Betalaínas são alcalóides coloridos que atuam como mediadores químicos e sensores em processos de interesse tecnológico. Esta Tese de Doutorado investiga o comportamento de betalaínas naturais, betanina e indicaxantina, em três sistemas químicos diferentes. O primeiro capítulo discute a estabilidade de emulsões água-óleo-água contendo betanina. As emulsões foram preparadas em um sistema de microcanais empregando-se óleo de soja e tensoativos grau alimentício. Betanina pura tende a estabilizar a emulsão em relação ao controle sem o pigmento, enquanto suco de beterraba liofilizado e betanina comercial diluída com maltodextrina não mostram a mesma atividade. No capítulo seguinte, a interação entre indicaxantina e cloreto de 7-metil-4-metóxiflavílio revela a ocorrência de transferência de energia e dados de espectroscopia de 1H-RMN indicam a formação de um complexo no estado fundamental. Finalmente, a interação entre betanina e paraquat na presença e ausência de luz e oxigênio é investigada. Dados de espectroscopia de 1H-RMN sugerem a formação de um complexo entre as espécies e o estudo cinético sugere que betanina interfere na regeneração da forma oxidada do paraquat por oxigênio. / Betalains are colored alkaloids that act as chemical mediators and sensors in processes of technological interest. This doctoral thesis investigates the behavior of natural betalains, betanin and indicaxanthin, in three different chemical systems. The first chapter discusses the stability of water-oil-water emulsions containing betanin. The emulsions were prepared in a microchannel system using soybean oil and food grade surfactants. Pure betanin tends to stabilize the emulsion relative to the control without the pigment, while freeze-dried beet juice and commercial betanin diluted with dextrin do not show the same activity. In the following chapter, the interaction between indicaxanthin and 7-methyl-4-methoxyflavylium chloride reveals the occurrence of energy transfer and 1H-NMR spectroscopy data suggests the formation of a complex in the ground state. Finally, the interaction between betanin and paraquat in the presence and absence of light and oxygen is investigated. 1H-NMR spectroscopy data suggest the formation of a complex between species and the kinetic study suggests that betanin interferes in the regeneration of the oxidized form of paraquat by oxygen

Betanina e indicaxantina foram obtidas e purificadas e a hidrólise térmica de betanina foi investigada em diferentes pHs, concentrações de tampão, temperaturas e com a adição de sais. Para a decomposição de indicaxantina, foi realizado um estudo em diferentes pHs. Tampões acetato e citrato se mostraram adequados para estudos com betanina, dentro de sua faixa de tamponamento. Os experimentos realizados com tampão fosfato indicaram a ocorrência de catálise geral pelo íon fosfato presente no tampão. O efeito dos sais sobre a hidrólise de betanina foi investigado em pHs 3 e 6,2, com a adição de sais de sódio, amônio e sais cloretos. p-Toluenosulfonato de sódio, cloreto de amônio e cloreto tetrabutilamônio foram os sais que apresentaram maior efeito sobre a constante cinética observada de hidrólise de betanina. A hidrólise das duas betalaínas apresentou um comportamento semelhante com a variação do pH e o ajuste multiparamétrico dos dados sugere que a catálise básica específica é a principal responsável pela hidrólise de betanina e indicaxantina. Um modelo que sugere a abertura do anel 1,2,3,4-tetrahidropiridínico das betalaínas é proposto para explicar o efeito do pH sobre a constante cinética de decomposição determinada em meio ácido. / Betanin and indicaxanthin were obtained and purified and the thermal hydrolysis of betanin was investigated at different pH, buffer concentration, temperature and in the presence of different salts. For the decomposition of indicaxanthin, a study was conducted at different pHs. Acetate buffer and citrate buffer proved to be suitable for the study of betanin. The experiments carried out with phosphate buffer indicated the occurrence of general base catalysis by phosphate ion present in the buffer. The effect of salts on the betanin hydrolysis was investigated at pH 3 and 6.2 with the addition of sodium salts, ammonium salts and chlorides. Sodium p-toluenesulfonate, ammonium chloride and tetrabutylammonium chloride had the larger effects on the observed rate constant for the hydrolysis of betanin. The variation of pH resulted in similar hydrolysis profile for both betalains studied and multiparameter fitting of the data suggests that the specific base catalysis is primarily responsible for the hydrolysis of betanin and indicaxanthin. A model that suggests the opening of the 1,2,3,4-tetrahydropyridine ring of betalains is proposed to explain the effect of pH on the decomposition rate constant under acidic conditions.

