O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, o efeito de diferentes tempos de pré-irradiação do fotossensibilizador na terapia fotodinâmica em biofilmes formados por Streptococcus mutans e Candida albicans, por meio da avaliação da carga microbiana. Os fatores em estudo foram: tempos de pré-irradiação do fotossensibilizador em 3 níveis (1, 2 ou 5 minutos). Para o controle do biofilme dentário cariogênico com aPDT foi utilizado o azul de metileno (0,01%) associado ao laser de diodo (&lambda;=660 nm). O digluconato de clorexidina (CHX a 0,12%) e a solução salina foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. O delineamento do estudo foi realizado em blocos completos e casualizados, sendo a amostra composta por 15 culturas de biofilmes de S. mutans, divididas aleatoriamente em 5 grupos e 15 culturas de C. albicans, também divididas em 5 grupos. O experimento foi realizado em triplicata (n=3) e as variáveis de resposta foram obtidas por meio de análise quantitativa da viabilidade bacteriana, expressa em unidades formadoras de colônia (UFC) por mm2 da área do espécime. Os dados obtidos foram analisados com o auxílio do teste one-way ANOVA e pós-teste de Tukey. Todas as análises foram efetuadas por meio do programa Graph Pad Prism 4.0, com nível de significância de 5%. Para o grupo de S. mutans, apenas a solução salina apresentou diferença estatisticamente significante quando comparada aos demais tratamentos (p<0.05), ou seja, o tratamento com aPDT, independentemente do tempo de irradiação aplicado, foi semelhante ao tratamento com CHX e ambos foram mais eficazes na redução do biofilme cariogênico, em comparação à solução salina. Para o grupo de C. albicans não houve diferença estatística entre os grupos (p>0.05). Portanto, pode-se concluir que o tratamento com aPDT diminuiu o número de UFCs de S. Mutans de forma semelhante à CHX, independentemente do tempo de pré-irradiação aplicado. Não foi possível constatar nenhum efeito desta terapia e dos diferentes tempos de pré-irradiação sobre o biofilme de C. albicans. Desta forma, o tempo de pré-irradiação de 1 minuto pode ser utilizado com o objetivo de reduzir a carga microbiana de S. Mutans. / The aim of the present study was to evaluate, in vitro, the effect of different pre-irradiation times of the photosensitizer in photodynamic therapy in biofilms formed by on by Streptococcus mutans and Candida albicans, through the evaluation of the microbial load. The factors under study were: times of pre-irradiation of the photosensitizer in 3 levels (1, 2 or 5 minutes). For the control of the cariogenic dental biofilm with aPDT, methylene blue (0.01%) was used in association with the diode laser (&lambda;=660 nm). Chlorhexidine digluconate (0.12% CHX) and saline were used as positive and negative controls, respectively. The study design was carried out in complete and randomized blocks. The sample consisted of 15 S. mutans biofilms cultures, randomly divided into 5 groups and 15 C. albicans cultures, also divided into 5 groups. The experiment was performed in triplicate (n = 3) and the response variables were obtained through quantitative analysis of bacterial viability, expressed in colony forming units (CFU) per mm2 of the specimen area. The data were analyzed with the aid of the ANOVA one-way test and Tukey\'s post-test. All analyzes were performed using the Graph Pad Prism 4.0 program, with a significance level of 5%. For the S. mutans group, only the saline solution presented a statistically significant difference when compared to the other treatments (p <0.05), that is, the treatment with aPDT, irrespective of the irradiation time applied, was similar to the treatment with CHX and both were more effective in reducing cariogenic biofilm compared to saline. For the group of C. albicans there was no statistical difference between the groups (p> 0.05). Therefore, it can be concluded that the treatment with aPDT reduced the number of CFUs of S. Mutans in a similar way to CHX, independently of the pre-irradiation time applied. No effect of this therapy or of the different pre-irradiation times on the C. albicans biofilm could be observed. In this way, the pre-irradiation time of 1 minute can be used to reduce the microbial load of S. mutans.

