Esta tesis tuvo cinco objetivos principales: 1) conocer el grado de asociación entre los resultados del grado de inflamación subclínica obtenidos mediante la técnica de cytobrush (CB) y los cambios en la histología uterina mediante la evaluación de biopsias uterinas (BU); 2) estudiar las variaciones fisiológicas del porcentaje de polimorfo nucleares neutrófilos (PMN) en la citología endometrial durante el ciclo estral por medio de la técnica de CB; 3) validar la técnica de CB en nuestro país y determinar la prevalencia de ES y los niveles de corte del porcentaje PMN que se correspondan con una disminución de la eficiencia reproductiva; 4) determinar los agentes bacteriológicos involucrados en la ES; 5) demostrar que la histeroscopía (HI) puede ser usada para evaluar métodos de diagnóstico de EC y ES en vacas de tambo. Para cumplir con estos cinco objetivos se realizaron cinco experimentos. Los principales resultados obtenidos en esta tesis fueron que se validó por primera vez en nuestro país la técnica del CB para realizar el diagnostico de ES, y se determinaron los puntos de corte del porcentaje de PMN para diagnosticar a campo la prevalencia de ES. Durante el ciclo estral, el porcentaje de PMN nunca superó el 2% de PMN, mientras que con porcentajes de PMN superiores al 8%, 6%, 4% y 5% a los 21-33, 34 a 47, 48 a 62 y 21 a 62 dpp se comienza a observar una disminución de la eficiencia reproductiva. Este ha sido el primer trabajo en nuestro país en demostrar que las vacas con ES tuvieron 16,2% de reducción en la tasa de concepción al primer servicio, 16,8% de reducción en la cantidad de vacas preñadas a los 100 días de lactancia y 29 días de aumento de días abiertos comparado con vacas sin ES. Otro hallazgo importante de este trabajo fue que no existe relación entre ES y aislamiento bacteriano. Por último, se demostró que la HI es una técnica eficiente para el diagnóstico de EC pero ineficiente para el diagnóstico de ES.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Realiza el secuenciamiento del genoma completo de un patógeno alimentario nativo del género Clostridium usando la tecnología NGS y el análisis bioinformático comparativo con secuencias de importancia en inocuidad alimentaria. Para ello, aisla el ADN genómico del agente patógeno proveniente de una fuente alimentaria, realiza el secuenciamiento, ensamblaje y anotación del genoma completo del patógeno alimentario nativo del género Clostridium, identifica las secuencias de importancia en inocuidad alimentaria del patógeno alimentario y realiza el análisis bioinformático. / Tesis

Xanthomonas arboricola pv. pruni is the causal agent of the bacterial spot disease of stone fruits, almond and ornamental species of Prunus. This pathogen constitutes one of the major threats to this group of species due to the economic losses it generates, and it is therefore considered as a quarantine organism in the European Union (EU). Recently, several outbreaks of the disease have been described in EU countries including Spain, where this pathogen has been detected in seven regions. Given the importance of this emerging disease and the lack of information about it, several aspects related to its diagnosis and epidemiology have been addressed in this work. Additionally, taxonomic characterization of three atypical Xanthomonas strains isolated from nectarines, causing similar symptoms to those produced by X. arboricola pv. pruni, have also been performed. First, a prototype of lateral flow immunoassay has been designed for the diagnosis of bacterial spot disease. It was developed by producing two polyclonal antibodies which were then combined with carbon nanoparticles and assembled on nitrocellulose strips. The specificity of the immunoassay was tested, obtaining a positive result with all the strains of X. arboricola pv. pruni analyzed. The limit of detection observed was 104 CFU/ml, which is sufficient for the detection of this pathogen in symptomatic samples. To demonstrate the accuracy and the reliability of the immunoassay, the prototype developed was used in the analysis of naturally infected field samples and healthy samples. Results were compared to those obtained by plate isolation and real time PCR, and a high correlation among techniques was observed. In a second step, as X. arboricola pv. pruni was first detected in Spain in 2002, and in subsequent years several outbreaks have occurred in 11 provinces, it was considered of interest to study the relationships between a collection of 239 Spanish strains of this pathogen originated from nurseries, orchards and interceptions with the technique of the Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis (MLVA). This method confirmed its high discriminatory power and the strains were grouped in 18 genetic clusters. The results obtained suggest multiple introductions of X. arboricola pv. pruni in Spain, and the leading role of the nurseries in the introduction and dissemination of this pathogen through the commercialization of contaminated plant propagation material. Finally, three strains isolated from nectarines in Murcia showing