Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DayseCSC_DISSERT.pdf: 507696 bytes, checksum: 782930a6c60b8e6d0073baa1386c82e5 (MD5) Previous issue date: 2010-10-08 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / A 140,0 kDa lectin was purified and characterized from the mushroom Clavaria cristata. The purification procedures from the crude extract of the mushroom comprised gel filtration chromatography on Sephacryl s200 and ion exchange on Resource Q column. The purified lectin agglutinated all types of human erythrocytes with preference for trypsinized type O erythrocytes. The haemagglutinating activity is dependent of Ca 2+ ions and was strongly inhibited by the glycoprotein bovine submaxillary mucin (BSM) up to the concentration of 0, 125 mg/mL. The C. cristata lectin (CcL) was stable in the pH range of 2,5-11,5 and termostable up to 80 ?C. CcL molecular mass determined by gel filtration on a Superose 6 10 300 column was approximately 140,3 kDa. SDS polyacrilamide gel electrophoresis revealed a single band with a molecular mass of approximately 14,5 kDa, when the lectin was heated at 100 ?C in the presence or absence of ?-mercaptoethanol. CcL induced activation of murine peritoneal macrophages in vitro resulting in the release of nitric oxide (NO), reaching the maximum production at 24 h. In experimental paw oedema model in mice, CcL showed proinflammatory activity being able to induce oedema formation. Cell viability of HepG2, MDA 435 e 3T3 cell lines was examined after 72 h of incubation with CcL in different concentrations (0,5-50 ?g/mL). CcL inhibited HepG2 cells growth with an IC50 value of 50 ?g/mL. In the present work, the observed immunomodulatory and antiproliferative effects indicate CcL as a possible immunomodulator compound, interfering in the macrophages immune response, taking possible anti-parasitic, anti-tumoral effects or diagnostic and/or therapeutic / Uma lectina de 140,0 kDa foi purificada e caracterizada a partir do extrato prot?ico do fungo Clavaria cristata. O processo de purifica??o a partir do extrato bruto do fungo compreendeu uma cromatografia de gel filtra??o SEPHACRYL S200 e uma cromatografia de troca i?nica Resource Q em sistema FPLC-AKTA (Fast Protein Liquid Chromatography). A lectina de C. cristata (CcL) aglutinou todos os tipos de eritr?citos humanos com prefer?ncia pelos do tipo O tratados com tripsina. A atividade hemaglutinante de CcL se mostrou dependente do ?on c?lcio e foi fortemente inibida pela glicoprote?na mucina bovina (BSM) at? a concentra??o m?nima de 0,125 mg/mL. CcL foi est?vel numa ampla faixa de pH, que variou entre 2,5-11,5 e termoest?vel at? 80?C por uma hora. A massa molecular da CcL, determ inada por cromatografia de gel filtra??o Superose 6 10 300 GL em sistema de FPLC-AKTA foi de aproximadamente 140,3 kDa e uma eletroforese SDS-PAGE revelou uma ?nica banda com massa molecular de aproximadamente 14,5 kDa quando a lectina foi aquecida ? temperatura de 100 ?C. CcL induziu a ativa??o de macr?fagos murinos in vitro com conseq?ente libera??o de ?xido n?trico atingindo a m?xima produ??o de ?xido n?trico no tempo de 24 h. Em modelo experimental de edema de pata em camundongos, a lectina do fungo apresentou atividade pr?-inflamat?ria sendo capaz de induzir a forma??o do edema. A viabilidade celular das linhagens celulares HepG2, MDA 435 e 3T3 foi analisada ap?s incuba??o por 72 h com concentra??es de CcL (0,5-50 ?g/mL). O valor do IC50 foi obtido com a concentra??o de CcL de 50 ?g/mL para linhagem de c?lulas HepG2. No presente trabalho, os efeitos imunomodulat?rios e antiproliferativos foram observados apontando a CcL como um poss?vel imunomodulador, interferindo na resposta imune de macr?fagos levando a poss?veis efeitos anti-parasit?rios, anti-tumorais ou agente diagn?stico e/ou terap?utico