A incidência de infecções por fungos oportunistas na população de pacientes imunocomprometidos tem aumentado nos últimos anos, e estas são, principalmente, causadas por Candida albicans. Este patógeno oportunista pode crescer em diferentes formas, variando de levedura, pseudohifa e hifa e essa transição morfológica está associada com a virulência. Na transição de levedura para hifa, genes hifa-específicos são expressos e muitos deles codificam proteínas que possuem uma molécula de GPI (glicosilfosfatilinositol), mas a maioria (66%) das proteínas preditas ancoradas por GPI (PGAs), ainda possuem função desconhecida. Portanto, o objetivo deste trabalho, foi iniciar a caracterização funcional dos genes PGA13 e PGA58 através de análises in silico, da expressão diferencial dos RNAm sob condições ambientais diversas, e nos mutantes nulos TUP1 e EFG1, e a obtenção e caracterização fenotípica dos mutantes de PGA13: homozigoto nulo e de superexpressão. Os estudos realizados in silico indicam que PGA13 e PGA58 são reguladas pelos fatores transcricionais Efg1, Tec1 e Nrg1 e que possuem sítios potenciais de glicosilação. A análise transcricional desses genes mostra que ambos são regulados por Tup1 e que respondem aos estímulos NaCl (Cloreto de sódio), H2O2 (Peróxido de hidrogênio), etanol, cafeína, HCl (Ácido Clorídrico) e às condições hipo e hiperosmótica. Os mutantes nulos e de superexpressão de PGA13 e PGA58 foram obtidos e as linhagens que perderam o gene PGA13 tiveram um padrão de crescimento da colônia diferente da linhagem CAI-4 e foram mais sensíveis aos compostos SDS, Higromicina B e pH ácido, enquanto o mutante que superexpressava foi mais resistente. Estes resultados sugerem que Pga13 deve ter papel importante na parede celular, visto que a falta dela ocasionou maior sensibilidade a compostos que agridem a parede celular. / The incidence of opportunistic fungal infections in immunocompromised patients has increased in the last years. Candida albicans is the most commonly isolate in immunocompromised patients. C. albicans may grow in distinct morphologies: yeast, pseudohyphal and true hyphal. The switch between yeast and filamentous forms is strongly associated with virulence. During the transition, hyphal-specific genes are expressed and many of these genes encode glycophosphatidylinositol (GPI)- anchored proteins. The majority (66%) of predited GPI proteins has unknown functions. The purpose of this work was to functionally characterize the novel PGA13 and PGA58 genes. To accomplish this task, we have made in silico promoter analysis, mRNA differential expression analysis under some environmental conditions. We have also verified whether those genes are regulated by Tup1 and Efg1 transcriptional regulators. We have knocked out PGA13 and have done phenotypic analysis of the resulting PGA13 null mutant strain and a Pga13 overexpressing strain. The in silico promoter analysis indicates that PGA13 and PGA58 may be regulated by the transcriptional factors Efg1, Tec1 and Nrg1. PGA13 and PGA58 aminoacid sequence analysis revealed that they have potential glycosylation sites. The transcriptional analysis has shown that both genes are regulated by the morphogenesis negative regulator Tup1. PGA13 and PGA58 genes have differential expression in response to salt, hydrogen peroxide, ethanol, caffein, and acid stresses, and also to hypo and hyperosmotic shocks. The phenotypic analysis shows that the pga13/pga13 mutant was more sensitive to SDS, Hygromycin B and acid pH in a plate dilution sensitivity test. Interestingly, the overexpressing mutant strain was more resistant to the same compounds. Taken together these results suggest that PGA13 may have an important role in the cell wall since its absence leads to higher sensitivity to compounds that affect this organelle.

A Estomatite protética associada a Candida (EPC) acomete a mucosa bucal em contato com próteses removíveis e, clinicamente, caracteriza-se por eritema com diferentes graus de inflamação. Esta doença é considerada de etiologia multifatorial, isto é, uma associação de fatores como trauma, falta de higienização, uso contínuo da prótese, hipersensibilidade ao material usado na dentadura, diabetes, terapia imunossupressora e infecção por fungo, como diferentes espécies de Candida. Os principais fatores de virulência deste fungo são a formação de hifas, dimorfismo, alterações fenotípicas, aderência, persistência, sinergismo com as bactérias, interferências com o sistema de defesa do hospedeiro e a produção de enzimas hidrolíticas. Dentre as enzimas hidrolíticas, a proteinase aspartil secretada (SAP) é uma das mais importantes para a patogenia de C. albicans, sendo nociva para o tecido epitelial e para o sistema imune do hospedeiro. Não está totalmente compreendida a real penetração do fungo nos tecidos e sua correlação com a presença da SAP, na doença estomatite protética. Essa dificuldade de avaliação pode ser justificada pelas divergências intrínsecas e extrínsecas observadas em muitos aspectos, como diferentes costumes, hábitos sociais, estado emocional e fisiológico. A utilização de um modelo experimental em animais poderá minimizar essas divergências e fornecer condições mais padronizadas para o experimento. Neste trabalho, foram avaliadas, quantitativamente, a expressão gênica das enzimas SAP-2, SAP-5 e SAP-9, presentes no biofilme formado na superfície interna das placas acrílicas superiores de ratos e, microscopicamente, a invasão do fungo no tecido epitelial do palato. Para isso, foram selecionados 49 ratos Wistar, com 90 dias de vida, pesando em média 300g, os quais foram divididos em 3 grupos: Controle, Placa/Candida e Placa, acompanhados durante 2, 4 e 6 dias. Os resultados demostraram que, em 4 dias de uso da placa acrílica contaminada, houve, em alguns ratos, sinais clínicos de inflamação no palato duro; microscopicamente, hiperplasia epitelial, hiperqueratinização, invasão fúngica nas camadas superficiais do revestimento epitelial, microabscessos de Munro e hiperplasia papilar; e maior percentual de neutrófilos no Grupo Placa/Candida em relação aos Grupos Controle e Placa. Também no quarto dia de uso da placa acrílica superior, no Grupo Placa/Candida, o biofilme formado na sua superfície interna apresentou a mais alta expressão gênica relativa das enzimas SAP-2, SAP-5 e SAP-9 que os períodos de 2 e 6 dias de uso. Assim, a invasão fúngica no revestimento epitelial do palato duro pode estar correlacionada com a alta expressão de RNAm das SAPs -2, -5 e -9. / Denture stomatitis (D.S.) affects the oral mucosa in contact with removable dentures, and clinically characterized by erythema