Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-07-21T17:14:40Z No. of bitstreams: 1 AmandaLarissaMarquesDeMedeiros_TESE.pdf: 2401701 bytes, checksum: 6c9f1744f688fa158feed1ba0fad56b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-07-22T11:33:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AmandaLarissaMarquesDeMedeiros_TESE.pdf: 2401701 bytes, checksum: 6c9f1744f688fa158feed1ba0fad56b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-22T11:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AmandaLarissaMarquesDeMedeiros_TESE.pdf: 2401701 bytes, checksum: 6c9f1744f688fa158feed1ba0fad56b1 (MD5) Previous issue date: 2015-10-16 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A cana-de-a??car ? uma importante cultura para nosso pa?s, que contribui com quase metade de toda a produtividade mundial. Muitos desafios s?o enfrentados pelas plantas, que muitas vezes n?o atingem todo o seu potencial gen?tico devido a presen?a de estresses bi?ticos e abi?ticos. Como consequ?ncia, esses estresses podem gerar esp?cies reativas de oxig?nio, que podem danificar o material gen?tico. Outra consequ?ncia do estresse ? a flora??o precoce, que diminui tamb?m a produtividade da cana-de-a??car. Neste contexto, este trabalho apresenta como objetivos caracterizar os genes scMUTM1 e scMUTM2, duas DNA glicosilases pertencentes ? via de reparo por excis?o de base (BER), al?m de identificar transcritos potencialmente relacionados com estresse e reparo de DNA, em duas variedades com fen?tipo contrastante para flora??o. A caracteriza??o das glicosilases incluiu a constru??o de cassetes de express?o de prote?nas, para posterior purifica??o e uso em ensaios enzim?ticos; constru??o de ?rvore filogen?tica e an?lise de promotor deste gene. Com a reconstru??o filogen?tica de MUTM foi poss?vel observar que h? o agrupamento desta sequ?ncia em um ramo com monocotiled?neas e outro com dicotiled?neas. Isto sugere que a duplica??o desta sequ?ncia pode ter ocorrido depois da diverg?ncia desses dois grupos. Com a an?lise do promotor deste gene, ? sugerido que, provavelmente, o gene ScMUTM1 pode estar sofrendo subfuncionaliza??o, uma vez que a regi?o promotora do gene ScMUTM2 apresenta uma maior quantidade de sequ?ncias regulat?rias relacionadas ao estresse. Por meio das an?lises de express?o g?nica utilizando microarranjos, se observou a superexpress?o de genes relacionados ao estresse de forma marcante em uma das condi??es de an?lise relacionadas com flora??o precoce. / Sugarcane is an important culture for Brazil that holds almost half of all worldwide productivity. Plants face many challenges, because of biotic and abiotic stresses presents in the production field, which could prevent plants from reaching their genetic potential. As consequence, those stresses can generate Reactive Oxygen Species ? ROS ? that can cause damages on DNA. Another consequence of stress is the early-flowering process, which contributes for a reduction on yield. In this context, the aim of this work is to characterize ScMUTM1 and ScMUTM2, two DNA glycosylases belonging to base excision repair pathway; and identify genes potentially related to stress and DNA repair in two sugarcane cultivars with contrasting flowering phenotypes. The characterization of the DNA glycosylases included the construction of vector to over express the recombinant proteins ScMUTM1 and ScMUTM2; they will be used in a near future to purification of these proteins and use in enzymatic assays. It was also made a phylogenetic reconstruction of this gene in plants and analysis of its promoter. With the phylogenetic analysis, it is possible to observe the presence of these genes grouped inside a branch with monocots and another one with dicots. This suggests that the duplication of this gene probably occurred after the separation of these two groups. The analysis of the promotor of MUTM shows of the presence of stress-related regulatory motifs at ScMUTM2 promoter, when compared with ScMUTM1. This may suggests that ScMUTM1 might be suffering sub functionalization process. After the analysis of microarrays data, it is observed an up-regulation from some stress-related genes in one of the conditions analyzed, related to early flowering process.

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, deve lidar com diversas condições do ambiente e depende dos hospedeiros para suprir suas necessidades nutricionais. Uma delas é a necessidade de captar a molécula de heme (Fe-protoporfirina IX) que será utilizada como fator de crescimento. Os mecanismos envolvendo o metabolismo de heme são cruciais para a sobrevivência do T. cruzi pois o parasito não possui várias enzimas de biossíntese dessa porfirina e o heme livre pode apresentar citotoxicidade para célula. Na tentativa de perseguir o destino final do heme no parasito, nós estudamos essa via inexplorada no T. cruzi. Nessa tese, nós demonstramos que epimastigotas cultivados com heme, produziram os compostos, α-meso hidroxiheme, verdoheme e biliverdina (identificados por HPLC acoplado á espectrofotômetria). Além disso, nós observamos através de análise dos extratos de epimastigotas no espectrômetro de massas (LQT Orbitrap), espécies iônicas de m/z 583,4 e m/z 619,3. A fragmentação subsequente desses íons originaram espécies filhas típicas das moléculas de biliverdina e verdoheme, respectivamente. Nós observamos também, espécies iônicas de m/z 1397,4 