Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas, 2012. / Submitted by Liliane Simões (miix007@gmail.com) on 2013-04-08T12:03:48Z No. of bitstreams: 1 2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-08T14:20:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-08T14:20:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Este estudo foi conduzido em linhagens B12/B12 e B4/B4 de aves congênicas de Praga geneticamente idênticas em todos os loci exceto no MHC relacionado às respostas imunes que conferem resistência ou susceptibilidade à oncogênese induzida pelo vírus (RSV). As linhagens de aves de Praga foram doadas ao LMPDC/UnB pelo Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências de Praga. Ovos férteis de galinha foram inoculados com 100 tripomastigotas de Trypanosoma cruzi e os pintos nasceram sem a infecção, mas eles retiveram sequências de minicírculos de kDNA mitocondrial do parasito em vários cromossomos. As aves com as mutações (kDNA+) desenvolveram cardiomiopatia com os aspectos similares aqueles vistos na doença de Chagas humana. Tendo estabelecido o modelo transfilo refratário ao T. cruzi foi possível investigar a autoimunidade e determinar a patogêneses da rejeição do coração. A transferência passiva das lesões mediante injeções de células mononucleares do sangue de aves mutadas (kDNA+) para aves receptoras controles sadias mostrou pequenos focos inflamatórios no miocárdio. A ausência de tais achados em aves controles (kDNA-) mostrou que apenas linfócitos de aves mutadas (kDNA+) aderiam ao miocárdio. Mas não foi obtida cardiomiopatia mediante transferência de células mononucleares do sangue de aves mutadas para aves sadias. Entretanto, a destruição de células da medula óssea de aves mutadas (kDNA+) com drogas, e sua substituição pelo enxerto de medula óssea sadia de aves controle (kDNA-) inibiu a cardiomiopatia na ave kDNA+. Este experimento foi monitorado pelo enxerto de coração repórter no subcutâneo da ave receptora, cujo estudo histopatológico aos onze dias pós-enxerto revelou ausência de lesão inflamatória. Em experimento reverso, foi feita transferência da patologia de aves mutadas (kDNA+) para aves controle (kDNA-), sadia que tiveram a medula óssea destruída com drogas. Nesse experimento, o enxerto de medula óssea de aves kDNA+ em aves receptoras kDNA- revelou infiltrado inflamatório e lesão no coração repórter enxertado no subcutâneo. O estudo imunocitoquimico revelou no coração repórter patologia similar a lesão no coração da ave adulta, onde a destruição do miocárdio era feita pelos infiltrados de linfócitos T citotóxicos CD8-α, CD8-β, CD8-γδ, CD8-vβ1, e CD8-vβ2 que lisa as células alvo. As aves kDNA+ que sucumbiram a cardiomiopatia e aquelas que foram sacrificadas aos 12 meses de idade revelaram lesões inflamatórias autoimunes no coração adulto e no coração repórter. Os resultados que mostraram inibição da patologia autoimmune no coração das aves kDNA+ pela substituição da medula óssea doente pela medula óssea de ave sadia sugerem a possibilidade de tratamento da cardiomiopatia chagásica pela transferência de medula óssea. / The study was conducted in lineages B12/B12 and B4/B4 of congenic birds of Prague, showing complete genetic identity in all loci but different MHC carrying on the immune responses that afford resistance and/or susceptibility to RSV induced oncogenesis. The congenic birds were donated by the Czech Republic Academy of Sciences Institute of Molecular Genetics our Laboratory at the University of Brasilia. Fertile chicken eggs were inoculated with 100 tripomastigotes of Trypanosoma cruzi and the chicks hatched were parasite-free, but they retained the parasite mitochondrial kDNA minicircle sequences in various chromosomes. The chicken with mutations (kDNA+) developed Chagas-like heart disease with features similar to those seen in the human disease. Having established the transkingdom model system to study the pathogenesis, it was possible to investigate the autoimmune rejection of the kDNA+ chicken heart. The passive transfer of blood mononuclear cells from mutated (kDNA+) birds to naive recipients revealed small inflammatory infiltrates in the myocardium, but the cardiomyopathy was not observed. The absence of lymphocyte infiltrates in the control chicken (kDNA-) heart showed that only kDNA+ lymphocytes adhere to the myocardium. Moreover, the Chagas-like cardiomyopathy was not obtained by injections of blood mononuclear cells from kDNA+ chickens, and, therefore, other experiments of transfer of bone marrow cells were conducted, aiming at production of the heart disease in the recipient chicken. In this regard, kDNA- mutated chicken bone marrow cells, which were destroyed with drugs, were replaced by healthy bone marrow cells from sick (kDNA+) chicken. This experiment was monitored by a reporter heart grafted in the subcutaneous pouch of a recipientbird. Eleven days after grafting, the histopathology study revealed inflammatory cell infiltrates and destruction of the myocardium by cytotoxic T- lymphocytes T CD8-α, CD8-β, CD8-γδ, CD8-vβ1, e CD8-vβ2 that lyse the target cells . The kDNA+ birds that succumbed to natural death and those that did not succumb to heart disease were sacrificed at 12 months of age. The kDNA+ (mutated) birds‟ revealed autoimmune inflammatory lesion similar to that in the reporter heart. The results of these experiments suggested a reverse experiment, aiming at the inhibition of the pathology. The replacement of the sick (kDNA+) bone marrow by healthy bone marrow from a naive (kDNA-) donor inhibited the inflammatory autoimmune lesions in the heart of the kDNA- mutated, sick chicken.The inhibition of the heart pathology in the kDNA+ chicken experiments deciphered a treatment possible for the human Chagas heart disease.