Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans les conditions normales, les organismes maintiennent une masse cellulaire endocrine stable tout au long de leur vie. En cas d’obésité, la masse de cellules b pancréatiques est capable de maintenir des taux de glucose plasmatique en augmentant la sécrétion en insuline. L’incapacité de ces cellules à fournir de l’insuline entraîne alors l’apparition d’une hyperglycémie et d’un diabète de type II. Cliniquement, la majorité des individus obèses ne développent pas de diabète car les îlots pallient à cette résistance à l’insuline. La preuve de l’adaptation de la masse d’îlots humains à l’obésité, in vivo, n’a pas été clairement décrite et, de plus, peu d’informations existent sur les mécanismes et les types cellulaires impliqués. Actuellement, la mise en évidence de l’augmentation de la masse des cellules b chez les humains obèses repose uniquement sur des études histologiques.But : Au cours de cette thèse, nous avons cherché, dans un premier temps (partie 1), à évaluer la morphologie des îlots pancréatiques et la distribution des cellules a et b chez des donneurs en état de mort cérébrale normaux, en surpoids et obèses. Dans un second temps (partie 2), nous avons étudié l’adaptation au cours du temps des îlots humains à un environnement obésogène. Nous avons montré ainsi que les îlots humains non diabétiques s’adaptent in vivo à l’obésité en modifiant la masse de cellules b, leur fonction et leur expression génique. En suite (partie 3), on a identifié le mécanisme de transdifférenciation des cellules alpha et beta en utilisant la méthode de lineage tracing. Finalement (partie 4), on a déterminé la différence sur l’expression de gène des ilots humains greffé chez les souris sous régime control ou régime riche en graisse en utilisant les puces d’ARN (Illumina).Methodes et Resultats: Des coupes de pancréas humains inclues en paraffines ont été analysées. Les donneurs obèses étaient caractérisés par une augmentation de la masse endocrine totale, de la taille des îlots, de la graisse intra-pancréatique et du ratio b:a dans les îlots, mais avec une diminution du ratio a:b dans les îlots. Au cours de l’étude longitudinale, des souris Rag2-/- non diabétiques ont été greffées sous la capsule rénale avec des îlots humains issus de donneurs en état de mort cérébrale (donneurs non diabétiques ou donneurs avec un dysfonctionnement métabolique déclaré). Les animaux ont été nourris pendant 2 semaines avec soit un régime contrôle soit un régime riche en graisse (high fat diet HFD). Un suivi du poids, du taux des triglycérides, de la glycémie et du C-peptide a été mis en place. Après sacrifice des souris, les greffons et les pancréas endogènes ont été analysés pour le volume endocrine, la distribution des cellules b et a et les mécanismes de régénération des cellules pancréatiques. Après 12 semaines sous régime gras, les souris montraient toutes les caractéristiques typiques de l’obésité, à savoir, une augmentation du poids, un doublement de la graisse abdominale, des triglycérides, de la glycémie et une sensibilité à l’insuline réduite. De plus, l’apparition sur ces animaux d’un doublement rapide de la quantité de C-peptide humain dans le sérum murin nous indique la mise en place d’une compensation fonctionnelle. Une analyse histologique des greffons a permis de mettre en évidence une adaptation de la masse endocrine des îlots avec une augmentation des cellules b. D’autres analyses ont identifié la prolifération et la néogénèse comme les mécanismes responsables de ce doublement de la masse endocrine humaine.Discussion: Ce nouveau modèle animal permet d’étudier, in vivo sur une longue période, l’adaptation des îlots humains à un environnement obésogène murin. Il peut être utilisé comme un outil dans le décryptage des voies de signalisation impliquées dans l’expansion des cellules b humaines et permettre également l’identification des facteurs prédisposant ces cellules à subir une décompensation. / Under normal healthy conditions, organisms maintain a dynamic endocrinecell mass throughout life. Pancreatic beta cell mass are able to maintain plasma glucose levels increasing insulin secretion in conditions as obesity.Beta cell inability to compensate in insulin demand provokes hyperglycemia and Type 2 Diabetes. Clinically, most obese individuals do not develop diabetes because islets compensate for insulin resistance. Direct evidence that human islet mass adapts longitudinally to obesity in vivo was lacking