Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease

INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

O objetivo desse estudo foi determinar os valores do volume do líquido amniótico e do embrião, pela ultra-sonografia bidimensional e tridimensional em gestantes normais da 8ª a 11ª semana de gestação. Realizamos estudo prospectivo longitudinal em 25 fetos normais. Os critérios de inclusão foram gestações únicas, avaliação clínica e laboratorial normal e os de exclusão, gestantes portadoras de patologias maternas e/ou próprias da gestação, como também as usuárias de fumo, álcool ou drogas. Todas as pacientes assinaram o termo de consentimento esclarecido pós-informado. Os exames foram realizados por dois observadores que utilizaram aparelho ultra-songráfico modelo SA-9900 (MEDISON), transdutor endovaginal volumétrico, banda larga, de 5- 6,5 MHz, com 120 0 de campo visual. Cada gestante foi avaliadana 8ª, 9ª, 10ª e 11ª semana de gestação. O estudo bidimensional consistiu da determinação das medidas volumétricas por cálculo matemático baseado na forma do elipsóide, averiguando-se o volume do saco amniótico total e do embrião. No estudo tridimensional o volume do líquido amniótico foi feito pela técnica VOCAL. Em ambos o volume do líquido amniótico foi obtido da subtração da medida do volume do saco amniótico pela medida volumétrica do embrião. Os dados foram analisados pela análise de variância (ANOVA), correlação e análise de regressão. Em todas as análises foi utilizado como nível de significância p< 0,05. O volume do líquido amniótico (V LA ) pela ultra-sonografia bidimensional aumentou de 5,45 cm3 para 39,52 cm 3 da 8ª para a 11ª semana (ANOVA - p< 0,05). A correlação entre a idade gestacional e o volume do líquido amniótico foi forte e positiva (p< 0,001,r 2 = 88,3%). No estudo tridimensional o volume do líquido amniótico aumentou de 5,75 cm 3 para 42,96 cm 3 da 8ª para a 11 semana (ANOVA - p< 0,05). A correlação entre a idade gestacional e o volume do líquido amniótico foi forte e positiva (p< 0,001,r 2 = 98,1%). Concluindo, o volume do líquido amniótico e do embrião aumenta progressivamente da 8ª para a 11ª semana de gestação tanto na avaliação bidimensional como natridimensional. A estimativa do volume do líquido amniótico na ultra-sonografia tridimensional é menor que a bidimensional na 9ª e 10ª semana gestacional e maior na 11ª semana de gestação. O volume do embrião é maior pela técnica tridimensional do que pela bidimensional em todas as semanas gestacionais avaliadas. / The objective of this study was to determine amniotic fluid and embryo volumes by two-dimensional and three-dimensional ultrasonography in normal pregnant women from the 8th to the 11th week of gestation. We made a prospective longitudinal study on 25 normal fetuses. Inclusion criteria were singleton fetuses and normal clinical and laboratoryevaluation, and exclusion criteria were pregnant women withmaternal diseases and/or diseases typical of pregnancy, smokers, and alcohol or drug users. All patients signed an informed consent form. The tests were performed by two observers using an ultrasonography apparatus model SA-9900 (MEDISON), a volumetric endovaginal transducer, a 5-6.5 Hz broad band and 120 o of visual field. Each pregnant woman was evaluated in the8 th ,9 th , 10 th and 11 th week of gestation. The two-dimensional study consisted of the determination of volumetric measurements by a mathematical calculation based on the ellipsoid shape, with determination of total amniotic sac volume and embryo volume. In the three-dimensional study the amniotic fluid volume was determined by the VOCAL technique. In both methods, the amniotic fluid volume was obtained by subtracting the volumetric measurement of the embryo from the measurement of the amniotic sac volume. Data were analyzed statistically by analysis of variance (ANOVA), by correlation and by regression analysis, with the level of significance set at p< 0.05 in all analyses. The amniotic fluid volume (V AF ) determined by two-dimensional ultrasonography increased from 5.45 to 39.52 cm 3 from the8 th to the 11 th week (ANOVA - p< 0.05). There was a strongpositive correlation between gestational age andVAF (p< 0.001,r 2 = 88.3%). In the three-dimensional study,VAF increased from 5.75 to 42.96 cm 3 from the8 th to the 11 th week (ANOVA - p< 0.05). The correlation between gestational age andVAF was strong and positive (p< 0.001,r 2 = 98.1%). In conclusion, the volume of the amniotic fluid and of the embryo increased progressively from the 8th to the 11th week of gestation both when evaluated by two-dimensional and three-dimensional ultrasonography. The estimate ofVAF obtained by three-dimensional ultrasonography was lower than that obtained by two-dimensional ultrasonography in the 9th and 10th week of gestation and higher in the 11th week of gestation. The embryo volume obtained by the three-dimensional technique was larger than that obtained by the two-dimensional technique in all gestational weeks evaluated.