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AcariziaES_DISSERT_com restrincao.pdf: 1340411 bytes, checksum: 77725d07cd1be6709e0cbb731be2b1e1 (MD5) Previous issue date: 2010-10-06 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Reactive oxygen species (ROS) are produced by aerobic metabolism and react with biomolecules, such as lipids, proteins and DNA. In high concentration, they lead to oxidative stress. Among ROS, singlet oxygen (1O2) is one of the main ROS involved in oxidative stress and is one of the most reactive forms of molecular oxygen. The exposure of some dyes, such as methylene blue (MB) to light (MB+VL), is able to generate 1O2 and it is the principle involved in photodynamic therapy (PDT). 1O2 e other ROS have caused toxic and carcinogenic effects and have been associated with ageing, neurodegenerative diseases and cancer. Oxidative DNA damage is mainly repaired by base excision repair (BER) pathway. However, recent studies have observed the involvement of nucleotide excision repair (NER) factors in the repair of this type of injury. One of these factors is the Xeroderma Pigmentosum Complementation Group A (XPA) protein, which acts with other proteins in DNA damage recognition and in the recruitment of other repair factors. Moreover, oxidative agents such as 1O2 can induce gene expression. In this context, this study aimed at evaluating the response of XPA-deficient cells after treatment with photosensitized MB. For this purpose, we analyzed the cell viability and occurrence of oxidative DNA damage in cells lines proficient and deficient in XPA after treatment with MB+VL, and evaluated the expression of this enzyme in proficient and complemented cells. Our results indicate an increased resistance to treatment of complemented cells and a higher level of oxidative damage in the deficient cell lines. Furthermore, the treatment was able to modulate the XPA expression up to 24 hours later. These results indicate a direct evidence for the involvement of NER enzymes in the repair of oxidative damage. Besides, a better understanding of the effects of PDT on the induction of gene expression could be provided / Esp?cies reativas de oxig?nio (ERO) s?o produzidas durante o metabolismo aer?bico e s?o capazes de reagir com diversas biomol?culas, como lip?dios, prote?nas e DNA. Dentre as ERO, o oxig?nio singlete (1O2) e conhecido como um dos principais agentes envolvidos no estresse oxidativo. A exposi??o de alguns pigmentos, como o azul de metileno (MB) a luz e capaz de gerar 1O2, sendo essa a base da terapia fotodin?mica (TFD). Quando em excesso, o 1O2 e outras ERRO mostram efeitos t?xicos e carcinog?nicos e est?o relacionados ao envelhecimento e a etiologia de varias doen?as, incluindo artrite, doen?as degenerativas e c?ncer. A principal via de reparo de danos oxidativos ao DNA e a via por excis?o de base (BER). No entanto, estudos recentes tem observado a atua??o de fatores da via de reparo por excisao de nucleotideo (NER) na corre??o desse tipo de les?o. Um dos fatores da via NER e a prote?na Xeroderma Pigmentoso do Grupo de complementa??o A (XPA), que atua em conjunto com outras prote?nas na etapa de localiza??o dos s?tios de danos e de recrutamento de outros fatores de reparo. Ainda, agentes oxidativos como o 1O2 sao capazes de induzir a express?o g?nica. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a resposta de c?lulas deficientes em XPA ao tratamento com MB fotossensibilizado. Para isso, foram analisadas a viabilidade celular e a ocorr?ncia de danos oxidativos em linhagens proficientes e deficientes em XPA, assim como a express?o dessa enzima em c?lulas proficientes e complementadas. Nossos resultados indicam um aumento da resist?ncia ao tratamento em c?lulas complementadas com XPA e um maior n?vel de danos oxidativos em linhagens deficientes nessa enzima. Alem disso, o tratamento foi respons?vel pela modula??o da express?o dessa enzima ate 24h depois. Esses resultados indicam uma evidencia direta da participa??o de enzimas do NER no reparo de danos oxidativos e contribui para um melhor entendimento sobre os efeitos da TFD na indu??o da express?o g?nica