and, moreover, little information was available on the mechanismsand cell type(s) involved.Current evidence for increased beta cell mass in obese humans (vs lean) is based entirely on postmortem histology.Aim: In this thesis, firstly (Part 1) we performed a descriptive cross sectional study by evaluating the pancreatic islet morphology and alpha and beta cell distribution from our archived human pancreatic sections of obese and normal subjects. Secondly, (Part 2) we explored the longitudinal adaptation of human islets to an obesogenic environment and showed direct evidence that non-diabetic human islets adapt bothendocrine and beta cell mass, function and gene expression to obesity in vivo. Thirdly (Part 3) we performed lineage tracing to determine which cell type alpha or beta give rise to the increase islet mass in obesity. Finally (Part 4) in this diet induced obesity model we developed, we looked at the differential gene expression with Illumina gene chips in a kinetic study on human islets which were laser capture microdissected at 6, 8 and 10 weeks on control or high fat diet.Methods: Archived human pancreatic sections were immunostained for endocrine, beta, alpha, fat. In the obese/immunodeficient mouse model, non-diabetic Rag2–/– mice were transplanted under kidney capsule with human islets from human brain-deceased donors (non-diabetics donors and donors with overt metabolic dysfunction). Animals were fed for 12 weeks with a control or high-fat diet (HFD), and followed for weight, serum triacylglycerol, fasting blood glucose and human C-peptide. After the mice were killed, human grafts and the endogenous pancreas were analyzed for endocrine volume, distribution of beta and alpha cells, and mechanisms of regeneration.Results: The cross-sectional study, performed on archived human paraffin embedded sections of normal weight, overweight, or obese subjects showed that obese donors were characterized by an increased total endocrine mass, bigger individual islet size, increased intrapancreatic fat, increased β to  cell ratio and decreased :β cell ratio in islets. In the longitudinal study, concomitant with the increased weight gain, doubling of abdominal fat, increased serum triacylglycerol and reduced insulin sensitivity in 12 week HFD animals we reported that human islet grafts showed functional compensation, measured as a more than doubling of fasting human C-peptide in mouse serum, and histological adaptation of islet endocrine mass including increased beta cells. Further analysis of the human grafts revealed proliferation and neogenesis as the responsible mechanisms for the doubling of the human endocrine mass.Discussion: This novel model allows, for the first time, longitudinal studies of human islet adaptation to an obese murine environment and may be instrumental in deciphering pathways involved in human beta cell expansion, as well as in helping to identify factors predisposing human beta cells to undergo decompensation.

Les Glioblastomes représentent les tumeurs cérébrales primaires les plus fréquentes chez l'adulte. Nous avons mis en évidence le rôle du récepteur PPARß/delta dans le caractère tumoral des glioblastomes. Nous avons montré que l'activation de ce récepteur stimule la prolifération et la migration des cellules de glioblastome T98G. Nous avons également montré que l'activation de PPARß/delta induit l'expression du gène Siah-1L et que la surexpression de ce gène stimule la prolifération et la migration cellulaire des glioblastomes. Nous avons ensuite étudié la régulation du gène Siah-1L humain et montré que son expression est induite par PPARß/delta. Le clonage du promoteur de ce gène et l'étude de sa régulation a permis de montrer que son induction par PPARß/delta est médiée par un élément de réponse situé au niveau du promoteur / Glioblastoma represent the most frequent primary brain tumor in adults. We highlighted the role of PPARß/delta in glioblastoma tumorigenesis. We have shown that activation of this receptor stimulates proliferation and migration of glioblastoma cells T98G. We also showed that activation of PPARß/delta induces the expression of Siah-1L gene and that overexpression of Siah-1L stimulates cell proliferation and migration of glioblastoma cells. We also studied the regulation of Siah-1L gene and showed that its expression is induced by PPARß/delta. Cloning of Siah-1L gene promoter sequence and the study of its regulation showed that the induction of the expression of Siah-1L by PPARß/delta is mediated by a response element located at the promoter sequence

