Biochemistry is usually the last taught discipline of chemistry. In the Czech Republic, grammar school students study biochemistry during the third or fourth grade. This can sometimes cause problems because there is often little time left for biochemistry when compared to other chemical disciplines. The content of the biochemical curriculum is often limited only to memorization of the most important facts and there is no time enough to point out the important relationships of biochemistry to everyday life. In the last year of study, many students have already decided whether or not to study chemistry in the future and it is then difficult to find some topics that would attract the attention of those who do not want to continue studying chemistry. This thesis is focused on the solving this situation. The first part gives an overview on the theoretical background, which forms the framework for the following parts - Analysis of selected textbooks, which was done to map the current state of teaching biochemistry in Czech schools, and Creation of new didactic materials that can complement current textbooks and help teachers explain the basics of biochemistry more clearly and in the context of contemporary everyday life. The last part of this diploma thesis summarizes the experiences with use of the...

Die Dissertation beschreibt Arbeiten zur Herstellung neuer Cetrorelixkomplexe, zur Kinetik der dynamischen Liberation, zur Struktur von Aggregaten und Komplexen von Cetrorelix und zur Berechnung von Komplexeigenschaften mit Molecular Modeling. / Presented are results about new complexes of cetrorelix, the kinetics of dynamical liberations, the structure of Cetrorelix aggregates and complexes and the computation of properties of complexes by molecular modeling.

Eukaryontische Zellen besitzen ein Zytoskelett, ein zelluläres Netzwerk aus Biopolymeren. Unter diesen Biopolymeren sind die Mikrotubuli weitgehend konserviert. Diese aus Tubulin aufgebauten Filamente sind dynamisch und wechseln zwischen Phasen des Wachstums und der Schrumpfung. Die genauen Mechanismen, die die dynamische Instabilität der Mikrotubuli bestimmen, werden noch erforscht. Die Allgegenwart von Mikrotubuli wirft die Frage auf, wie sie in verschiedenen thermischen Umgebungen konservierte Funktionen ausführen können. Um dieser Fragestellung nachzugehen, habe ich verwandte Froscharten mit unterschiedlich temperierten Lebensräumen untersucht: Xenopus laevis (16-22 °C), Xenopus borealis (19-23 °C) und Xenopus tropicalis (22-30 °C). Um zu untersuchen, ob sich die biochemischen Eigenschaften von Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli bei den drei Arten an die Temperatur angepasst hat, habe ich die Methoden der Tubulin-Affinitätsreinigung und die temperaturgesteuerte TIRF-Mikroskopie zur Rekonstitution der Mikrotubuli-Dynamik kombiniert. Dabei habe ich festgestellt, dass bei einer Temperatur von 25°C die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikrotubuli im Bezug zur thermischen Nische der einzelnen Arten negativ korreliert. Die Verwendung der Arrhenius-Gleichung zum Vergleich der Aktivierungsenergie der Mikrotubuli-Polymerisation für jede Spezies ergab, dass die freie Energie des Tubulins umso höher ist, je kälter die thermische Nische der Spezies ist. Die Mikrotubuli von X. laevis und X. borealis zeigten eine längere Lebensdauer und wurden häufiger zerstört als die von X. tropicalis. Die Tubuline von X. laevis und X. borealis sind phosphoryliert, im Gegensatz zu X. tropicalis. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Xenopus Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli an die Temperatur angepasst haben. Kalt lebende Arten kommen mit der niedrigeren Energie des Milieus zurecht, durch verbessertes Wachstum und Stabilität. / Eukaryotic cells hold a cytoskeleton, a cellular network of biopolymers. Among the filaments of the cytoskeleton, microtubules are widely conserved. Built from tubulin, those filaments are dynamic, alternating between phases of growth and shrinkage. The biochemical properties of tubulin shape the dynamic behavior of microtubules, which is crucial for many cellular processes. The precise mechanisms determining microtubule dynamic instability are still under investigation. The ubiquity of microtubules raises the question of how they can perform conserved functions within various thermal environments. To address this, I turned to closely related frog species living at different temperatures, Xenopus laevis (niche: 16-22°C), Xenopus borealis (19-23°C) and Xenopus tropicalis (22-30°C). To probe whether the biochemical properties of tubulin and microtubule dynamics adapted to temperature across those three species, I combined tubulin affinity purification and temperature-controlled TIRF microscopy of in vitro reconstitution of microtubule dynamics. I found that at 25°C, the microtubule growth velocity inversely correlates with the thermal niche of each species. Adjusting temperature to each species’ endogenous condition modulates the growth rate differences across species. Using the Arrhenius equation to compare the activation energy of microtubule polymerization for each species suggested that the colder the thermal niche of the species, the higher the free energy of its tubulin. Microtubules from the cold-adapted species X. laevis and X. borealis have longer lifetimes and rescue more often than those of X. tropicalis, both at 25°C and at each species’ endogenous condition. X. laevis and X. borealis tubulins are phosphorylated, contrary to X. tropicalis. My results show that Xenopus tubulin and microtubule dynamics have adapted to temperature. Cold-living species cope with the lower energy of the milieu by facilitating growth and stability.

RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.

Condensine sind essentiell für die Faltung von Chromatin und wurden auch mit der Transkriptionsregulation in Verbindung gebracht. Der zugrunde liegende Mechanismus für die Transkriptionsregulation ist jedoch unklar. Condensin DC in C. elegans ist ein gutes Modell zur Erforschung der Transkriptionsregulation durch Condensine, da es spezifisch für die Dosiskompensation der Gene auf dem X Chromosom benutzt wird. Condensin DC bindet an beide X Chromosome in C. elegans Hermaphroditen und reduziert deren Transkription um die Hälfte. In meiner Dissertation habe ich untersucht, welche Rolle ein dynamisches Binden von Condensin DC an Chromatin spielt und wie dies die Transkription während der Embryogenese reguliert. Condensine binden dynamisch an Chromatin, um es zu komprimieren und durch Bildung von Schlaufen die Transkription zu regulieren. Mit Hilfe von „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) habe ich in adulten Darmzellen von C. elegans untersucht, welche Faktoren das dynamische Binden von Condensin DC an die X Chromosomen beeinflussen. Meine Daten zeigen, dass sowohl die ATPase-Domäne von Condensin DC, als auch eine nicht-katalytische Aktivität einer Histon-Demethylase die Bindedynamik von Condensin DC beeinflussen und damit Transkription regulieren. Zusätzlich habe ich mit einem Mikroskopieansatz, der auf dem Nachweis von einzelnen RNA Molekülen beruht (smFISH), die Transkription von mehreren Genen untersucht, die durch Condensin DC während der Embryonalentwicklung reguliert werden. Die aus diesen Daten ermittelten Transkriptionskinetiken deuten darauf hin, dass Condensin DC vorrangig die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation reguliert. Zusammenfassend liefert meine Forschung neue Einblicke in die Transkriptionsregulation durch Condensine und kann als Basis für detailliertere, mechanistische Studien der Rolle von Condensinen in der Transkriptionsregulation in C. elegans und auch in anderen Organismen dienen. / Condensins are essential for chromosome compaction and have been implicated in transcription regulation. The mechanistic foundation of this regulatory function is poorly understood. A clear paradigm to address this question is the X-specific condensin DC in C. elegans, which specifically binds to and transcriptionally represses X chromosomes in XX hermaphrodites by 2-fold. In my thesis, I studied condensin DC binding dynamics to the X chromosome and how condensin DC affects transcription kinetics in single embryos. The binding of condensins to chromatin has been described in recent microscopy-based studies as dynamic in processes including loop formation, chromatin compaction and transcription regulation. To study the dynamics of condensin DC binding, I established fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in C. elegans adult intestinal cells. With this method, I studied how the ATPase domain and different histone modifiers regulate the dynamic binding of condensin DC. I found that the ATPase domain is critical for binding of the complex and that the noncatalytic activity of a histone demethylase increases the dynamics of condensin DC binding, which is crucial for its role in transcription regulation. To further study the mechanism of condensin DC in transcription regulation, I used an imaging approach based on widefield single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). I obtained thousands of smFISH images for a set of condensin DC-regulated genes and extracted mature and nascent RNA counts in 3D, which I used to determine transcription burst characteristics throughout embryonic development. My data show that condensin DC regulates the frequency of transcription initiation to down-regulate X-chromosomal genes. Taken together, my results provide new insight into condensin-mediated transcription regulation, which can be used to inform future studies on the mechanism of condensins in transcription regulation in C. elegans and other organisms.