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-04-08T15:22:25Z No. of bitstreams: 1 2012_MariaCarolinaCambraiaGuimaroDiniz.pdf: 3847057 bytes, checksum: 0125863da5f90bb3fcf083c0aadcc000 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-08T16:25:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MariaCarolinaCambraiaGuimaroDiniz.pdf: 3847057 bytes, checksum: 0125863da5f90bb3fcf083c0aadcc000 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-08T16:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MariaCarolinaCambraiaGuimaroDiniz.pdf: 3847057 bytes, checksum: 0125863da5f90bb3fcf083c0aadcc000 (MD5) / A base da teoria autoimune da doença de Chagas é a rejeição acelerada das células do coração pelos linfócitos efetores do sistema imune. Estudos do nosso Laboratório sugerem que uma transferência de minicírculos de kDNA de T. cruzi para o genoma do hospedeiro pode explicar a origem da patogênese da doença. Mas, como o hospedeiro mamífero retém a infecção chagásica ao longo da vida, decidimos empregar um modelo trans-filo que elimina a infecção e permite analisar com segurança a transferência do kDNA e sua possível relação com a rejeição autoimune do coração chagásico. Aves são refratárias ao Trypanosoma cruzi, mas a infecção pode ser estabelecida na primeira semana, antes do desenvolvimento do embrião. Pintos que eclodem de ovos inoculados com formas tripomastigotas de T. cruzi são livres da infecção, mas retêm DNA do cinetoplasto (kDNA) do parasita no genoma; os exames de PCR revelam positividade para kDNA na ausência de DNA nuclear (nDNA). O kDNA integrado no genoma das aves parentais foi transferido verticalmente para as progênies. A identificação das seqüências de minicírculos integradas no genoma das aves foi feita com auxilio da técnica tpTAIL PCR, e as quimeras kDNA-DNA hospedeiro foram mapeadas em vários cromossomos. Esses resultados também mostraram o kDNA integrado em retroelementos CR1 em 28% das sequências. As mutações foram localizadas em diversos loci, e as mutações nos genes CNNM2, tetraspaninas-18, e distrofina foram analisadas. As bandas desses genes nas hibridizações pelo Southern blot mostraram variações no padrão de migração, e este achado foi atribuído a recombinações e deleção na progênie. Ademais, as estruturas das seqüências nas regiões variáveis dos minicírculos de kDNA nos genes CNNM2 e distrofina dos parentais diferia daquelas presentes nas progênies. Tais diferenças, decorrentes da diversidade dos minicírculos, hitchhiking, recombinações, e mosaicismos sugerem um tipo de herança semiconservativa, não-Mendeliana. As aves kDNA-mutadas desenvolveram cardiomegalia e o exame histopatológico revelou lesão típica da doença de Chagas, com destruição de células cardíacas pelos linfócitos efetores do sistema imune. Aves controle não tinham lesão. Os resultados apresentados sugerem que as mutações de kDNA nos parentais são transferidas verticalmente e fixadas no genoma das progênies, podendo estar associadas às lesões autoimunes no coração do hospedeiro. A origem genética da patogênese da cardiopatia autoimune explica a variabilidade das manifestações clínicas semelhantes à doença de Chagas no modelo das aves sem o parasitismo. / The autoimmune theory suggests an accelerated rejection of heart cells by immune system effectors lymphocytes and Chagas heart disease. Studies of our Laboratory shows that transfer of Trypanosoma cruzi kDNA minicircles to the host genome may explain the origin of the autoimmunity. To eliminate any role played by parasite persistence in the chronic Chagas disease, we used the chicken model to shed light further on the origin of the autoimmune rejection of target cells in the heart. Birds are refractory to T. cruzi but the infection can be established in the early embryo. The inoculation of T. cruzi trypomastigotes into the air chamber of fertile egg generates parasite-free chickens at hatching: The exams revealed the presence of kDNA and absence of nuclear DNA (nDNA). Crossbreeding vertically transferred the kDNA mutations to progeny. The sequencing of minicircle kDNA was made by the tpTAIL PCR technique, and the chimera sequences showed kDNA conserved and variable regions at several chromosomes. These results also revealed that the kDNA integrated into retrotransposons CR1 in 28% of those sequences. The kDNA mutations were mapped to several loci, but the CNNM2, tetraspanin-18 and dystrophin genes were analised with more detail. Southern blot hybridization revealed bands with various migration patterns, possibly, due to recombination and deletion occurring over time. The kDNA mutations in CNNM2 and dystrophin loci showed structural differences in kDNA variable regions in parental and progeny. Additionally to mutation differences stemming from minicircle diversity, hitchhiking, recombination and mosaicisms also account for the semi-conservative, non-Mendelian, pattern observed. The kDNA-mutated birds showed cardiomegaly and the histopathology documented typical Chagas disease lesions, whereby parasite-free target heart cells were rejected by the immune system mononuclear cells. Control birds did not show these lesions. These findings highlight the association between the heart disease and genotype modifications, resulting from the kDNA integrations in the chicken genome. The genetically driven pathogenesis of Chagas-like heart disease explains a gamut of clinical manifestations in the parasite-free chicken model.