e m/z 1135,4. A fragmentação dessas espécies produziram íons, sendo um deles com a mesma massa molecular de heme (m/z 616,3). Essa espécie iônica por sua vez, gerou fragmentos iônicos idênticos a uma molécula de heme, confirmando que esses intermediários são produtos da modificação da porfirina. Baseado nesses resultados, nós propomos um modelo onde o catabolismo de heme em T. cruzi, envolveria a conjugação da bis(glutationil)spermina, um derivado da tripanotiona presente em tripanossomatídeos, à porfirina (m/z 1137,4), seguido da remoção de dois resíduos de ácidos glutâmicos (m/z 1135,4). Embora o significado bioquímico e fisiológico da adição desse resíduo tiol na molécula de heme ainda é pouco compreendido, alguns trabalhos demonstram a abilidade desses compostos em ligar na porfirina, sem contar também, que esse heme conjugado poderia resultar em uma forma efetiva de prevenção de danos à membrana e a célula ocasionados pelo acúmulo de heme livre. Em conjunto, esses resultados fornecem novas abordagens do metabolismo de heme em T. cruzi, revelando possíveis alvos de intervenção quimioterápica futuros. Nossa proposta está direcionada para uma via ativa de catabolismo de heme que inclui a adição de grupos tiol (derivado da tripanotiona) à heme e a clivagem do anel porfirínico originando a molécula de biliverdina. / Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a complex life cycle and they must cope with diverse environmental conditions and depends on hosts for its nutritional needs. One of the nutritional characteristic is that they need a heme compound (Fe-protoporphyrin IX) as a growth factor. The mechanisms involved in these processes are crucial for their survival mainly because of trypanosomatids lack of the complete heme biosynthetic pathway and the cytotoxic activity of free heme. Following the fate of this porphyrin in the parasite we studied this missing pathway in T. cruzi. Here, we show that epimastigotes cultivated with heme yielded the compounds, α-meso hydroxyheme, verdoheme and biliverdin (as determined by HPLC with diode array detector). Furthermore, we observed ion species of m/z 583.4 and m/z 619.3 from epimastigotes extracts detected by direct infusion on LQT Orbitrap platform. A tipical biliverdin and verdoheme doughter-ion species were generated by m/z 583.4 and m/z 619.3 fragmentations, respectively. We also observed an ion species at m/z 1397.4 and m/z 1135. The subsequent fragmentation of this species produced a daughter-ions whose one with the same molecular mass as heme (m/z 616.4). This species, in turn, generated daughter species identical to an authentic heme, confirming that these intermediates were modified heme products. Based on these findings, we propose that heme catabolism in T. cruzi involves a additions of Bis(glutathionyl)spermine, a low molecular mass thiols occurring in trypanosomatids, to heme (m/z 1397.4), followed by removal of the glutamic residues (m/z 1135). Although the biochemical and physiological significance of the addition of thiol residues to heme molecule is underexplored, some works, already demonstrated their ability to bind heme and also this modified heme may resulting in the effective prevention of membrane damage and cytotoxicity by the heme accumulation. Taken together, these results offer new insights into heme metabolism in T. cruzi, revealing potential future therapeutic targets. We propose an active heme catabolism pathway that includes a trypanotione derivate additions and cleavage of the heme porphyring ring to biliverdin.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de β- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a β-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a β-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese. / Trypanosoma cruzi epimastigotes proliferate and differentiate inside different compartments of the triatomines gut. These environments are antagonic in terms of nutrient content, pH and redox status. All these factors represent a challenge to the protozoan due to the presence of molecules and factors which are able to induce different signals to the parasite. Thus, we tested the influence of abundant metabolism products of the vector, with distinct redox status, in the proliferation and metacyclogenesis in vitro and in vivo. These molecules are heme and hemozoin, both byproducts of hemoglobin digestion, and urate, present in the urine of insects. Heme is a ubiquitous molecule present in all living organisms. Our group studied its role in T. cruzi growth in vitro, showing that this signal is governed by the redox-sensitive enzyme CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Indeed, it seems to rely on a redox signaling pathway in which heme, but not its analogs, induces ROS formation, thus modulating CaMKII activity (Nogueira et al., 2011). Although it induces ROS in epimastigotes, the heme molecule had no deleterious effect upon the parasites ultrastructure, suggesting an adaptation to oxidative environments. In addition, FCCP inhibited mitochondrial ROS formation, then decreasing the parasite proliferation. On the other hand, AA drastically increased mitochondrial ROS production leading to cell death. These results corroborate the hypothesis of redox regulation of epimastigotes proliferation. Hemozoin (β- hematin) formation is an elegant strategy to minimize the toxic effect of heme in