similar symptoms to those produced by X. arboricola pv. pruni, were analyzed using both phenotypic and molecular methods. The first results of biochemical tests and PCR were negative for this pathogen. Therefore, these isolates have been subjected to a taxonomic characterization through a polyphasic approach, comparing them with reference strains of other Xanthomonas species. Additionally, inoculations on peach plants demonstrated the pathogenicity of the three strains. The results obtained confirmed that these strains constitute a new species of the genus Xanthomonas, for which the name Xanthomonas prunicola has been proposed, and its main differential characteristics from the other species of this genus have been defined. Overall, the studies collected in this thesis provide a rapid method for on-site diagnosis of the bacterial spot disease, a deeper knowledge of the genetic diversity of the Spanish strains of X. arboricola pv. pruni and the development of a new methodology for its evaluation, as well as the description of a new Xanthomonas species that affects nectarine. / Xanthomonas arboricola pv. pruni es el agente causal de la mancha bacteriana de los frutales de hueso, el almendro y especies ornamentales del género Prunus. Este patógeno constituye una de las mayores amenazas para estas especies debido a las pérdidas económicas que genera, por lo que está considerado como un organismo de cuarentena en la Unión Europea (UE). Se han descrito numerosos brotes en países miembros de la UE en los últimos años y entre ellos en España, donde ha sido detectada la bacteria en siete Comunidades Autónomas. Ante la importancia de esta enfermedad emergente y la carencia de información sobre la misma, en este trabajo se han abordado aspectos relacionados con su diagnóstico y epidemiología que permitirán ampliar nuestro conocimiento sobre ella. Además, también se ha realizado la caracterización taxonómica de tres cepas atípicas de Xanthomonas aisladas de nectarino, que causan síntomas similares a los producidos por X. arboricola pv. pruni. En primer lugar, se ha desarrollado un prototipo de tiras inmunológicas de flujo lateral para el diagnóstico de la mancha bacteriana. Para su diseño, se partió de dos anticuerpos policlonales que se combinaron con nanopartículas de carbono y se ensamblaron en membranas de nitrocelulosa. Se analizó la especificidad de las tiras, obteniendo resultado positivo con todas las cepas de X. arboricola pv. pruni ensayadas. El límite de detección obtenido con las tiras de flujo lateral fue de 104 UFC/ml, que es suficiente para la detección de esta bacteria en muestras sintomáticas. Para comprobar su fiabilidad y precisión, el prototipo desarrollado se utilizó en el análisis de muestras de campo naturalmente infectadas y muestras sanas, y los resultados se compararon con los obtenidos en el aislamiento en medio de cultivo y los de PCR en tiempo real, observándose una elevada correlación entre las tres técnicas. En segundo lugar, como X. arboricola pv. pruni se detectó por primera vez en España en 2002, y desde entonces se han producido brotes de la enfermedad en 11 provincias, se consideró de interés estudiar las relaciones existentes entre una colección de 239 cepas españolas de esta bacteria procedentes de viveros, plantaciones e intercepciones, con la técnica del "Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis" (MLVA). Se demostró su gran poder de resolución ya que permitió clasificar las cepas en 18 grupos genéticos. Los resultados obtenidos sugieren que en España se han producido múltiples introducciones de la bacteria, y que los viveros han jugado un papel importante en la introducción y diseminación del patógeno a través de la comercialización de material vegetal contaminado. Por último, se analizaron fenotípica y molecularmente tres cepas aisladas en nectarinos de la provincia de Murcia, que mostraban síntomas similares a los causados por X. arboricola pv. pruni. Los primeros análisis basados en test bioquímicos y PCR resultaron negativos para este patógeno. Por tanto, se ha llevado a cabo la caracterización taxonómica de dichos aislados a través de un estudio polifásico, comparándolos con cepas de referencia de otras especies de Xanthomonas. Además, se realizaron inoculaciones que confirmaron la patogenicidad de las cepas. Los resultados obtenidos han permitido clasificar estas cepas como una nueva especie del género Xanthomonas, para la que se ha propuesto el nombre de Xanthomonas prunicola y para la que se han definido sus características diferenciales de las otras especies de este género. Los trabajos presentados en esta memoria han aportado un nuevo método rápido de diagnóstico in situ de la mancha bacteriana, el desarrollo una nueva metodología para la evaluación de la diversidad genética de una selección de cepas españolas de X. arboricola pv. pruni, así como la descripción de una nueva especie de Xanthomonas que afecta a nectarino. / Xanthomonas arboricola pv. pruni és l'agent causal de la taca bacteriana dels fruiters d'os, l'ametler i espècies ornamentals del gènere Prunus. Aquest