 oder NAS3 mit erhöhtem Eisengehalt im Samen korreliert. Die Expression der Gene für die Aufnahme von Fe und die Homöostase bestätigten den erhöhten Fe-Gehalt in diesen überexprimierenden Pflanzen. Die doppelte Überexpression der VTL-Gene in Kombination mit IMA1 oder NAS3 führte zu keinem weiteren Anstieg des Fe-Gehaltes, der wahrscheinlich durch die Regulation der VTL-Gene durch IMA1-Expression und den Mangel an erhöhtem Nicotianamin im Fall von VTL5 / NAS3-Überexpressionpflanzen verursacht würde. Zukünftige Forschung sollte der Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf Kulturpflanzen gewidmet sein. / Iron (Fe) ranks fourth in an abundance of elements in the Earth’s crust, but Fe deficiency is a widespread problem in plants and animals because of the insolubility of Fe oxides. Fe deficiency leads to reduce plant productivity and most significantly to enhanced Fe-induced anemia in humans. Fe biofortification has been suggested to be a practical approach for improving the nutritional quality of plants for food or feed. In this work, we have tested new strategies for increasing Fe content in the model plant Arabidopsis. Vacuolar Fe transport genes of the VTL family (VIT1-like) were over-expressed in combination with the newly discovered Fe regulatory protein IMA1 (IronMan1) or the Fe-binding peptide NAS3. Over-expression of each of the five VTL genes (VTL1 – 5) led to an increased Fe content by 2- to 3-fold in Arabidopsis seeds. IMA1 was greatly induced under Fe deficiency. Over-expression of IMA1 resulted in an Fe deficiency response also in Fe-sufficient plants. Fe content was an increase by 3-fold in seed, leaves, roots, and seedlings of Arabidopsis. The expression of Fe uptake and homeostasis genes was greatly induced in over-expressing plants independent of the Fe supply compared to the wild type. Analyses of NAS3 OE plants showed that Fe content in seeds was increased approximately 2-fold compared to WT. In conclusion, we have demonstrated that single over-expression of VTL1, 2, 3, 4 or 5, IMA1 or NAS3 correlated with increased seed Fe. Expression of Fe uptake and homeostasis genes confirmed the increased Fe content in these over-expressing plants. Double over-expression of the VTL genes in combination with IMA1 or NAS3 resulted in no further increase in Fe likely caused by the regulation of the VTL genes by IMA1 expression and the lack of increased nicotianamine in the case of VTL5/NAS3 over-expressing plants. Future research should be dedicated to extending these findings to crop plants.

Ultraschnelle Energietransferprozesse zwischen den Anregungszuständen organischer Pigmentmoleküle in photosynthetischen Lichtsammelkomplexen gehören zu den schnellsten bisher untersuchten biologischen Ereignissen. Diese Vorgänge wurden insbesondere auch für den Haupt-Antennenkomplex der höheren Pflanzen (LHCII) beobachtet, der mehr als die Hälfte des pflanzlichen Chlorophylls (Chl) bindet (5 Chl b und 7 Chl a pro Monomer). Offenbar ist dieser Pigment-Protein-Komplex entscheidend für Regulationsmechanismen verantwortlich, die eine schnelle Adaptation des Photosyntheseapparats an wechselnde Licht- bedingungen ermöglichen. Die Struktur von LHCII ist mit einer Auflösung von 3.4 Å bekannt und erlaubt (im Prinzip) die Berechnung des Anregungsenergietransfers auf Basis eines Förster-Mechanismus. In diesem Zusammenhang gibt es jedoch noch zahlreiche ungeklärte Fragen, die vor allem die Orientierung der Pigmente zueinander sowie deren mögliche starke (exzitonische) Wechselwirkung betreffen. Allerdings sind konventionelle spektroskopische Methoden nicht geeignet, diese Merkmale ausreichend aufzuklären. Aus diesem Grund wird in dieser Arbeit untersucht, inwieweit neuere laserspektroskopische Methoden wie die nichtlineare Polarisationsspektroskopie in der Frequenzdomäne (NLPF) zur Ermittlung unbekannter Parameter beitragen können. Anfänglich ergaben sich besonders Fragen der Anwendbarkeit der NLPF auf solche hoch- komplexen Untersuchungsobjekte sowie der Signifikanz eventuell erzielbarer Ergebnisse. Aufbauend auf einer parallel verfaßten Dissertation zu theoretischen Aspekten der NLPF- Methode [1] wurde daher ein vereinfachtes System modelliert, das die Heterogenität der individuellen Chl(e) im LHCII widerspiegelt. Die gewonnenen Resultate ließen vermuten, daß die reine Simulation von NLPF-Spektren