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Introduction: Intraperitoneal tumor seeding is a common form of recurrence after surgery for GI tumours. Early diagnosis and treatment may influence the course of disease. Hypothesis and objectives of the work The finding of free tumor cells and / or elevation of tumor markers in peritoneal fluid predicts intraperitoneal tumor recurrence. The results of these tests can be used to indicate HIPEC. Aim of this work is to determine the sensitivity and specificity of cytology and tumor markers levels and importance of these tests for early diagnosis and prognosis of recurrence. Another objective was to confirm the applicability of RT PCR for identification of free tumor cells. Patients and methods . Materials are sourced both during initial surgery (220 patients) and by the dispensary controls (25 patients). The peritoneal fluid was examined cytologically and biochemically too. 50 samples was exemined by RT PCR. Results Elevation of tumor markers or finding of free intraperitoneal tumor cells predicts recurrence. The prognosis of these patients corresponds to stage IV TNM classification, regardless of other parameters TNM. Low sensitivity of these tests (34% for cytology, 53% for tumor markers) does not allow its use as an indicator of HIPEC. Due to degradation of RNA we did not confirm the value of RT...

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Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Enzyme des Oxylipinstoffwechsels in P. patens funktionell und strukturell charakterisiert. Dafür wurden die bifunktionelle PpLOX1 und zwei AOCs (PpAOC1 und PpAOC2) ausgewählt. Mittels verschiedener biochemischer, bioinformatischer und biophysikalischer Methoden wurden diese Enzyme bezüglich Funktion, Aktivität und Struktur charakterisiert. Desweiteren wurden nach erfolgreicher Kristallisation von PpAOC1 und PpAOC2 die hochaufgelösten Röntgenkristallstrukturen beider Enzyme im Grundzustand sowie im Komplex mit Substratanalogen gelöst. Für PpAOC2 wurden dabei zwei verschiedene Bindemodi des Liganden beobachtet. Der Einfluß der Aminosäurereste Arg-345, Arg-638 und Tyr-851 auf den Reaktionsmechanismus von PpLOX1 wurde durch zielgerichtete Mutagenese und nachfolgende Analyse der Produktbildung durch die erhaltenen Varianten untersucht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Umsetzung verschiedener Fettsäuren durch das Ausgangsenzym oder die Varianten R345L bzw. R638L gefunden. Dagegen zeigte die Doppelvariante R345L/R638L eine stark verringerte Menge an gebildeten Produkten. Demnach scheint zumindest das Vorliegen einer dieser beiden positiv geladenen Reste wichtig für die Umsetzung der Substrate zu sein. Möglicherweise wird die negativ geladene Carboxylatgruppe der jeweiligen Fettsäure durch elektrostatische Wechselwirkungen über Arg-345 oder Arg-638 gebunden. Die Variante Y851I bildete geringere Mengen von 12-ODTE, Keto-Fettsäuren und auch weniger Produkt als das Ausgangsenzym. Demnach scheint auch dieser Rest an der Katalyse beteiligt zu sein. Da aber für die Variante Y851F sogar ein erhöhter Anteil an 12-ODTE gefunden wurde, scheint der voluminöse und hydrophobe aromatische Ring, und nicht die Hydroxyl-Gruppe des Tyrosin, wichtig zu sein. Die gereinigten Enzyme PpAOC1 und PpAOC2 wurden für Aktivitätstest mit verschiedenen C20-Fettsäure-Hydroperoxiden verwendet. Beide Enzyme zeigten Aktivität gegenüber den 15-Hydroperoxiden von EPA und ETA, jedoch nicht von AA. Darüber hinaus besitzt PpAOC2, aber nicht PpAOC1, Aktivität für die 12-Hydroperoxide welche sich von AA, EPA und DGLA ableiten. Es wurden zusätzlich zu 11-OPTA bislang nicht beschriebene zyklische Verbindungen gebildet, deren chemische Struktur durch Fragmentierung mittels ESI-MS/MS aufgeklärt wurde. In den vorliegenden Studien zu PpAOC1 und PpAOC2 wurde das Glutamat an Position 18 jeweils durch Glutamin oder Aspartat ausgetauscht. Es wurde gezeigt, dass der konservierte Glutamatrest und seine negative Carboxylatgruppe in beiden Enzymen essenziell für die Katalyse ist. Dagegen wurde für die Variante R22L lediglich ein Einfluß auf die Aktivität in PpAOC2 gefunden. Im aktiven Zentrum von PpAOC1 werden zwei Wassermoleküle von vier Aminosäureresten koordiniert, während in PpAOC2 ein Wassermolekül von zwei Aminosäureresten gebunden ist. Inwiefern diese Wassermoleküle an der Katalyse beteiligt sind, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden.