Orientador: Erick Leite Bastos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia/Química.

Orientador: Erick Leite Bastos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2012

Orientador: Erick Leite Bastos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2012

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T04:46:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 295333.pdf: 1281017 bytes, checksum: 8fbda3179374b21d9efd3874cd50fcb0 (MD5) / As doenças foliares podem causar importantes danos às plantas cultivadas, como a cercosporiose da beterraba (Cercospora beticola Sacc.) e a sarna da macieira (Venturia inaequalis Cke.). Neste trabalho, diferentes elicitores de defesa em plantas foram testados para o controle dessas doenças, buscando-se identificar mecanismos de ação envolvidos. Para isso, foram conduzidos ensaios em casa de vegetação e in vitro. No patossistema macieira-sarna, foram avaliados fosfito de potássio, quitosana, suspensão bruta de fermento à base de Saccharomyces cerevisiae (SBSC), filtrado da suspensão autoclavada de fermento à base de Saccharomyces cerevisiae (FASC) e suspensão da fração polissacarídica do parênquima de reserva de folhas de babosa (FPPRB) pulverizados em plantas de macieira, cv. Gala aos 3 ou 7 dias antes da inoculação do patógeno (d.a.i.). Amostras de plantas tratadas com alguns desses produtos foram coletadas para a determinação das atividades enzimáticas de peroxidases e ß-1,3 glucanases, e dos teores de flavonóides e compostos fenólicos totais. Constatou-se que o fosfito de potássio (2 µL.mL-1) reduziu a severidade da sarna nas mudas de macieira, em média de 73%. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a aplicação de fosfito 7 d.a.i. reduziu o teor de flavonóides nas folhas suscetíveis à sarna, no momento da inoculação, enquanto a quitosana reduziu esse teor nas folhas resistentes à doença. Em geral, folhas suscetíveis à sarna apresentaram maior teor de flavonóides do que as resistentes. O teor de compostos fenólicos totais não foi alterado pela aplicação de fosfito ou quitosana, e foi similar entre folhas suscetíveis e resistentes à doença. Quanto à atividade enzimática, não houve diferença entre as plantas que receberam os produtos, porém as folhas resistentes à sarna apresentaram maior atividade de peroxidases em dois experimentos distintos. Apesar de apenas o fosfito ter reduzido a severidade da doença, ambos fosfito e quitosana reduziram a germinação de esporos do fungo in vitro. No caso do patossistema beterraba-cercosporiose, quitosana e o indutor de resistência acibenzolar-S-metílico (ASM) foram testados preventivamente, em diferentes doses e intervalos de tempo entre tratamento e inoculação. Em alguns bioensaios foram coletadas amostras de folhas para quantificar a atividade de peroxidases e ß-1,3 glucanases e também o teor de flavonóides, compostos fenólicos totais e betalaínas totais. A severidade da doença foi avaliada nas três folhas mais velhas 20 dias após a inoculação com o auxílio do programa computacional Quant v.1.0.2.. Ainda, foram conduzidos testes em lâminas de microscopia escavadas para verificar a germinação de esporos de C. beticola na presença de diferentes doses dos produtos testados. Quitosana e ASM reduziram a severidade da cercosporiose em folhas de beterraba, proporcionando maior efeito quando pulverizados 3 d.a.i. (1 mg.mL-1) para quitosana, e 7 d.a.i (50 mg.L-1) para o ASM. O polissacarídeo afetou diretamente o patógeno, inibindo significativamente o crescimento micelial e a germinação de esporos. Plantas que receberam uma aplicação de quitosana apresentaram maior atividade de enzimas oxidativas 3 dias depois, imediatamente antes da inoculação do patógeno. Em plantas tratadas por duas vezes com o polissacarídeo, as atividades de peroxidases e ß-1,3 glucanases foram maiores em relação à testemunha, antes e depois da inoculação. Esses resultados indicam que o controle da cercosporiose exercido pela quitosana pode ter sido tanto por seu efeito direto sobre o patógeno, como pela ativação de proteínas-RP. O ASM, por sua vez, apresentou pequeno efeito antimicrobiano contra C. beticola, mas promoveu os maiores aumentos nas atividades de peroxidases e ß-1,3 glucanases, indicando-se que o seu efeito na redução da severidade da doença esteja relacionado principalmente à ativação de mecanismos de defesa. Desta forma, a