nicht ausreicht, um eindeutige Aussagen über die Molekülparameter zu gewinnen. Um den benötigten zusätzlichen Erkenntnisgewinn zu erreichen, wurden daher Paralleluntersuchungen mit anderen laserspektroskopischen Methoden (nichtlineare Absorption mit fs-Pulsen, intensitätsabhängige NLPF, Einzelmolekülspektroskopie, Tieftemperatur-NLPF) sowie mit in vitro rekonstituierten Protein-Mutanten durchgeführt. Als Ergebnis konnte die Subbstruktur der Qy- Absorptionsbande der ersten angeregten Zustände der Chl(e) für LHCII ausreichend beschrieben werden. Darüber hinaus ergaben sich Aussagen zu exzitonischen Wechselwirkungen zwischen bestimmten Chl(en), die unter anderem Einfluß auf das Energie- transferverhalten haben. Diese zusätzlichen Untersuchungen erlaubten letztendlich eine Modellierung der bei Raum- temperatur an LHCII gemessenen NLPF-Spektren. Neben dem dabei implizit gewonnenen Verständnis der nichtlinearen optischen Eigenschaften im Bereich der Qy-Absorption ließen sich so Aussagen über bestimmte Modellparameter, besonders über die Orientierung von Übergangsdipolmomenten, ableiten. Abschließend wurde die Auswirkung der Erkenntnisse auf das Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen für intra- und inter-komplexen Energietransfer erläutert. / Ultra-fast excitation energy transfer (EET) between excited states of organic pigment molecules in photosynthetic antenna complexes belongs to the fastest observed biological processes. Such EET phenomena has been studied to a large extent for the main light- harvesting complex of the higher plants (LHCII), which appears to play an exceptional role for the regulatory function (i.e. light adaptation) of the plant photosynthetic apparatus. The structure of this pigment-protein complex harboring more than 50 % of the total chlorophyll (Chl) content is known with 3.4 Å resolution and reveals the binding sites of 5 Chl b and 7 Chl a per monomeric unit. Based on this structure analysis, EET calculations are (in principle) available on the molecular level under the assumption of Förster-type transfer. However, several molecular features like mutual pigment orientations and electronic interactions between their transition dipoles are still rather uncertain. Since conventional spectroscopic techniques can hardly reveal the corresponding parameters, this work was aimed at the evaluation of newly introduced laser spectroscopic techniques with respect to these questions. In the beginning, suitability and significance of the method when applied to highly complicated structures like pigment-protein complexes were studied by modeling heterogeneous, LHCII-like absorption systems in NLPF experiments. Based on recent improvements in the NLPF theory by a parallel theoretical investigation [1], these simulations clarified the sensitivity of the NLPF method on numerous physical parameters. As a major consequence, unambiguous evaluations of NLPF measurements appear to require substantial additional information about the investigated system. Accordingly, several supplementary methods like nonlinear absorption (using fs-pulses), intensity-dependent NLPF, single- molecule spectroscopy, and NLPF at low temperatures were employed. These investigations revealed unique information about excitonic interaction between certain Chl(s), including implications for the overall EET scheme. The sub-structure model for the Qy-absorption region of LHCII was further essentially improved by the analysis of reconstituted proteins with selectively modified Chl binding residues in the amino-acid sequence. The sum of all complementary investigations allowed finally the evaluation of room temperature NLPF measurements of trimeric LHCII. Due to the unique selectivity of the spectra to individual transition-dipole directions, several orientation parameters have been obtained. Under this point of view, the NLPF method has indeed revealed a high potential as compared to conventional techniques like circular dichroism spectroscopy. Moreover, the understanding of nonlinear phenomena in the Qy-absorption region of LHCII as a consequence of molecular interaction provides further knowledge for the application of other nonlinear optical experiments. Concluding, implications of the obtained results for the structure-function relationship of intra- and inter-complex EET were elucidated.