with varying degrees of inflammation. This disease is considered a multifactorial etiology, with a combination of factors such as trauma, lack of hygiene, continuous use of stents, hypersensitivity to the material used for dentures, diabetes, immunosuppressive therapy and fungal infection, such as different species of Candida. The main virulence factors of the fungus are the formation of hyphae, dimorphism, phenotypic changes, adherence, persistence, synergism with bacteria, interference with the host defense system and the production of hydrolytic proteins. Among the hydrolytic proteins, the secreted aspartyl proteinase (SAP) is one of the most important in the pathogenesis of C. albicans. SAP is harmful to both the epithelial tissue and to the host\'s immune system. It is not fully understood the real penetration of the fungus in the epithelium tissue and its correlation with the presence of SAP, in denture stomatitis. This difficulty in evaluation can be justified by the intrinsic and extrinsic differences observed in many aspects, different customs, social`s habits, emotional and physiological state. Using an experimental animal model may minimize these differences and provide more standardized conditions for the experiment. In the present work, the aim was to evaluate quantitatively the gene expression of enzymes SAP-2, SAP-5 and SAP-9 of the biofilm formed in internal surface of rat`s upper acrylic plates, and to analysis microscopically, the fungal invasion in palatal epithelial tissue. 49 Wistar rats were selected, 90 days old, weighing on average 300g. They were divided into three groups: Control Group, Plate/Candida and Plate, follow by 2, 4 and 6 days of the use of the plates. The results demonstrated, in four days of use of the acrylic plate, clinical signs of inflammation in the hard palate; microscopically epithelial hyperplasia, hyperkeratinization, fungal invasion in the superficial layers of the epithelial lining, Munro`s microabscess and papillary hyperplasia; and higher percentage of neutrophils in the Plate/Candida Group, compared to Control and Plate Groups. In the period of 4 days, the relative gene expression of the SAPs-2, -5 and -9 in biofilm also showed to be higher in Plate/Candida Group, compared with the periods of 2 and 6 days. Thus, the fungal invasion in the epithelial lining of the hard palate may be correlated with high mRNA expressionn of SAPs -2, -5 e -9.

A Hiperplasia Papilar (HP) é considerada uma forma de candidose bucal, em especial uma forma de estomatite por dentadura, tipo III segundo a classificação de Newton (1962), a qual obedece a critérios clínicos e microscópicos. Sua etiologia é ainda pouco esclarecida, mas diversos fatores têm sido associados, tais como próteses dentárias mal adaptadas, má higiene oral, material utilizado na confecção das próteses resultando em hipersensibilidade, trauma, imunodeficiência e o fungo Candida albicans. A aderência e a invasão deste fungo no tecido epitelial já foram comprovadas e relatadas na literatura, entretanto ainda não há trabalhos que identifiquem a presença e a localização exata do fungo C. albicans no revestimento epitelial das lesões de HP. Os linfócitos T e os macrófagos são as principais células envolvidas no mecanismo de defesa do hospedeiro contra leveduras do gênero Candida, contudo é necessário estabelecer uma relação entre a presença do fungo e as alterações epiteliais, bem como o tipo e intensidade do infiltrado inflamatório presente nas HPs. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a presença de Candida albicans no revestimento epitelial de lesões de HP, por meio de imunofluorescência, e correlacionar os valores quantitativos obtidos com as características demográficas, do epitélio e do infiltrado inflamatório subepitelial. Mucosa palatal normal foi utilizada como controle. A análise estatística comparativa múltipla entre o número médio de fungos nos diferentes grupos experimentais (Grupo HP e Grupo controle) foi obtida pelo teste de Mann Whitney, e a correlação do número médio de Candida albicans imunomarcadas com as características do revestimento epitelial e do infiltrado inflamatório subepitelial por meio do teste de Spearman. Em ambos os testes, foram adotados o nível de significância de 5% (p<0,05). Apenas as lesões de HP demonstraram a presença de C. albicans, e o número médio foi de 14 C. albicans/mm2. Não se observou correlação entre o número médio de C. albicans e as diferentes características epiteliais ou do infiltrado inflamatório subjacente ou ainda as características demográficas. / The papillary hyperplasia (PH) is considered a form of oral candidosis, in particular a form of denture stomatitis, type III according to the classification of Newton (1962), which fulfills the clinical and microscopic criteria. Its etiology is still unclear, but several factors have been associated, such as prostheses poorly adapted, poor oral hygiene, material used in the manufacture of prostheses resulting in hypersensitivity, trauma, immune and fungus Candida albicans. The adhesion and invasion of this fungus in the epithelial tissue have been demonstrated and reported in the literature, however there is not a work to identify the presence and exact location of the fungus C. albicans in the epithelial lining of the lesions of PH. T-lymphocytes and macrophages are the main cells involved in host defense mechanism against the yeast of Candida, however it is necessary to establish a relationship between the presence of the fungus and the epithelial changes, and the type and intensity of inflammatory infiltrate present in PHs. This study aimed to evaluate the presence of Candida albicans in the epithelial lining of lesion of PH, by immunofluorescence and to correlate the quantitative values obtained with the demographic characteristics, the epithelium and the subepithelial inflammatory infiltrate. Normal palatal mucosa was used as control. Comparative statistical analysis between the multiple number of fungi in different experimental groups (PH group and Control group) was obtained by Mann Whitney test, and correlation of the average number of Candida albicans immunomarked with the characteristics of the epithelial lining and subepithelial inflammatory infiltrate by Spearman test. In both tests were used a significance level of 5% (p <0.05). Only the lesions of PH demonstrated the presence of C. albicans, and the average number was 14 C. albicans/mm2. There was no correlation between the average number of C. albicans and the different characteristics of epithelial or underlying inflammatory infiltrate or demographic characteristics.