Nos últimos anos, um importante destaque tem sido dado aos linfócitos Th17 para o desenvolvimento e manutenção da inflamação associada à autoimunidade. A esclerose múltipla é uma doença autoimune desmielinizante do SNC, cuja patogênese está associada à resposta do padrão Th17. Evidências têm demonstrado que estas células são submetidas a uma reprogramação metabólica após serem ativadas, sendo essa adequação essencial para sua completa diferenciação e aquisição de funções efetoras. A enzima Piruvato Quinase M2 (PKM2) participa da etapa final da glicólise convertendo fosfoenolpiruvato em piruvato. Estudos recentes demonstraram que a fosforilação de PKM2 a torna capaz de translocar para o núcleo, onde adquire um papel no controle da expressão gênica. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o envolvimento da PKM2 na diferenciação de linfócitos Th17, bem como sua participação no desenvolvimento da encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo animal de esclerose múltipla. Observou-se que durante o processo de diferenciação, os linfócitos Th17 aumentam a expressão gênica de PKM2 bem como a sua forma fosforilada (Y105). De forma interessante, tanto a inibição farmacológica como a deleção gênica da PKM2 especificamente em linfócitos T promoveram uma redução da diferenciação e expansão da subpopulação Th17, que foi associada com diminuição na expressão de moléculas efetoras e fatores de transcrição chave para o estabelecimento do fenótipo Th17. Em um contexto de resposta autoimune, notou-se que PKM2 é superexpressa nos órgãos linfóides periféricos e sistema nervoso central de animais com EAE, sendo correlacionada com o infiltrado de células inflamatórias. Corroborando com os dados in vitro, a deficiência de PKM2 em linfócitos T promoveu redução dos sinais clínicos da EAE, acompanhada de baixa frequência de linfócitos Th17 e menor expressão de moléculas inflamatórias do perfil Th17. Adicionalmente, o tratamento farmacológico com o inibidor da PKM2 atenuou a progressão e gravidade da EAE. Portanto, esses achados implicam um importante papel para PKM2 em doenças autoimunes por regular o desenvolvimento e função de linfócitos Th17. / Over the past few years, an important highlight has been given to Th17 lymphocytes for the development and maintenance of autoimmunity-associated inflammation. Multiple sclerosis is a CNS demyelinating autoimmune disease that is associated to Th17-mediated response. Some evidences have demonstrated that those cells undergo metabolic reprogramming after being activated, which is essential for their complete differentiation and acquisition of effector functions. The enzyme Pyruvate kinase M2 (PKM2) participates at the final step of glycolysis by converting phosphoenolpyruvate into pyruvate. Recent studies have demonstrated that PKM2 phosphorylation allows its translocation into the nucleus, where it plays a role in controlling gene expression. Thus, the aim of this study was to evaluate the involvement of PKM2 in Th17 lymphocytes differentiation, as well as its role in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model for multiple sclerosis. It was perceived that during differentiation process, Th17 lymphocytes increase PKM2 gene expression, and also its phosphorylated form (Y105). Interestingly, both pharmacological inhibition and T-lymphocyte-specific PKM2 gene deletion promoted a reduction in differentiation and expansion of Th17 subpopulation, being associated to diminished expression of effector molecules and key transcription factors for the establishment of Th17 phenotype. In the context of an autoimmune response, it was noticed that PKM2 is overexpressed in peripheral lymphoid organs and central nervous system of EAE-bearing mice, which was correlated with the inflammatory cell infiltration. Corroborating with in vitro data, the deficiency of PKM2 in T lymphocytes led to a reduction of EAE clinical score along with low Th17 frequency and diminished expression of Th17-related inflammatory molecules. Additionally, pharmacological treatment with the PKM2 inhibitor attenuated EAE progression and severity. Therefore, these findings imply an important role for PKM2 in autoimmune diseases by regulating the development and function of Th17 lymphocytes.