hematophagous insects. However, β-hematin had no influence upon the proliferation or metacyclogenesis in vitro. Also, urate, GSH and NAC impaired epimastigote proliferation. These effects were partially reversed when the antioxidants were incubated along with heme. During metacyclogenesis in vitro, NAC and urate induced a significant increment of trypomastigotes and decreased the percentage of epimastigotes. Heme and β-hematin presented the opposite effect diminishing the percentage of trypomastigotes and increasing the percentage of epimastigotes. To confirm the influence of the redox status in the parasite biology in vivo, we quantified the parasite loads in the anterior and posterior midguts and in the rectum of the triatomine vector fed with or without NAC and urate by qPCR. The treatment with the antioxidants increased the parasite loads in all midgut sections analyzed. Afterwards, in order to distinguish the evolutive forms responsible for the increment of parasite loads, we performed differential counting of the midgut sections. Five days post infection we observed an increment of trypomastigotes and a decrease of epimastigote forms in vivo. Taken together, these data suggests that, as well as nutrient content and pH, the redox status may also influence T. cruzi biology in the vector. In this scenario, oxidants act to turn on proliferation and in contrast, antioxidants seem to switch the cycle towards metacyclogenesis.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases. / NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species (ROS) have emerged as critical mediators of several cell functions as diverse as migration, growth, proliferation and survival. Recent evidence has show that NAD(P)H oxidase activity is essential to melanoma proliferation and survival. We reported that NAD(P)H oxidase inhibitor diphenyleneiodonium (DPI) inhibited melanoma growth. NAD(P)H oxidase inhibition induced changes in cell shape with cell spreading decrease, rounding up and detachment. These phenomena were accompanied by rearrangement of actin network and a decrease in both focal adhesion (FAK) phosphorylation in Tyr397 residue and in FAK association to actin and c-Src, indicating that inhibition of ROS generation would down- modulate integrin-mediated signaling, what often results in a particular type of apoptotic cell death, known as anoikis. We observed that NAD(P)H oxidase inhibitor induced apoptosis in melanoma cells with activation of caspase-3. We results show that the effects promoted by NAD(P)H oxidase inhibition on melanoma growth were completely abolished by the pre-treatment of MV3 cells with the protein tyrosine phosphatases inhibitor sodium orthovanadate. In conclusion, our results strongly suggest that ROS generated by NAD(P)H oxidase complex transmit cell survival signals in melanoma cells through the FAK-Src pathway, probably inhibiting protein tyrosine phosphatases.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JairMS.pdf: 604378 bytes, checksum: 8f3220e89d5c178954aadb5186b98f52 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Hybrids among transgenic plants and related species are expected to occur if they are sympatric and when there are not crossing barriers; as is the case, in Brazil, of cry1Ac transgenic cotton and Gossypium barbadense. This species has been maintained as dooryard plants, and should be preserved as a genetic resource. Hybrids were evaluated about traits related to fitness, leading to infer about its chances of survivor and selection. A barbadense genotype collected at the state of Mato Grosso was outcrossed to the variety DP 404, containing the gene cry1Ac, and to the isoline DP 404. All the F1 individuals and 122 among 170 F2 individuals expressed the toxin, and presented levels of resistance to pink bollworm (Pectinophora gossypiella) and cotton leafworm (Alabama argillacea) equivalent to the transgenic parent and superior to the isoline, barbadense or non transgenic hybrids. The percentage of germination and number of days to germinate did not differ among genotypes. Anthesis of the first flower and opening of the first cotton boll occurred earlier for herbaceous cotton and F1 hybrids than F2 population in average; all the populations presented a number of days to flower and opening of the first boll smaller then barbadense. The highest plants were barbadenses, and herbaceus the smallest, with F1 and F2 populations presenting intermediary heights. The number of seeds per plants were superior for F1 hybrids an herbaceous cotton, F2 populations were in average intermediary; the barbadense genotype produced the smallest number of seeds per plant. Pink bollworm, mainly, and also cotton leafworm, are important barbadense pests, so the transgene positive effect could favor the selection of hybrids, and hence G. hirsutum genome, against the maintenance of pure G. barbadense genome. The selection may be influenced by the plant uses: the smaller size of hybrids when compared to the barbadense may lead them to be differentiated from these parents to which medicinal properties are attributed; on the other hand, the greater boll production may favor hybrids maintenance with the purpose of producing lamp wicks, or use as an ornamental or swab / Espera-se que hibrida??es entre plantas transg?nicas e esp?cies pr?ximas ocorram sempre que haja simpatria e n?o existam barreiras de cruzamento, como ? o caso, no Brasil, do algodoeiro contendo o gene cry1Ac e a esp?cie Gossypium barbadense. Os barbadenses v?m sendo mantidos em quintais, e ? importante sua preserva??o como recurso gen?tico. H?bridos foram avaliados para caracteres relacionados com a adaptabilidade, inferindo sobre suas chances de sobreviv?ncia e sele??o. Para isto, obtiveram-se plantas F1 e F2 do cruzamento entre um algodoeiro barbadense coletado no estado de Mato Grosso com as cultivares DP404, contendo cry1Ac, e de sua isolinha DP4049. Todos os 37 indiv?duos F1 e 122 dentre 170 indiv?duos F2 avaliados expressaram cry1Ac, e apresentaram n?veis de resist?ncia ?s lagartas rosada (Pectinophora gossypiella) e curuquer?