aplicação preventiva de fosfito de potássio é uma opção para o controle da sarna da macieira, enquanto que quitosana e o ASM podem auxiliar no manejo da cercosporiose da beterraba. / The foliar diseases such as Cercospora leaf spot (Cercospora beticola Sacc.) in beets and apple scab (Venturia inaequalis Cke.) can cause significant damage to crops. In this work, potential elicitors of plant defenses were evaluated for the control of these diseases. For this, trials were conducted inside the greenhouse and in vitro conditions. In the apple-scab pathosystem, potassium phosphite, chitosan, the crude suspension of commercial Saccharomyces cerevisiae (SBSC), the filtrate of S. cerevisiae obtained from autoclaved commercial yeast (FASC) and the suspension of polysaccharide from Aloe leaves (FPPRB) were sprayed on apple plants, cv. Gala, at 3 or 7 days before pathogen inoculation. Leaf samples from plants treated with some of these products were collected to determine the enzymatic activity of peroxidase and â-1,3 glucanases, and levels of phenolic compounds and flavonoids. Potassium phosphite (2 ìL.mL-1) reduced the severity of apple scab on seedlings, by around 73%. Regarding biochemical parameters, the application of phosphite 7 d.a.i. reduced the content of flavonoids in the scab suscetible leaves, at the time of inoculation, while the polysaccharide chitosan reduced the flavonoid content in the resistant leaves. Overall, scab suscetible leaves had higher content of flavonoids than resistant leaves. The content of phenolic compounds was not altered by application of phosphite or chitosan, and it was similar between suscetible and resistant leaves. There was not difference in the enzymatic activities among plants that received the different products, but the scab resistant leaves had higher peroxidase activity in two distinct experiments. Only the phosphite reduced the severity of the disease, but both phosphite and chitosan reduced the germination of V. inaequalis spores. In the case of Cercospora leaf spot, chitosan and the plant activator acibenzolar-S-methyl (ASM) were evaluated preventively at different doses and intervals between treatment and inoculation. In some bioassays leaf samples were collected to quantify the peroxidase and â-1,3 glucanase activities as well to determine the flavonoid, phenolic compound and betalain contents. Disease severity was assessed in the three oldest leaves 20 days after inoculation with the aid of software Quant v.1.0.2.. In addition, tests were conducted in glass slides to check the spore germination of C. beticola in the presence of different doses of the products. The polysaccharide chitosan and plant activator ASM reduced the severity of Cercospora leaf spot, and the effect was better when chitosan was sprayed 3 d.a.i. (1 mg.mL-1), or when ASM was sprayed 7 d.a.i. (50 mg.L-1). The polysaccharide affected the pathogen directly, both on the mycelial growth and spore germination. Plants that received an application of chitosan had higher oxidative enzyme activity 3 days later, just before the inoculation. In plants treated with chitosan twice, the peroxidase and â-1,3 glucanase activities were higher compared to the control, before and after the inoculation. These results indicate that the control of Cercospora leaf spot by chitosan has occurred by antibiosis and by the activation of PR-proteins. In turn, ASM had a little effect against C. beticola, but it promoted the highest levels in peroxidase and â-1,3 glucanase activities, indicating that its effect in reducing the severity of the disease is mainly related to the activation of defense mechanisms. Thus, the preventive application of potassium phosphite is an option for control of apple scab, while chitosan and ASM can help in the management of Cercospora leaf spot.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:01:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 231705.pdf: 983808 bytes, checksum: c8c205007c8ff6dead851f696b1c0445 (MD5) / O estudo de técnicas de purificação de corantes naturais que aliem eficácia a baixo custo é imprescindível para aumentar a viabilidade da produção dos mesmos em larga escala, visto que, mesmo com a proibição de alguns corantes sintéticos por causarem efeitos nocivos à saúde humana, os corantes naturais perdem em competitividade no mercado pelo alto preço associado e menor estabilidade.