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T08:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thome_Rodolfo_D.pdf: 18503134 bytes, checksum: f4906f6cd7d52ca62d211efbbca1732a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A malária permanece como a maior doença infecciosa do mundo, sendo que metade da população mundial se encontra em risco de ser infectada. A destruição do agente causador, protozoários do gênero Plasmodium, é essencial para a resolução da moléstia e é mediada pela atuação coordenada entre linfócitos T e B. Foi noticiado a presença de auto-anticorpos em pacientes portadores de malária, e em alguns casos o agravamento de doenças autoimunes como o lúpus e, possivelmente, a esclerose múltipla. Estudos conduzidos em nosso laboratório demonstraram que a infecção por P. berghei NK65 em camundongos promoveu atrofia do timo e subsequente migração de células T CD4+CD8+ (DP) para órgãos linfoides secundários. Tendo em vista que o timo é o órgão linfoide primário responsável pela maturação e desenvolvimento de linfócitos T, desempenhando um papel primordial em gerar a tolerância central, o presente estudo teve por objetivo investigar o efeito da infecção por P. berghei sobre a evolução clínica da Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) e também sobre o perfil de ativação de células dendríticas. Os resultados obtidos mostraram que camundongos curados da malária apresentaram quadro clínico exacerbado de EAE quando comparados com animais que não entraram em contato com o plasmódio. A piora no quadro clínico de EAE se associou com a migração precoce de células T-DP para o Sistema Nervoso Central (SNC) e pela produção de citocinas inflamatórias por tais células. Camundongos resistentes a EAE desenvolveram a doença após a infecção por plasmódio, indicando que a atrofia tímica induzida pela infecção é capaz de alterar a susceptibilidade ao desenvolvimento de doenças autoimunes. Por outro lado, o tratamento de células dendríticas (DCs) com extratos derivados do plasmódio modificou seu estado de maturação/ativação para um perfil tolerogênico. A transferência adotiva de células dendríticas moduladas com extratos de plasmódio foi capaz de reduzir a EAE, bem como a neuro-inflamação do SNC pela supressão da resposta imune celular a neuro-antígenos. Tomados em conjunto, os resultados obtidos neste estudo mostram que a infecção por Plasmodium berghei NK65 promove alterações significativas no sistema imune que auxiliam na exacerbação da neuro-inflamação autoimune. Por outro lado, a utilização de extratos do plasmódio pode se tornar uma alternativa inovadora na modulação da inflamação por meio da transferência adotiva de células dendríticas tornadas tolerogênicas com tais extratos / Abstract: Malaria remains as the most frequent infectious disease in the world, where half of the world population is at risk. Destruction of the causative agent, protozoan of the Plasmodium gender, is essential for the resolution of the disease and this is mediated by the coordinated action of both T and B lymphocytes. It has been demonstrated that malaria-bearing patients possess auto-antibodies, e in some cases, the worsening of autoimmune diseases such as lupus and multiple sclerosis. Studies, conducted by our group, have shown that P. berghei NK65 infection promoted thymic atrophy and the subsequent migration of CD4+CD8+ (DP) T cells towards the peripheral immune system. Since the thymus is the primary lymphoid organ responsible for the generation and maturation of T cells, playing a major role in the shaping of T cells repertoire, the present study aimed to investigate the influence of P. berghei infection in the clinical course of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), the mouse model for multiple sclerosis, and also over the maturation/activation status of dendritic cells. Results showed that malaria-cured mice developed a more severe EAE clinical course compared with control mice. The worsening in EAE score was related to the migration of DP-T cells towards the Central Nervous System (CNS), where these cells produced high amounts of inflammatory cytokines. Interestingly, EAE-resistant BALB/c mice developed the disease after plasmodia infection, indicating that the thymic atrophy induced by the infection is able to alter the susceptibility to autoimmune diseases. On the other hand, treatment of dendritic cells (DCs) with P.berghei extracts (PbX) modified their activation/maturation status towards a tolerogenic profile. The adoptive transfer of DC-PbX was able to suppress the development of EAE, as well as neuro-inflammation, through the reduction in cellular immune responses towards neuro-antigens. Taken together, the results collected in this study show that Plasmodium berghei NK65 infection promotes significant alterations in the immune system that aid the development of autoimmune neuro-inflammation. On the other hand, the use of plasmodia extracts may become an interesting approach to modulate inflammation through the adoptive transfer of tolerogenic dendritic cells / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:28:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3514_1.pdf: 1662461 bytes, checksum: 4299ca9ce68f3278627f129280b296b3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / O polimorfismo no éxon 1 do gene da lectina ligadora de manose (MBL2) altera os níveis séricos e a funcionalidade desta lectina (MBL), que é um componente da imunidade natural, e poderia estar envolvida na susceptibilidade e no tipo de resposta ao tratamento da hepatite C crônica.O interferon alfa peguilado (IFNα-peg) associado à ribavirina (RIBA) melhorou a resposta terapêutica de pacientes infectados pelo vírus da hepatite C (HCV), embora de modo não satisfatório. Estudos de fatores relacionando a resposta terapêutica não sustentável podem indicar novas estratégias de tratamento. A infecção pelo o HCV e seu tratamento com