patogen constitueix una de les majors amenaces per a aquestes espècies a causa de les pèrdues econòmiques que genera, per la qual cosa està considerat com un organisme de quarantena en la Unió Europea (UE). S'han descrit nombrosos brots en països membres de la UE en els últims anys i entre ells a Espanya, on ha sigut detectat el bacteri en set Comunitats Autònomes. Davant la importància d'aquesta malaltia emergent i la manca d'informació sobre aquest tema, en aquest treball s¿han abordat aspectos relacionats amb el seu diagnòstic i epidemiologia que permetran ampliar el nostre coneixement sobre ella. A més, també s'ha realitzat la caracterització taxonòmica de tres ceps atípics de Xanthomonas aïllats de nectariner, que causen símptomes similars als produïts per X. arboricola pv. pruni. En primer lloc, s'ha desenvolupat un prototip de tires immunològiques de flux lateral per al diagnòstic de la taca bacteriana. Per al seu disseny, es va partir de dos anticossos policlonals que es van combinar amb nanopartícules de carboni i es van assemblar en membranes de nitrocel¿lulosa. Es va analitzar l'especificitat de les tires obtenint resultat positiu amb tots els ceps de X. arboricola pv. pruni assajats. El límit de detecció obtingut amb les tires de flux lateral va ser de 104 UFC/ml, que és suficient per a la detecció d'aquest bacteri en mostres amb símptomes de la malaltia. Per a comprovar la seua fiabilitat i precisió, el prototip desenvolupat es va utilitzar en l'anàlisi de mostres de camp naturalment infectades i mostres sanes, i els resultats es van comparar amb els obtinguts en l'aïllament en medi de cultiu i els de PCR en temps real, observant-se una elevada correlació entre les tres tècniques. En segon lloc, com que X. arboricola pv. pruni es va detectar per primera vegada a Espanya en 2002, i des de llavors s¿han produït brots de la malaltia en 11 províncies, es va considerar d'interès estudiar les relacions existents entre una col¿lecció de 239 ceps espanyols d'aquest bacteri procedents de vivers, plantacions i intercepcions amb la tècnica del "Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis" (MLVA). Es va demostrar el seu gran poder de resolució ja que va permetre classificar els ceps en 18 grups genètics. Els resultats obtinguts suggereixen que a Espanya s'han produït múltiples introduccions del bacteri, i que els vivers han jugat un paper important en la introducció i disseminació del patogen a través de material vegetal contaminat. Finalment, es van analitzar fenotípicament i molecularment tres ceps aïllats en nectariners de la província de Múrcia, que mostraven símptomes similars als causats per X. arboricola pv. pruni. Les primeres anàlisis basades en test bioquímics i PCR van resultar negatius per a aquest patogen. Per tant, s'ha dut a terme la caracterització taxonòmica de dits aïllats a través d'un estudi polifàsic, comparant aquests amb ceps de referència d'altres espècies de Xanthomonas. A més, es van realitzar inoculacions que van confirmar la patogenicitat dels ceps. Els resultats obtinguts han permés classificar aquests ceps com una nova espècie del gènere Xanthomonas, per a la qual s'ha proposat el nom de Xanthomonas prunicola, i per a la que s'han definit les seues característiques diferencials de les altres espècies d'aquest génere. Els treballs presentats en aquesta memoria han aportat un nou mètode ràpid de diagnòstic in situ de la taca bacteriana, el desenvolupament d'una nova metodologia per a l'avaluació de la diversitat genètica d'una selecció de ceps espanyols de X. arboricola pv. pruni, així com la descripció d'una nova espècie de Xanthomonas que afecta al nectariner. / López Soriano, P. (2017). Especies de Xanthomonas causantes de enfermedades en frutales de hueso y almendro: diagnóstico, diversidad genética y taxonomía [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86200 / TESIS

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata, es la principal plaga de la fruticultura en el mundo. El desarrollo de métodos ambientalmente seguros de control de plagas, como Bacillus thuringiensis (Bt), adquiere cada vez mayor importancia. Esta tesis doctoral evalúa la validez de Bt y sus delta-endotoxinas como agentes de control de C. capitata. El análisis de la biodiversidad de Bt ha reflejado la gran riqueza presente en el agroecosistema de los cítricos. Sin embargo, ninguna de las cepas ensayadas (905) muestra alta toxicidad sobre C. capitata cuando esporas/cristales o sobrenadantes de su cultivo son ensayados. En cambio, la solubilización de los cristales de una selección de 42 cepas de Bacillus sp. ha demostrado que, para las cepas de la subespecie israelensis (Bti), este tratamiento produce una ganancia de función biológica. Adicionalmente, la predigestión de dichas protoxinas con proteasas de otro díptero, Culex pipiens, aumenta su actividad larvicida (CL50 31.26 µg/cm2). Por otro lado, se ha demostrado que, entre las delta-endotoxinas producidas por Bti, la protoxina Cyt1Aa es el factor determinante, con una CL50 sobre larvas de 4.93 µg/cm2. Sobre adultos, Cyt1Aa produce efectos