Genomweite Bemühungen haben eine große Anzahl langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs) identifiziert, obwohl ihre möglichen Funktionen weitgehend rätselhaft bleiben. Hier verwendeten wir ein System zur synchronisierten Blüteninduktion in Arabidopsis, um 4106 blütenbezogene lange intergene RNAs (lincRNAs) zu identifizieren. Blütenbezogene lincRNAs sind typischerweise mit funktionellen Enhancern assoziiert, die bidirektional transkribiert werden und mit verschiedenen funktionellen Genmodulen assoziiert sind, die mit der Entwicklung von Blütenorganen zusammenhängen, die durch Koexpressionsnetzwerkanalyse aufgedeckt wurden. Die Master-regulatorischen Transkriptionsfaktoren (TFs) APETALA1 (AP1) und SEPALLATA3 (SEP3) binden an lincRNA-assoziierte Enhancer. Die Bindung dieser TFs korreliert mit der Zunahme der lincRNA-Transkription und fördert möglicherweise die Zugänglichkeit von Chromatin an Enhancern, gefolgt von der Aktivierung einer Untergruppe von Zielgenen. Darüber hinaus ist die Evolutionsdynamik von lincRNAs in Pflanzen, einschließlich nicht blühender Pflanzen, noch nicht bekannt, und das Expressionsmuster in verschiedenen Pflanzenarten war ziemlich unbekannt. Hier identifizierten wir Tausende von lincRNAs in 26 Pflanzenarten, einschließlich nicht blühender Pflanzen. Ein direkter Vergleich von lincRNAs zeigt, dass die meisten lincRNAs speziesspezifisch sind und das Expressionsmuster von lincRNAs einen hohen Transkriptionsumsatz nahe legt. Darüber hinaus zeigen konservierte lincRNAs eine aktive Regulation durch Transkriptionsfaktoren wie AP1 und SEP3. Konservierte lincRNAs zeigen eine konservierte blütenbezogene Funktionalität sowohl in der Brassicaceae- als auch in der Grasfamilie. Die Evolutionslandschaft von lincRNAs in Pflanzen liefert wichtige Einblicke in die Erhaltung und Funktionalität von lincRNAs. / Genome-wide efforts have identified a large number of long non-coding RNAs (lncRNAs), although their potential functions remain largely enigmatic. Here, we used a system for synchronized floral induction in Arabidopsis to identify 4106 flower-related long intergenic RNAs (lincRNAs). Flower-related lincRNAs are typically associated with functional enhancers which are bi-directionally transcribed and are associated with diverse functional gene modules related to floral organ development revealed by co-expression network analysis. The master regulatory transcription factors (TFs) APETALA1 (AP1) and SEPALLATA3 (SEP3) bind to lincRNA-associated enhancers. The binding of these TFs is correlated with the increase in lincRNA transcription and potentially promotes chromatin accessibility at enhancers, followed by activation of a subset of target genes. Furthermore, the evolutionary dynamics of lincRNAs in plants including non-flowering plants still remain to be elusive and the expression pattern in different plant species was quite unknown. Here, we identified thousands of lincRNAs in 26 plant species including non-flowering plants, and allow us to infer sequence conserved and synteny based homolog lincRNAs, and explore conserved characteristics of lincRNAs during plants evolution. Direct comparison of lincRNAs reveals most lincRNAs are species-specific and the expression pattern of lincRNAs suggests their high evolutionary gain and loss. Moreover, conserved lincRNAs show active regulation by transcriptional factors such as AP1 and SEP3. Conserved lincRNAs demonstrate conserved flower related functionality in both the Brassicaceae and grass family. The evolutionary landscape of lincRNAs in plants provide important insights into the conservation and functionality of lincRNAs.