Stem cell synthesized extracellular matrix (ECM) may serve as a replacement for current bone grafting techniques. The overall goal of this thesis is to quantify the osteoinductivity of the ECM produced by human amniotic fluid stem cells (AFS cells), compare it to that of human mesenchymal stem cells (MSC), and assess its potential for use in bone tissue engineering therapies. Each stem cell type was cultured in osteogenic media to produce the ECM, which was then decellularized via freeze/thaw cycling and DNase treatment. The success of the decellularization was confirmed with live/dead staining and DNA quantification. A series of in vitro studies were performed to evaluate the characteristics of the ECM relevant to a bone tissue engineering therapy. Reseeded MSCs were able to attach to and proliferate on both ECM types in both 2D and 3D culture. In 2D, cells cultured on both ECM types showed increased levels of calcium deposition. Additionally, cells cultured on the MSC ECM showed increased alkaline phosphatase activity. A synergistic effect on osteogenic differentiation was observed when the osteoinductive factor dexamethasone was added to the culture. In 3D, both ECM types increased the mineralized matrix production of reseeded MSCs. The AFS ECM had a greater effect than the MSC ECM. When ECM was used to treat a rat femoral segmental defect in vivo, it was found that each ECM type increased the rate of bridging of the defect when compared to collagen coated scaffolds. However the ECM did not have a significant effect on the volume of mineralized matrix within the defect site in this study.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laura Fregonassi Ribeiro Fraga.pdf: 4567995 bytes, checksum: 80f83feca246031271e511fadd682376 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / A infecção amniótica e a corioamnionite (CAM) são determinantes de infecções materna e perinatal, parturição e nascimento pretermo e morbi-mortalidade pós-natal. Embora métodos clínicos, histopatológicos, microbiológicos, bioquímicos e moleculares possam diagnosticar CAM, nenhum logrou amplo emprego, permanecendo muitos casos clínica e epidemiologicamente ocultos. O presente estudo analisa o exame do cório placentário (EECP) proposto por Blanc (1953) para o diagnóstico de CAM a tempo de orientar o manejo da puérpera e do neonato sob risco. Objetivo. Determinar o valor e a reprodutibilidade do EECP em comparação com a histopatologia convencional (HP). Material e métodos. Dentre as placentas examinadas entre 2008 e 2012, em dois laboratórios de Vitória, ES, um público (HUCAM) e um privado (PAT), foram selecionadas 1626, incluindo: uma amostra de corte transversal (HCT, n: 108) e duas séries consecutivas examinadas por suspeita neonatal de CAM (HIB, n: 193) e por variadas indicações obstétricas (PIV, n: 1325). O EECP foi realizado no puerpério imediato (HIB e HCT) ou como primeira etapa da HP (PIV). Os casos foram categorizados por procedência, idade gestacional, desfecho perinatal, método de exame, estágio e grau da CAM e foram calculados índices de valor diagnóstico e concordância entre os dois métodos (EECP e HP). Resultados. CAM por HP foi observada em 12,8% dos casos (HCT: 31,5% e PIV: 11,3%) dos quais 2,4% com resposta inflamatória fetal; CAM pelo EECP foi observada em 14,2% (HCT: 41,7%, HIB: 31,1% e PIV: 9,1%). O EECP revelou-se exequível e rápido, com sensibilidade 50,0%, especificidade 93,7%, valores preditivos positivo 53,8% e negativo 92,7% e razões de verossimilhança positiva 7,9 e negativa 0,53. Concordância entre EECP e HP foi observada em 