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AmandaLMM_DISSERT.pdf: 1135135 bytes, checksum: 22f94cd634c60ab505070e7d4ae43900 (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In this work, we used sugarcane as a model due to its importance for sugar and ethanol production. Unlike the current plant models, sugarcane presents a complex genetics and an enormous allelic variation. Here, we report the analysis of SAGE libraries produced using the shoot apical meristem from contrasted genotypes by flowering induction (non-flowering vs. early-flowering varieties) grown under S?o Paulo state conditions. The expression pattern was analyzed using samples from S?o Paulo (SP) and Rio Grande do Norte (RN) states. These results showed that cDNAs identified by SAGE libraries had differential expression only in S?o Paulo state samples. Furthermore, the cDNA identified CYP (Citocrome P450) was chosen for in silico and genome characterization because it was found in SAGE libraries and subtractive libraries from samples from RN. Phylogenetic trees showed the relationship for these sequences. Furthermore, the qRT-PCR for CYP showed a potential role as flowering indutor for RN samples considering different isophorms. Considering the results present here, it can be consider that CYP gene may be used as molecular marker / A cana-de-a??car ? um modelo devido ? sua import?ncia na produ??o de ?lcool e a??car. Diferente de outras plantas modelo, ela apresenta um genoma complexo e muita varia??o al?lica. Foram analisadas as bibliotecas SAGE produzidas a partir de ?pices meristem?ticos de cana-de-a??car de gen?tipos tardio e precoce, quanto ao florescimento, cultivados no estado de S?o Paulo. A express?o destes cDNAs prospectados foi analisada usando amostras de S?o Paulo e do Rio Grande do Norte. Estes resultados mostraram que os genes apresentavam express?o diferencial apenas para os gen?tipos cultivados em S?o Paulo. Entretanto, o cDNA CYP (Citocromo P450), foi escolhido para uma an?lise in silico e caracteriza??o gen?tica por ter sido identificado tanto nas bibliotecas SAGE como em bibliotecas subtrativas realizadas com gen?tipos cultivados no Rio Grande do Norte. ?rvores filogen?ticas mostraram a rela??o evolutiva entre as sequ?ncias. Al?m disso, dados de qRT-PCR para CYP51 mostram um poss?vel papel indutor de flora??o nas condi??es do RN. Considerando os resultados apresentados, podemos inferir que o gene CYP51 pode ser utilizado como marcador molecular para o melhoramento cl?ssico

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CelinaMPGD_TESE.pdf: 1816885 bytes, checksum: 1e39ca48cae61af571d696fef8f71be4 (MD5) Previous issue date: 2012-10-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The present study examines the chemical composition and their effects on free radicals, inflammation, angiogenesis, coagulation, VEGF effects and cellular proliferation of a polysaccharides from alga Sargassum vulgare. The sulfated polysaccharide was extracted from brown seaweed by proteolysis with enzymes maxataze. The presence of proteins and sugars were observed in crude polysaccharides. Fractionation of this crude extract was made with growing concentration of acetone (0.3-1.5 v) and produced four groups of polysaccharides. Anionic polysaccharides from brown seaweed Sargassum vulgare, SV1and PSV1 were fractionated (SV1) and purified (PSV1), and displayed with high total sugars and sulfate content and very low level of protein. This fucan SV1 contains low levels of protein and high carbohydrate and sulfate