In dieser Arbeit wurden die von Seitz et al. entwickelten forced intercalation (FIT)-Sonden zur mRNA-Charakterisierung in lebenden Zellen eingesetzt. Es erfolgte die Synthese verbesserter FIT-Sonden für die systematische Untersuchung der Aufnahme durch lebende Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen. Dafür wurden sowohl hergestellte FIT-Sonden-Konjugate/Aggregate als auch kommerziell erhältliche Reagenzien, wie z.B. die Palmitinsäure und das porenbildende Enzym Streptolysin-O auf ihre Effizienz untersucht. Die optimalen Bedingungen für das Einbringen von DNA- und PNA-FIT-Sonden in Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen lieferte das Enzym Streptolysin-O. Durch den simultanen Einsatz von drei unterschiedlichen Sonden (BO-, TO- und CB-markiert), komplementär zu drei verschiedenen Zielsequenzen, gelang es erstmals eine Dreifarben-Lebendzell-Bildgebung mit FIT-Sonden durchzuführen. Des Weiteren wurden TO-FIT-Sonden zur Unterscheidung verschiedener T-Zelllinien eingesetzt. Mithilfe eines kompetitiven Hybridisierungsexperiments konnte die spezifische Fluoreszenzemission der Sonden in den Zellen belegt werden. Untersuchungen mit zwei T-Zelllinien zeigten, dass TO-FIT-Sonden sowie terminal Cy7-markierte TO-FIT-Sonden eine erhöhte TO-Emission bei Vorhandensein der komplementären TCR-mRNA-Zielsequenz in den Zellen aufwiesen. Der terminale Cy7-Farbstoff bot mit einem zweiten Detektionskanal die Möglichkeit die Cy7-Intensität und die vorhandene TO-Intensität ins Verhältnis zu setzen, sodass Signale von ungebundener Sonde leichter ausgeschlossen werden konnten. Dies ermöglichte eine spezifische Markierung der T-Zellen. Es folgte die Synthese CB-markierter FIT-Sonden zur Aufklärung biologischer Fragestellungen, wie dem Verlauf einer Influenza A Infektion und die Synthese und Evaluation neuer Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum bei 590/596 nm. Zudem wurde der Einbau eines zyklischen PNA- Monomers bezüglich der Verbesserung von Responsivität und Helligkeit von PNA-FIT-Sonden analysiert. / In this work forced Intercalation (FIT) probes, developed by Seitz et al. were used for the mRNA characterization in living cells. The synthesis of improved FIT probes as well as the systematic study on the uptake of FIT probes by living Flp-In™ 293 T-REx™ cells was performed. Therefore FIT probe conjugates/aggregates as well as commercially available reagents, e.g. palmitic acid and the pore-forming enzyme Streptolysin-O were investigated under various conditions. Furthermore, the transfection was tested using an electroporator. The optimal transfection condition for the introduction of DNA and PNA FIT probes into Flp-In™ 293 T-REx™ cells was achieved using Streptolysin-O. Multicolor live cell imaging with the simultaneous use of three different FIT probes (BO, TO and QB) against three different target sequences was performed successfully. In addition, FIT probes were used for the differentiation between T cell lines. A competitive hybridization experiment with cells confirmed the specific fluorescence emission of the probes. Further studies with two cell lines and TO-FIT probes as well as terminal Cy7-labeled TO-FIT probes showed an increased TO emission in the presence of the complementary TCR mRNA target sequence in the cells. A second detection channel of the terminal Cy7 dye provided the advantage of comparing the Cy7- and TO-intensity ratio, thereby making it easier to exclude signals from unbound probe. This enabled the specific tagging of t cells. This was followed by the synthesis of QB-DNA-based FIT probes for the use in various biological applications e.g. as a pan selective marker for Influenza A infection. Moreover, the synthesis and evaluation of new dyes with an absorption maximum at 590/596 nm was performed. The incorporation of a cyclic PNA monomer next to the TO dye has also been realized to improve responsiveness and brightness in PNA-FIT probes.