-doalgodoeiro (Alabama argillacea) equivalentes ao parental transg?nicos e superiores a isolinha, barbadense e h?bridos que n?o continham o transgene. N?o foram observadas diferen?as significativas para a porcentagem de germina??o ou quantidade de dias para germina??o. O florescimento e abertura do primeiro capulho ocorreram mais cedo nos algodoeiros herb?ceos e nos h?bridos que nas popula??es F2 em m?dia; todas as popula??es apresentaram um n?mero de dias para o florescimento e abertura do primeiro capulho significativamente mais baixo que os barbadenses. As plantas mais altas na matura??o eram os barbadenses, e os herb?ceos as mais baixas, sendo as popula??es F1 e F2 intermedi?rias. O n?mero de sementes por planta foi superior nos h?bridos F1 e algodoeiros herb?ceos, sendo as popula??es F2 intermedi?rias em m?dia, e os barbadenses aqueles que produziram menor n?mero de sementes. A lagarta rosada, principalmente, e tamb?m a curuquer?-do-algodoeiro s?o importantes pragas de G. barbadense, portanto o efeito positivo do transgene pode favorecer a sele??o de h?bridos contendo o transgene, e deste modo favorecer plantas que cont?m genoma de G. hirsutum, em detrimento da pureza do genoma de barbadense. A sele??o deve ser influenciada pelos usos da planta: o fato de os h?bridos serem mais baixos pode diferenci?-los dos pais barbadenses aos quais a propriedades medicinais s?o atribuidas; por outro lado, a produ??o bem maior de capulhos pode favorecer a manuten??o dos h?bridos quando se visa confec??o de pavios ou ornamenta??o de quintais e jardins

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarolinaCSO.pdf: 673645 bytes, checksum: 65edb3dd5d260d66ee98b34da41f4185 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / Gluconacetobacter diazotrophicus ? uma alfa-proteobact?ria Gram-negativa, tolerante a meios ?cidos, fixadora de nitrog?nio atmosf?rico e foi a primeira bact?ria diazotr?fica endof?tica isolada da cana-de-a??car. Por sua vez, Gluconobacter oxydans, tamb?m alfa-proteobact?ria Gram-negativa, possui a capacidade de oxidar incompletamente alco?is e carboidratos. Ambas de interesse biotecnol?gico e industrial, essas bact?rias tiveram seus genomas seq?enciados completamente em 2007. Desta forma, foi de interesse desse trabalho analisar e comparar os genes de reparo do DNA devido sua import?ncia na manuten??o da integridade gen?mica. Sendo assim, as vias de reparo presentes nos dois organismos foram identificadas, utilizando como base uma terceira alfa-proteobact?ria, a Caulobacter crescentus, cujos genes de reparo foram descritos por um trabalho anterior e tamb?m os genes bem estabelecidos para o reparo do DNA em Escherichia coli. Para esse estudo, um banco de dados contendo ort?logos para os genes de reparo de DNA encontrados nos organismos foi criado e an?lises comparativas por similaridade usando o pacote Blast e o software Clustal foram feitas. Este estudo demonstrou que as principais vias de reparo ao DNA reparos por excis?o, reparo direto, reparo recombinacional e reparo pelo sistema SOS est?o presentes nos organismos analisados, demonstrando, na maioria das vezes, boa similaridade com E. coli. Interessantemente, foram encontradas duplica??es g?nicas nos quais uma das c?pias estava presente no cromossomo e a outra, no plasm?deo, como no caso de UvrD, DnaE e Ssb, possivelmente caracterizando eventos de transfer?ncia lateral. Por fim, uma grande novidade foi a identifica??o de ort?logos para RecB em G. diazotrophicus e G. oxydans e de ort?logos duplicados de RecD em G. diazotrophicus. At? o momento, n?o havia sido relatada a presen?a de membros da via de inicia??o RecBCD do reparo recombinacional em alfaproteobact?rias

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-02-21T21:54:36Z No. of bitstreams: 1 GabrielleMacedoPereira_TESE.pdf: 7916343 bytes, checksum: 47f4f16d292c186e81c42187080b1343 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-02-23T21:04:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 GabrielleMacedoPereira_TESE.pdf: 7916343 bytes, checksum: 47f4f16d292c186e81c42187080b1343 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-23T21:04:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GabrielleMacedoPereira_TESE.pdf: 7916343 bytes, checksum: 47f4f16d292c186e81c42187080b1343 (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / O bioma Caatinga ? exclusivamente brasileiro, marcado pelo clima semi?rido. Este bioma se destaca pelo alto ?ndice de endemismo e desconhecimento cient?fico ao seu respeito. Para sobreviver neste ambiente, as plantas desenvolveram mecanismos intr?nsecos de percep??o dos sinais ambientais externos e suas respectivas respostas metab?licas. Dentre as esp?cies de ocorr?ncia