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Interaction entre membrane plasmique et cytosquelette : Approche biomimétique pour l'étude des interactions entre ezrine, PIP2 et actineCarvalho, Kevin 20 November 2009 (has links) (PDF)
La membrane plasmique de la cellule est composée de lipides et interagit notamment avec le squelette de la cellule (le cytosquelette), par l'intermédiaire de protéines d'ancrages et de lipides clefs qui jouent un rôle spécifique dans certains types d'interactions. Parmi les protéines intervenant dans l'ancrage direct de la membrane plasmique au cytosquelette, des protéines de la famille des ERM (Ezrine, Radixine, Moésine) peuvent interagir spécifiquement avec un lipide, le phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2), d'une part et avec l'actine du cytosquelette d'autre part. Dans le but de comprendre les interactions entre membrane plasmique et cytosquelette, nous avons réalisé des expériences in vitro sur des systèmes comportant un nombre minimal de constituants : des vésicules géantes (GUV) contenant du PIP2, de l'ezrine recombinante et de l'actine purifiée. Nous avons mis en évidence que la liaison au PIP2 induit des changements conformationnels de l'ezrine. L'ezrine est alors capable d'interagir avec les filaments d'actine. Nous avons caractérisé quantitativement l'incorporation de PIP2 dans la membrane de vésicule géantes, et montré que l'interaction de l'ezrine avec les vésicule géante contenant du PIP2, induit un partitionnement du lipide dans la bicouche lipidique et conduit à la formation d'agrégats de PIP2 et d'ezrine sur la membrane. La connaissance des effets de l'ezrine sur les membranes contenant du PIP2 et la connaissance des différents mécanismes se produisant lors des interactions permettra de définir plus précisément le rôle de l'ezrine in cellulo.
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Le rôle mécanique de " power stroke " dans la contraction musculaireSheshka, Raman 21 September 2012 (has links) (PDF)
Cette thèse est consacrée à la modélisation du fonctionnement mécanique de l'interaction myosine II / actine, qui est responsable de la génération de force active dans les muscles squelettiques à l'échelle nanomérique. Les unités contractiles du muscle contiennent les filaments d'actine et de myosine, les derniers sont formés par un assemblage des myosines II. La myosine II est un moteur moléculaire qui s'attache et se détache périodiquement au filament d'actine en présence d'ATP. Afin de comprendre le phénomène de la contraction musculaire d'un point de vue mécanique, nous suivons l'approche développée par la communauté de cliquets Browniens, qui remplace l'interprétation chimique traditionnelle de génération de force active par une étude de la dynamique de Langevin des systèmes mécaniques avec des paysages énergétiques bien définis. Nous mettons l'accent sur le rôle du changement conformationnel, ou " power stroke ", dans le fonctionnement de la myosine II. Nous identifions le "power stroke" comme le principal moteur de la contractilité, ce qui reflète la réalité biologique. Nous proposons un modèle mécanique innovant et, en mettant l'accent sur le rôle actif de " power stroke ", nous établissons un lien entre les moteurs processifs et nonprocessifs. Dans cette thèse, nous présentons les premiers exemples de modèles de moteur moléculaire nonprocessif actionnés exclusivement par "power stroke " et exploitant le phénomène de la résonance stochastique.
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Etude et Imagerie de la polymerisation de l'actineSpitz, Jean-Alexis 08 November 2006 (has links) (PDF)
L'objet de l'étude présentée ici est le cytosquelette d'actine. Cet arrangement polymère dynamique est très impliqué à la fois dans la morphologie cellulaire mais aussi dans les phénomènes d'adhérence et de motilité cellulaires. La perturbation de cette dynamique et des fonctions qui lui sont associées est caractéristique de la transformation tumorale, ce qui fait de l'actine une cible pharmacologique anti-cancéreuse.<br />La thématique générale de ce manuscrit est l'étude et l'imagerie de la polymérisation de l'actine. <br />La première partie de ce manuscrit est consacrée au développement et à la validation théorique et expérimentale d'un test de mesure de la polymérisation in vitro de l'actine à partir d'extraits cellulaires. La polymérisation de l'actine est suivie grâce à l'augmentation de l'anisotropie de fluorescence d'un marqueur fluorescent, l'Alexa488, utilisé comme traceur dans les échantillons.<br />La deuxième partie présente le montage et la caractérisation d'un nouveau système d'imagerie de la durée de vie de fluorescence (FLIM) sous microscope par comptage monophotonique ainsi qu'un développement de cet instrument pour faire l'imagerie de l'anisotropie de fluorescence résolu dans le temps (trFAIM). Cet instrument, qui nous a déjà permis de faire l'imagerie de polymères d'actine, ouvre également des perspectives pour de nombreuses autres applications à la fois dans l'imagerie cellulaire (polymérisation de l'actine in vivo, calcium intracellulaire3, ...) mais également dans d'autres thématiques développées au PPSM (cristaux organiques fluorescents, nanolatex, ...).<br />Enfin, le troisième chapitre propose une technologie originale pour faire l'étude in vivo de la polymérisation de l'actine mettant en oeuvre une instrumentation de pointe issue de la physique appliquée des lasers. L'emploi d'un laser femtoseconde permet la nano-dissection, dans une cellule vivante, d'une fibre de stress d'actine dont on peut ensuite étudier le rétablissement.