Zusammenfassung Thema dieser Arbeit sind zwei zentrale biochemische Aspekte der Proteinbiosynthese , wobei das Ribosom eine zentrale Komponente darstellt: erstens wird ein spezieller Faktor des Elongationszyklus in Pilzen, eEF3, und zweitens der proteinleitende Kanal bei der kotranslationalen Proteintranslokation durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) betrachtet. Für die Elongation der Polypeptidkette benötigen alle Organismen zwei Elongationsfaktoren, die GTPasen eEF1A (EF-Tu in Prokaryoten) und eEF2 (EF-G in Prokaryoten). Bei Fungi wird noch ein dritter Elongationsfaktor, eEF3, benötigt. Dieser Faktor ist eine ATPase mit ABC-Kassetten-Domänen. Durch einen nicht bekannten Mechamismus stimuliert er in Gegenwart von ATP die eEF1A-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle. Es wurde vorgeschlagen, dass eEF3 die Freisetzung von deacylierter tRNA aus der ribosomalen E-Stelle ermöglicht, und dadurch über allosterische Kopplung die Affinität der A-Stelle für Aminoacyl-tRNA erhöht. In dieser Arbeit wird die Kryo-EM Struktur von ribosomengebundenem eEF3 bei 13,3 Å vorgestellt. Dabei zeigt sich eine vollig neue ribosomale Bindungsstelle für eEF3 von der aus tatsächlich die Affinität für tRNA in der ribosomalen E-Stelle moduliert werden kann. Mit Hilfe der Kristallstruktur von eEF3 wurde ein molekulares Modell für eEF3 in seiner funktionalen Konformation generiert, welches die strukturelle Basis für die Aktivität dieses ABC-Proteins im Kontext der Translation liefert. Bei der kotranslationalen Translokation stellt der heterotrimere Sec61-Komplex einen signalsequenzgesteuerten proteinleitenden Kanal (PCC) dar, der die Translokation eines sekretorischen Proteins durch, oder die Integration von Membranproteinen in die ER-Membran erlaubt. Es wird angenommen, dass der aktive proteinleitende Kanal im ribosomengebundenen Zustand aus einer oligomeren Struktur mit mehreren Kopien des Sec61-Heterotrimers besteht. Die Kristallstruktur eines inaktiven PCC zeigt jedoch nur ein einziges Heterotrimer (Monomer), das auch im aktiven Zustand funktional sein könnte. In dieser Arbeit wird eine Kryo-EM-Struktur des aktiven proteinleitenden Kanals im Komplex mit einem translatierenden Ribosom aus Hefe präsentiert, die die bislang detailierteste Elektronendichtekarte für den PCC zeigt. Als charakteristisches Merkmal kann eine trichterförmige Pore auf der zytosolischen Seite visualisiert werden. Es wurden verschiedene molekulare Modelle für den aktiven Zustand in die Elektronendichte gedockt. Obwohl eine genaue molekulare Interpretation durch die Auflösung (12,3 Å) nach wie vor limitiert ist, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass nur ein einziges, geöffnetes Sec61-Heterotrimer im aktiven Kanal vorliegt. / This work presents cryo-EM structures of two active ribosomal ligands in yeast, namely eEF3 and Sec61. Protein synthesis requires two canonical elongation factors in all kingdoms. These are the GTPases eEF1A (EF-Tu in prokaryotes) and eEF2 (EF-G in prokayotes). In fungi, a third elongation factor eEF3 is required, which belongs to the ATP-binding cassette- (ABC-) protein family. This factor is essential for the binding of the aminoacyl-tRNA-eEF1A-GTP ternary complex to the A site of the ribosome and has been suggested to do so by facilitating the clearance of deacyl-tRNA from the ribosomal E-site. The cryo-EM structure of the ATP-bound form of eEF3 in complex with an 80S ribosome shows that eEF3 binds the ribosome in the post-translocational conformation using a novel binding site. From there the affinity for tRNA in the ribosomal E site could be easily modified. Using the crystal structure of eEF3, a molecular model for eEF3 was generated, which provides the structural basis for the activity of an ABC protein in the context of translation. In co-translational translocation the trimeric Sec61-complex serves as a signal sequence-gated protein-conducting channel (PCC) which allows the translocation of a secetory protein through and the integration of a membrane protein into the lipid bilayer of the ER. Bound to a ribosome, the active PCC seems to have an oligomeric structure consisting of several copies of Sec61-trimers. The crystal structure of an inactive PCC, however, shows only a single heterotrimer (monomer) which could also be functional in the active state. The cryo-EM structure of the active PCC in complex with a translating ribosome shows the hitherto most detailed electron density map for the PCC. The most characteristic feature is a funnel-shaped off-centered pore at the cytosolic side. Several models for the active state were docked into the EM-density. Although a precise molecular interpretation is limited by the resolution (12, 3 Å), a single copy of an opened Sec61-heterotrimer seems to be the most reasonable fit for the density.