Moléculas orgânicas fluorescentes são uma importante ferramenta para biologia celular. Compostos ideais para esta aplicação devem ter alto brilho (produto do coeficiente de atenuação molar e do rendimento quântico de fluorescência), ser fotoestáveis e internalizáveis, não comprometer a viabilidade celular e interagir com biomoléculas com algum grau de especificidade. Nesta Tese de Doutorado é apresentado o estudo do uso de cBeet120, uma betalaína cumarínica artificial, e células de glioma humano da linhagem U87-MG. Betalaínas são pigmentos de plantas que apresentam alta biocompatibilidade que servem como material de partida para o desenvolvimento de derivados funcionais. A sonda se acumula principalmente no núcleo das células U87- MG e marca principalmente nucléolos via interação com proteínas. A presença de DNAse ou RNAase elimina a marcação nuclear, sem afetar a fraca marcação citoplasmática de fundo. Estudos de inibição de transporte sugerem que cBeet120 é internalizada por transportadores de L-glutamato da família de transportadores de amino ácidos excitatórios (EAAT). O uso de artemisinina para inibição Ca2+-ATPases aumenta a velocidade de internalização de cBeet120 em células U87-MG. Quando irradiada com luz de cor ciano, cBeet120 no interior do núcleo de células vivas é fotoativada, resultando em um aumento da intensidade de fluorescência com o tempo (monitorado por 90 min) e o deslocamento hipsocrômico do máximo de emissão. Em células fixadas com paraformaldeído, o padrão de marcação da célula se torna mais difuso e a sonda emite fluorescência sem fotoativação. Medidas de tempo de vida de fluorescência em solução e imageamento por microscopia de tempo de vida de fluorescência permitem inferir a ocorrência da formação de um complexo proteína-cBeet120 ou um produto de transiminação que pode estar sujeito a isomerização cis/trans. / Fluorescent organic molecules are an important tool for cell biology. Ideal compounds for this application must have high brightness (product of the molar attenuation coefficient and fluorescence quantum yield), be photostable and internalizable by cells, do not compromise cellular viability and interact with biomolecules with some degree of specificity. In this Doctorate Thesis, we describe the interaction of cBeet120, an artificial coumarinic betalain, and human glioma cells of line U87-MG. Betalains are plant pigments that exhibit high biocompatibility that serve as starting material for the development of functional derivatives. The probe accumulates mainly in the nucleus of the U87-MG cells and mainly marks nucleoli via interaction with proteins. The presence of DNAse or RNAase eliminates nuclear labeling, without affecting the poor background cytoplasmic labeling. Transport inhibition studies suggest that cBeet120 is internalized by L-glutamate transporters from the excitatory amino acid transporter (EAAT) family. The use of artemisinin for inhibition Ca2+-ATPases increases the rate of cBeet120 internalization in U87-MG cells. When irradiated with cyan colored light, cBeet120 within the nucleus of living cells is photoactivated, resulting in an increase in fluorescence intensity over time (monitored for 90 min) and the hypochromic shift of the emission maximum. In cells fixed with paraformaldehyde, the labeling pattern of the cell becomes more diffuse and the probe emits fluorescence without photoactivation. Fluorescence life-time measurements in solution and fluorescence life-time imaging microscopy allows to infer the occurrence of the formation of a protein-cBeet120 complex or the formation of a transimination product that may be subject to cis/trans isomerization.