IFNα- peg/ RIBA são relacionados aos marcadores sorológicos de autoimunidade tireoidiana (AAT). A deficiência de MBL está associada ao desenvolvimento de doenças autoimunes. Neste estudo verificamos a associação entre o polimorfismo do MBL2 com o HCV e a resposta ao seu tratamento. Verificamos também, a associação entre o HCV, seu tratamento combinado e genótipos virais com AAT. Participaram deste estudo 162 pacientes infectados pelo o HCV, sendo 111 tratados com IFNα-peg/RIBA e 51 não tratados atendidos no Serviço de Gastrohepatologia do Hospital Universitário Oswaldo Cruz da Universidade de Pernambuco Brasil e, 232 voluntários sadios. Entre os pacientes, 65 indivíduos tinham a carga viral disponível após o término do tratamento, e foram classificados em respondedores virológicos (n=37) e não respondedores virológicos (n=28). O polimorfismo do MBL2 foi determinado por PCR em tempo real e classificou o alelo selvagem (A) e os polimórficos (0). Pacientes e controles foram testados para anticorpos anti-peroxidase tireoidiana e anti-tireoglobulina. A freqüência do polimorfismo para MBL2 foi mais alta nos pacientes infectados pelo HCV do que nos indivíduos sadios (p=0,01; OR=4,44; IC 0,56-10,06). Os genótipos minoritários A0/00 não foram mais freqüentes no grupo que respondeu ao tratamento (p=0,1146; OR 2,54; IC 0,83 -7,87). A ocorrência de AAT foi de 11,1% (n=18) nos pacientes (n=162), de 11,7% (n=13) nos pacientes após o tratamento (n=111) e de 9,8% (n=5) nos pacientes não tratados (51). Estes dados mostraram correlação positiva quando pacientes com AAT tratados (p= 0,01; OR 5,35; IC 1,41-9,89) e sem tratamento específico (p=0,0474; OR 4,38; IC 0,81-29,08) foram comparados com voluntários. Comparando os grupos de pacientes, não encontramos diferenças nas freqüências de AAT (p=0,928; OR 1,22; IC 0,38-4,63). A presença de AAT nos pacientes com o HCV não foi maior no sexo feminino (p=0,0801; OR 2,91; IC 0,91-10,9). A chance do genótipo 1 do HCV estar relacionado à AAT foi 3,42 vezes maior do que a do genótipo 3 (p= 0,14; OR 3,42; IC 0,71-3,24). Os pacientes infectados pelo HCV e com AAT positivos (n=18) apresentaram uma elevada freqüência do polimorfismo do MBL2 (22%) comparando com aqueles sem AAT (10%) (n=144), entretanto esta diferença não foi significativa (p= 0,1196; OR 2,65; IC 0,56 10,06). O polimorfismo estrutural do MBL2 foi associado à infecção pelo HCV, indicando que a MBL poderia ter um papel na imunidade inata contra este vírus. A deficiência de MBL parece não influenciar a resposta ao tratamento do HCV, embora uma população maior de pacientes deva ser estudada. O sexo feminino não foi confirmado como importante fator de risco de desenvolvimento de AAT nos pacientes de HCV. O HCV parece ser um fator importante no desenvolvimento de autoimunidade tireoidiana, independente da terapia combinada. O polimorfismo do gene MBL2 parece não estar associado com o desenvolvimento de AAT nos pacientes de HCV, entretanto devido ao reduzido número de pacientes infectados pelo HCV com AAT (n=18) esta observação não pode ser considerada definitiva

Orientadores: Denise Engelbrecht Zantut Wittmann, Sarah Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T02:28:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Botelho_IlkaMaraBorges_M.pdf: 1340793 bytes, checksum: 6ef5a41b67a7eddca52fc55dea2f96d4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Vitamina D tem sido apontada como importante regulador da resposta imune. Estudos tem demonstrado haver relação entre insuficiência de vitamina D e presença de doenças autoimunes como Tireoidite de Hashimoto (TH). É possível que o processo autoimune na TH seja inibido em diferentes estágios pela vitamina D em sua forma ativa. Nossos objetivos foram estudar a prevalência de insuficiência de vitamina D e a relação de suas concentrações séricas com marcadores de função e autoimunidade tireoideana. Material e Métodos: Amostras de sangue foram coletadas de 54 pacientes com TH e 54 indivíduos saudáveis sem diagnóstico de TH com idade entre 18 e 75 anos. Foram realizadas dosagens séricas de vitamina D (25OHD), TSH, T4 livre, cálcio, fósforo, paratormônio (PTH), anticorpos anti-tireoperoxidase (AcTPO), anti-tireoglobulina (AcTG) e anti-receptor de TSH (TRAb). Volume tireoideano foi estimado por ultrassonografia. Foram coletados dados demográficos, de peso, altura, índice de massa corporal (IMC) e tempo de diagnóstico. Pacientes e indivíduos do grupo de controle foram pareados por idade e sexo. O nível de significância estatística adotado foi 5%. Resultados: Prevalência de insuficiência de vitamina D foi encontrada em 68.5% dos pacientes e em 38.9% dos indivíduos do grupo de controle (p =0,002). Houve uma correlação positiva entre níveis de AcTPO e maior volumetireoideano nos pacientes (r = 0,319; p= 0.019). Não houve correlação entre concentração de vitamina D, TSH, T4livre,TRAb, AcTGe volume tireoideano. Conclusões: Demonstramosmaior prevalência deinsuficiência de vitamina Dem pacientescom tireoidite de Hashimotoem relaçãoa indivíduos de um grupo controlesaudável, não havendo correlaçãocom o estado hormnal tireoideanooumarcadores séricos deautoimunidadeda tireóide.Por sua vez, maior volume da tireóidese associou a maior grau de infiltração inflamatóriaautoimune,refletido pelacorrelaçãocom maiores concentrações AcTPO / Abstract: Introduction: Vitamin D has been pointed out as an important immune response regulator. Studies have shown a relationship between vitamin D insufficiency and the presence of autoimmune diseases such as Hashimoto's Thyroiditis (HT). It's possible that the autoimmune process in HT is inhibited in its different stages by vitamin D on its active form .Our aims were to study the prevalence of vitamin D insufficiency and relationship of the serum concentrations with thyroid function and autoimmunity markers. Material and Methods: Blood samples were collected from 54 patients with HT and 54 healthy