Le Canada est l’un des plus grands pays exportateurs de porc du monde et le Québec à lui seul compte pour 6% de ce commerce mondial. Pour conserver sa compétitivité et l’excellence de ses produits, une connaissance approfondie des agents infectieux circulant au sein des troupeaux est primordiale. Plusieurs pathogènes sont peu étudiés et pourtant retrouvés chez les porcs à travers la planète. Cette étude avait pour but l’évaluation de la prévalence des astrovirus porcins, calicivirus, kobuvirus porcin, rotavirus, torque teno sus virus ainsi que le virus de l’hépatite E lors du suivi de porcelets dans un réseau de production porcine, de la maternité jusqu’en fin d’engraissement. Nous voulions brosser un portrait de l’excrétion de ces virus à travers les différentes étapes de production des animaux. L’échantillonnage de porcelets sains et en diarrhée en pré-sevrage a permis de déterminer lesquelles de ces infections virales constituaient des facteurs de risque pour la diarrhée à ce stade de production. Le virome intestinal, la partie virale du microbiome, a également été caractérisé permettant de connaître la diversité des virus entériques porcins aux différentes étapes de production, ainsi qu’entre les porcelets sains et en diarrhée. De plus, la dissémination du virus de l’hépatite E dans l’environnement ainsi que les sources probables de contamination ont été décrites à l’aide d’échantillons provenant des environnements intérieurs et extérieurs de fermes d’engraissement, de la cour d’un abattoir et de transporteurs d’animaux. Les résultats obtenus ont permis de décrire les dynamiques temporelles d’excrétion de ces virus entériques porcins en fonction des stades de production des porcs, démontrant une différence dans l’excrétion de ces virus en fonction de l’âge. Les calicivirus, ainsi que les astrovirus porcins groupes 3 et 5 étaient des facteurs de risque de diarrhée en maternité. Pour la première fois au Canada, la détection et la caractérisation des souches du kobuvirus porcin ont été réalisées, permettant de mieux comprendre leur diversité et leur persistance à travers les stades de production. La diversité du virome entérique porcin a été analysée avec la plateforme de séquençage MiSeq et cette diversité était différente entre les porcelets sains et en diarrhée, ainsi qu’entre les stades de production. Cependant, les traitements enzymatiques utilisés pour le prétraitement des échantillons fécaux ne permettaient pas le séquençage de certains virus à ARN simple-brin. Des souches similaires du virus de l’hépatite E étaient présentes dans l’environnement des fermes, ainsi qu’aux endroits communs à forte circulation des intervenants du réseau. Les activités dans la cour de l’abattoir pourraient donc être impliquées dans la dissémination de ce virus. Cette étude a permis de mieux connaitre la prévalence et la distribution des virus entériques infectant les porcs. De plus, certains des virus entériques étudiés ont été reconnus comme facteurs de risque de la diarrhée en co-infections et devront être étudiés en détail pour comprendre leurs mécanismes en relation avec la diarrhée néonatale. Des interventions plus spécifiques lors d’éclosion de diarrhées porcines, dont l’étiologie est inconnue, pourront donc être réalisées, ainsi que l’élaboration de mesures de biosécurité plus adaptées en fonction du stade de production des porcs. / Canada is a major pork exporter around the world and the province of Quebec alone accounts for 6% of this trade. To maintain the province’s competitiveness and the excellence of its products, a comprehensive understanding of the infectious agents circulating in herds is essential. Several pathogens have been intensively studied, while others have yet to be investigated even though they have been reported in pigs all around the world. This study evaluated the prevalence of porcine astroviruses, calicivirus, porcine kobuvirus, rotavirus, torque teno sus virus and hepatitis E virus, monitored in a pig production network, from the nursing farms to the end of the fattening farms to portray the excretion patterns of these viruses through the different life stages of pigs. The sampling of healthy piglets alongside piglets with diarrhea in the nursing farms allowed to determine which viruses, or co-infections of viruses were factors of diarrhea at this life stage. The intestinal virome, the viral part of the microbiome, was characterized and viral diversity of porcine enteric viruses at different life stages, as well as between healthy and diarrheic piglets were evaluated. Moreover, the dissemination of the hepatitis E virus in the farm environment, as well as the possible sources of contamination were described, from the indoor and outdoor environment of fattening farms, the slaughterhouse yard and animal transporters. The results obtained in this study described the temporal excretion dynamics of these porcine enteric viruses according to the life stages of the pigs, demonstrating the difference in the excretion of the studied viruses according to the life stage. The calicivirus, as well as the porcine astrovirus groups 3 and 5 were found to be risk factors for diarrhea in the nursing farms. For the first time in Canada, the detection and characterization of porcine kobuvirus strains were evaluated and provided a better understanding of their diversity and the persistence of these strains in the network. The porcine enteric virome diversity was analyzed on a MiSeq sequencing platform and this diversity was different between healthy and diarrheic piglets, as well as between the different life stages. However, the different enzymatic treatments used as pretreatments for fecal samples altered the ability to detect certain single-stranded RNA viruses. Similar strains of the hepatitis E virus were present in the indoor and outdoor environment of the fattening farms, as well as in common places of high circulation from the various stakeholders in the pig production network. The activities in the slaughterhouse yard could therefore be involved in the spread of this virus. This study shed light on enteric viruses infecting pigs. In addition, some of the infections from enteric viruses studied were risk factors for diarrhea in co-infections and will need to be studied in more details to understand their mechanisms, in relation to neonatal diarrhea. More specific interventions during outbreaks of porcine diarrhea of unknown etiology could be carried out, as well as the development of more adapted biosecurity measures according to the life stage of the pigs.