Peptide bilden eine einzigartige Klasse von Biomolekülen. Auf Grund ihrer komplexen Struktur sind sie in der Lage hochspezifisch an Zielmoleküle zu binden und können darüber hinaus bioaktive Eigenschaften aufweisen. In dieser Dissertation wurden verschiedene Anwendungen, für die biologisch aktive Peptide genutzt werden können untersucht und darüber hinaus die Konjugation ungeschützter Peptide an funktionelle Gerüstmoleküle betrachtet. Die spezifischen Bindungseigenschaften eines Hemagglutinin bindenden Peptids konnten durch deren multivalente Präsentation auf einem Polymer-Nanopartikel genutzt werden, um einen hochwirksamen Virus-Eintritts-Blocker zu synthetisieren. Außerdem wurde in dieser Dissertation eine neuartige chemoselektive Konjugation zwischen ungeschützten zyklischen Peptiden und Proteinen erforscht, basierend auf der Staudinger Phosphonite Reaktion. Die kovalente Bindung zwischen Proteinen und Peptiden ermöglichte die zellulären Aufnahme und zytosolische Verteilung des konjugierten Proteins. Die neuartige Staudinger induzierte Thiol Addition konnte darüber hinaus für die intramolekulare Makrozyklisierung von Peptiden eingesetzt werden, wodurch die biologische Aktivität der Peptide gesteigert wurde. Dies konnte anhand von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden, als auch in der Stabilisierung der helikalen Struktur eines peptidischen Protein-Protein-Interaktions Inhibitors gezeigt werden. Des weiteren wurde eine bioreversible chemoselektive Konjugationsmethode untersucht, basierend auf der O-Alkylierung von Carbonsäuren, um eGFP mit zyklischen zellpenetrierenden Peptiden zu markieren. Erste Schritte zur Evaluierung der entstandenen Konjugate wurden unternommen. Zusammengenommen konnte die Vielfältigkeit bioaktiver Peptide in mehreren Anwendungen gezeigt werden, mit besonderem Augenmerk auf die Erweiterung der Konjugationsmethoden für ungeschützte Peptide an funktionale Trägermoleküle. / Synthetic peptides are a unique class of biomolecules. Due to their complex structure they can bind targets in a highly specific manner and can furthermore exhibit unique properties. Even though they are complex in structure, they are straightforward synthetically accessible. This thesis evolves around the many different aspects, in which biological active peptides can be used, from specific binders to cell penetration tags. Furthermore, the site specific and chemoselective conjugation of an unprotected peptide to a functional scaffold has been addressed. The binding properties of peptides could be used to generate a highly potent virus entry blocker from a viral-membrane-protein binding peptide, which was displayed multivalently on a polymeric nanoparticle. Furthermore, this thesis explored a novel chemoselective reaction, based on the Staudinger phosphonite reaction to conjugate cyclic peptides to eGFP. The covalent attachment of the peptidic ligand promoted efficiently the cellular uptake of protein and its cytosolic distribution. The novel Staudinger induced thiol addition cascade was further successfully used in an intramolecular reaction to macrocyclize peptides in order to induce bioactivity. This could be shown for the synthesis of cyclic cell penetrating peptides, as well as to stabilize the helical structure of a peptidic protein-protein interaction inhibitor. Furthermore, a bioreversible chemoselective conjugation based on a diazo building block, was used to label eGFP with cyclic cell penetrating peptides. First steps to evaluate the potency in vitro were undertaken. Taken together, the versatility of bioactive peptides was demonstrated in multiple applications and the tools to conjugate unprotected peptides to functional scaffolds was extended by the Staudinger induced thiol addition.