Os leucotrienos aumentam a fagocitose e a atividade microbicida contra uma série de patógenos. Em macrófagos alveolares, LTB4 e LTD4 aumentam a fagocitose via Fc&#947;R de modo dependente de PKC. Entretanto, o papel das isoformas específicas da PKC, das MAPK, e da PI3K neste processo, ainda não é conhecido. Além disso, pouco se sabe sobre a importância dos leucotrienos na fagocitose via outros receptores. Os objetivos deste trabalho são: a) ampliar o conhecimento sobre as vias de sinalização ativadas pelos leucotrienos durante a fagocitose de hemácias opsonizadas por IgG; b) avaliar o efeito dos leucotrienos na fagocitose de Candida albicans, por macrófagos alveolares e as vias de sinalização intracelular envolvidas. Observou-se que os leucotrienos endogenamente produzidos ou adicionados aos macrófagos alveolares, aumentam a fagocitose via Fc&#947;R e para isso utilizam distintas vias de sinalização intracelular. A ação do LTB4 envolveu predominantemente a via ERK1/2 e PKC&#945;. E com menor intensidade da PKC&#948;. A ação do LTD4 envolveu exclusivamente a via p38 e PKC&#948;. Ambos leucotrienos utilizaram a PI3K para aumentar a fagocitose via Fc&#947;R. Na fagocitose de C.albicans, os macrófagos alveolares produziram LTB4. Tanto o LTB4 quanto o LTD4 endógenos contribuíram para a fagocitose da C.albicans que ocorre predominantemente via receptor manose. A fagocitose via receptor manose foi potencializada pela adição tahto do LTB4 quanto do LTD4 c&#947; de modo dependente da ativação da PKC&#948; e da PI3K. As vias da PKC&#945;., ERK1/2 e p38 não estão envolvidas na potencialização da fagocitose de C.albicans por leucotrienos. O esclarecimento das moléculas sinalizadoras envolvidas na interação de macrófagos alveolares com patógenos poderá contribuir para o desenvolvimento de alvos específicos e refinados no controle e tratamento de infecções pulmonares. Analisados em conjunto, os resultados mostram que os leucotrienos são importantes moduladores das funções dos macrófagos alveolares, por aumentar a fagocitose tanto através dos receptores para Fc&#947; como do receptor manose. Além disso, os LTB4 e LTD4 ativam programas de sinalização distintos para potencializar a fagocitose via receptor Fc&#947;, enquanto na fagocitose via receptor manose os LTB4 e LTD4 usam as mesmas vias. / Leukotrienes enhance phagocytosis and microbicidal activity against several pathogens. In alveolar macrophages, LTB4 and cysteinyl LT both enhance Fc&#947; receptor - mediated phagocytosis. While both LTB4 and LTD4 enhances phagocytosis dependent on PKC activity, only LTB4 requires the protein tyrosine kinase syk to do so. However, the role of specific PKC isoforms, MAPKs (p38 and ERK1/2), and PI3K in mediating LT-enhanced Fc&#947;R-mediated phagocytosis is unknown. In addition, the importance of LT in the phagocytosis via other receptors is also understudied. In the present work we sought to determine the importance of the above kinases during IgG-opsonized phagocytosis and if both classes of LT enhance the ingestion of C. albicans; the receptors and the molecular mechanisms involved. Studies with isoform-selective inhibitors indicated that LTB4 effects were dependent on both PKC&#945. And PKC&#948;, while LTD4 effects were exclusively due to PKC&#948; activation. Although both exogenous LTB4 and LTD4 enhanced p38 and ERK1/2 activation, LTB4 required only ERK1/2, while LTD4 required only p38 activation. Activation by both LT was dependent on PI3K activation. It was found that exogenously added LTB4 and LTD4 both enhanced PKC& and PKC&#945;. Phosphorylation during Fc&#947;R engagement. Regarding the studies concerning the importance of LT in the ingestion of C.albicans, both endogenous and exogenous LTB4 and LTD4 enhanced C.albicans phagocytosis. LT effects were dependent exclusively on PKC&#948; and P13K. We also demonstrated that the LT effect on C.albicans was due to the mannose receptor activation. Taken together, leukotrienes are potente immunomodulators of the phagocyte function, by enhancing phagocytosis both via Fc&#947;R and mannose receptor. Moreover, LT receptors activate different signaling programs to enhance Fc&#947;R-mediated phagocytosis, while the signaling elicited to enhance C.albicans ingestion is similar for both classes of LTs. Thus the nature of the signaling elicited by the phagocytic receptors dictates the signaling induced by LT.