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène de grande importance dans l'industrie porcine car il peut entraîner des pertes économiques. L'une des lignées cellulaires couramment utilisée pour la recherche et la production de vaccins est MARC-145 (cellules rénales de singe vert africain). Les interactions moléculaires entre les cellules hôtes et le virus sont essentielles pour comprendre le mécanisme par lequel le virus utilise la machinerie cellulaire pour se répliquer et infecter les cellules voisines. Notre objectif était d'analyser les changements protéomiques produits lors de l'infection par le VSRRP chez les cellules MARC-145, y compris la composition des virions et des exosomes produits par les cellules infectées. Les surnageants des cellules infectées et non infectées ont été purifiés pour obtenir les virions et exosomes des cellules hôtes. Par la suite, les protéines extraites ont été analysées par spectrométrie de masse à haute résolution quadripolaire-hybride-Orbitrap, et classées selon la fonction moléculaire et la localisation subcellulaire. Le besoin d'obtenir des données protéomiques fiables a conduit au prochain objectif : optimiser l'infection des cellules MARC-145 par le VSRRP. Pour évaluer l'efficacité de l'infection, nous avons synchronisé l'infection en utilisant un virus marqué avec une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et en ajoutant des polycations à différentes concentrations pour stimuler la liaison des particules virales à la cellule. Pour vérifier le pourcentage de cellules infectées, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux. Nos résultats suggèrent que les protéines cellulaires affectées au cours de l'infection par le VSRRP pourraient jouer un rôle important dans la réponse immunitaire de l'hôte et / ou le cycle de vie viral. L’efficacité de l'utilisation de polycations pour augmenter l'infection par le VSRRP a été démontrée. / Porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) is a pathogen of high importance in the porcine industry because it can lead to significant economic losses. One of the cell lines routinely used for research and vaccine production is MARC-145 (African green monkey kidney cells). Molecular interactions between the host cells and the virus are essential to understand how the virus uses the cell machinery to replicate and infect neighbouring cells. Our goal was to analyze the proteomic changes involved during the PRRSV infection in MARC-145 cells, including the composition of the infected cells' virions and exosomes. The infected and non-infected cells' supernatants were purified to obtain the host cells' virions and exosomes. Extracted proteins were further analyzed by High-Resolution-Quadrupole-Hybrid-Orbitrap mass spectrometry and classified according to molecular function and subcellular localization. The need for obtaining reliable proteomics data led to the next goal of optimizing the infection of MARC-145 cells with PRRSV. To assess the efficiency of the infection, we synchronized the infection, used a virus tagged with an enhanced green fluorescent protein (EGFP) and added polycations at different concentrations to stimulate the binding of the viral particles to the cell. To verify the percentage of infected cells, we used fluorescence microscopy and flow cytometry. Our findings suggest the cellular proteins affected during the PRRSV infection could play important roles in host immune response and/or the viral life cycle. The efficiency of the use of polycations was demonstrated to be effective in increasing PRRSV infection.

Le virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1) est l'un des agents pathogènes humains les plus anciens et les plus efficaces. On estime que 3.7 milliards de personnes dans le monde vivent avec le VHS-1. Le virus persiste à l'état latent dans les neurones sensoriels, réapparaissant occasionnellement sous la forme d'une infection lytique qui endommage l'épithélium. Même si le VHS-1 provoque une maladie bénigne connue sous le nom de feu sauvage dans la majorité des cas, l'infection peut entraîner des conséquences catastrophiques telles que l'encéphalite et la kératite chez les personnes immunodéprimées les nouveau-nés. Compte tenu de la présence généralisée des infections à VHS-1, le virus représente une menace potentielle pour le système de santé. Le génome à ADN du VHS-1 est protégé par une cage protéique appelée capside. Bien que l'assemblage de la capside du VHS-1 et l'encapsidation du génome aient lieu à l'intérieur du noyau de l'hôte, les étapes finales de la maturation doivent être achevées dans le cytoplasme. Ainsi, pour la sortie du noyau, le virus a développé un mécanisme connu sous le nom d’enveloppement-déenveloppement-réenveloppement. La première étape de ce processus est principalement régulée par le complexe de sortie nucléaire (pUL31 et pUL34) et entraîne le bourgeonnement de la capside alors enveloppée dans l'espace périnucléaire. Par la suite, le déenveloppement de ces capsides périnucléaires et leur libération dans le cytoplasme seraient largement modulés par la kinase virale pUs3. Ce processus est sélectif, car les capsides remplies d'ADN (capsides C) sortent préférentiellement du noyau au détriment des intermédiaires viraux sans génome (capsides A et B). Cependant, nous ne savons pas pourquoi les capsides C sont favorisées lors de ce processus. En aval, le virus mûrit, recrute de nombreuses protéines puis acquiert une enveloppe à partir d'un compartiment cytoplasmique. Il sort ensuite de la cellule sous forme de virions enveloppés matures. Outre les facteurs viraux mentionnés et quelques protéines hôtes, l'implication de nombreuses autres protéines virales et cellulaires dans cette voie n'a pas été entièrement caractérisée. Pour élucider davantage ce processus de sélection de la capside C, nous avons profité de l'analyse MS/MS des capsides nucléaires du VHS-1 pour définir les facteurs hôtes et viraux spécifiques à chaque intermédiaire de capside