Le diabète de type 2 résulte d’une diminution de la masse fonctionnelle de cellules bêta pancréatiques, possiblement liée à une dédifférenciation cellulaire : les cellules bêta restent présentes, mais leur production d’insuline s’effondre. Ce phénomène, s’il est avéré, ouvrirait la voie à de nouvelles recherches thérapeutiques. Mais s’il est démontré dans certains modèles murins, il n’existe que des arguments très indirects chez l’Humain. Notre objectif est d’apporter de nouveaux arguments pour ce phénomène chez l’humain en modélisant la dédifférenciation de cellules bêta humaines, en utilisant la lignée de cellules bêta pancréatiques humaines EndoC-βH1 et des îlots pancréatiques humains primaires. Nous avons découvert qu’un traitement par FGF2 effondrait la production d'insuline, et des études par RNA-Seq ont révélé un effondrement de plusieurs marqueurs spécifiques de la cellule bêta, incluant INS, MAFB, SLC2A2, SLC30A8 and GCK. Parallèlement, le traitement par FGF2 induisait l'expression de gènes normalement absents d’une cellule bêta, tels les facteurs de transcription MYC, HES1, SOX9 et NEUROG3. La dédifférenciation induite par le FGF2 était temps- et dose-dépendante, et réversible après wash-out. En outre, nous démontrons que la dédifférenciation modifie l’interaction de la cellule bêta avec son environnement : l'expression de TNFRSF11B (ostéoprotégerine), un récepteur tronqué pour RANKL (receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand), est induite lors du traitement par FGF2, et les cellules β sont alors protégées contre la signalisation RANKL (TNFSF11) par inhibition de la phosphorylation de P38. Enfin, les analyses des données transcriptomiques ont révélé des niveaux accrus d'ARNm de FGF2 dans les cellules canalaires, endothéliales et stellaires dans les pancréas d’individus diabétiques de type 2, alors que les taux d'ARNm de FGFR1, SOX9 et HES1 sont augmentés dans les îlots pancréatiques d’individus diabétiques de type 2. Nous avons donc développé un modèle de dédifférenciation des cellules bêta humaines induit par le FGF2, identifié de nouveaux marqueurs de dédifférenciation, et trouvé des signes d'augmentation de FGF2, FGFR1 et des marqueurs de dédifférenciation au cours du diabète de type 2. / Clinical and experimental evidences indicate a reduced functional β cell mass in type 2 diabetes. A recent hypothesis implicates β cell dedifferentiation in this reduction of functional β-cell mass. The vast majority of data related to β cell dedifferentiation derive from rodent models, and only indirect evidences are available in human. Our goal was to model human β-cell dedifferentiation using the functional human pancreatic β-cell line, EndoC-βH1, and primary human pancreatic islets. By screening a number of molecules in EndoC-βH1 cells, we found that FGF2 treatment dramatically reduces insulin production and MAFA expression, a β cell specific transcriptional activator. RNASeq of EndoC-βH1 cells treated with FGF2 revealed the down-regulation of additional human β cell specific markers, including INS, MAFB, SLC2A2, SLC30A8 and GCK. In parallel, FGF2 treatment activated the expression of β cell disallowed genes. This is the case for transcription factors such as MYC, HES1, SOX9 and NEUROG3. This is also the case for hormones such as GASTRIN and PYY. Such data were further confirmed by qPCR and immunostaining on primary human islets, attesting that dedifferentiation process occurs in human primary β cells. FGF2-induced dedifferentiation was time- and dose-dependent, and reversible upon wash-out. Furthermore, transcriptomic analysis revealed an increase of TNFRSF11B (osteoprotegerin) expression upon FGF2 treatment. TNFRSF11B is a decoy receptor for the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL). Our experimental data on EndoC-βH1 demonstrated that FGF2-induced TNFRSF11B protected β cells against TNFSF11 (RANKL) signaling by preventing P38 phosphorylation. Finally, analyses of transcriptomic data revealed increased FGF2 mRNA levels in ductal, endothelial and stellate cells in pancreases from type 2 diabetic patients, whereas FGFR1, SOX9 and HES1 mRNA levels increased in islets from type 2 diabetic patients. In conclusion, we developed a robust model to study β-cell dedifferentiation in a human context. We discovered SOX9, HES1 and MYC as positive markers of human β cell dedifferentiation, demonstrating evidence for dedifferentiation process in human β cell.