content. This polysaccharides prolonged activated partial thromboplastin time (aPTT) at 50 μg (>240 s). SV1 was found to have no effect on prothrombin time (PT), corresponding to the extrinsic pathway of coagulation. SV1 exhibits high antithrombotic action in vivo, with a concentration ten times higher than heparin. Polysaccharides from S. vulgare promoted direct inhibition enzymatic activity of thrombin and stimulated enzymatic activity of FXa. SV1 showed optimal inhibitory activity of thrombin (50.2?0.28%) at a concentration of 25 μg/mL. Its antioxidant action on scavenging radicals by DPPH was (22%), indicating the polymer has no cytotoxic action (hemolytic) on ABO and Rh blood types in different erythrocyte groups and displays strong anti-inflammatory action on all concentrations tested in the carrageenan-induced paw edema model, demonstrated by reduced edema and cellular infiltration. Angiogenesis is a dynamic process of proliferation and differentiation. It requires endothelial proliferation, migration, and tube formation. In this context, endothelial cells are a preferred target for several studies and therapies. The antiangiogenic efficacy of polysaccharides was examined in vivo in the chick chorioallantoic membrane (CAM) model by using fertilized eggs. Decreases in the density of the capillaries were assessed and scored. The results showed that SV1 and PSV1 have an inhibitory effect on angiogenesis. These results were also confirmed by inhibition tubulogenesis in rabbit aorta endothelial cell (RAEC) in matrigel. These compounds were assessed in Apoptosis assay (Annexin V - FITC / PI) and cell viability by MTT assay of RAEC. These polysaccharides do not affect the viability and do not have apoptotic or necrotic action. RAEC cell when incubated with SV1 and PSV1showed inhibition of VEGF secretion, observed when compounds were incubated at 25, 50 and 100 μg/μL. The VEGF secretion with the RAEC cell line for 24 h, was more effective for PSV1 at 50 μg/μL(71.4%) than SV1 100 μg/μL (75.9%). SV1 and PSV1 had an antiproliferative action (47%) against tumor cell line HeLa. Our results indicate that these sulfated polysaccharides have antiangiogenic and antitumoral actions / O presente estudo analisa a composi??o qu?mica e seus efeitos sobre os radicais livres, inflama??o, angiog?nese, coagula??o, VEGF e prolifera??o celular dos polissacar?deos de uma alga Sargassum vulgare. O polissac?rido sulfatado foi extra?do a partir de algas marrons por prote?lise com a enzima maxataze. A presen?a de prote?nas e a??cares foram observados no cru de polissacarideos. Fracionamento do o extrato bruto foi feito com concentra??es crescente de acetona (0,3-1,5 v), produzindo quatro grupos de polissacarideos. Estes compostos ani?nicos da alga S. vulgare, foram fracionados (SV1) e purificados (PSV1) exibindo com alta a??cares totais e sulfatecontent e n?vel muito baixo de prote?nas.A fucana SV1 cont?m baixos n?veis de prote?na e de hidratos de carbono e alto teor de sulfato. Este polissacar?deos prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) a 50 ug (>240 s). n?o foi observado qualquer efeito de SV1 sobre o tempo de protrombina (PT), que corresponde a via extr?nseca da coagula??o. SV1 exibiu alta a??o antitromb?tica in vivo, com uma concentra??o 10 vezes maior do que a heparina. SV1 promoveu a actividade de inibi??o enzim?tica direta da trombina e estimulou a atividade enzim?tica do FXa. Mostrou tamb?m, atividade inibidora optima de trombina (50,2 ? 