As técnicas utilizadas no preparo do produto minimamente processado (PMP) devem preconizar a menor perda possível dos principais compostos funcionais e de qualidade durante o preparo e armazenamento dos alimentos. No entanto, há respostas dos PMPs quanto ao dano sofrido durante seu preparo, que disparam várias reações relacionadas com a fisiologia do estresse, que podem ser amenizadas com a aplicação de aditivos antioxidantes. Assim, torna-se importante determinar os pontos principais de perdas dos compostos funcionais, bem como, entender a relação de aditivos antioxidantes durante o processamento e o armazenamento. Foram avaliadas as perdas qualitativas nas etapas do processamento de beterraba minimamente processada. Após, foi testada a utilização de cisteína (aminoácido antioxidante) para manutenção da qualidade visual, capacidade antioxidante, betalaínas e polifenóis no armazenamento. Como principais resultados, o descascamento foi a etapa crítica do processo, com a perda das principais camadas celulares (colênquima) de acúmulo de compostos bioativos. Com a aplicação de cisteína, esta foi mais efeticaz nas maiores dosagens (0,1% e 0,2%) para manutenção dos aspectos visuais e controle do esbranquiçamento superficial, dos teores de betalaínas e compostos fenólicos totais. Isso refletiu na manutenção da capacidade antioxidante do produto durante os dias de análise. No entanto, dosagens mais altas não impedem a ação enzimática da polifenoloxidase (PPO), o que resulta principalmente na perda das concentrações de ácidos hidroxicinâmicos. Ainda, foi identificada pela primeira vez em beterraba uma betacianina fosforilada de ocorrência sazonal, a 2\'O- apiosil betanina. Em conclusão, este trabalho apresenta importante contribuição para o entendimento das relações entre as perdas dos principais compostos bioativos e os processos de preparo e armazenamento de beterraba minimamente processada. Além disso, foi demonstrado que a cisteína é eficiente para conservação das propriedades funcionais em beterraba minimamente processada, atendendo aos requisitos de um produto antioxidante para aplicação em alimentos, sendo eficaz em baixas concentrações. / The techniques used in the preparation of the fresh-cut product should recommend the lowest possible loss of the main functional and quality compounds during the preparation and storage of the food. However, there are several responses from the fresh-cut product regarding the damage suffered during their preparation, which trigger several reactions related to the physiology of stress, which can be mitigated by the application of antioxidant additives. Thus, it is important to determine the main loss points of the functional compounds, as well as to understand the interaction of antioxidant additives, such as cysteine, in order to avoid or mitigate such losses, being analyzed for the direct interference of processing and storage. The qualitative losses in the processing stages of fresh-cut beets were evaluated. After that, the use of cysteine (antioxidant amino acid) for the maintenance of visual quality, antioxidant capacity, betalains and polyphenols in storage was tested. As the main results, peeling was the critical stage of the process, with loss of the main cellular layers (collenchyma) of accumulation of bioactive compounds. Cysteine application, was more effective in the higher dosages (0.1% and 0.2%) for maintenance of the visual aspects and control of the superficial whitening, the contents of betalains and total phenolic compounds. This reflected in conservation the antioxidant capacity of the product during the days of analysis. However, higher dosages do not prevent the enzymatic action of polyphenoloxidase (PPO), which results mainly in the loss of hydroxycinnamic acid concentrations. As well, a seasonally occurring phosphorylated betacyanin, 2\'O-apiosyl betanine, was first time identified in beet. In conclusion, this work presents an important contribution to the understanding of the relationships between the losses of the main bioactive compounds and the processes of preparation and storage of minimally processed beets. In addition, it has been demonstrated that cysteine is efficient for preserving the functional properties in minimally processed beets, meeting the requirements of an antioxidant product for food application, being effective in low concentrations.