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STRUCTURES, STABILITÉ ET FONCTIONS DU CYTOSQUELETTE D'ACTINE DANS LES OSTÉOCLASTES MÂTURESChabadel, Anne 09 July 2007 (has links) (PDF)
L'ostéoclaste est une cellule spécialisée dans la résorption de la matrice osseuse. Elle présente une organisation différente de l'actine selon les substrats sur lesquels elle est ensemencée. Sur verre ou plastique, l'actine est sous forme de "podosomes", alors que sur un substrat résorbable, elle se ré-organise en une ceinture conttinue, la zone de scellement (SZ). L'étude de cellules déficientes en WIP nous a permis de démontrer qu'un ostéoclaste sur verre forme 2 domaines d'actine distincts: les coeurs de podosomes et le nuage. Ces 2 domaines sont induits par différents récepteurs, CD44 et Beta3, polymérisés par des voies distinctes, et ont pour fonction l'adhérence et la contraction. Ils se ré-organisent en une unique structure, la SZ, quand l'ostéoclaste est transféré sur un substrat résorbable. Nous avons également démontré que le maintien de la ceinture de podosomes dépend d'un réseau de microtubules intact.
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Dynamique des filaments d'actine: de la molécule individuelle à la formation de structures organiséesMichelot, Alphée Tristan 06 July 2007 (has links) (PDF)
L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.<br />Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.
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Mécanismes moléculaires impliqués dans la résorption osseuseGeorgess, Dan 01 October 2013 (has links) (PDF)
Le remodelage osseux est un processus physiologique de renouvellement de l'os ancien par de l'os nouveau. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées géantes dont la fonction principale est de dégrader la matrice osseuse, première étape de ce remodelage. Le travail réalisé s'inscrit dans une thématique d'expertise de notre laboratoire, celle de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les ostéoclastes résorbants. Nous avons pu élucider le rôle de la formation des podosomes et de leur organisation collective sur l'adhérence et la migration ostéoclastique. Nos résultats ont démontré que l'assemblage de podosomes sous forme de structures circulaires dites " anneaux " exerce une force centripète sur le substrat et ainsi déclenche la migration de l'ostéoclaste. L'alternance entre apparition et disparition de ces anneaux au sein de la cellule résulte en une migration saltatoire universelle pour tous les ostéoclastes.L'objectif principal de cette thèse était de trouver de nouveaux gènes impliqués dans l'organisation des podosomes. Nous avons mis en place une analyse transcriptomique comparant les ostéoclastes avec d'autres cellules multinucléées géantes qui présentent des podosomes mais sont incapables de résorber l'os. Parmi la liste de six gènes établie par cette méthode, nous avons étudié RhoE. En exploitant la culture d'ostéoclastes primaires déplétés de RhoE, nous avons démontré que ce gène est essentiel pour la migration ostéoclastique et la résorption osseuse. Nous avons ensuite établi que RhoE agit comme antagoniste de la voie de Rock pour assurer le renouvellement d'actine au sein des podosomes, ce qui entretien la fonction ostéoclastique.