0,28%) a uma concentra??o de 25 ug / mL. A sua ac??o anti-oxidante de radicais scavenging por DPPH foi de (22%), indicando que o pol?mero n?o tem qualquer a??o citot?xica (hemol?tica) em tipos de sangue ABO e Rh, em diferentes grupos de eritr?citos e exibindo alta a??o anti-inflamat?ria em edema de pata de ratos Wistar em todas as concentra??es testadas induzida por carragenina. Tal processo foi demonstrado por edema e infiltra??o celular. A angiogenese ? um processo din?mico de prolifera??o e diferencia??o. Ele requer prolifera??o endotelial, migra??o, e a forma??o do tubo. Neste contexto, as c?lulas endoteliais s?o um alvo preferido para muitos estudos e terapias. A efic?cia antiangiogenico de polissacar?deos foi examinada in vivo na membrana corioalant?ica pinto (CAM) usando-se ovos fertilizados. Diminui??es na densidade dos capilares foram avaliados e pontuados. Os resultados mostraram que SV1 e PSV1 tem um efeito inibidor da angiogenese. Estes resultados foram tamb?m confirmados por tubulogenesis inibi??o na c?lula endotelial da aorta de coelho (RAEC) em matrigel. C?lulas RAEC quando foram incubadas com SV1and PSV1 demonstraram inibi??o da secre??o de VEGF, a 25, 50 e 100 ug/mL. A secre??o de VEGF com a linha de c?lulas RAEC durante 24 h, foi mais eficaz para PSV1 a 50 ug / mL (71,4%) do que SV1 100 ug / mL (75,9%). SV1 e PSV1 posuiram uma ac??o antiproliferativa (47%) contra as c?lulas tumorais tipo HeLa. Estes compostos foram avaliados tamb?m, no ensaio de apoptose (anexina V - FITC / PI) e a viabilidade celular pelo ensaio de MTT de RAEC. Estes polissacar?deos n?o afetaram a viabilidade e n?o tiveram a??o apopt?tica ou necr?tica. Nossos resultados indicam que estes polissacar?deos sulfatados t?m a??es antiangiog?nica e antitumoral e constituem um importante alvo biol?gico e farmacol?gico

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NathaliaKA_DISSERT.pdf: 1804671 bytes, checksum: dc9249f4244d248101071758a918d9fa (MD5) Previous issue date: 2011-03-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The acquisition of oligosaccharides from chitosan has been the subject of several studies in the pharmaceutical, biochemical, food and medical due to functional properties of these compounds. This study aimed to boost its production of chitooligosaccharides (COS) through the optimization of production and characterization of chitosanolytic enzymes secreted by microorganisms Paenibacillus chitinolyticus and Paenibacillus ehimensis, and evaluating the antioxidant potential of the products obtained. In the process of optimizing the production of chitosanase were employed strategies Fractional Factorial Experimental Design and Central Composite Rotatable Design. The results identified the chitosan, peptone and yeast extract as the components that influenced the production of chitosanase by these microorganisms. With the optimization of the culture media was possible to obtain an increase of approximately 8.1 times (from 0.043 to 0.35 U.mL U.mL-1) and 7.6 times (from 0.08 U.mL-1 to 0.61 U.mL-1) in the enzymatic activity of chitosanase produced by P. chitinolyticus and P. ehimensis respectively. Enzyme complexes showed high stability in temperature ranges between 30? and 55? C and pH between 5.0 and 9.0. Has seen the share of organic solvents, divalent ions and other chemical agents on the activity of these enzymes, demonstrating high stability of these crude complexes and dependence of Mn2+. The COS generated showed the ability of DPPH radical scavenging activity, reaching a maximum rate of scavenging of 61% and 39% when they were produced with enzymes of P. ehimensis and P. chitinolyticus respectively. The use of these enzymes in raw form might facilitate its use for industrial applications / A obten??o de oligossacar?deos a partir da quitosana tem sido alvo de diversas pesquisas na ?rea farmac?utica, bioqu?mica, alimentar e m?dica, devido ?s propriedades funcionais destes compostos. Este trabalho teve o objetivo de potencializar a produ??o de quitooligossacar?deos (QOS), atrav?s da otimiza??o da produ??o e caracteriza??o de enzimas quitosanol?ticas secretadas pelos microrganismos Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis, e