Investigamos a ocorrência de espécies de leveduras isoladas em um hospital infantil. Pesquisamos a presença de C. dubliniensis; investigamos as espécies do complexo Candida parapsilosis e estudamos as espécies deste complexo quanto a produção de biofilme. Pesquisamos os fatores relacionados a virulência e o perfil de sensibilidade pelo método Etest®. Dentre os anos em estudo C. albicans foi a levedura mais isolada com 36.45% seguida de C. tropicalis 23.36%, C. parapsilosis sensu stricto 21.49%, Pichia anômala 5.61%, C. guilliermondii 4.67%, C. krusei 2.80%; C. orthopsilosis 1.87%, C. glabrata 1.87%, C. metapsilosis 0.94%, C. pararugosa 0.94%. C. dubliniensis não foi isolada nesta pesquisa. No estudo do complexo Candida parapsilosis, C. parapsilosis sensu estricto foi a espécie mais prevalente. Produziram biofilme apenas oito amostras de C. parapsilosis sensu estricto e uma amostra de C. orthopsilosis. As espécies não-albicans produziram mais proteinase e hialuronidase do que C. albicans. No estudo da fosfolipase e hemolisina, C. albicans foi a espécie mais produtora. Todas as amostras foram sensíveis para anfotericina B e para fluconazol quatro amostras foram resistentes. Duas amostras foram resistentes para caspofungina. / We investigated the occurrence of yeast species isolated in a public hospital. We researched the presence of C. dubliniensis and investigated the species within the complex Candida parapsilosis and studied this complex in relation to biofilm´s production. We also investigated the factors related to virulence and studied the sensibility profile by the \"Etest ®\" method. During the years of study, C. albicans was the most isolated yeast with 36.45% followed by C. tropicalis 23,36%, C. parapsilosis sensu stricto 21,49%, Pichia anomala 5,61%, C. guilliermondii 4.67%, C. krusei 2.80%, C. orthopsilosis 1.87%, C. glabrata 1.87%, C. metapsilosis 0.94%, C. pararugosa 0.94%. C. dubliniensis was not isolated in this study. In the study of Candida parapsilosis complex, C. parapsilosis sensu stricto was the most prevalent species. Only eight strains of C. parapsilosis sensu stricto and one strain of C. orthopsilosis produce biofilm. The non-albicans species showed greater activity of the proteinase and hyaluronidase than C. albicans. In the study of hemolysin and phospholipase, C. albicans was the most producer. All strains were susceptible to amphotericin B and to fluconazole four were resistant. For caspofungin, two strains were resistant.

Estomatite protética associada a Cândida (EPC), a lesão mais frequente em usuários de próteses removíveis, principalmente os idosos, caracteriza-se por uma inflamação da mucosa bucal que suporta a prótese. Está fortemente associada com Candida Albicans, bem como com fatores locais e sistêmicos, como a deficiência da resposta imune. Os monócitos são importantes na resposta protetora contra o fungo, produzindo citocinas que recrutam e ativam leucócitos. Existem alterações funcionais dessas células com o avanço da idade. Não foi possível encontrar na literatura dados referentes à função imunomodulatória dos monócitos de idosos com EPC. O presente trabalho pretendeu avaliar a produção de citocinas por essas células, estimuladas in vitro com C. albicans, obtidas do sangue periférico de idosos usuários de prótese total superior (PTS) com EPC, comparando-se com idosos usuários de PTS sem EPC, e com idosos e jovens não usuários de PTS. Os monócitos isolados foram cultivados em placas de cultura de 24 poços, na ausência ou presença de lipopolissacarídeo (LPS) ou C. albicans ATCC 90028 morta pelo calor. Após 18 horas, o sobrenadante foi coletado e submetido ao ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA) para dosagem das citocinas pró- inflamatórias fator de necrose tumoral- (TNF-), interleucina-6 (IL-6), IL-1, CXCL8 e proteína quimiotática de monócito (MCP-1), e anti-inflamatórias IL-10 e fator transformador de crescimento- (TGF-). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão dos valores obtidos para cada grupo, e foram analisados por meio de testes estatísticos não-paramétricos. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os resultados demonstraram, de uma forma geral, alterações nos monócitos oriundos dos idosos com EPC, em comparação aos outros grupos: menor produção espontânea de CXCL8 e de MCP-1; menores níveis de TNF-, de IL-6, de IL-1, de CXCL8, de MCP-1 e de IL-10, após estímulo com LPS; e menor produção de TNF- e de IL-6, após estímulo com C. albicans. Comparando-se idosos e jovens, independente da presença de EPC, os resultados revelaram alterações nos monócitos dos idosos: uma menor produção de TGF-, espontânea e após estímulo com C. albicans. Em conclusão, a disfunção na produção in vitro de citocinas pró e anti-inflamatórias pelos monócitos de idosos com EPC pode representar um aspecto adicional associado à suscetibilidade ao desenvolvimento e à persistência da EPC. Ainda, a disfunção nos monócitos dos grupos de idosos, quanto à produção in vitro de TGF-, pode representar aspectos referentes à imunossenescência. / Candida-associated denture stomatitis (DS), the most frequent lesion among denture wearers, especially the elderly, is characterized by inflammation of the denture-bearing mucosa. It is strongly associated with Candida albicans, as well as with local and systemic factors, such as impaired immune response. Monocytes are important in the protective immune response against the fungus, by the production of cytokines that recruit and activate leukocytes. There are functional changes of these cells with advancing age. No data were found in the literature concerning the immunomodulatory function of these phagocytes in elderly patients with DS. This study aimed to evaluate the cytokine production by monocytes, challenged in vitro with