nucléaire (Chapitre 2; Article 1). Nous avons trouvé deux protéines virales (pUL42 et pUL46) et sept facteurs de l'hôte (glycogène synthase, quatre protéines différentes liées à la kératine, fibronectine 1 et PCBP1) qui étaient spécifiques des capsides C matures. Fait intéressant, toutes ces protéines semblent posséder des fonctions qui ont le potentiel de médier la sortie nucléaire préférentielle des capsides C. Par conséquent, l'analyse fonctionnelle future de ces protéines pourrait nous fournir des informations inestimables sur la sortie nucléaire actuellement énigmatique des capsides du VHS-1. Les travaux en cours d'un collègue de laboratoire avec lequel je collabore impliquent PCBP1 en tant que modulateur de la sortie nucléaire (mémoire de Mackenzie Thornbury). Nous nous sommes ensuite concentrés sur un ensemble de données protéomiques déjà existantes des virions extracellulaires matures, qui a identifié jusqu'à 49 protéines hôtes incorporées dans le virus, y compris une hélicase à ARN humaine appelée DDX3X qui s'est avérée être un modulateur actif de la propagation virale (Chapitre 2; Article 2). Nous avons remarqué que cette protéine se déplace vers le noyau tard lors de l'infection, coïncidant avec la majeure partie de la sortie nucléaire virale. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que DDX3X serait impliqué dans la sortie nucléaire virale. Nous avons découvert que, tardivement au cours de l'infection, pUL31 interagit avec DDX3X au niveau du noyau. Nous avons également constaté que DDX3X stimule de grandes agrégations de capsides virales matures dans la périphérie nucléaire. Fait intéressant, la redirection de DDX3X vers le bord nucléaire dépend de la présence de la machinerie de sortie nucléaire virale (pUL31, pUL34 et pUs3) et de capsides matures. Enfin, nos données ont montré qu'en l'absence de DDX3X, les capsides C s'accumulent entre les deux membranes nucléaires, probablement à la suite d'une incorporation inefficace de pUs3 au site de sortie. Ces résultats ont élucidé une nouvelle fonction de DDX3X et pourraient ouvrir de nouvelles voies passionnantes de recherche pour développement d’antiviraux en ciblant cette hélicase à ARN cellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is one of the oldest and most successful human pathogens. It is estimated that 3.7 billion people worldwide are living with HSV-1. The virus latently persists in sensory neurons, occasionally recurring as a lytic infection which damages the connected epithelium. Even though HSV-1 causes a mild disease known as the cold sore in majority of cases, the infection can have catastrophic consequences such as encephalitis and keratitis in immunocompromised individuals, newborns and, more rarely, in immune competent adults. Considering the widespread presence of HSV-1 infections, the virus poses a potential threat to the healthcare system. The DNA genome of HSV-1 is protected by a protein cage called a capsid. Although HSV-1 capsid assembly and genome packaging take place inside the host nucleus, the final steps of maturation must be completed inside the cytoplasm. Since the large diameter of these viral capsids (~125 nm) far exceeds the 30 nm cut-off of the nuclear pore complex, the virus has evolved a mechanism known as envelopment-deenvelopmentreenvelopment. The first step of this complex process is mainly regulated by the components of the nuclear egress complex (pUL31 and pUL34) and results in the budding of enveloped capsid into the perinuclear space. Subsequently, deenvelopment of these perinuclear capsids and their release into the cytoplasm is thought to be largely modulated by the viral kinase pUs3. This process is selective as DNA-filled capsids (C-capsids) preferentially exit the nucleus compared to genome-free viral intermediates (A- and Bcapsids). However, it is unclear how C-capsids are preferentially selected for the nuclear egress. Further downstream, the virus matures and recruit numerous proteins onto the viral capsids and acquire an envelope from a cytoplasmic compartment. It then exits the cell as mature enveloped virions. Apart from the mentioned viral factors and a handful of host proteins, implication of many other viral and cellular proteins in this pathway have not been fully characterized. To further resolve this process of C-capsid selection, we took advantage of MS/MS analysis of HSV-1 nuclear capsids to define host and viral factors specific to each nuclear capsid intermediate (Chapter 2; Article 1). We found two viral proteins (pUL42 and pUL46) and seven host factors (glycogen synthase, four different keratin-related proteins, fibronectin 1, and PCBP1) that were specific to mature C-capsids. Interestingly, all these proteins seem to possess functions that have the potential to mediate the preferential nuclear exit of C-capsids. Therefore, future functional analysis of these proteins might provide us with invaluable insights into the currently enigmatic nuclear egress of HSV-1 capsids. Ongoing work by a lab colleague with which I collaborate implicates PCBP1 as a modulator of nuclear egress (memoir of Mackenzie Thornbury). We then focused on an existing proteomics data set of mature extracellular virions, which revealed 49 virus-incorporated host proteins, including a human RNA helicase called DDX3X that we found to be an active modulator of viral propagation (Chapter 2; Article 2). We observed that DDX3X relocates to the nuclear rim late during infection, coinciding with the bulk of viral nuclear egress, and leading us to hypothesize that DDX3X is involved in the process. We discovered that, late during the infection, pUL31 interacts with DDX3X at the nuclear rim. We also found that DDX3X stimulates large aggregations of mature viral capsids in the nuclear periphery. Unexpectedly, redirection of DDX3X to the nuclear rim was dependent on the presence of the viral nuclear egress machinery (pUL31, pUL34 and pUs3) and mature capsids. Lastly, our data showed that in the absence of DDX3X, C-capsids accumulate in the perinuclear space, likely as the result of inefficient incorporation of pUs3 to the site of egress. These results have elucidated a novel function for DDX3X and may open new and exciting paths to produce antivirals by targeting this cellular RNA helicase.