avalia??o do potencial antioxidante dos produtos obtidos. No processo de otimiza??o da produ??o de quitosanases foram empregadas as estrat?gias de Planejamento Experimental Fatorial Fracionado e Delineamento Central Composto Rotacional. Os resultados encontrados identificaram a quitosana, a peptona e o extrato de levedura como os componentes que mais influenciaram na produ??o de quitosanases por estes microrganismos. Com a otimiza??o dos meios de cultivo foi poss?vel obter um aumento de aproximadamente 8,1 vezes (de 0,043U.mL-1 para 0,35U.mL-1) e de 7,6 vezes (de 0,08U.mL-1 para 0,61U.mL-1) na atividade enzim?tica de quitosanases produzidas pelos P. chitinolyticus e P. ehimensis, respectivamente. Os complexos enzim?ticos mostraram alta estabilidade nas faixas de temperatura entre 30?C e 55?C, e de pH entre 5,0 e 9,0. Foi vista a a??o de solventes org?nicos, ?ons bivalentes e outros agentes qu?micos sobre a atividade destas enzimas, demonstrando alta estabilidade destes complexos brutos e depend?ncia de Mn2+. Os QOS gerados mostraram habilidade de seq?estro do radical DPPH, atingindo uma taxa m?xima de seq?estro de 61% e 39% quando estes foram produzidos com enzimas do P. ehimensis e P. chitinolyticus, respectivamente. A utiliza??o dessas enzimas na forma bruta poder? facilitar seu uso para aplica??es industriais

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DayseSA_DISSERT.pdf: 846190 bytes, checksum: eef38ab14de25ca6c9fac44eeac25ae1 (MD5) Previous issue date: 2011-08-05 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In the last years, heparin has become target of many studies related to inflammation due its ability of biding to proteins involved on immune response. Recently, it was demonstrated, at our laboratory, using a thIoglycollate-induced peritonitis model, heparin s capacity of reduce cellular influx into the peritoneal cavity, 3 hours after the inflammatory stimulus. Once neutrophilic infiltration is highest around 8 hours after the inflammatory stimulus, at the present work, using the same peritonitis model, it was assessed heparin s ability of keeping the interference on leukocyte infiltration, 8 hours after inflammation induction. Moreover, using cellular differential count, it was evaluated how the cellular populations involved in the inflammatory process would be affected by the treatment. Eight hours after the inflammatory stimulus, only heparin dosage of 1 &#956;g/Kg was able to reduce the cellular influx to peritoneum, 62.8% of reduction when compared to positive control (p < 0.001). Furthermore, heparin dosage of 15 &#956;g/Kg presented a pro-inflammatory effect in whole blood verified by the increase of 60.9% (p < 0.001) and 117.8% (p < 0.001) on neutrophils and monocytes proportion, respectively, when compared to positive control. In addition, this dosage also presented a neutrophilic proportion on peritoneal fluid 27.3% higher than positive control (p < 0.05). This duality between anti- and pro-inflammatory effects at different times corroborates studies that attribute a pleiotropic immunomodulator role to heparin. / Nos ?ltimos anos, a heparina vem sendo alvo de v?rios estudos relacionados ? inflama??o, devido sua capacidade de se ligar a diversas prote?nas envolvidas com a resposta imune. Recentemente, em nosso laborat?rio, foi demonstrada, em modelo de peritonite induzida por tioglicolato, a capacidade da heparina em reduzir o influxo celular ? cavidade peritoneal, 3 horas ap?s o est?mulo inflamat?rio. No presente trabalho, utilizando o mesmo modelo, foi avaliada a capacidade da heparina em interferir na infiltra??o leucocit?ria ap?s 8 horas da indu??o da inflama??o, momento em que a infiltra??o neutrof?lica ? m?xima. Utilizando contagem diferencial celular, avaliou-se a influ?ncia da heparina sobre as popula??es celulares envolvidas na inflama??o. Oito horas ap?s o est?mulo inflamat?rio, apenas a dosagem de heparina de 1 &#956;g/Kg, manteve a capacidade de interferir na migra??o leucocit?ria, apresentando 62,8% de diminui??o (p < 0,001) no influxo celular, quando comparada ao controle positivo. Enquanto para a dosagem de heparina de 15 &#956;g/Kg foi observado efeito pr?