C. albicans, obtained from peripheral blood of elderly denture wearers with DS, compared with elderly denture wearers without DS and elderly and young non-denture wearers. The isolated monocytes were cultivated in 24-well flat-bottomed culture plates, in the absence or presence of lipopolysaccharide (LPS) or heat-killed C.albicans ATCC 90028. After 18 hours, the supernatant was collected and submitted to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha (TNF-), interleukin-6 (IL-6), CXCL8, IL-1, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and anti-inflammatory cytokines IL-10 and transforming growth factor- (TGF-). The results are expressed as mean ± standard deviation of the values obtained for each group, and were analyzed using nonparametric statistical tests; p values <0.05 were considered statistically significant. The results demonstrated, in general, changes in monocytes from the elderly with DS, as compared to other groups: lower spontaneous production of CXCL8 and MCP-1; lower levels of TNF-, IL-6, IL-1, CXCL8, MCP-1 and IL-10 after stimulation with LPS; and reduced production of TNF- and IL-6 after stimulation with C. albicans. Comparing young and old, regardless of the presence of DS, the results revealed changes in the monocytes of the elderly: a lower production of TGF-, spontaneous and after stimulation with C. albicans. In conclusion, the dysfunctional in vitro production of pro- and anti-inflammatory cytokines by monocytes from elderly patients with EPC may represent an additional aspect associated with susceptibility to the development and to the persistence of DS. Still, the dysfunction in monocytes of elderly groups, regarding the in vitro production of TGF-, may represent aspects related to immunosenescence.

A candidose bucal acomete grande número de pessoas mundialmente, sendo associada a condições como imunossupressão, radioterapia, tabagismo, higiene bucal, idade, xerostomia e uso de próteses removíveis. Uma importante abordagem terapêutica para essas infecções consiste nos medicamentos antifúngicos, que podem apresentar efeitos colaterais e resultar na resistência dos patógenos. Nesse contexto, a terapia fotodinâmica (PDT) faz-se interessante como alternativa capaz de minimizar essas limitações. Protocolos de PDT poderão ser mais facilmente assimilados à prática clínica se empregarem materiais já aprovados para uso odontológico. Sendo assim, este estudo propõe avaliar o uso de PDT com eritrosina como fotossensibilizador, irradiada por um LED azul, usando-se um modelo animal. Quarenta camundongos tiveram candidose induzida sobre o dorso da língua por meio de imunossupressão e inoculação com Candida albicans. Após estabelecimento da lesão durante cinco dias, os animais receberam um dentre quatro tratamentos possíveis: aplicação da eritrosina 5% seguida de irradiação pelo LED (E+L+); aplicação de eritrosina, somente (E+L-); salina seguida pela irradiação (EL+); e somente salina (E-L-). A fim de distinguir possíveis efeitos colaterais, os mesmos tratamentos foram aplicados em 12 camundongos sem a indução de candidose. O número de unidades formadoras de colônia de C. albicans foi contado após o tratamento, e a mucosa foi submetida à análise histológica para determinar o grau de inflamação. Os dados dos grupos foram comparados por meio de ANOVA e teste de Kruskal-Wallis, (&alpha;=0,05). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos testados quanto à contagem de colônias de C. albicans e o grau de inflamação. O infiltrado inflamatório foi classificado como discreto na maioria dos casos. Os animais com candidose bucal induzida e os saudáveis que foram submetidos aplicação de eritrosina 5% e irradiação pelo LED apresentaram infiltrado inflamatório mais acentuado e lesões mais evidentes na camada epitelial, sugerindo que este protocolo ocasionou danos aos tecidos orais. / Oral candidosis affects many people worldwide and is associated with conditions such as immunosuppression, radiation, smoking, oral hygiene, age, xerostomia and use of removable prostheses. An important therapeutic approach for these infections consists of antifungal drugs, which have side effects and can result in the resistance of pathogens. In this context, photodynamic therapy (PDT) is an interesting alternative able to overcome those limitations. PDT protocols can be more easily assimilated in clinical practice if they employ materials already approved for use in dentistry. Thus, this study evaluate the PDT with the use of erythrosine as a photosensitizer, irradiated by a blue LED light, using an animal model. Forty mice had candidosis induced on the tongue by the immunosuppression and inoculation with Candida albicans. After five days that the lesion is established, the animals received one of four possible treatments: application of 5% erythrosine and irradiation by the LED (E+L+); erythrosine application, only (E+L- ); saline followed by irradiation (E-L+); and only saline (E-L-). In order to distinguish potential side effects, the same treatments were applied in 12 mice without induced candidosis. Colony-forming units (CFU) of C. albicans were counted after treatment, and the mucosa was subjected to histological analysis to determine the degree of inflammation. The data of the groups were compared using ANOVA and Kruskal-Wallis test (&alpha;=0.05). No significant difference was detected among the groups tested for the number of CFU of C. albicans and the degree of inflammation. The inflammatory infiltrate was classified as mild in most cases. Animals with induced oral candidosis and the healthy ones exhibited more pronounced inflammatory infiltrate and lesions in the epithelial layer following PDT by 5% erythrosine and irradiation by the LED light. Such findings suggest that this protocol resulted in damage to oral tissues.