no bioma Caatinga, como fonte de alcaloides bioativos, destaca-se Erythroxylum pungens, que apresenta potencial pouco explorado. Assim, o objetivo deste trabalho ? investigar o proteoma total e o perfil metab?lico de E. pungens, aliado ? bioprospec??o de alcaloides trop?nicos com potencial citot?xico. Para isso, no cap?tulo 1 identificou-se, por espectrometria de massas, sete alcaloides trop?nicos conhecidos; 3-(2-metilbutiriloxi)tropan-6, 7-diol como tamb?m 3-(2-metilbutiriloxi)nortropan-6, 7-diol foram isolados e caracterizado por RMN 1D e 2D pela primeira vez. N,N-Dimetil-1-H-indol-3-etanamina foi isolado e caracterizado a partir de ra?zes de E. pungens. Al?m disso, verificou-se que alcaloides isolados de E. pungens, frente a cinco linhagens celulares, apontaram potencial seletivo de 3-(2-metilbutiriloxi)tropan-6, 7-diol contra c?lulas de tumorais de pr?stata. Para melhor conhecer a esp?cie e, com vistas na produ??o de alcaloides trop?nicos, trabalhou-se o proteoma e perfil alcalo?dico no cap?tulo 2. Dessa forma foi poss?vel identificar 1746 prote?nas nas folhas, 1779 no caule e 1026 na raiz de E. pungens. Atrav?s da recupera??o dos termos no Gene Ontology, observou-se os processos nos quais estas prote?nas est?o envolvidas, verificando o mesmo perfil de processos para os tr?s ?rg?os de E. pungens, com destaque para respostas a estresses bi?ticos, abi?ticos, qu?micos, al?m das respostas ao estresse oxidativo. Foram observados n?veis significativos de prote?nas envolvidas na fotoss?ntese das folhas de E. pungens, fotorrespira??o, al?m prote?nas relacionadas ?s respostas ao estresse: prote?nas da fam?lia 14-3-3, peroxidases, catalases, super?xido-dismutase e prote?nas de choque t?rmico, que tamb?m podem atuar no turnover prote?co. Ainda foram identificadas cinco prote?nas hom?logas a tropinona redutase na folha, e produ??o de alcaloide em todos os ?rg?os. No cap?tulo 3, por meio do experimento com esp?cimes de E. pungens submetidas a estresse h?drico por suspens?o de rega em casa de vegeta??o, notou-se que esta esp?cie investe no aumento de prote?nas relacionadas ?s respostas ao estresse h?drico, aumenta significativamente o teor de prolina livre no citosol. Ademais, mat?m a produ??o de alcaloides que parecem estar mais relacionado a fase de desenvolvimento da planta. Com isso, os resultados deste trabalho busca contribuir para a fitoqu?mica e fisiologia de E. pungens, assim como promove o uso racional da esp?cie, e consequentemente a conserva??o do bioma Caatinga. / Caatinga biome is exclusive brazilian, marked by semi-arid climate. This biome stands out for the high endemism index and scientific unfamiliarity.To survive in this environment with peculiar edaphoclimatic conditions, plants show evolution of intrinsic mechanisms of external environmental signals perception and their respectives metabolic responses. Among the occurrence genera in Caatinga biome, as bioactive alkaloids source, the Erythroxylum pungens species, which has unexplored potential, is outstanding. Thus, the objective of this work is to investigate total proteome and metabolic fingerprint of E. pungens, together with tropane alkaloids bioprospection with cytotoxic potential. For this, in chapter 1 it was possible to identify, by mass spectrometry, seven known tropane alkaloids; 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol as well as 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol were isolated and characterized by 1D and 2D NMR for the first time. N,N-Dimethyl-1-H-indol-3-ethanamine was isolated and characterized from roots of E. punctures. In addition, it was found that alkaloids isolated from E. pungens, against five cell lines, indicated selective potential of 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol against prostate tumor cells. In chapter 2, it was possible to identify 1746 proteins in the leaves, 1779 in the stem and 1026 in the root of E. pungens. Through the recovery of the GO terms, it was possible to evaluate processes in which these proteins are involved, verifying the same process profile for three organs of E. pungens, with emphasis on biotic, abiotic, chemical stress responses, as well as responses to oxidative stress. Were observed significant proteins levels involved in photosynthesis of E. pungens leaves, photorespiration, as well as many proteins related to stress responses: proteins from 14-3-3 family, peroxidases, catalases, superoxide dismutase and shock proteins, which can also act on protein turnover. Were still identificated five proteins homologous to tropinone reductase, and alkaloid production in all organs suggesting that even under chronic stress conditions, E. pungens maintains the production of these metabolites. In chapter 3, through specimens submission experiment of E. pungens to water stress by irrigation suspension in greenhouse, it was observed that this species invest in the increase of proteins related to the responses to water stress, it significantly increases free proline content in cytosol which functions as an important osmoprotector. Furthermore, maintains alkaloids production that appear to be more related to development stage of the plant than stress condition in which it is inserted. The results of this work seek to contribute to knowledge of E. pungens phytochemistry and physiology, as well as to promote the species and consequently conservation of Caatinga biome.