88,8%, diagnóstico apenas pelo EECP em 5,7% e apenas pela HP em 5,5% (kappa: 0,45). Conclusão. O EECP pode ser empregado para o diagnóstico rápido de CAM. Trata-se de método exequível, que tem bons índices de valor diagnóstico e pode ser útil para orientar a conduta no puerpério e período neonatal imediatos / Amniotic infection and chorioamnionitis (CAM) are determining factors of maternal and perinatal infections, preterm births and postnatal mortality and morbidity. As none of clinical, microbiological, biochemical, molecular and histopathological proposed methods for CAM diagnosis has achieved broad and routine employment, many cases remain clinical and epidemiologically occult. After Blanc s proposal (1959), this study analysis the placental chorionic sampling and microscopical examination (EECP) at early postpartum period to CAM diagnosis in order to help a timely clinical decision to treat the risk mother and newborn infant. Objectives. To establish the diagnostic value and the reproducibility of EECP compared to conventional histopathology (HP) CAM diagnosis. Material e Methods. Out from all placentas examined between 2008 and 2012, in two Pathology laboratories at Vitória City, southwestern Brazil, one public (HUCAM) and one private (PAT), 1626 were selected including: a cross-sectional sampling (HCT, n: 108) and two consecutive cases series examined after neonatal clinical infection suspicion (HIB, n: 193) and varied others obstetrical indications (PIV, n: 1325). The EECP was done at immediate postpartum period (HIB and HCT) or as the first step of HP examination (PIV). The cases were categorized by study groups, gestational age, perinatal outcome, method of examination, CAM stage and grade, and the statistic indexes of agreement and diagnostic value between the two methods (EECP and HP) were calculated. Results. In overall cases, CAM diagnosis by HP were observed in 12.8% (HCT: 31.5% e PIV: 11.3%) from which 2.4% with a fetal inflammatory response; CAM diagnosis by EECP were observed in 14.2% (HCT: 41.7%, HIB: 31.1% e PIV: 9.1%). The EECP revealed itself to be a fast and easy to perform method, with 50.0% sensitivity, 93.7% specificity, 53.8 predictive positive and 92.7% predictive negative values, and 7.9 likelihood positive and 0.53 likelihood negative ratios. Agreement between EECP and HP were observed in 88.8%, CAM diagnosis only by EECP in 5.7% and only by HP in 5.5% (kappa: 0,45). Conclusion. The EECP method could be an important contribution to fast CAM diagnosis. It is easy to perform, with significant statistic indexes of diagnosis value and can be helpful to guide the clinical decision at early postpartum period

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 803317 bytes, checksum: fc5cc2e40df938c5be793a101a6e3195 (MD5) Previous issue date: 2007-02-15 / União de Ensino Superior de Viçosa - UNIVIÇOSA / The amniotic membrane has been widely used in the repair of corneal ulcers showing good results as it exhibits anti-adhesive effect and bacteriostatics properties, it protects the wound, reduces pain, participates in the epithelization and is not immunogenic. This membrane can be used on corneal ulcers as a graft or a patch depending on its position. A superficial keratectomy was made on all of the 28 animals included in this study. On the resulted corneal ulcer of the 14 animals of the treated group an amniotic membrane was used as patch sutured with its epithelial surface over the experimentally made ulcer. The control group did not receive the patch. The animals were submitted to clinical evaluations 24 hours after