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Étude mécanique des gels d'actine branchésPujol, Thomas 11 December 2012 (has links) (PDF)
Les réseaux formés par les filaments d'actine jouent un rôle fondamental en mécanique cellulaire, puisqu'ils contribuent grandement à la forme des cellules, à leur capacité à migrer et à leurs propriétés mécaniques. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux propriétés mécaniques des gels d'actine branchés présents dans le lamellipode. Dans le cadre de ma thèse, nous avons développé une nouvelle technique de mesure basée sur l'attraction dipolaire entre des colloïdes magnétiques nous permettant de mesurer le module de Young de gels d'actine reconstitués à la surface des particules à l'aide de la machinerie Arp2/3. Notre technique nous permet de réaliserun très grand nombre de mesures.Les faibles barres d'erreur ainsi obtenues nous ont permis d'étudier, pour la première fois, le lien entre les propriétés microscopiques architecturales des gels et leur réponse mécanique. Nous avons observé une forte rigidification du gel avec une augmentation de la concentration en protéine nucléatrice des branches Arp2/3 et en protéine de coiffe gelsoline durant la croissance du gel, montrant ainsi un lien entre l'architecture du réseau et son élasticité. De plus, nous avons étudié le lien entre le module élastique des gels, la flexibilité des filaments et l'augmentation des contraintes internes. Ces différentes études pointent en direction d'une réponse mécanique des gels d'actine à structure dendritique d'origine enthalpique, contrairement aux gels d'actine polymérisés en solution, dont l'élasticité est d'origine entropique.
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Mécanismes Moléculaires impliqués dans les Myopathies: Analyses des interactions Dystrophine-Lipides.Sarkis, Joe 04 November 2011 (has links) (PDF)
La caractérisation de l'interaction de différentes biomolécules avec les lipides constitue une étape cruciale pour la compréhension du comportement et du mode d'action de ces molécules avec les membranes cellulaires. Nous présentons ici des études biomimétiques d'une protéine musculaire. Des modèles membranaires et des méthodes biophysiques ont été utilisées. La dystrophine est une protéine filamenteuse essentielle pour le fonctionnement musculaire. Son absence ou sa modification suite à des mutations ont responsables de myopathies. Dans cette étude, nous avons analysé les propriétés de certaines répétitions homologues à la spectrine du domaine central de la dystrophine. Nous caractérisons les interactions spécifiques de deux sous domaines constitués des répétitions 1 à 3 et 20 à 24 avec les lipides. Nous montrons d'autre part, que l'interaction et l'organisation des répétitions 11 à 15 avec des membranes anioniques et zwitterioniques sont modulées par la courbure membranaire et le packing lipidique. L'analyse de propriétés rhéologiques de surface montre que les répétitions 11 à 15 forment un lien fonctionnel entre la membrane et les filaments d'actine du cytosquelette. Cette liaison mécanique contribuerait in vivo au rôle d'amortisseur de chocs attribué à la dystrophine lors des cycles de contractions-relaxations musculaires. Dans une dernière partie de ce travail, nous avons étudié la relation structure-activité d'un "de novo" peptide antimicrobien, K4. Nous identifions un mécanisme d'action de type detergent-like, conférant l'activité antimicrobienne.
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Les billes magnétiques comme capteurs de force : application à la pression de croissance de filaments d'actineDémoulin, Damien 10 May 2012 (has links) (PDF)
Les colloïdes superparamagnétiques sont utilisés dans de nombreuses études pour appliquer une force sur des cellules ou des molécules d'ADN. Dans une première partie, nous explorons le processus physique par lequel ces objets acquièrent une imantation leur permettant d'exercer des forces. Nous montrons comment la présence de quelques gros grains ferromagnétiques dans les colloïdes leur permet de s'orienter dans un champ externe. La robustesse de ce modèle est démontrée par sa généralisation à plusieurs tailles de colloïdes et sa cohérence avec les propriétés du ferrofluide ayant servi à les fabriquer. Dans une seconde partie, la réaction de filaments d'actine à la pression exercée par des colloïdes superparamagnétiques est étudiée. Nous sondons ainsi le mécanisme par lequel la polymérisation d'actine peut générer les forces à l'origine du phénomène de motilité cellulaire. La maîtrise de l'organisation des filaments autorise à étudier deux situations idéales. Dans l'une les filaments sont très fluctuants, et nous montrons que leur longueur est indépendante de la force appliquée. Ceci n'est plus vrai dans la deuxième situation, où les filaments rigides poussent face à la charge. Nous mesurons ainsi pour la première fois l'effet d'une force sur la vitesse de polymérisation de l'actine. Un modèle numérique de type Brownian ratchet sans partage de la charge permet de décrire la force générée.