RNA-Bindungsproteine spielen Schlüsselfunktionen bei der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression. Durch Bindung an RNA steuern sie die RNA-Aufbereitung, den Transport, die Stabilität und die Translation. In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung bakterieller post-transkriptioneller Mechanismen erzielt. Es wird immer deutlicher, dass diese Regulierungsebene auch bei der Pathogenese und Antibiotikaresistenz eine wichtige Rolle spielt. Die Analyse von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) auf Proteomebene wurde durch die (m)RNA-interactome-capture Technologie vorangetrieben, die den Teil des Proteoms isoliert, welcher mit polyadenylierter (m)RNA vernetzt ist. Dies hat zur Identifizierung von Hunderten von neuen RBPs in einer Vielzahl von eukaryontischen Arten, vom Menschen bis zur Hefe, geführt. Allerdings fehlt die Poly-Adenylierung in der funktionellen RNA von Bakterien und anderen Klassen von -eukaryontischen- regulatorischen RNAs. Ziel dieser Arbeit war es, diese Einschränkung durch die Entwicklung einer neuartigen und unvoreingenommenen Methode zur Aufreinigung von UV-vernetzten RNPs in lebenden Zellen zu überwinden: PTex (Phenol-Toluol-Extraktion). Das Reinigungsprinzip basiert ausschließlich auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften von vernetzten RNPs gegenüber ungebundenen Proteinen oder RNA; es ist dabei unparteiisch gegenüber spezifischen RNAs oder Proteinen und ermöglicht somit erstmals eine systemweite Analyse von nicht-poly-(A)-RNA-interagierenden Proteinen sowohl in eukaryontischen (HEK293) als auch in prokaryontischen (Salmonella Typhimurium) Zellen. / RNA binding proteins play key functions in post-transcriptional regulation of gene expression. By binding to RNA, they control RNA editing, transport, stability and translation. In the last decade, significant advances have been made in the elucidation of bacterial post-transcriptional mechanisms. It is becoming increasingly clear that this layer of regulation also plays an important role in pathogenesis and antibiotic resistance. The analysis of RNA-protein complexes (RNPs) at the proteome level has been driven by the (m)RNA interactome capture technology which isolates the proteome cross-linked to poly-adenylated (m)RNA. This has resulted in the identification of hundreds of novel RBPs in a diversity of eukaryotic species ranging from humans to yeast. However, poly-adenylation is absent in functional RNA from bacteria and other classes of -eukaryotic- regulatory RNAs. This work was aimed to overcome that limitation by developing a novel and unbiased method for the purification of UV-cross-linked RNPs in living cells: PTex (Phenol Toluol extraction). The purification principle is solely based on physicochemical properties of cross-linked RNPs versus unbound proteins or RNA, and it is impartial towards specific RNA or proteins; enabling for the first time a system-wide analysis of non-poly(A) RNA interacting proteins in both eukaryotic (HEK293) and prokaryotic (Salmonella Typhimurium) cells.