individuals without a diagnosis of HT, aged 18 to 75 years. We conducted serum 25OH vitamin D, TSH, free T4, calcium, phosphorus, PTH, TPOAb, TgAb and TRAb. Thyroid volume was estimated by ultrasound. Data on demographic, weight, height, body mass index and time since diagnosis were collected. Patients and control subjects were matched by sexand age. The significance level for statistical analysis was 5%. Results: Prevalence of vitamin D insufficiency was found in 68.5% of patients and in 38.9% of subjects in the control group (p= 0.002). There was a positive correlation between TPOAb and volume in patients (p= 0.019). There was no correlation between vitamin D concentration and thyroid volume, TRAb, TgAb, TSH or free T4. Conclusions: We demonstrated a higher prevalence of vitamin D insufficiency in patients with Hashimoto's thyroiditis compared to individuals of a healthy control group, no correlation with thyroid state hormonal or serum markers of thyroid autoimmunity. In turn, greater thyroid volume was associated with a higher degree of autoimmune inflammatory infiltration, reflected by the correlation with higher concentrations AcTPO / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

O presente estudo discute o papel dos miRNAs na fisiopatologia molecular de Esclerose Múltipla Recorrente Remitente (EMRR). O estudo demonstrou que em linfócitos T CD4+ de pacientes com EMRR em surto ocorre a diminuição da expressão do miR-15a e do miR16-1 em contraposição ao aumento de seu gene alvo BCL-2, um importante gene regulador da apoptose. Esses achados sugerem a participação desses miRNAs no controle da apoptose na EM. Para explorar essa associação, foi analisado a expressão global de miRNAs nas subpopulações de linfócitos T de pacientes com EMRR no estágio de remissão. O resultado dessa análise determinou de forma inédita o aumento significativo da expressão de 9 miRNAs (miRNAs-16, miRNAs-20a, miRNAs-21, miRNAs-24, miRNAs-155, miRNAs-221, miRNAs-222, miRNAs-720 e miRNAs-1281) nos linfócitos T CD8+ de memória central. A análise in silico dos alvos desses miRNAs indicou que três vias canônicas, relacionadas à ativação da apoptose, eram enriquecidas com alvos preditos e validados experimentalmente desses miRNAs. Desse modo sugerimos a forte relação desses miRNAs no controle da apoptose nos linfócitos T dos pacientes com EMRR. A fim de aprofundar nossos estudos, selecionamos os miRNAs miR-21 e miR-24, para a realização de experimentos funcionais in vivo. Foi verificada a indução da expressão miR-21 somente nos linfócitos T CD4+ de modelo experimental da EM. Adicionalmente, experimentos in vitro demonstraram que a expressão do miR-21 e restrita as populações de células Th2 e Th17. Nesse caso, miR-21 parece ser regulado pelo fator de transcrição STAT3, sugerindo assim que o aumento da expressão do miR-21 verificada no modelo animal possa estar relacionada com a presença de linfócitos T CD4+ de perfil Th17 nesse tecido. Em resumo, o conjunto desses resultados demonstra a relevância dos miRNAs na fisiopatologia da EMRR, principalmente no controle da apoptose. / This study discusses the role of miRNA in the Molecular Pathophysiology of Relapse Remitting Multiple Sclerosis (RRMS). The study has shown that CD4+ lymphocytes from relapsed RRMS patients had lower expression of miR15a and miR-16-1 in contraposition of higher expression of the target gene BCL-2, a key regulator of apoptosis. These findings suggest the role of those on the control of apoptosis in MS. In order to explore this association, the global expression of miRNAs was analysed in T lymphocyte subpopulations from remission RRMS patients. The result of this analysis has demonstrated for the first time a significant higher expression of 9 miRNAs (miRNAs-16, miRNAs-20a, miRNAs-21, miRNAs-24, miRNAs-155, miRNAs-221, miRNAs-222, miRNAs-720 e miRNAs-1281) in central memory T CD8+ lymphocytes. In silico analysis of the miRNAs targets indicates that three canonical pathways related to the activation of apoptosis were enriched with predicted and experimental validated gene targets for those miRNAs. In this way, we suggest the strong relation of these miRNAs in the control of apoptosis in the lymphocytes from RRMS patients. In order to intensify our studies we selected miR-21 and miR-24 to perform in vivo functional experiments. It was verified miR-21 induction only in T CD4+ lymphocytes from MS animal model. Additionally, in vitro experiments have demonstrated that miR-21 expression was restricted to Th2 and Th17 cell populations. In this way, miR-21 seems to be regulated by the STAT3 transcription factor, thereby suggesting that the increase of miR-21 expression observed in vivo could be related with Th17 CD4+ present in this tissue. In summary, this set of results showed the relevance of miRNAs in the RRMS pathophysiology, mainly in the control of apoptosis.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-04-27T14:19:15Z No. of bitstreams: 1 GLAUCIELEN GOMES DA SILVA.pdf: 1992448 bytes, checksum: 7764de752332d80cd64fa3e7a9e1b7a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T14:19:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GLAUCIELEN GOMES DA SILVA.pdf: 1992448 bytes, checksum: 7764de752332d80cd64fa3e7a9e1b7a1 (MD5) Previous issue date: 2017-03-08 / The search for autoantibodies in HEp-2 cells represents a relevant tool for diagnostic assistance in the investigation of autoimmune diseases, especially rheumatic diseases. This methodology, over the last years, underwent by intense process of improvement and standardization with the accomplishment of the Brazilian Consensus. The objective of this study was to evaluate the implantation of recommendations in the clinical laboratories that perform the methodology, 16 years after the accomplishment of the I Brazilian Consensus on ANA in HEp-2 cells. A research was conducted for the laboratories between February and October 2016. The laboratories