the proceedings, at a two-day interval during the first week and at a four-day interval from the second week until 180 days after surgeries. The histological and morphometric analysis were undertaken at 1, 2, 7, 15, 30, 60 e 180 days after surgery. The amniotic membrane s effect as a patch and its incorporation to the cornea were evaluated. The time needed for the corneal repair of the treated group was compared to the control and the time needed for the cornea s complete transparence was observed. Glycerin at 99% was evaluated as a preservation medium and the binocular magnifying glass was evaluated during surgeries. The corneal opacity was always present both in the treated and the control group during 180 days. The membrane retained the inflammatory cells on its surface and provided an improvement on the repair process at the beginning, but at some point it delayed this process and its conclusion. The membrane and the trauma caused by the suture needle leaded to discomfort, conjunctival congestion, ocular secretion and stimulated neovascularization and corneal fibrosis. There was no incorporation of the membrane to the cornea. The glycerin at 99% acted efficiently as a preservation medium when analyzing contamination, but its anti-angiogenesis characteristics were lost. The binocular magnifying glass was efficient during these works proceedings. / A membrana amniótica tem sido amplamente utilizada na reparação de úlceras de córnea, demonstrando resultados satisfatórios por possuir efeito antiadesivo, propriedades bacteriostáticas, promover a proteção da lesão, reduzir a dor, auxiliar na epitelização e não possuir imunogenicidade. Esta membrana pode ser utilizada em lesões da córnea como enxerto ou como bandagem dependendo do seu posicionamento. Neste estudo, foi realizada a ceratectomia superficial em 28 coelhos. No grupo tratado, composto por 14 animas, utilizou-se a membrana amniótica canina como bandagem, suturada com sua face epitelial aplicada sobre o leito da úlcera experimental. O grupo controle não recebeu tratamento. A avaliação clínica foi realizada a partir de 24 horas após a realização dos procedimentos, em intervalos de 2 dias na primeira semana e de 4 dias da segunda semana até os 180 dias de pósoperatório. A avaliação histológica e morfométrica foram realizadas aos 1, 2, 7, 15, 30, 60 e 180 dias após a cirurgia. Observaram-se os efeitos da membrana amniótica como bandagem e sua incorporação à córnea. Comparou-se o tempo de reparação da córnea entre os grupos e verificou-se o período para que a córnea apresentasse transparência completa. Avaliaram-se ainda a eficácia da glicerina a 99% como meio de preservação das membranas e da lupa binocular como instrumento de magnificação do campo operatório nos procedimentos cirúrgicos. A opacidade corneana esteve presente em todos os animais, tanto no grupo tratado como no grupo controle, durante os 180 dias. A membrana atuou contendo as células inflamatórias em sua superfície e promoveu um avanço no início do processo de reparação, porém a partir de determinado momento retardou a sua conclusão; e juntamente com o trauma causado pela agulha de sutura causou desconforto, congestão conjuntival, secreção ocular e estimulou a neovascularização e a fibrose na córnea. Não houve incorporação da membrana à córnea. A glicerina a 99% atuou satisfatoriamente como meio de preservação da membrana no que diz respeito à contaminação, mas suas características antiangiogênicas foram perdidas. A lupa binocular mostrou ser eficiente na realização dos procedimentos cirúrgicos envolvidos neste trabalho.