L’infection au virus du papillome humain oncogénique (VPH-HR) est associée au développement du cancer du col de l’utérus. L’expression des oncogènes viraux E6 et E7, qui favorisent la progression vers le cancer, est régulée par la région de contrôle longue ou LCR qui contient des sites de liaison pour plusieurs facteurs de transcription cellulaires et pour le répresseur viral E2. L’expression des oncogènes E6 et E7 est souvent dérégulée dans les cancers du col de l’utérus, une résultante de l’intégration du génome viral qui détruit fréquemment le cadre de lecture du gène E2. Plusieurs isolats ou variantes du VPH de type 33 (VPH33) avec une séquence nucléotidique du LCR différente du prototype ont été identifiés dans des spécimens de femmes infectées par le VPH et présentant des lésions intraépithéliales au niveau du col utérin. Deux polymorphismes, une délétion de 79 pb et la transversion C7732G, ont été associés à la persistance de l’infection et à un plus grand risque de développer une lésion intraépithéliale de haut-grade, respectivement. L’effet fonctionnel des polymorphismes du LCR du VPH33 sur l’expression génique virale, en particulier de la délétion de 79 pb et de C7732G, n’a jamais été caractérisé. Dans une première étude, l’activité transcriptionnelle des variantes de LCR du VPH33 a été comparée à celle du prototype dans les lignées cellulaires C33A et HeLa par des études de gènes rapporteurs suite à leur introduction en amont du gène de la Renilla luciférase. Nos résultats indiquent que l’activité transcriptionnelle des variantes du LCR du VPH33 reflète leur classification phylogénétique; les variantes issues de la lignée A2 étant les plus actives dans les C33A que le prototype du groupe A1. Des analyses par mutagenèse dirigée ont établi que l’activité accrue des LCRs de ces variantes est due à plusieurs variations, incluant la délétion de 79 pb et C7732G, et dont leur effet individuel est assez modeste. Dans les cellules HeLa, les niveaux de transcription des variantes de la lignée A2 étaient similaires à ceux observés chez le prototype. Cet effet a été attribué à la variation A7879G qui induit la répression du LCR dans ces cellules. Ces résultats indiquent que la combinaison de plusieurs variations dites faibles altère significativement l’activité transcriptionnelle du LCR du VPH33. D’un autre côté, les résultats rapportés dans notre deuxième étude indiquent que la mutation d’un élément important pour la régulation de la transcription virale peut tout autant altérer l’activité du LCR. La variante rare LCR10 de la lignée B montre une activité transcriptionnelle accrue comparée au prototype. Des analyses par mutagenèse dirigée ont identifié la variation T7791C comme étant responsable de l’activité augmentée du LCR10. L’effet stimulateur de ce polymorphisme est dû au fait qu’un site répresseur pour le facteur cellulaire C/EBPβ est aboli, tel que déterminé par des essais de liaison à l’ADN in vitro et de gène rapporteur. Un deuxième site C/EBPβ a également été identifié, cette fois-ci, agissant comme activateur de l’expression génique. Finalement, dans une troisième étude, nous montrons que C/EBPβ est un régulateur commun de l’expression des gènes chez les VPHs oncogéniques. Effectivement, plusieurs sites C/EBPβ sont retrouvés dans la région amplificatrice du LCR des VPHs à haut-risque tel que déterminé par des prédictions basées sur des matrices d’énergie et de fréquence. Certains de ces éléments sont similaires aux sites répresseurs et activateurs retrouvés dans le VPH33. Dans l’ensemble, nos études démontrent l’importance de caractériser l’effet individuel des polymorphismes du LCR pour mieux comprendre les mécanismes de modulation de la transcription des VPHs. De plus, nous montrons que C/EBPβ joue un rôle central autant dans la répression que dans l’activation de l’expression des gènes viraux. / The infection by the oncogenic human papillomavirus (HR-HPV) is associated with the development of cervical cancer. The expression of the E6 and E7 viral oncogenes favors progression towards cancer and is driven by the long control region (LCR) which contains binding sites for both cellular factors and the viral E2 protein. The expression of these oncogenes is often upregulated in cervical cancer due to the integration of the viral genome which frequently disrupts the open reading frame of the repressor E2 gene. Several isolates or variants of HPV type 33 (HPV33) with a slightly different nucleotide sequence were previously identified in clinical samples from women infected with HPV33 and presenting squamous intraepithelial lesions of the uterus. Two polymorphisms, a 79-bp deletion and the C7732G transversion, were previously associated with an increased risk of persistence of infection and of developing high-grade lesions, respectively. The functional effect of polymorphisms in the HPV33 LCR on viral gene expression has never been assessed in particular for the 79-bp deletion and C7732G. In the first study presented here, the transcriptional activity of the HPV33 LCR variants were compared to that of the prototype in C33A and HeLa cell lines using gene reporter assays following their introduction upstream of the Renilla luciferase. Our results indicate that the LCR activity of the variants reflects their phylogenetic classification. As such, variants from the A2-sublineage were the most active in C33A cells when compared to the A1-sublineage prototype. Mutational analysis showed that the increased in LCR activity was the result of several weakly-acting variations, including the 79-bp deletion and C7732G. In HeLa cells, the lower transcriptional activity of the A2 variants was caused by A7879G which induces repression of the LCR in these cells. These results show that the combination of weakly-acting variations in the LCR significantly alters viral gene expression. In the second study, we show that the mutation of important regulatory elements also significantly enhances the transcriptional activity of the LCR. The rare HPV33 LCR10 variant from the B lineage exhibits increased transcriptional activity compared to the prototype. Mutational analysis shows that the T7791C variation is responsible for this phenotype. The stimulating effect of this variation is caused by the disruption of a repressor C/EBPβ site as determined in an in vitro DNA-binding assay and gene reporter assays. A second site necessary this time for the activation of the LCR was also identified. Finally, in the third study, we show that C/EBPβ is a common regulator of the oncogenic HPV gene expression. Several C/EBPβ sites were found in the enhancer region of the LCR of these HPV types as determined by our prediction using both energy- and frequency-based matrices. Some of these sites were found to be similar to the repressor and activating sites in the HPV33 LCR. Taken together, our studies highlight the importance of characterizing individual variations in the LCR in order to improve our knowledge on the mechanisms involved in the regulation of viral gene expression. We also show that the activating and inhibitory functions of C/EBPβ are important for the modulation of viral transcription.