Die phosphorylierungsabhängige Bindung von Arrestin an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) ist ein weit verbreiteter Mechanismus, um aktive Rezeptoren zu inhibieren. Für die Bindung von Arrestin an lichtaktiviertes, phosphoryliertes Rhodopsin (pRho), einem GPCR, der sich in der Diskmembran der Stäbchenzellen der Netzhaut befindet, ist in Lipidmembranen die Phosphorylierung von 2 der insgesamt 7 Phosphorylierungsstellen im Rezeptor-C-Terminus nötig, wohingegen 3 Phosphate das Arrestin quantitativ aktivieren. Welchen Einfluss höhere Phosphorylierungsniveaus auf die Rezeptor-Arrestin-Interaktion haben, ist bisher ungeklärt. In dieser Arbeit wurde daher eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Rhodopsin-Phosphorylierung etabliert, die unterschiedlich pRho-Spezies präparativ getrennt und mit den isolierten pRho-Spezies verschiedene Parameter der Rezeptor-Arrestin-Interaktion, wie z.B. die Bindungsstöchiometrie der resultierenden pRho-Arrestin-Komplexe, untersucht. Für die Charakterisierung der Arrestinbindung wurden Titrationen mit 3 verschiedenen fluoreszenzmarkierten Arrestinmutanten und pRho in gemischten Phospholidipd/Detergens-Mizellen durchgeführt. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass der Phosphorylierungsgrad von Rhodopsin neben der Affinität von Arrestin auch die Bindungsstöchiometrie beeinflusst. So haben die Komplexe bei geringem Phosphorylierungsgrad eine 2 : 1 (pRho : Arrestin) Stöchiometrie, während bei einem sehr hohen Phosphorylierungsgrad bevorzugt 1 : 1 pRho-Arrestin-Komplexe gebildet werden. Zudem weisen ein unterschiedliches Elutionsverhalten bei der säulenchromatographischen Trennung und Abweichungen in der pRho-Arrestin-Stöchiometrie verschiedener pRho-Präparationen mit ähnlicher Gesamtanzahl an Phosphaten auf einen zusätzlichen Einfluss unterschiedlicher Phosphorylierungsmuster hin. Insgesamt deuten die Daten auf eine komplexe Beziehung zwischen dem Phosphorylierungsgrad der Rezeptoren und dem Arrestin-Bindungsmodus hin. / The phosphorylation-dependent binding of arrestin to G protein-coupled receptors (GPCRs) is a widely used mechanism to inhibit active receptors. In lipid membranes, the binding of arrestin to light-activated, phosphorylated rhodopsin (pRho), a GPCR located in the disc membranes of retinal rod cells, requires the phosphorylation of 2 of the 7 phosphorylation sites in the receptor C-terminus, whereas 3 phosphates are required to completely activate arrestin. The influence of higher phosphorylation levels on the receptor/arrestin interaction is still unclear. In this thesis, a method for the quantitative determination of rhodopsin phosphorylation was established, rhodopsin species with varying degrees of phosphorylation were separated preparatively and different parameters of the receptor/arrestin interaction, such as the binding stoichiometry of the resulting pRho/arrestin complexes, were investigated for each isolated pRho species. For the characterization of arrestin binding, titrations with 3 different fluorescently labeled arrestin mutants and pRho in mixed phospholipid/detergent micelles were performed. The data obtained in this work show that the phosphorylation level of rhodopsin influences the binding stoichiometry in addition to the affinity of arrestin binding to rhodopsin. Thus, complexes with a low level of phosphorylation have a 2 : 1 (pRho : arrestin) stoichiometry, whereas 1 : 1 pRho/arrestin complexes are preferably formed at a very high degree of phosphorylation. In addition, a different elution behaviour during chromatographic separation and variances in the pRho/arrestin stoichiometry of different pRho preparations with similar overall number of phosphates indicate an additional influence of distinct phosphorylation patterns. Overall, the data indicate a complex relationship between receptor phosphorylation level and arrestin binding mode.

Verticillium longisporum ist ein bodenbürtiger, phytopathogener Pilz, der Pflanzen der Familie der Brassicaceen befällt. Er dringt durch die Wurzel ein und verbreitet sich in der Pflanze über das Xylem. In dieser Arbeit wurden die metabolischen Veränderungen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana während der Pflanzen-Pilz-Interaktion analysiert. Hierfür wurde die

My PhD study 'Educational application of models of complex biochemical processes' discusses the possibility of integrating simple bioorganic teaching experiments, modelling complex biochemical processes in living systems into a curriculum of secondary schools, and universities, and even elementary schools in some cases. The aim of these experiments is simplified, but illustrative and appropriate for approaching complex problems of biochemical processes in a transparent experiment, running in spite of conditions comparable to real natural clauses in a living system. The theoretical part is divided into three thematic circuits: biochemistry and bioorganic chemistry, bioorganic models and their characteristics and selected specific forms of applying bioorganic models into teaching chemistry. The next part dealing with bioorganic models and their characteristics is further divided on the base of some specific models. These are consisted of models of enzymes and their catalytic activity, models of biochemical reactions and antidotal and toxic substances affecting life-forms and their carcinogenic efficiency. The practical part contains methodic treatment of six selected models that demonstrate specific biochemical processes or structure of complex organic compounds. These models include modeling biuret...