Despite therapeutic advances, opportunistic fungal infectious diseases have increased in prevalence and have become a universal public health problem. Candida albicans (CA) is a commensal fungus that under certain environmental conditions can act as an opportunistic pathogen and colonize mucous membranes and tissues causing local and systemic infections. The emergence of drug resistant strains, as well as the increase of immunosuppressed patients, has limited therapeutic options. Therefore the aim of this study was to evaluate 1) The antifungal activity of Punicalagin (P), alone or in combination with Nystatin (N), against two CA strains. 2) The cytotoxicity effect of P and N, as well as the combination of both, on human primary cells. In the first step, yeasts of CA ATCC 90028 and SC5314 were exposed to P and N for 24 hours. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of P (50 g/mL) and N (3.9 g/mL) were determined by the broth microdilution assay. The Checkerboard Assay was performed to verify the synergism between the combinations (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 and P/2 N/2), which were selected from the 56 combinations initially tested. The fungal metabolism was assessed by the metabolic reduction assay XTT (24h) and Minimum Microbicidal Concentration (MMC) was determined by Colony-forming unit (CFU/mL, 24h). The evaluation of virulence factors gene expression was amplified and quantified by PCR real time (Polymerase Chain Reaction-RT-qPCR, only for P/8 N/4 in 24h). The analysis of proteins related to essential biological processes of the fungus was performed by LC-MS/MS (24h). MIC and MMC of P were significantly reduced in the presence of N, indicating synergism between both. Once the antifungal potential of P was verified, we proposed to evaluate whether this drug acts through the same mechanism of action of N, altering the permeability of the cell membrane of the fungus (binding ergosterol). The evaluation of gene expression has demonstrated upregulation of some genes that may be related to a defense mechanism associated with stress or cell death. The proteomics analysis revealed alterations in the expression of several proteins in the fungi exposed to P/8 N/4 in relation to negative control, correlated with important biological processes, such as, energy metabolism, stress response, drug metabolism, among others. In the second step, cytotoxicity assays involving P and N, as well as the combination of both, were undertaken on human palate epithelial cells (HPEC) and human gingival fibroblasts cells (HGF) by Alamarblue dye. Similarly, P cytotoxicity was reduced when used in combination with N. Based on these in vitro results, the synergistic antifungal activity produced between P and N suggested that the combination of drugs, at the concentrations tested, may be a topical therapeutic or preventive alternative to be used in cases of superficial candidiasis, such as denture stomatitis. / Apesar dos avanços terapêuticos, doenças infecciosas por fungos oportunistas têm aumentado em prevalência e tornaram-se um problema universal de saúde pública. Candida albicans (CA) é um fungo comensal que, sob certas condições ambientais, pode atuar como um patógeno oportunista e colonizar mucosas e tecidos causando infecções locais e sistêmicas. O surgimento de cepas resistentes às drogas convencionalmente utilizadas, assim como aumento de pacientes imunodeprimidos, tem limitado as opções terapêuticas. Portanto o objetivo deste estudo foi avaliar: 1) a atividade antifúngica de Punicalagina (P), com ou sem a associação de Nistatina (N), contra duas cepas de CA. 2) O efeito citotóxico de P e N, assim como suas combinações, em culturas primárias humanas de células epiteliais de palato (CEPH) e de fibroblastos gengivais (FGH). Na primeira etapa, leveduras de CA ATCC 90028 e SC5314 foram expostas a P e N, por 24 horas. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de P (50 g/mL) e N (3,9 g/mL) foram determinadas pelo método de diluição em caldo. O Ensaio Checkerboard foi realizado para verificar o sinergismo entre as combinações (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 e P/2 N/2), as quais foram selecionadas a partir de 56 combinações inicialmente testadas. O metabolismo fúngico foi avaliado pelo método do XTT (24h) e a Concentração Mínima Microbicida (CMM) foi realizada através de Unidades formadoras de colônias (UFC/mL, 24h). A avaliação da expressão gênica de fatores de virulência foi amplificada e quantificada por PCR em tempo real (Reação em Cadeia da Polimerase-RT-qPCR, apenas para P/8 N/4 em 24h). A análise proteômica para identificação de proteínas alteradas foi realizada por LC-MS/MS (24h). A MIC e MMC de P foram significativamente reduzidas na presença de N, indicando sinergismo entre ambas. Confirmado o potencial antifúngico, o Ensaio de mecanismo de ação (teste do ergosterol) foi realizado e não foi confirmada a ação de P através da ligação ao ergosterol. A avaliação da expressão gênica demonstrou regulação positiva de alguns genes que pode estar relacionado a um mecanismo de defesa associado ao estress ou a morte celular. A análise proteômica revelou proteínas diferencialmente expressas nos fungos expostos a P/8 N/4 em relação ao controle negativo (sem tratamento), as quais estão relacionadas ao processo de metabolismo energético, resposta ao estress e metabolismo de drogas, dentre outros. Na segunda etapa, CEPH e FGH foram expostas a P e N e suas combinações por 24h para realização dos ensaios de viabilidade por Alamarblue. Combinada à N, a Punicalagina apresentou-se menos citotóxica do que de forma isolada. Com base nesses resultados in vitro, o sinergismo antifúngico produzido entre P e N sugere que a combinação das drogas pode ser uma alternativa terapêutica tópica para ser utilizada nos casos de candidose localizada, como por exemplo, a estomatite protética.