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent causateur de maladies du foie important responsable d’une pandémie affectant près de 180 millions d’individus mondialement. L’absence de symptômes dans les premières années d’infection entraîne des diagnostics tardifs qui empêchent la prise en charge rapide des patients avant l’apparition d’une fibrose et, dans près de 16 % des cas d’infection, d’une cirrhose. En exploitant les interactions protéine-protéine membranaires, des essais utilisant la technologie BRET, dans les cellules vivantes, ont été précédemment optimisés afin d’établir le réseau complet des interactions du VHC. En utilisant les fondements de cette étude, un essai à haut débit dans les cellules vivantes a été réalisé pour identifier de nouveaux composés anti-VHC ciblant une nouvelle interaction NS3/4A-NS3/4A. Approximativement 110,000 petites molécules ont été criblées pour leurs effets sur l’homodimérization de NS3/4A et ont été classées par rapport à leur spécificité et à leur puissance contre le VHC. Au terme de cette étude, UM42811 a été identifié comme un activateur potentiel de l’interaction NS3/4A-NS3/4A offrant une activité antivirale prometteuse dotant une excellente fenêtre thérapeutique. Par la suite, un séquençage exhaustif des virus, soumis à un traitement de UM42811, a permis d’établir le profil de résistance du VHC contre ce composé. Grâce à cette fine cartographie, il a été possible d’identifier un nouveau mécanisme d’inhibition de NS3/4A qui est indépendant de son activité protéase. En utilisant les données de notre groupe sur les interactions VHC-hôte, il a été possible de continuer la caractérisation fonctionnelle du composé UM42811 en étudiant son effet sur les interactions potentiellement bénéfiques à la persistance virale. Pour ce faire, les protéines associées au transport nucléaire et mitochondriale qui sont des interactants de choix de NS3/4A ont été priorisées. Parmi ces facteurs de l’hôte, l’étude de karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) et de heat shock protein 60 (HSP60) a été priorisée. De façon intéressante, les expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que UM42811 était capable de prévenir l’interaction KPNB1-NS3/4A ainsi que l’interaction HSP60-NS3/4A. De plus, les études ii fonctionnelles et les analyses d’immunobuvardage de type western ont démontré que l’interaction KPNB1-NS3/4A avait des effets délétères sur l’induction des gènes stimulés par l’interféron (ISG). Finalement, il a été démontré que KPNB1 est possiblement clivé par NS3/4A suggérant la présence potentielle d’un mécanisme de subversion ou d’échappement. En bref, cette étude démontre la puissance des stratégies impliquant les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes pour l’identification de nouveaux composés inhibiteurs, caractérise un nouveau mécanisme d’inhibition anti-VHC et révèle la possibilité d’un nouveau mécanisme d’évasion du système immunitaire. / Hepatitis C virus (HCV) is an important causative agent for liver diseases and is responsible for a worldwide pandemic affecting roughly 180 million individuals worldwide. Late diagnosis following the progression to fibrosis and to cirrhosis, in nearly 16% of chronic infections, is attributed to the absence of symptoms in the first years of infection. By exploiting membrane protein-protein interactions (PPI), live cell assays using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology have previously been optimized to complete a comprehensive hepatitis C virus (HCV) protein interaction network. Using the groundwork laid by this network study, a high-throughput assay (HTS) cell-based assay was implemented to identify novel inhibitory compounds targeting an unreported NS3/4A-NS3/4A interaction. Approximately 110,000 compounds from a small-molecule collection were screened to monitor modulation of NS3/4A homodimerization and were discriminated based on specificity and potency. UM42811 was identified as a potential NS3/4A-NS3/4A interaction activator and found to have a promising antiviral activity boasting an excellent therapeutic window. Combined deep sequencing and mutation mapping have yielded a resistance profile based on statistical and functional probability pointing towards a novel inhibitory mechanism targeting the HCV NS3/4A independent from protease activity inhibition. Data from an HCV to host protein interaction network generated by our group was used to analyze alternative effects of UM42811 on interactions which potentially benefit viral persistence. NS3/4A-specific host interactors were heavily associated with nuclear and mitochondrial transport based on Gene Ontology (GO). Among these specific interactors, karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) and heat shock protein 60 (HSP60) were selected for further study. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments revealed that UM42811 was able to prevent both KPNB1-NS3/4A and HSP60-NS3/4A interactions. Moreover, functional and western analysis revealed the KPNB1-NS3/4A interaction to have deleterious effects on iv interferon stimulated gene (ISG) induction. Unexpectedly, analysis revealed a putative NS3/4A mediated cleavage of KPNB1. Overall, this study demonstrates the strength of cell-based PPI strategies in the identification of novel HCV antiviral compounds, characterizes a novel inhibitory mechanism for HCV and reveals a potentially novel viral immune evasion mechanism.