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-03-21T11:48:14Z No. of bitstreams: 1 JonathasDiegoLimaSantos_TESE.pdf: 8935214 bytes, checksum: 86433d89608ea11b99ac2a3911f14149 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-03-23T11:23:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 JonathasDiegoLimaSantos_TESE.pdf: 8935214 bytes, checksum: 86433d89608ea11b99ac2a3911f14149 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-23T11:23:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JonathasDiegoLimaSantos_TESE.pdf: 8935214 bytes, checksum: 86433d89608ea11b99ac2a3911f14149 (MD5) Previous issue date: 2017-12-15 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Chromobcterium violaceum (C. violaceum) ? uma bact?ria Gram-negativa, encontrada em regi?es tropicais e subtropicais, considerada organismo modelo de vida livre. Alguns estudos prote?micos realizados com esta bact?ria demonstraram sua capacidade de adapta??o a desafios ambientais, como alta concentra??o de ferro e exposi??o ao estresse oxidativo. No entanto, nenhum estudo foi feito com esta esp?cie submetida ? microgravidade simulada (MGS), ou seja, em condi??es em que a gravidade ? artificialmente reduzida para menos de 1xg. Estudos MGS podem ser importantes para entender as modula??es em n?vel molecular sofridas pelos organismos vivos. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta de C. violaceum, como organismo modelo de vida livre, cultivado em MGS, usando t?cnicas de prote?mica para entender como a bact?ria responde a esse estresse. A MGS foi conseguida por meio da rota??o do vessel ao redor do eixo horizontal perpendicular ao vetor gravitacional nos sistemas de cultura de c?lulas rotativas - Rotating Cell Culture Systems ? (RCCS4). MGS foi conduzido a uma velocidade de 40 rpm por um per?odo de 12 horas para obter a curva de crescimento a cada 2 horas. Prote?nas totais foram extra?das de amostras de cultura de c?lulas bacteriana coletada ?s 5 e 12 horas, correspondendo as fases exponenciais inicial (MG5) e tardia (MG12), respectivamente, tendo a curva de crescimento como refer?ncia. Ap?s a tripsiniza??o, as amostras foram analisadas em espectr?metro de massas Q-TOF. Como resultado um total de 212 prote?nas durante ?s 5h de crescimento e 192 ?s 12h foram detectadas, das quais 144 delas foram comuns em ambos os per?odos. No proteoma de C. violaceum obitido em 5h de crescimento 195 prote?nas foram identificadas em gravidade normal (GN5) e 155 prote?nas foram identificadas em MG5, sendo 18 upreguladas, 19 downreguladas e 17 expressas somente na condi??o de MG5. No proteoma obtido em 12h de crescimento, 165 prote?nas foram identificadas em gravidade normal (GN12) e 173 em MG12, das quais, 17 foram upreguladas, 22 downreguladas e 28 expressas somente na condi??o de MG12 Al?m disso, foi poss?vel identificar 25 prote?nas com fun??o desconhecida em MG5 e MG12. Utilizando ferramentas computacionais foi poss?vel construir redes de intera??es prote?na-prote?na (PPI) e as sub-redes contendo grupo de prote?nas com fun??es correlacionadas, analisar vias metab?licas, processos biol?gicos, contexto gen?mico e busca por dom?nios conservados e sequ?ncias hom?logas de prote?nas com fun??o desconhecida. Como resultado, identificamos sub-redes relacionadas com a bioss?ntese de prote?nas, regula??o da transcri??o e tradu??o, resposta ao estresse e metabolismo energ?tico, conclu?mos que as respostas celulares associadas ? express?o diferencial induzida pela MGS levaram ? diminui??o do crescimento de C. violaceum, acompanhado pela regula??o negativa de prote?nas relacionadas com processos transcricionais, traducionais e libera??o de energia por vias aer?bicas e pela regula??o positiva de prote?nas envolvidas no estresse oxidativo, na via anaer?bica e na sobreviv?ncia celular. / Chromobcterium violaceum (C.violaceum) is a Gram-negative bacteria, which has been found at tropical and subtropical regions, considered a free living model organism. Some proteomic studies performed with this bacterium have demonstrated its ability to adapt to environmental challenges such as high iron concentration and oxidative stress exposure. However, no study was made with this specie submitted to simulated microgravity (SMG), that is, under conditions in which the gravity is artificially reduced to less than 1xg. MGS studies may be important in understanding the molecular-level modulations undergone by living organisms. Therefore, the aim of this study was to characterize the response of C. violaceum, as free-living model organism, cultured at MGS, using proteomics techniques in order to understand how this bacterium response to this stress. The SMG was achieved by rotating the vessel around the horizontal axis perpendicular to the gravitational vector in Rotating Cell Culture Systems (RCCS4). SMG was conducted at a speed of 40 rpm for a period of 12 hours to obtain the growth curve every 2 hours. Total protein extraction was made in two times: 5 and 12 hours, corresponding to early (MG5) and late (MG12) exponential phase, respectively, taking the growth curve as a reference. After trypsinization, samples were analyzed with Q-TOF mass spectrometer. As a result a total of 212 proteins during 5h of growth and 192 at 12h were detected, of which 144 of them were common in both periods. We detected 155 proteins during MG5, from which 18 proteins were upregulated, 19 down-regulated