Post-translationale Modifikationen (PTMs) sind wesentlich für die Regulierung von zellulären Mechanismen. Um diese Prozesse besser zu verstehen, ist es essentiell Methoden für deren Erforschung zu entwickeln. In dieser Arbeit wurden zwei chemoproteomische Ansätze entwickelt, um die PTMs, Proteinphosphorylierung und Proteinpyrophosphorylierung zu untersuchen. Die Proteom-weite Erforschung von Proteinphosphorylierungen beruht gewöhnlich auf der LC-MS/MS-Analyse von enzymatisch verdauten Proteomen und da die Phosphorylierung von niedriger Abundanz ist, wird ein Phosphopeptid-Anreicherungsschritt benötigt. Die Identifizierung von bestimmten Phosphopeptiden ist allerdings abhängig von der gewählten Anreicherungsmethode. Die Entwicklung von neuen Prozeduren ist daher bedeutsam, um neue Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Im ersten Projekt wurde eine milde und selektive Phosphopeptid-Anreicherungsmethode entwickelt und optimiert. Die Methode zeigte die Fähigkeit Phosphopeptide anzureichern und somit das Potential, das Repertoire der vorherigen Methoden zu erweitern, um neue Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Proteinpyrophosphorylierung ist eine unlängst identifizierte PTM, die nicht-enzymatisch an Proteine angefügt wird und es ist nur wenig ist über ihre Funktion bekannt. Vorherige Studien wiesen darauf hin, dass diese Modifikation enzymatisch entfernt wird, allerdings sind die verantwortlichen Enzyme („Proteinpyrophosphatasen“) nicht bekannt. Hier wurde eine Peptidaffinitätsmethode entwickelt, um potentielle Pyrophosphatasen und weitere interagierende Proteine aus humanen Zellen zu identifizieren. Damit wurden 6 Phosphatasen als potentielle Pyrophosphatase-Kandidaten identifiziert und weitere interagierende Proteine gaben Aufschlüsse über die Funktion der Proteinpyrophosphorylierung. Dadurch wurde das Potential der Methode aufgezeigt, interagierende Proteine der Proteinpyrophosphorylierung zu identifizieren, um die zelluläre Rolle zu verstehen. / Post-translational modifications (PTMs) are crucial for the regulation of cellular mechanisms. To better understand these processes, the development of chemical tools to investigate them is of high importance. In this thesis, two chemoproteomics approaches were established to investigate the PTMs protein phosphorylation and protein pyrophosphorylation. The proteome-wide study of protein phosphorylation usually relies on LC-MS/MS analysis of enzymatically digested proteomes, requiring a phosphopeptide enrichment step, due to the low abundance of phosphorylation. However, the identification of certain sets of phosphopeptides is dependend on the choice of enrichment method. Therefore, the development of new workflows is important to identify new phosphorylation sites. In the first project, a mild and selective phosphopeptide enrichment method was developed and optimized. The method was able to enrich phosphopeptides and therefore, showed the potential to complement the repertoire of current methods to identify new phosphorylation sites. Protein pyrophosphorylation is a recently discovered PTM, which is non-enzymatically attached to proteins and there is only sparse knowledge about the function. Previous studies have indicated the enzymatic removal of this modification, but the responsible enzymes (‘protein pyrophosphatases’) are unknown. Here, a peptide affinity capture method was developed to identify potential pyrophosphatases and further interacting proteins from human cells. Therewith, 6 phosphatases were identified as potential pyrophosphatase candidates and further interacting proteins gave insights into the function and mechanisms of protein pyrophosphorylation. Thereby, the potential of this method was demonstrated to identify interacting proteins of protein pyrophosphorylation to understand the cellular role.

Sleep is a vital behavioral and physiological state. It is controlled by conserved genes and neuronal circuit mechanisms. In the round worm Caenorhabditis elegans, one single neuron called RIS is essential for sleep. During sleep, RIS activates to shut down behavior and to support survival. Here, we summarize how stress leads to the activation of RIS signaling through immunity and longevity signaling pathways and how the single RIS neuron becomes crucial for the round worm to survive. / Circa acht Stunden täglich, also ein Drittel unseres Lebens, verbringen wir Menschen schlafend. Dabei opfern wir dem Schlaf nicht nur sehr viel Zeit, sondern nehmen sogar in Kauf, währenddessen durch stark eingeschränktes Bewusstsein besonders vulnerabel zu sein. Und nicht nur wir Menschen gehen dieses Risiko ein, sondern jedes bekannte Lebewesen mit Nervensystem. Angesichts all dessen lässt sich erahnen, dass Schlaf für uns absolut unentbehrliche Vorteile bringt. In der Tat ist chronischer Schlafmangel mit gesundheitlichen Schäden assoziiert, z. B. einem erhöhten Infektionsrisiko, Krebs, Depressionen und vielen mehr. Die molekularen und zellulären Mechanismen hinter den Zusammenhängen zwischen Schlaf und Gesundheit sind bis heute aber kaum verstanden.