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique. / Mouse hepatitis virus type 3 (MHV3) is an excellent model to study immunological disorders related to viral infections. The fulminant acute hepatitis induced in susceptible C57BL/6 mice is characterized by the presence of necrotic and inflammatory foci in the liver associated with B and T cell immunodeficiencies leading to the death of the animals in 3 to 5 days post-infection. The fulminance of this viral infection suggests a deficiency in the natural immunity mechanisms under control of NK and NK-T cells and an imbalance between the hepatic tolerance and the inflammatory responses. To understand the different mechanisms involved in the acute hepatitis, in vivo infections have been done in C57BL/6 mice with either the pathogenic L2-MHV3, or with its attenuated variants: the weak attenuated 51.6-MHV3, the highly attenuated CL12-MHV3 or the non-pathogenic YAC-MHV3 viruses, possessing different tropisms for liver sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells. The results demonstrate that splenic and myeloid NK cells are impaired during a MHV3 infection. This impairment is due to a recruitment of these cells in the liver and a virus-induced apoptotic phenomenon. The recruitment and the subsequent apoptosis of NK and NK-T cells during the first three days of infection are in relation with the pathogenicity of the MHV3 variants. In spite of the fact that hepatic recruited NK cells are still cytotoxic, these cells undergo apoptosis due to viral replication via the formation of syncytia. Addition of IL-12 and IL-18, which are impaired during the acute hepatitis, promote a synergistic IFN-g production by NK cells depending of both the p38 MAPK pathway and the viral replication. Moreover, the specific viral receptor CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) is essential for this response but also exerts an inhibitory action. Levels of the immunosuppressive cytokines IL-10, TGF-b and PGE2, mainly produced by Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells, and implicated in the natural hepatic tolerance, are in inverse correlation with the pathogenicity of the MHV3 variants. Finally, viral infection promotes the secretion of IL-6 and TNF-a by macrophages, triggered by the fixation of viral particules to TLR2 and heparan sulfate receptors rather than the engagement of CEACAM1a receptor and viral replication. In conclusion, our results suggest new mechanisms by which the MHV3 virus disturbs the innate immunity under control of NK and NK-T cells, as well as the cytokines involved in the hepatic tolerance to the detriment of the inflammatory response.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is responsible for the acquired immune deficiency syndrome (AIDS). HIV-1 develops a resistance towards the inhibitors used to treat infected patients. It is thus important to identify new targets for the development of novel antiretroviral agents. The aim of our work was to better characterize the programmed -1 ribosomal frameshift which generates the precursor of HIV-1 enzymes. The frameshift occurs at a specific sequence of HIV-1 full-length messenger RNA (mRNA), the slippery sequence, and is performed by a minority of the ribosomes translating this mRNA. The frameshift efficiency is controlled by the frameshift stimulatory signal (FSS), an irregular stem-loop located downstream of the slippery sequence. FSS structure is unfolded by every ribosome translating this region and can refold afterwards. We showed that HIV-1 frameshift efficiency is affected by changes in the rate of translation initiation. We transfected Jurkat-T and HEK 293T cells with a bicistronic reporter that contains the frameshift region of HIV-1 between the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) genes. Rluc is produced by all ribosomes translating this reporter whereas only ribosomes that make a –1 frameshift produce Fluc. The translation of the reporter is initiated via a cap-dependant mode, like the majority of cellular mRNAs. We first determined the effect of three inhibitors of translation initiation. We showed that their presence increases the frameshift efficiency. We next determined the impact of the TAR stem loop, which is located at the 5’end of every HIV-1 mRNA. TAR is known to impair the binding of the small subunit of the ribosome (40S) to the mRNA. TAR also modulates the activity of the double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR). When PKR is activated, it phosphorylates the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2), inhibiting translation initiation. The inhibition of PKR has the opposite effect. We studied the effect of TAR on PKR by positioning TAR at a distance of the 5’ end where it cannot interfere with the binding of the 40S. Our results showed that a small amount of TAR, which activates PKR, increases the frameshift efficiency whereas a large amount of TAR, which inhibits PKR, decreases it. A model is presented where the variations of translation initiation modulate HIV-1 frameshift efficiency by altering the distance between the elongating ribosomes. This influences the probability that these ribosomes encounter or not a folded FSS. We next observed the effect of the 5’ untranslated region (UTR) of HIV-1 full length mRNA on its frameshift efficiency. This 5’UTR contains several structured parts, including TAR at the 5’end, which can inhibit translation initiation. This mRNA has a cap and an internal ribosome entry site (IRES) and could then use a cap dependent and an IRES-dependent mode of translation initiation. We replaced the 5’UTR of our bicistronic reporter mRNA by the complete 5’UTR of HIV-1 full-length mRNA or a part of it. Our results showed that the presence of the complete 5’UTR inhibits cap-dependent initiation of translation and increases the frameshift efficiency. Those effects are mostly due to the presence of TAR followed by a Poly(A) stem-loop. We also constructed a tricistronic reporter where the ribosomes translating the luciferases have to use an IRES-dependent initiation mode. The rate of this initiation was low and the frameshift efficiency obtained was also low. We proposed a hypothesis accounting for this situation. We also observed that when both initiation modes are available, the cap-dependent mode seems to be highly favored. Finally, we studied the impact of the Tat viral protein on translation initiation and frameshift efficiency. We showed that the presence of Tat increases translation initiation and decreases the frameshift efficiency. Those effects are more important when TAR is present at the 5’end of mRNA. We propose a model explaining the effects of Tat on translation initiation by the inhibition of PKR and by changes in the expression of cellular proteins that are able to unfold TAR. Our results allow us to better understand the mechanisms controlling HIV-1 frameshift, which will help in the development of drugs targeting the HIV-1 frameshift.

La réplication et l’assemblage du virus de l’hépatite C (VHC) sont régulés finement dans le temps et l’espace par les interactions protéiques entre le virus avec l’hôte. La compréhension de la biologie du virus ainsi que sa pathogénicité passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hôte. Afin d’identifier ces interactions, nous avons exploité une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à une détection par spectrométrie de masse (MS), pour ensuite évaluer le rôle des protéines identifiées dans le cycle viral par une technique de silençage génique. Les protéines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont été exprimées individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprécipitées afin d’isoler des complexes protéiques qui ont été soumis à l’analyse MS. Ainsi, 98 protéines de l’hôte ont été identifiées avec un enrichissement significatif et illustrant une spécificité d’interaction. L’enrichissement de protéines connues dans la littérature a démontré la force de l’approche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hôte. Enfin, le rôle de ces interactants sur la réplication virale a été évalué dans un criblage génomique par ARN interférant (ARNi). Deux systèmes rapporteurs de la réplication virale ont été utilisés : le système de réplicon sous-génomique (Huh7-Con1-Fluc) et le système infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi qu’un essai de toxicité cellulaire (Alamar Blue). Parmi les protéines de l’hôte interagissant avec le VHC, 28 protéines ont démontré un effet significatif sans effet de toxicité cellulaire, suggérant fortement un rôle dans la réplication du VHC. Globalement, l’étude a mené à l’identification de nouvelles interactions virus/hôte et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. / Hepatitis C virus (HCV) replication and assembly are tightly regulated in time and space within the cell, most likely due to protein interactions between virus and host. In order to better understand HCV biology and its pathogenesis, there is a need to unravel virus/host interaction network. We extended our knowledge of virus/host interactions by the identification of cellular proteins associated to HCV proteins using an immunoprecipitation (IP) technique coupled to mass spectrometry (MS), and further evaluate the role of retrieved interactors using gene knockdown. FLAG-tagged viral proteins Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A and NS5B have been expressed individually in 293T human cells, and immunoprecipitated protein complexes have been submitted to MS analysis for identification of host proteins. In this study, 98 proteins were significantly enriched and showed specific interaction to a viral protein. Retrieval of previously characterized interacting proteins proved the strength of the method. Six newly identified interactors by MS were individually confirmed using IP of viral proteins. We evaluated the role of identified interactors in HCV replication by performing a functional lentivirus-based RNA interference (RNAi) screen. Two reporter systems were used: the sub- genomic replicon (Huh7-Con1-Fluc) and a full length infectious clone (J6/JFH-1/p7Rluc2a), as well as the cellular toxicity assay Alamar blue. Of the identified host interactors, 28 proteins showed a significant effect on HCV replication upon gene knockdown and without cellular toxicity. Overall, the study led to the identification of novel virus/host interactions essential in HCV life cycle and provides novel potential drug targets.