and 17 proteins were exclusive when compared to GN5. In the proteome obtained in 12h of growth, 165 proteins were identified in normal gravity (GN12) and 173 in MG12, of which, 17 were upregulated, 22 were downregulated and 28 expressed only in MG12 condition. In addition, it was possible to identify 25 proteins with unknown function in MG5 and MG12. Using computational tools it was possible to construct networks of protein-protein interactions (PPI) and sub-networks containing group of proteins with correlated functions, to analyze metabolic pathways, biological processes, genomic context and search for conserved domains and homologous sequences of proteins with unknown function . As a result, we identified sub-networks related to protein biosynthesis, transcription regulation and translation, stress response and energetic metabolism, we conclude that the cellular responses associated with differential expression induced by MGS led to a decrease in the growth of C. violaceum, accompanied by the negative regulation of proteins related to transcriptional, translational and energy release by aerobic pathways and by the positive regulation of proteins involved in oxidative stress, anaerobic pathway and cell survival.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-04-02T15:02:41Z No. of bitstreams: 1 AdrianaMarinaESilvaParente_DISSERT.pdf: 1386035 bytes, checksum: 87910526a122893f94a9f3045c8c9c4f (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-04-05T13:08:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AdrianaMarinaESilvaParente_DISSERT.pdf: 1386035 bytes, checksum: 87910526a122893f94a9f3045c8c9c4f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T13:08:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianaMarinaESilvaParente_DISSERT.pdf: 1386035 bytes, checksum: 87910526a122893f94a9f3045c8c9c4f (MD5) Previous issue date: 2017-11-28 / Tityus stigmurus corresponde ? esp?cie de escorpi?o predominante na regi?o Nordeste do Brasil, sendo considerado um dos principais causadores de acidentes escorpi?nicos. Na pe?onha do T. stigmurus, que ? composta de uma mistura complexa de mol?culas de alta e baixa massa molecular, foi identificado e caracterizado um pept?deo antimicrobiano denominado Stigmurina (FFSLIPSLVGGLISAFK-NH2). Pept?deos antimicrobianos s?o pequenas mol?culas consideradas a primeira linha de defesa contra micro-organismos, apresentando amplo espectro de a??o antimicrobiana. A literatura reporta tamb?m a atividade desses pept?deos contra c?lulas cancer?genas. Sequ?ncias nativas de pept?deos bioativos como prot?tipo para a obten??o de novas mol?culas t?m sido utilizadas com o intuito de potencializar a sua atividade e reduzir a toxicidade. Nesse contexto, realizou-se a caracteriza??o estrutural in silico e por dicro?smo circular, bem como a avalia??o da atividade antimicrobiana, antiparasit?ria, antiproliferativa e hemol?tica de dois pept?deos an?logos obtidos ? partir da Stigmurina, denominados StigA3 e StigA4. A an?lise da conforma??o tridimensional in silico do StigA3 e StigA4 demonstrou uma estrutura helicoidal, sendo este resultado confirmado por dicro?smo circular. O aumento da carga superficial e do momento hidrof?bico de ambos os pept?deos an?logos quando comparado com a Stigmurina resultaram na potencializa??o da atividade antimicrobiana e antiparasit?ria. Os pept?deos StigA3 e StigA4 apresentaram a??o antiproliferativa semelhante ao pept?deo nativo, com exce??o para a c?lula normal, para qual os pept?deos an?logos se mostraram menos t?xicos. Portanto, estes resultados indicam uma potencial aplica??o terap?utica destes pept?deos an?logos, demonstrando a efici?ncia do desenho racional de f?rmacos para a obten??o de novos agentes antiproliferativos e anti-infecciosos. / Tityus stigmurus it?s the predominant scorpion specie in Northeast region from Brazil, it?s considered one of the main cause of scorpion accidents in this region. In T. stigmurus venom, which is a complex mixture of high and low molecular mass molecules, was identified an antimicrobial peptide denominated Stigmurin. Antimicrobial peptides are small molecules considered the first line of defense against microorganisms, they show broad spectrum action. Many authors have proved that these peptides can also be effective on cancerous cells. Mutation in these molecules sequence has been held aiming the increase in the activity maintaining its low toxicity. Therefore, it is proposed the characterization of the structure in silico and by circular dichroism, as well the antimicrobial, antiparasitic, anti-proliferative and hemolytic activities of two analog peptides from Stigmurin, denominated StigA3 and StigA4. We performed an in silico analysis for these peptides, where we were able to observe ?-helix structure, which was confirmed by circular dichroism. We were also able to find that the analog peptides net charge and hydrophobic moment were higher than Sitgmurin?s, which can explain the increase in antimicrobial and antiparasitic activity. The peptides StigA3 e StigA4 showed activity on cancerous cells similiar to the native peptide, except when tested on a normal cell we were able to find that they?re less toxic. Therefore, these results indicate a potential biotechnological application for the analogs peptides, even as prototype to new therapeutic agents.