INTRODUÇÃO: O fenótipo de resistência a drogas é caracterizado pela superexpressão das proteínas da família ABC (ATP-Binding Cassette). A Pglicoproteína (P-gp), codificada pelo gene ABCB1, é uma das bombas de efluxo mais estudadas, como agente interferente no tratamento de diversos tipos de câncer, seguida pela proteína MRP1 (Multidrug Resistance-related Protein 1), transcrita pelo gene ABCC1. Estudos recentes relacionaram a atuação da proteína LRP (Lung Resistance Protein) a estas bombas, devido sua alta expressão em tumores com fenótipo resistente. Em contrapartida, estes transportadores também exercem funções fisiológicas contra metabólitos, compostos citotóxicos e teratogênicos, em diversos tecidos normais como rins, fígado, intestino e célulastronco. As proteínas ABC são consideradas marcadores específicos das célulastronco hematopoiéticas, porém, ainda são pouco descritas nas células-tronco mesenquimais (CTM). A medula óssea (MO) é a fonte mais bem descrita de CTM adultas, cujas propriedades são conhecidas e utilizadas na aplicação clínica. Entretanto, recentemente células-tronco de origem fetal têm criado expectativas e o líquido amniótico (LA) apontado como fonte promissora deste tipo celular, que por sua vez, é pouco estudada acerca da atuação das bombas ABC. Sendo assim, o presente estudo visou caracterizar a expressão da P-gp, MRP1 e LRP em célulastronco mesenquimais humanas do líquido amniótico e medula óssea. MÉTODOS: Foram isoladas CTM de amostras do LA e MO, caracterizadas através de citometria de fluxo, ensaios de diferenciação em tecidos mesenquimais in vitro e expressão dos genes de indiferenciação Oct-4 e Nanog por RT-PCR. Verificou-se também a presença da P-gp através da técnica de imunocitoquímica e a sua resistência frente a diferentes concentrações de doxorrubicina (DOX) através do ensaio de MTT, foram utilizadas como controles as células MES-SA e MES-DX (sarcoma uterino respectivamente sensível e sua variante resistente à DOX). Para avaliar o funcionamento da P-gp, foi feito ensaio de exclusão do corante Rhodamina 123 (Rh 123) por meio de citometria de fluxo, com ou sem bloqueio da P-gp utilizando verapamil. E por fim, foi verificada a expressão dos genes ABCB1/ABCC1/LRP por meio de PCR em tempo real, nas amostras pré e pós-diferenciações adipogênica, osteogênica e condrogênica. RESULTADOS: As CTM, tanto da MO quanto do LA, exibiram respostas semelhantes às células resistentes MES-DX e expressam a Pgp de forma homogênea nas suas populações. O ensaio de exclusão da Rh 123 demonstrou dinâmicas de efluxo do corante semelhantes entre as células-tronco do LA e as MES-DX, com e sem a presença de verapamil. No entanto, as células da MO apresentaram efluxo crescente e não responderam ao bloqueador verapamil como as outras linhagens. A distribuição da expressão gênica, o ABCB1 se mostrou menor que a do LRP nas amostras de LA indiferenciadas. No entanto a expressão do ABCB1 nas amostras de LA foi maior em comparação às amostras de MO indiferenciadas. Não houve seignificância estatística na comparação da expressão gênica antes e depois das diferenciações adipogênica e osteogênica. CONCLUSÃO: As CTM são resistentes ao quimioterápico doxorrubicina, mas, possuem baixa expressão do ABCB1. Portanto, as CTM podem possuir outro mecanismo, como a MRP1 e LRP, atuando no mecanismo de resistência à DOX, além da P-gp / BACKGROUND: The drug resistance phenotype is characterized by ABC (ATPBinding Cassette) family proteins overexpression. The P-glycoprotein (P-gp) codified by ABCB1 gene is one of the most studied efflux pumps such as interfering agent in cancer treatment followed by MRP1 (Multidrug Resistance-related protein 1) transcribed by ABCC1 gene. Recent studies have linked the LRP (Lung Resistance Protein) to these pumps activities because of its high expression in resistant cancers. Though these transporters also have physiological functions against metabolites, cytotoxic and teratogenic compounds in normal tissues as kidneys, liver, intestine and stem cells. ABC proteins are considered hematopoietic stem cells specific markers but are poorly described in mesenchymal stem cells (MSC). Bone marrow (BM) is the best characterized adult MSC source its properties are well known and used in clinical application. However recently fetal stem cells has raised expectations and amniotic fluid (AF) is a promising source of this cell type which in turn is scarce regarding about presence and activity of the ABC pumps. The aim of this study was characterize the P-gp, MRP1 and LRP expression in human mesenchymal stem cells from amniotic fluid and bone marrow. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from AF and BM and characterized by flow cytometry, in vitro mesenchymal differentiation assays, Oct-4 and Nanog genes expression by RT-PCR. The P-gp presence were found over immunocytochemical technique and its activity against different concentrations of doxorubicin (DOX) by MTT assay which were used as control cells MES-DX and MES-SA (uterine sarcoma respectively resistant and susceptible to DOX). The P-gp was evaluated in Rhodamine 123 (Rh 123) dye exclusion through flow cytometry with or without blocking P-gp from verapamil. Finally was observed ABCB1/ABCC1/LRP genes expression by real time PCR after and before adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. RESULTS: BM and AF MSC showed the same response of the DOX resistant cells MES-DX and express P-gp homogeneously though their populations. The Rh 123 dye exclusion assay demonstrated that the AF stem cells efflux dynamics are similar to the MES-DX with and without the presence of verapamil. However BM MSC showed crescent efflux and no response to verapamil as the other cells. The ABCB1 gene was less expressed than LRP in undifferentiated AF MSC. No difference was found in gene expression before osteogenic and adipogenic differentiation. CONCLUSION: MSC have low expression of ABCB1 although are resistant to doxorubicin so other mechanisms such as MRP1 or LRP may be acting to these cells defense in addition to P-gp

Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease

No Brasil, houve significativa redução da mortalidade infantil, porém não do componente perinatal que corresponde a 13% do total. O diagnóstico das infecções congênitas com base apenas em dados clínicos, ultrassonográficos e sorológicos maternos é muito difícil, havendo necessidade de um número grande de sorologias, algumas delas não disponíveis na rotina laboratorial, e o simples encontro de sorologia positiva (IgM e IgG positivas) na gestante não constitui prova inequívoca da transmissão vertical. A extração de DNA/ RNA a partir de líquido amniótico possui baixo rendimento, dificultando a realização de inúmeros testes moleculares. Sendo assim, na tentativa de preencher esta lacuna diagnóstica, a presente pesquisa teve como objetivo a padronização e validação de uma multiplex-nested-PCR capaz de detectar, de forma simultânea, sete patógenos que causam infecções congênitas e possuem DNA no genoma: CMV, HSV, VZV, EBV, adenovírus, parvovírus B19 e Toxoplasma gondii, com determinação da frequência relativa de cada microrganismo em um grupo de gestantes com (estudo) e sem suspeita de infecção (controle). No grupo de estudo, 147 gestantes foram recrutadas, com 57 casos positivos (38,8%): 32 com T. gondii (21,8% do total e 56,1% dos positivos);12 com CMV (8,1% e 21%); 5 casos com parvovírus (3,4% e 8,8%); 4 com adenovírus (2,7% e 7%) e 4 casos com dupla detecção (2 casos com T. gondii e CMV; 1 caso com T. gondii e VZV e 1 caso com CMV e parvovírus B19). O grupo controle contou com 193 casos e 197 amostras: líquido amniótico para cariotipagem em gestantes com idade avançada (n=44); amostras de sangue (n =150), e fragmentos de placentas (n=3) de gestantes com pré-natal normal, no momento do parto. Neste grupo, duas amostras de líquido amniótico foram positivas (1,04% do total de casos e 4,5% dos líquidos): um caso de adenovírus em feto com cariótipo normal, e um caso de T. gondii em feto com translucência nucal aumentada e trissomia do 21 (síndrome de Down). Neste grupo controle 14/193 cariótipos fetais se encontravam alterados (7,2%). A falta de estudos similares dificultou a comparação dos resultados, porém a multiplex-nested-PCR detectou número quase seis vezes superior ao detectado pelos exames disponíveis nos centros participantes. Todos os resultados positivos foram confirmados pelo sequenciamento dos produtos de amplificação. A similaridade entre as sequências amplificadas e os protótipos do GenBank variou entre 95-98%. No presente estudo, a padronização e validação de uma multiplex-nested-PCR foi realizada com sucesso, utilizando protocolos simples, reprodutíveis, agrupamento dos sete controles positivos em um único plasmídeo bacteriano e substituição da detecção do material amplificado pela eletroforese capilar, mais rápida, com menor custo, e com maior grau de resolução que os géis de agarose. Para a implantação da técnica na rotina laboratorial, pretende-se a substituição do sequenciamento como método confirmatório, pela realização de amplificações em tempo real com Sybr Green, apenas do patógeno que for detectado pela multiplex-nested-PCR. / In Brazil, there was a significant reduction in infant mortality, but not in the perinatal component, which corresponds to 13% of the