Le facteur de transcription IIH (TFIIH) joue un rôle crucial dans la transcription et dans la réparation de l’ADN. La sous-unité Tfb1/p62 (levure et humain) de TFIIH interagit avec de nombreux facteurs de transcription (p53, NFκB, TFIIEα) et de réparation (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). La majorité des interactions avec Tfb1/p62 requiert le domaine d’homologie à la Pleckstrin (PH) localisé dans la région N-terminal de la protéine (2, 3). Ce domaine PH forme des complexes avec des domaines de transactivation acide provenant de protéines cibles impliquées dans la transcription et la réparation de l’ADN. De récentes études ont montré que Tfb1/p62 est une cible pour les protéines virales telles que la protéine VP16 du virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1, la protéine E1 du virus du papillome humain (VPH) et la protéine EBNA-2 du virus Epstein-Barr (EBV) (4, 5). Ces protéines virales interagissent avec la sous-unité Tfb1/p62 par un domaine de transactivation acide suggérant une interaction similaire à ce qui est observé chez les facteurs de transcription humains comme p53. Ce mémoire présente une caractérisation structurelle et fonctionnelle du complexe formé par la protéine virale EBNA2 et la protéine humaine Tfb1/p62. L’analyse est faite en utilisant le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et une expérience de transactivation chez la levure. Cette étude amène une plus grande compréhension des protéines impliquées dans les maladies comme le lymphome de Burkitt et le lymphome de Hodgkin qui sont souvent associées à l’infection à l’EBV (revue dans (6)) et caractérise une cible potentielle pour un antiviral. / The general transcription factor IIH (TFIIH) plays crucial roles in both transcription and DNA repair. Tfb1/p62 (yeast and human), one of the ten/eleven subunits of TFIIH, has been shown to interact with several important transcription (p53, NFκB, TFIIEα) and repair factors (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). Most of the interactions with Tfb1/p62 require the Pleckstrin homology (PH) domain located at the amino-terminal end of the protein (2, 3). This PH domain in particular forms complexes with highly acidic domains from target proteins involved in both transcriptional activation and DNA repair. Recent studies has shown that the Tfb1/p62 subunit of TFIIH is also targeted by a number of viral proteins including the Herpes Simplex virus (HSV) protein VP16, the Human papillomavirus (HPV) protein HPV E1 and the Epstein-Barr virus (EBV) protein EBNA-2 (4, 5). These viral proteins interact with the Tfb1/p62 subunit via acidic domain which suggests that they are forming similar interactions as the one observed with human transcription and repair factors. This thesis provides a structural and functional characterization of the complex formed by the viral proteins EBNA2 and the human protein Tfb1/p62 subunit of TFIIH. The analysis is done using isothermal titration calorimetry (ITC), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and a yeast activation assay. This study brings a greater understanding of proteins implicated in diseases such as the Burkitt’s lymphoma directly linked to an EBV infection (review in (6)) and shows a viable target for antiviral drug.