were invited to answer questions that dealt with the guidelines of the Consensus, addressing technical aspects, quality control, reading of the slides, issuance of reports and educational programs. The study counted on the participation of 53 laboratories that jointly realize an estimate of 300,000 ANA by month. It has been identified that several medical specialties request the examination, and different professionals are responsible for the technical procedure and reading of the fluorescence slides. Consensus recommendations are being followed by all laboratories, in absolute by 58.5% of the laboratories. Regarding the technical procedure, 83.1% of the participants are screening at a 1:80 dilution and the title depletion, recommended by consensus, is being adopted by all participants. It was evidenced that 39.6% of the participants use more than one brand of kit and that 22.6% performs titration of the conjugate to each new kit and different lamp powers are used in laboratories with a predominance of 100 Watts. Regarding the reading of the slides, 94.3% stated that they observed the four cell compartments, 92.5% said to classify the chromosome metaphase plate negative or positive and 32.1% of the participants did not affirm to observe the cells in all phases of the cycle. In the issue of reports, 13.2% of the laboratories admitted to reporting only the name of the standard followed by the title, not presenting the descriptive report and 24.5% of the participants do not use education and quality control programs. Most laboratories were able to identify representative images of sets of patterns. The results presented here demonstrate consistent advances from the implementation of the ANA Consensus in Brazil, but also evidence the need for actions to implement continuing education programs. / A pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 tem auxiliado no diagnóstico na investigação de doenças autoimunes especialmente as reumáticas. Tal metodologia, ao longo dos últimos anos, passou por um intenso processo de aperfeiçoamento e padronização com a realização do Consenso Brasileiro. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, 16 anos após a realização do I Consenso Brasileiro de FAN em Células HEp-2, a implantação das recomendações nos laboratórios clínicos que realizam a metodologia. Foi realizada uma pesquisa direcionada aos laboratórios entre fevereiro e outubro de 2016. Os laboratórios foram convidados a responder um questionário sobre as diretrizes do Consenso, abordando aspectos técnicos, controle de qualidade, leitura das lâminas, emissão de laudos e programas educativos. O estudo contou com a participação de 53 laboratórios que, em conjunto, realizam uma estimativa de 300.000 FAN/mês. Foi identificada uma heterogeneidade em especialidades médicas solicitantes do teste e profissionais responsáveis pelo procedimento técnico e leitura das lâminas de fluorescência. As recomendações do Consenso estão sendo seguidas em sua totalidade por 58,5% dos laboratórios. Em relação ao procedimento técnico, 83,1% dos participantes fazem triagem com diluição 1:80 e o esgotamento de título, recomendado pelo Consenso, está sendo adotado por todos os participantes. Evidenciou-se que 39,6% dos participantes utilizam mais de uma marca de kit e que 22,6% realiza a titulação do conjugado a cada nova kit, e diferentes potências de lâmpadas são utilizadas nos laboratórios com predomínio das de 100 Watts. Em relação à leitura das lâminas, 94,3% afirmam observar os quatro compartimentos celulares, 92,5% afirmam classificar a placa metafásica cromossômica em negativa ou positiva e 32,1% dos participantes não afirmaram observar as células em todas as fases do ciclo celular. Na emissão de laudos, 13,2% dos laboratórios admitiram relatar somente o nome do padrão seguido pelo título, não apresentando o laudo descritivo e 24,5% dos participantes não utilizam programas de educação e controle de qualidade. A maioria dos laboratórios foi capaz de identificar imagens representativas de grupos de padrões. Os resultados aqui apresentados demonstram consistentes avanços a partir da implantação do Consenso de FAN no Brasil, porém, evidenciam também a necessidade de ações para implementação dos programas de educação continuada.

Atualmente, ainda é incerto se a hidrólise de L-arginil-β-naftilamida (ArgNA) e do leucotrieno (LT) A4 pela LT-A4-hidrolase (LT-A4-H) (EC 3.3.2.6) e pela aminopeptidase básica (APB) (EC 3.4.11.6) tem influência no desenvolvimento da artrite induzida por colágeno (CIA). O objetivo deste estudo foi investigar a inter-relação entre LT-A4-H, APB e LT-B4 em ratos submetidos à CIA. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), ensaio imunoenzimático (EIA), espectrofluorimetria e reação quantitativa em tempo real em cadeia da polimerase (qPCR) foram usados como metodologias. A existência dos genes para as proteínas EC 3.3.2.6 e EC 3.4.11.6 foi confirmada no tecido sinovial (TS) de ratos controles sadios. A hidrólise de ArgNA aumentou na fração solúvel (FS) dos animais submetidos à CIA que desenvolveram a doença (artríticos-CIA) em comparação com aqueles que não desenvolveram a doença (resistentes-CIA) e com os controles sadios. No líquido sinovial (SY) e no plasma sanguíneo houve menor hidrólise de ArgNA em resistentes em comparação aos artríticos e controles. Nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), os níveis de hidrólise de ArgNA aumentaram na FS de controles e na fração de membrana (FM) dos resistentes em comparação aos artríticos. Em comparação com controles sadios, a hidrólise de LT-A4 aumentou no SY e na FS de PBMCs de artríticos e resistentes. A hidrólise de LT-A4 também aumentou na FM do TS de resistentes e diminuiu na FM de PBMCs em artríticos e resistentes. Em todos estes compartimentos a hidrólise de ArgNA permaneceu inalterada ou relacionou-se inversamente com a hidrólise de LT-A4, comparativamente aos