Os tecidos pulpar e periodontal são frequentemente agredidos por fatores ambientais como calor, trauma mecânico e micro-organismos, sendo estes considerados o fator etiológico principal das periodontopatias e periapicopatias. Dentre as células residentes desses tecidos, especial atenção tem sido dada ao papel dos fibroblastos no desenvolvimento da resposta imune. Fibroblastos são células que respondem à estímulos microbianos e existem evidências do papel de receptores do tipo Toll (TLR) no reconhecimento desses estímulos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos gengivais e pulpares. Para tal, fibroblastos isolados a partir de tecido gengival e pulpar de camundongos do grupo controle e deficientes de TLR2, CD14 e MyD88 foram avaliados quanto à expressão de TLRs e moléculas de superfície, resposta proliferativa e produção de citocinas (TGF-&#x3B2;, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-13 e IL-6), após a estimulação com agonistas de TLR2, TLR4 e C. albicans. Fibroblastos gengivais e pulpares, apesar de provenientes de tecidos diferentes, apresentaram características morfológicas semelhantes. Contudo, a cinética de crescimento dos fibroblastos gengivais deficientes de MyD88 foi mais lenta, e fibroblastos pulpares demoraram mais tempo para surgir a partir dos fragmentos de tecido. A ausência de TLR2 e da molécula adaptadora MyD88 não afetaram a produção de colágeno Tipo I pelos fibroblastos gengivais. Entretanto, fibroblastos deficientes de CD14 apresentaram baixa produção de colágeno. Ademais, os fibroblastos gengivais expressaram TLR2, TLR3, TLR4, assim como as moléculas de adesão ICAM-1 e CD44. A ausência de TLR2 e CD14 interferiu na resposta proliferativa de fibroblastos gengivais e pulpares, respectivamente. O reconhecimento de C. albicans por fibroblastos gengivais e pulpares modulou a produção das citocinas. A produção de TNF-&#x3B1; foi dependente da sinalização via MyD88, CD14 e TLR2, enquanto que a produção de IL-1&#x3B2; e IL-13 foi dependente de TLR2. / Pulpal and periapical tissue are frequently injured by heat, mechanical trauma and microorganisms, which are considered the main etiological factor of periodontal and endodontic diseases. Among these tissue resident cells, special attention has been given to fibroblasts in the immune response. Fibroblasts are cells that recognize pathogens through Toll like receptors (TLR). The aim of this study was to evaluate the recognition of Candida albicans by pulpal and gingival fibroblasts from TLR2, CD14, MyD88 knockout mice and control group mice. The results were analyzed concerning the expression of TLR(s) and surface molecules, proliferative response and citokynes production (TGF-&#x3B2;, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-13 e IL-6) after the cells stimulation with TLR2, TLR4 and C.albicans agonists. Gingival and Pulpal fibroblasts, even isolated from different tissue, showed morphological similarities; however, gingival fibroblast deficient of MyD88 show lower proliferative response and pulpa l fibroblasts needed more time to detach from tissue fragments. The production of Type I collagen was affected in gingival cells deficient of CD14. Gingival fibroblasts expressed TLR2, TLR3, TLR4, and the adhesion molecules (ICAM-1 and CD44). The absence of TLR2 and CD14 interfered with the proliferative response of pulpal and gingival fibroblasts, respectively. The recognition of C. albicans by gingival and pulpal fibroblasts modulated the citokynes production. TNF-&#x3B1; production after the recognition of C. albicans was dependent from MyD88, CD14 and TLR2 molecules, whereas the production of IL-1&#x3B2; and IL-13 was dependent of TLR2.