total. Diagnosis of congenital infections based on maternal clinical, ultrasound and serological data is very difficult, requiring a large number of serologies, some of which are not available in the clinical laboratory routine, and the simple finding of a positive IgM and IgG in the pregnant woman does not constitute unequivocal evidence of vertical transmission. The extraction of DNA/ RNA from amniotic fluid samples has a low yield, making it difficult to perform many molecular tests on this biological material. Therefore, in an attempt to fill this diagnostic gap, the present research aimed at standardizing and validating a multiplex-nested-PCR capable of simultaneously detecting seven pathogens that cause congenital infections and have DNA in their genomes: CMV, HSV, VZV, EBV, adenovirus, parvovirus B19 and Toxoplasma gondii. The study has also aimed at determining the relative frequency of each microorganism in a group of pregnant women with (study group) or without suspicion of infection (control group). In the study group, 147 pregnant women were included and 57 (38.8%) positive cases detected. Thirty-two cases had T. gondii (21.8% of the total and 56.1% of the positive ones), 12 had CMV (8.1% and 21%); 5 cases had parvovirus (3.4% and 8.8%); 4 cases had adenovírus (2.7% and 7%). Four cases showed double detection (2 cases had T. gondii and CMV, 1 case had T. gondii and VZV, and 1 case had CMV and parvovirus). The control group had 193 cases and 197 samples: amniotic fluid for karyotyping in pregnant women with advanced age (n = 44); blood samples (n = 150), and fragments of placentas (n = 3) of pregnant women with normal prenatal care, at delivery. In this group, two amniotic fluid samples were positive (1.04% of total cases and 4.5% of fluids): one case of adenovirus with normal fetal karyotype, and one case of T. gondii with increased nuchal translucency and trisomy 21 (Down syndrome). In this control group, 13/ 193 fetal karyotypes were altered (6.7%). The lack of similar studies made it difficult to compare the results, but the multiplex-nested-PCR detected a number almost six times higher than that detected by the tests available at the participating centers. All the positive amplification products were sequencing and confirmed the results. The similarity between the amplified sequences and the GenBank prototypes varied between 95-98%. In the present study, the standardization and validation of a multiplex-nested-PCR was success, using simple and reproducible protocols, and the clustering of the seven positive controls on a single bacterial plasmid aside from the replacement of the amplification products detection by agarose gels for the capillary electrophoresis, which is faster, less expensive and has a higher degree of resolution. For the technique set up in the laboratory routine, the substitution of the sequencing as the confirmatory method for real-time amplifications with Sybr Green is required, amplifying only the pathogen that has been previously detected by the multiplex-nested-PCR.

Purpose: In an Orthopedic office in Northeast Tennessee clinical decision making about injection options for non-surgical candidates with knee osteoarthritis is unclear. Aims: This quality improvement project will develop a clinical guideline so that providers know criteria for choosing optimal knee alternative treatments for non-surgical knee patients. Outcome measures: An expert panel gave feedback and advice on the information presented for the injection types of Platelet Rich Plasma, Corticosteroids, Amniotic Allograft and Hyaluronic Acid. They edited the guideline then sent the edits back to be complied and edited using the Delphi method. Process and Methods: The expert feedback was then be collected in a non-identifiable fashion and the guideline was rewritten based on the panel advice. Then the guideline was then presented to the practice site and the site reviewed and rated the guideline on clarity, accuracy and ease of use. Results: The guideline was rated by the practice site as able to be adopted into practice and used at the site. Findings and Limitations: Limitations include the practice site is constantly changing and new implementations could be overlooked. The expert panel are all busy professionals and finding time to review and critique a guideline is extensive. Conclusions and Implications: This novel guideline will improve healthcare by eliciting an expert panel of orthopedics that perform injections to assist in compiling the most accurate up to date guideline through which will create enhanced decision making and overall better patient care when choosing knee injections for non surgical patients.