controles sadios. A hidrólise de ArgNA diferiu entre os artríticos e resistentes em FM-TS, FS-TS, FM-PBMCs, SY e no plasma sanguíneo. Uma relação no mesmo sentido foi encontrada entre alterações na hidrólise de LT-A4 e nos níveis de LT-B4 apenas em SY e FM-PBMCs dos artríticos e resistentes e em FM-TS dos resistentes, comparativamente aos controles sadios. Em conclusão, a atividade APB é um novo marcador que distingue ratos artríticos e resistentes no modelo CIA. Os níveis de LT-B4 em ratos não são controlados somente pela LT-A4-H. Alterações na atividade LT-A4-H e nos níveis de LT-B4 são indistinguíveis entre artríticos e resistentes, mas tais alterações marcadamente distinguem essas duas condições da condição saudável. LT-A4-H e APB estão relacionadas de uma forma compartimento-dependente, atuando como enzimas independentes, com modulação diferencial das suas especificidades, eficiências e/ou afinidades catalíticas sobre os substratos epóxi e peptídico, ou como enzimas bifuncionais, cujas atividades são inversamente relacionadas devido à inibição concorrente de uma destas atividades / Whether L-arginyl-β-naphthylamide (ArgNA) and leukotriene (LT)-A4 hydrolyses by LT-A4 hydrolase (LT-A4-H) (EC 3.3.2.6) and basic aminopeptidase (APB) (EC 3.4.11.6) influence the development of collagen-induced arthritis (CIA) is presently uncertain. The objective of this study was to investigate the interrelationship among LT-A4-H, APB and LT-B4 in CIA rats. High-performance liquid chromatography (HPLC), enzyme immunoassay (EIA), spectrofluorometry and quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) were used as methodologies. The existence of genes for EC 3.3.2.6 and EC 3.4.11.6 proteins were confirmed in the synovial tissue (TS) of healthy control rats. ArgNA hydrolysis was higher in soluble fraction (FS) in rats submitted to CIA that developed the disease (CIA-arthritic) than in those that did not develop the disease (CIA-resistant) or healthy control. Synovial fluid (SY) and blood plasma had lower ArgNA hydrolysis in CIA-resistant than in CIA-arthritic or control. In the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) the levels of ArgNA hydrolysis increased in FS of control and in membrane-bound fraction (FM) of CIA-resistant in comparison with CIA-arthritic. Compared with healthy control, LT-A4 hydrolysis increased in SY and in FS from PBMCs of CIA-arthritic and CIA-resistant. LT-A4 hydrolysis also increased in FM from TS of CIA-resistant and decreased in PBMCs-FM of CIA-arthritic and CIA-resistant. In all these locations hydrolysis of ArgNA remained unchanged or it was inversely related with LT-A4 hydrolysis, comparatively to healthy control. ArgNA hydrolysis differed between CIA-arthritic and CIA-resistant in TS-FM, TS-FS, PBMCs-FM, SY and blood plasma. A same-sense relationship was found between changes on LT-A4 hydrolysis and LT-B4 levels only in SY and PBMCs-FM of CIA-arthritic and CIA-resistant and in TS-FM of CIA-resistant, comparatively to healthy control. In conclusion, the APB activity is a novel distinctive marker of CIA-arthritic and CIA-resistant statuses. The levels of LT-B4 in rats are not controlled only by LT-A4-H. Changes on LT-A4-H activity and LT-B4 levels are indistinguishable between CIA-resistant and CIA-arthritic, but such variations markedly distinguish these two statuses from healthy status. LT-A4-H and APB are related in a compartment-dependent manner acting as independent enzymes with differential modulation of their specificity, efficiency and/or catalytic affinity on the aminoacyl and epoxy substrates, or as bifunctional enzymes which activities are inversely related due to the concurrent inhibition of one of these

A artrite induzida por pristane (PIA) em camundongos HIII (resistentes) e LIII (suscetíveis) foi usada para estudar mecanismos inflamatórios e imunes atuantes na fase pré-clínica da doença, os quais são pouco conhecidos. Estudos anteriores mostraram diferenças significativas na produção de citocinas nos animais HIII e LIII na fase pré-clínica da PIA, sugerindo forte influênica no fenótipo de PIA. A PIA foi induzida apenas por via intraperitoneal nos animais LIII, com intensa infiltração de neutrófilos, linfócitos, monócitos e macrófagos, altos níveis de IL-12p40 e maior expressão de genes de citocinas inflamatórias após a injeção de pristane. Por outro lado, na linhagem HIII houve aumento de eosinófilos e neutrófilos, mas redução de monócitos e linfócitos. Não observamos diferenças nos níveis de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, IFN-<font face=\"Symbol\">g, IL-12p70, IL-17, IL-10. Concluímos que a intensidade e o tipo de resposta inflamatória na fase inicial da PIA podem ser mecanismos envolvidos na diferença de resistência/ susceptibilidade entre as linhagens HIII e LIII. / Pristane-induced arthritis (PIA) in HIII (resistant) and LIII (susceptible) mice was used in this work to characterize the cellular and molecular alterations of the pre-clinical phase of the disease, of which little is known. Previous reports showed significant differences in cytokine production of HIII and LIII mice in the pre-clinical phase of PIA, suggesting a strong influence on PIA phenotype. PIA was induced only by the intraperitoneal route in LIII animals, which showed intense infiltration of neutrophils, lymphocytes, monocytes and macrophages, with high levels of IL-12p40 after pristane injection. Inflammatory cytokine genes were also upregulated in LIII mice. On the other hand, HIII strain had increased eosinophils and neutrophils, but reduced monocytes and lymphocytes. No significant differences were found in TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, IFN-<font face=\"Symbol\">g, IL-12p70, IL-17, IL-10 levels. We conclude that the intensity and type of inflammatory response in the initial phase of PIA may be different mechanisms involved in resistance / susceptibility between HIII and LIII mice.