subletales. Complementariamente, esta tesis propone un nuevo método de control basado en el desarrollo de toxinas recombinantes de fusión Cry-anticuerpo. Se ha puesto en práctica un sistema modelo para evaluar esta estrategia: se han desarrollado 4 variantes proteicas por la fusión entre partes de la protoxina Cry1Ab y un anticuerpo específico contra GFP (VHH anti-GFP) y éstas se han ensayado sobre larvas transgénicas de Drosophila melanogaster que expresan GFP en su intestino. Deficiencias en la unión de las toxinas de fusión a GFP, han impedido demostrar, por el momento, la estrategia propuesta. Por último, se han detectado al menos 160 proteínas distintas en las membranas intestinales de C. capitata y se han identificado las siguientes: V-ATPasa subunidades A y B, y alfa-tubulina. / Vidal Quist, JC. (2010). Estrategias para la utilización de la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis (Berliner) en el control de Ceratitis capitata (Wiedemann) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8336 / Palancia

La presente tesis "estudio de los efectos sobre el medio litoral derivados de la implantación de saneamientos integrales en la costa Cantábrica" pretende evaluar la validez de los diseños ambientales de estos saneamientos integrales como instrumentos predictivos aplicables a la gestión de la calidad de los sistemas acuáticos litorales mediante la realización de estudios dirigidos a analizar la afección que originan los vertidos de aguas tratadas a través del emisario submarino sobre el estado de las aguas costeras, sobre la calidad de los fondos sedimentarios y sobre las comunidades bentónicas establecidas; así como, mediante el análisis de la evolución de la calidad de las masas de agua estuarinas afectadas por los vertidos de tormenta. Los resultados obtenidos han servido para proponer una serie de indicaciones para el diseño de los programas de control operativo planteados en la DMA, a aplicar en las masas de agua afectadas por este tipo de vertidos. / This PhD thesis titled "Effects of coastal sanitations on Cantabrian littoral ecosystems (Bay of Biscay)" was carried out to evaluate the applicability of the environmental design of the sewer systems constructed in the north of Spain to the management of the aquatic ecosystems. This work has analysed the effects caused by the treated effluents discharged by the submarine outfall on the water and sediment quality and on the structure and composition of the hard-bottom benthic communities dwelling the outfall surroundings. On the other hand this study has analysed the recovery of the estuarine ecosystem (water, bacteriology, sediments and benthic organisms) directly affected in the past by the urban effluents and nowadays affected by storm discharges. Results obtained in both surveys have contributed to propose a guidance for the design of the Operative control of the water masses established in the EU Water Framework Directive in the north of Spain.

La bacteria Erwinia amylovora es el agente causal del fuego bacteriano de las rosáceas, responsable de importantes daños en varios frutales de pepita y plantas ornamentales. Debido a su fácil diseminación y difícil control, está considerada como una enfermedad de cuarentena en la Unión Europea. A pesar de los numerosos estudios realizados sobre E. amylovora, aún no se conoce su ciclo biológico completo, y la información sobre su posible supervivencia en condiciones de estrés y/o en hábitats fuera de hospedadores susceptibles es aún muy escasa. Por ello, en esta memoria se ha planteado estudiar la supervivencia de E. amylovora en un medio mineral con cobre, metal ampliamente usado para el control de bacteriosis de plantas, así como en condiciones de oligotrofia de ambientes naturales como el agua. Los resultados han demostrado que E. amylovora es capaz de sobrevivir frente a dichas situaciones de estrés mediante su entrada en el estado denominado Viable No Cultivable (VNC). Cuando las condiciones vuelven a ser favorables, E. amylovora recupera su cultivabilidad y su poder patógeno, por lo que el estado VNC puede ser considerado como una estrategia de supervivencia para la bacteria. Al observar que E. amylovora en condiciones adversas perdía su capacidad de formar colonias en un medio de cultivo sólido, pero mantenía su viabilidad y patogenicidad, se planteó aumentar la eficiencia de su recuperación en placa. Dado que el cobre es un micronutriente esencial que puede favorecer el crecimiento bacteriano en medios ricos, se optimizó uno de los medios de cultivo más empleados para el aislamiento de E. amylovora añadiendo sulfato de cobre. Así, se consiguió potenciar el crecimiento de este patógeno en condiciones de estrés y retrasar la pérdida de cultivabilidad. También se comprobó que la presencia de cobre en el medio de cultivo producía un incremento acusado en la mucosidad de las colonias de E. amylovo / Ordax Ibáñez, M. (2008). Supervivencia de Erwinia amylovora en condiciones de estrés: influencia de la presencia de cobre y la limitación de nutrientes [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2283 / Palancia