Foi preparada uma série de quatro betalaínas com o objetivo de determinar o efeito da metilação do nitrogênio imínico e da presença de uma hidroxila fenólica na posição 3 do anel aromático sobre a estabilidade e propriedades antirradicalares, fotofísicas e redox desta classe de pigmentos vegetais. O estudo destes compostos, chamados de m-betalainofenol, N-metil-m-betalainofenol, fenilbetalaína e N-metil-fenilbetalaína, revelou que os derivados metilados apresentam um deslocamento hipsocrômico sutil dos máximos de absorção e fluorescência em relação aos compostos não metilados. Os deslocamentos de Stokes são maiores em cerca de 4 kJ mol-1 para os derivados metilados e os rendimentos quânticos de fluorescência cerca de três vezes menores. A hidrólise destas betalaínas foi investigada na faixa de pH entre 3 e 7. Todas as betalaínas são mais persistentes em pH = 6 e a metilação da porção imínica aumenta significativamente a estabilidade da betalaína em meio aquoso. A presença da porção fenólica, em comparação a um grupo fenila, não afeta as propriedades fotofísicas dos compostos e tem um efeito menos pronunciado do que o da metilação sobre a estabilidade destes em meio aquoso. O comportamento eletroquímico dos compostos foi estudado por voltametria cíclica, nas mesmas condições de pH. A N-metilação foi novamente mais significativa do que a hidroxilação, provocando aumento de até 200 mV no potencial de pico anódico. O aumento do pH diminuiu o potencial de pico anódico dos quatro compostos, com uma razão entre prótons e elétrons igual a 1 para a maioria dos picos. A capacidade antirradicalar foi quantificada pelo ensaio colorimétrico TEAC baseado na redução de ABTS•+. Os dois derivados N-metilados apresentaram, em média, o mesmo valor de TEAC, apesar de um ser fenólico e o outro não. Já entre os não metilados, que têm TEAC de 2 a 3 unidades inferior à dos outros, a presença do fenol provoca elevação da capacidade antirradicalar. Os resultados sugerem a participação dos elétrons do anel 1,2,3,4-tetraidropiridínico, acoplados ao próton do nitrogênio imínico na ação antirradicalar de betalaínas. / A series of four artificial betalains was prepared in order to determine the effect of imine nitrogen methylation and phenyl hydroxylation (position 3) over stability and antiradical, photophysical and redox properties of this class of natural pigments. The study of m-betalainophenol, N-methyl-m-betalainophenol, phenylbetalain and N-methylbetalain, revealed that the methylated compounds present a small hypsochromic shift of both absorption and fluorescence maxima when compared to the others. The Stokes shifts are around 4 kJ mol-1 higher for methylated betalains, whereas the quantum yields are approximately three times lower. Their hydrolysis was investigated between pH 3 and 7. All compounds are more persistent in pH = 6, and imine methylation increases the overall stability in aqueous medium. The presence of a phenol group, in comparison with a phenyl substituent, has a minor effect on the photophysical properties of betalains and has a less pronounced effect over stability than that of methylation. The electrochemical behavior was studied by cyclic voltammetry, in the same pH range, and is also more significantly affected by methylation, rather than by hydroxylation. Methylation increases anodic peak potential up to 200 mV, and the potential is also much higher in more acidic media for all compounds. The number of protons involved in the electrochemical oxidation is the same as the number of electrons for most peaks The antiradical capacity was quantified using the TEAC assay, and ABTS•+ as radical. The methylated betalains presented, in average, the same TEAC value, although only one of them is phenolic. Among the non methylated, which are 2 to 3 units more efficient than the others, the phenolic one has a greater TEAC. These results suggest a participation of the 1,2,3,4-tetraidropiridinic ring electrons in the oxidation by ABTS•+, coupled to the imine nitrogen proton.