Les cellules endothéliales (EC) constituent une première barrière physique à la dissémination de virus pléiotropiques circulant par voie hématogène mais leur contribution à la défense innée anti-virale est peu connue. Des dysfonctions des EC de la barrière hémato-encéphalique (BMEC) et des sinusoïdes hépatiques (LSEC) ont été rapportées dans des neuropathologies et des hépatites aiguës ou chroniques d’origine virale, suggérant que des atteintes à leur intégrité contribuent à la pathogenèse. Les sérotypes de coronavirus de l’hépatite murine (MHV), se différenciant par leur capacité à induire des hépatites et des maladies neurologiques de sévérité variable et/ou leur tropisme pour les EC, représentent des modèles viraux privilégiés pour déterminer les conséquences de l’infection des EC sur la pathogenèse virale. Lors d’infection par voie hématogène, le sérotype MHV3, le plus virulent des MHV, induit une hépatite fulminante, caractérisée par une réponse inflammatoire sévère, et des lésions neurologiques secondaires alors que le sérotype moins virulent, MHV-A59, induit une hépatite modérée sans atteintes secondaires du système nerveux central (SNC). Par ailleurs, le sérotype MHV3, à la différence du MHV-A59, démontre une capacité à stimuler la production de cytokines par la voie TLR2. Les variants atténués du MHV3, les virus 51.6-MHV3 et YAC-MHV3, sont caractérisés par un faible tropisme pour les LSEC et induisent respectivement une hépatite modérée et subclinique. Compte tenu de l’importance des LSEC dans le maintien de la tolérance hépatique et de l’élimination des pathogènes circulants, il a été postulé que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire lors d’infections par les MHV est associée à la réplication virale et à l’altération des propriétés tolérogéniques et vasculaires des LSEC. Les désordres inflammatoires hépatiques pourraient résulter d’une activation différentielle du TLR2, plutôt que des autres TLR et des hélicases, selon les sérotypes. D’autre part, compte tenu du rôle des BMEC dans la prévention des infections du SNC, il a été postulé que l’invasion cérébrale secondaire par les coronavirus est reliée à l’infection des BMEC et le bris subséquent de la barrière hémato-encéphalique (BHE). À l’aide d’infections in vivo et in vitro par les différents sérotypes MHV, chez des souris ou des cultures de BMEC et de LSEC, nous avons démontré, d’une part, que l’infection in vitro des LSEC par le sétotype MHV3, à la différence des variants 51.6- et YAC-MHV3, altérait la production du facteur vasodilatant NO et renversait leur phénotype tolérogénique en favorisant la production de cytokines et de chimiokines inflammatoires. Ces dysfonctions se traduisaient in vivo par une réponse inflammatoire incontrôlée et une dérégulation du recrutement intrahépatique de leucocytes, favorisant la réplication virale et les dommages hépatiques. Nous avons aussi démontré, à l’aide de souris TLR2 KO et de LSEC dont l’expression du TLR2 a été abrogée par des siRNA, que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire induite par le sérotype MHV3, dépendait en partie de l’induction et de l’activation préférentielle du TLR2 par le virus dans le foie. D’autre part, la sévérité de la réplication virale au foie et des désordres dans le recrutement leucocytaire intrahépatique induits par le MHV3, et non par le MHV-A59 et le 51.6-MHV3, corrélaient avec une invasion virale subséquente du SNC, au niveau de la BHE. Nous avons démontré que l’invasion cérébrale du MHV3 était associée à une infection productive des BMEC et l’altération subséquente des protéines de jonctions serrées occludine, VE-cadhérine et ZO-1 se traduisant par une augmentation de la perméabilité de la BHE et l’entrée consécutive du virus dans le cerveau. Dans l’ensemble, les résultats de cette étude mettent en lumière l’importance du maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des LSEC et des BMEC lors d’infections virales aigües par des MHV afin de limiter les dommages hépatiques associés à l’induction d’une réponse inflammatoire exagérée et de prévenir le passage des virus au cerveau suite à une dissémination par voie hématogène. Ils révèlent en outre un nouveau rôle aggravant pour le TLR2 dans l’évolution de l’hépatite virale aigüe ouvrant la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques visant à moduler l’activité inflammatoire du TLR2. / Endothelial cells (EC) act as a physical barrier against invasion by pleiotropic blood borne viruses but their contribution in innate antiviral defense is poorly known. Dysfunctions in blood-brain barrier EC (BMECs) and liver sinusoidal EC (LSECs) have been reported in viral neuropathologies and hepatitis, suggesting that loss of ECs integrity may contribute to the pathogenesis. Mouse hepatitis coronaviruses (MHV), differing in their ability to induce severe to subclinical hepatitis and neurological diseases and / or their tropism for ECs, are relevant viral models to study the consequences of EC infection in viral pathogenesis. Following hematogenous infection, the MHV3 serotype, the most virulent MHV, induces fulminant hepatitis, characterized by severe inflammatory response, followed by neurological damage whereas the less virulent MHV-A59 serotype induces milder hepatitis but does not invade the central nervous system (CNS). In addition, MHV3, in contrast to MHV-A59, shows ability to induce TLR2-dependent cytokine response. The attenuated MHV3 variants, 51.6-MHV3 and YAC-MHV3, are characterized by a weak tropism for LSECs and induce moderated and subclinical hepatitis respectively. Given the importance of LSECs in hepatic tolerance and the elimination of circulating pathogens, it has been postulated that the severity of hepatitis and inflammatory response induced by MHVs correlates with infection and alterations in vascular and tolerogenic properties of LSECs. Hepatic inflammatory disorders may result from differential activation of TLR2, rather than other TLRs and helicases, according to serotypes. Moreover, given the role of BMECs in preventing CNS infections, it has been postulated that secondary cerebral invasion by coronaviruses is related to infection of BMECs and subsequent breakdown of the blood-brain barrier (BBB). Through in vitro and in vivo infections of isolated BMECs, LSECs or mice with the different MHVs, we demonstrated, first, that in vitro productive infection of LSECs by the highly virulent MHV3 serotype, in contrast to 51.6- et YAC-MHV3 variants, altered their production of vasoactive factors and overthrew their intrinsic tolerogenic properties by promoting inflammatory cytokines and chemokines production. These disturbances were reflected in vivo by an uncontrolled inflammatory response and a deregulation of intrahepatic leukocyte recruitment, favoring viral replication and liver damages. We demonstrated, using TLR2 KO mice and LSECs treated with siRNA for TLR2 that the abnormal inflammatory response induced by MHV3 depended in part on preferential induction and activation of TLR2 by the virus on the surface of hepatic cells. Moreover, the severity of the primary viral replication in the liver and disorders in intrahepatic leucocyte recruitment induced by MHV3, but not by MHV-A59 and 51.6-MHV3, correlated with a subsequent brain invasion at the BBB level. Such invasion was related to productive infection of BMECs and subsequent IFN--dependent disruption of tight junction proteins occludin, VE-cadherin and ZO-1, resulting in an increase of BBB permeability and further viral entry into the CNS. Overall, the results of this study highlight the importance of structural and functional integrity of LSECs and BMECs during acute viral infections by MHVs to limit liver damages associated with viral-induced exacerbation of inflammatory response and prevent brain invasion by MHVs following viral spread through the bloodstream. They also reveal a new worsening role for TLR2 in the evolution of acute viral hepatitis paving the way for new therapies targeting TLR2-induced inflammatory activity.