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Dynamique de l’actine : influence de l’architecture des réseaux d’actine sur le désassemblage par ADF/Cofiline / Actin dynamics : role of actin networks architecture in disassembly by ADF/Cofilin.Icheva, Tea Aleksandra 22 September 2017 (has links)
Le maintien de la morphologie et la production des forces par les cellules sont possibles grâce au cytosquelette, constitué de trois types de polymères protéiques dont les microfilaments d’actine. Les filaments d’actine s’organisent en différentes architectures, dont l’assemblage et le désassemblage sont étroitement contrôlés dans le temps et l’espace. En effet, une des caractéristiques d’un filament d’actine est son vieillissement, par l’hydrolyse progressive de l’ATP au sein des sous-unités. Pour assurer un renouvellement continu de l’ actine celle-ci doit donc être recyclée. Lorsque l’assemblage et désassemblage se compensent, les architectures d’actine sont alors dans un état stationnaire dynamique, dans lequel la concentration demonomères d’actine est perpétuellement renouvelée. Le désassemblage permet également de maintenir un réservoir important d’actine monomérique polymérisable, pour répondre rapidement aux besoins cellulaires. Le lamellipode, organe moteur de la cellule, est essentiellement composé d’unfeuillet fin mais très dense d’actine dendritique ainsi que de protéines régulatrices. Une protéine essentielle dans le turnover rapide du lamellipode est l’ADF/Cofiline. Elle est responsable du désassemblage des filaments âgés par fragmentation et pardébranchement. Jusqu’à présent, les études portaient le plus souvent sur les mécanismes microscopiques, à l’échelle du filament individuel. Or, pour comprendre la dynamique des réseaux branchés notamment au cours de la motilité cellulaire, il nous faut comprendre le désassemblage collectif et macroscopique du réseau d’actine dendritique. En combinant des milieux de motilité reconstitués à partir de protéinespurifiées à une nouvelle technique de micro-structuration de surfaces, j’ai pu reconstituer in vitro des réseaux dendritiques semblables au lamellipode. Ainsi, j’ai exploré au cours de ma thèse les paramètres qui contrôlent leur désassemblage macroscopique. Il en ressort que le désassemblage des réseaux dépend de leur architecture (densité) et de leur géométrie (taille) : les réseaux denses ou étendus sont moins efficacement désassemblés et restent cohésifs plus longtemps. Des modélisations montrent que c’est la déplétion locale en ADF/Cofiline autour du réseau d’actine qui semble responsable des effets observés. De plus, les réseaux constitués de densités d’actine hétérogènes acquièrent une directionnalité, qui peut être modulée par le désassemblage sélectif par ADF/Cofiline. Parallèlement, ces études ont permis de déterminer que pour avoir un réseau à l’état dynamiquestationnaire (ou à l’équilibre), il fallait atteindre un certain ratio d’ADF/Cofiline par actine. Ce travail a permis d’aller plus loin que les études fondamentales sur la fragmentation de filaments d’actine individuels, à l’échelle microscopique, et d’établir deux nouveaux paramètres qui contrôlent le désassemblage de réseaux d’actine dendritique à l’échelle macroscopique / Cells maintain their morphology and produce forces thanks to the cytoskeleton, which is composed of three types of protein polymers, amongst which the actin microfilaments. Actin filaments assemble into diverse architectures, which assembly and disassembly is tightly controlled in space and time. Indeed, the progressive hydrolysis of ATP in the monomers causes the actin filaments to age. Thus, actin needs to be recycled. When assembly and disassembly compensate, different actin architectures are in a dynamic steady state, in which the pool of actin monomers is renewed. Disassembly of actin structures also maintains a large reservoir of polymerization-ready monomers ready to assemble when needed by the cell.The lamellipodium is the locomotory organelle of the cell, and is made of a thin yet very dense sheet of dendritic actin network, with regulatory proteins. A pivotal protein is ADF/Cofilin, which is responsible of the disassembly of old actin filaments by fragmentation and debranching. To date, there have been extensive studies about the microscopic mechanisms, but if one wants to understand cell motility, one must decipher the collective and macroscopic disassembly of the dendritic actin network.By combining motility media reconstituted from purified proteins, and a new surface micro-patterning technique, I was able to reconstitute lamellipodium-like dendritic networks in vitro. During this thesis I explored the parameters that control the macroscopic disassembly of these networks. This work shows that the disassembly of dendritic actin networks depends on their architecture (density) and geometry (size): dense or extended networks are less efficiently disassembled and remain cohesive longer. Simulations show that these effects can be explains by a local depletion of ADF/Cofilin in the volume surrounding the network. Besides, networks of heterogeneous densities acquire directionality. This steering is modulated by selective disassembly of the networks by ADF/Cofilin. In parallel, these studies established a ratio at which networks are at a dynamic steady state.This work goes further than the fundamentally important studies about fragmentation of individual actin filaments, and establishes new parameters that control the disassembly of dendritic actin at the macroscopic scale.
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