Der Komplex aus Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und Acetyl-CoA-Synthase (CODH/ACS Komplex) des thermophilen Bakteriums Carboxydothermus hydrogenoformans katalysiert die Fixierung von CO2 in Acetyl-CoA und ist damit ein potenzieller Katalysator für die Erzeugung erneuerbarer Kraftstoffe aus CO2. Die Katalyse erfolgt an zwei verschiedenen Stellen: CO2 wird am Cluster C in der CODH-Untereinheit zu CO reduziert, das dann durch einen Tunnel innerhalb des Proteins zum Cluster A in der ACS-Untereinheit wandert, wo es mit einer Methylgruppe und CoA zu Acetyl-CoA reagiert. Die Art und Weise, wie die beiden katalytischen Aktivitäten zusammenwirken, sind noch unklar. Um hier mehr Licht ins Dunkel zu bringen, verfolgte diese Arbeit drei Ziele: die Bestimmung der Struktur des CODH/ACS-Komplexes von C. hydrogenoformans, die Untersuchung der CO2-Reduktionsaktivität von CODHasen und die Analyse der Rolle des internen Tunnels im CODH/ACS-Komplex. Die Struktur des CODH/ACS-Komplexes von C. hydrogenoformans wurde durch Röntgenkristallographie mit einer Auflösung von 2,04 Å bestimmt. Die CO2-Reduktion am Cluster C wurde kinetisch untersucht. Es zeigte sich, dass die CO2-Reduktion durch einen Ping-Pong-Mechanismus mit zwei Reaktionsstellen erfolgen könnte, der in früheren Studien vorgeschlagen wurde, aber auch durch andere Mechanismen. Um eine Struktur-Funktionsbeziehung für CODHs zu ermitteln, wurde die CO2-Reduktionsaktivität für drei CODHasen von C. hydrogenoformans untersucht, deren Strukturen bekannt sind: CODH-II, CODH-IV, und der CODH/ACS-Komplex. Das Tunnelsystem im CODH/ACS-Komplex ist viel enger als in den anderen CODHs und könnte somit der Grund für die vergleichsweise geringe Aktivität des CODH/ACS-Komplexes sein. Dies wurde auch durch die Manipulation und Analyse des internen Tunnels des CODH/ACS-Komplexes unterstützt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Hauptzweck des Tunnels im CODH/ACS-Komplex die Kompartimentierung von CO und nicht der schnelle Substrattransport ist. / The complex of carbon monoxide dehydrogenase and acetyl-CoA synthase (CODH/ACS complex) of the thermophilic bacterium Carboxydothermus hydrogenoformans catalyses the fixation of CO2 into acetyl-CoA and is thus a potential catalyst for the production of renewable fuels from CO2. Catalysis occurs at two different sites: CO2 is reduced to CO at cluster C in the CODH subunit, which then travels through a tunnel within the protein to cluster A in the ACS subunit, where it reacts with a methyl group and CoA to form acetyl-CoA. The way in which the two catalytic activities interact is still unclear. To shed more light on this, this work pursued three goals: to determine the structure of the CODH/ACS complex of C. hydrogenoformans, to investigate the CO2 reduction activity of CODHases and to analyse the role of the internal tunnel in the CODH/ACS complex. The structure of the CODH/ACS complex of C. hydrogenoformans was determined by X-ray crystallography at 2.04 Å resolution. The CO2 reduction at cluster C was investigated kinetically. It was found that CO2 reduction could occur by a two-site ping-pong mechanism proposed in previous studies, but also by other mechanisms. To establish a structure-function relationship for CODHs, CO2 reduction activity was investigated for three CODHases of C. hydrogenoformans whose structures are known: CODH-II, CODH-IV, and the CODH/ACS complex. The tunnel system in the CODH/ACS complex is much narrower than in the other CODHs and could thus be the reason for the comparatively low activity of the CODH/ACS complex. This was also supported by the manipulation and analysis of the internal tunnel of the CODH/ACS complex. The results suggest that the main purpose of the tunnel in the CODH/ACS complex is to compartmentalise CO and not to rapidly transport substrate.

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