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-04-02T15:02:43Z No. of bitstreams: 1 GustavoHenriqueOliveiraCavalcante_DISSERT.pdf: 14332647 bytes, checksum: 07f54cbd966599c411e90b07dbb86ba8 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-04-05T13:57:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 GustavoHenriqueOliveiraCavalcante_DISSERT.pdf: 14332647 bytes, checksum: 07f54cbd966599c411e90b07dbb86ba8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T13:57:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GustavoHenriqueOliveiraCavalcante_DISSERT.pdf: 14332647 bytes, checksum: 07f54cbd966599c411e90b07dbb86ba8 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / O papilomav?rus humano (HPV) ? um pequeno v?rus de DNA de dupla fita circular, caracterizado como um dos mais comuns agentes sexualmente transmiss?veis no mundo, cuja detec??o e genotipagem acuradas s? s?o poss?veis por meio de t?cnicas de biologia molecular. Diferentes propriedades biol?gicas t?m sido reportadas dentre os mais de 170 tipos j? caracterizados, de maneira que um grupo particular de HPVs est? fortemente relacionado a infec??es persistentes, les?es intraepiteliais de diferentes graus e progress?o para c?nceres tais como cervical, anal, vulvar, vaginal, orofar?ngeo e de p?nis. No presente trabalho foram realizadas an?lises de variabilidade gen?tica e evolu??o molecular nos genomas dos principais HPVs de import?ncia cl?nica. Reconstru??es filogen?ticas e an?lises dos perfis de assinatura gen?tica nos genomas de cada gen?tipo sugeriram a presen?a de subgrupos de HPVs definidos por diferen?as nas sequ?ncias dos genes E1, E6, L1 e L2. Testes de evolu??o em n?vel de DNA revelaram uma atua??o mais forte da sele??o natural em c?dons espec?ficos, mais frequentemente nos genes E1, E2, L1 e L2. A partir dos dados obtidos nas an?lises de variabilidade, foi desenhado um novo conjunto de primers para a detec??o e genotipagem dos HPVs de import?ncia cl?nica por meio da t?cnica de rea??o em cadeia da polimerase (PCR). O gene E1 foi escolhido como alvo molecular devido a presen?a de uma regi?o conservada com tamanho vari?vel entre gen?tipos. O sistema proposto teve sua efici?ncia avaliada in vitro e foi comparado ao protocolo de PCR mais utilizado para detec??o do HPV em amostras cl?nicas. Utilizando a amplifica??o de ?cido nucleico de forma semianinhada (seminested), o sistema proposto foi capaz de detectar com boa sensibilidade alguns dos principais HPVs de alto risco oncog?nico e mostrou melhor especificidade em rela??o aos primers gen?ricos GP5+/6+, mesmo aplicando uma temperatura de anelamento consideravelmente maior. A an?lise do tamanho dos fragmentos amplificados usando a separa??o por eletroforese em gel de agarose pode favorecer a identifica??o do tipo de HPV presente nas amostras, permitindo a discrimina??o entre aqueles mais prevalentes na popula??o e a redu??o do tempo e do custo necess?rios para a identifica??o do agente. Opcionalmente, a separa??o dos produtos em matrizes de alta resolu??o e o sequenciamento direto podem ser usados para a tipagem, possibilitando a identifica??o de uma ampla variedade de gen?tipos de HPV descritos. / Human papillomavirus (HPV) is a small circular double-stranded DNA virus, characterized as one of the most common sexually transmitted agents in the world, whose accurate detection and genotyping is only possible through molecular biology techniques. Different biological properties have been reported among the more than 170 types already characterized, so that a particular group of HPVs is strongly related to persistent infections, intraepithelial lesions of different degrees and progression to cancers such as cervical, anal, vulvar, vaginal, oropharyngeal and penis. In the present work, analyzes of genetic variability and molecular evolution were performed in the genomes of the main clinically important HPVs. Phylogenetic reconstructions and analyzes of genetic signature profiles in the genomes of each genotype suggested the presence of subgroups of HPVs defined by differences in the E1, E6, L1 and L2 gene sequences. Evolution tests at DNA level have shown a stronger acting of natural selection at specific codons, more often in the E1, E2, L1 and L2 genes. From the data obtained in the analyzes of variability, a new set of primers was designed for the detection and genotyping of HPVs of clinical importance by polymerase chain reaction (PCR) technique. E1 gene was chosen as the molecular target due to the presence of a conserved region of variable size among genotypes. The proposed system had its efficiency evaluated in vitro and was compared to the most used PCR protocol for HPV detection in clinical samples. Using the seminested nucleic acid amplification, the proposed system was able to detect some of the major oncogenic HPVs with good sensitivity and showed a better specificity than the generic primers GP5+/6+, even applying a considerably higher annealing temperature. The analysis of the size of the amplified fragments using agarose gel electrophoresis may favor the identification of the HPV type present in the samples, allowing the discrimination between those more prevalent in the population and the reduction of the time and cost necessary for the identification of the agent. Optionally, the separation of products into high resolution matrices and direct sequencing can be used for typing, enabling the identification of a wide variety of HPV genotypes described.