-inflamat?rio no sangue total verificado pelos aumentos de 60,9% (p < 0,001) e 117,8% (p < 0,001) na propor??o de neutr?filos e mon?citos, respectivamente, em compara??o ao controle positivo. Al?m disso, essa dosagem tamb?m apresentou propor??o neutrof?lica no l?quido peritoneal 27,3% maior que o controle positivo (p < 0,05). Essa dualidade entre efeitos anti- e pr?-inflamat?rio nos diferentes tempos e doses analisados corroboram dados da literatura que atribuem ? heparina um papel como imunomodulador pleiotr?pico.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PauloRPN_DISSERT.pdf: 1361148 bytes, checksum: 4572b4a963991f34258d766f8d1c322f (MD5) Previous issue date: 2012-04-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Iron is an essential element for many cellular functions, including the immune response against intracellular pathogens. In this study, we aimed evaluate the effect of iron on IRP2, IFN-?, TNF-?, IL-6, IL-10, MIG and IP10 expression in PBMC and assess the effect of the spleen parasite load on the expression of these genes in the spleen of L. infantum naturally infected dogs. Blood sample from 7 DTH+ donor was collected and PBMC was obtained. The cells were cultivated in absence (iron chelator desferroximane, DFO 10 ?M supplemented media) or in presence of iron (hemin 6 mM) for 1 h, followed by stimulation with Leishmania infatum antigen for 4 h. 44 dog spleen samples were obtained and parasite load in this organ was determinate by qPCR. Gene expression was analyzed by qPCR and cytokine production quantified by flow cytometry. In antigen stimulated cells, genes involved in immune response are significantly more expressed in presence of iron. T CD4+ and TCD8+ lymphocytes produces IFN-?, TNF-? and IL-10 possibly in iron dependent pathway. Monocytes antigen stimulated reduced TNF-?, IL-6 and IL-10 production in presence of iron. We found spleen of infected dogs IRP2 expression increases according to parasite load in that organ, while an inverse profile was found for IFN-?, TNF-? e IL-10 expression. These results suggest that T lymphocytes depends on iron to produce IFN-?, TNF-? and IL-10, while iron seems to inhibit cytokine production in monocytes. So, we propose an immunoregulatory mechanism carried out by iron during L. infantum infection in humans and dogs / O ferro ? um elemento essencial para diversas fun??es celulares, incluindo a resposta imune a pat?genos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ferro sobre a express?o dos genes IRP2, IFN-?, TNF-?, IL-6, IL-10, MIG e IP10 em c?lulas mononucleares de sangue perif?rico (CMSP) humano e examinar o efeito da carga parasit?ria espl?nica sobre a express?o destes genes no ba?o de c?es naturalmente infectados por L. infantum. Coletou-se amostras de sangue perif?rico de 7 indiv?duos DTH+ e obteve-se as CMSP. As c?lulas foram cultivadas na aus?ncia (quelante deferoxamina 10 ?M) ou presen?a de ferro (Hemina 6 mM) por 1 hora seguido de estimula??o com ant?geno de Leishmania infantum por 4 horas. Obteve-se o ba?o de 44 c?es e determinouse a carga parasit?ria neste ?rg?o por qPCR. A express?o g?nica foi avaliada por qPCR e a produ??o de citocinas foi quantificada por citometria de fluxo. Encontramos que na presen?a de ferro a express?o de genes envolvidos na resposta imune ? significativamente aumentada em CMSP. Linf?citos T CD4+ e TCD8+ produzem IFN-?, TNF-? e IL-10 possivelmente por uma via dependente de ferro. Em mon?citos a produ??o de TNF-?, IL-6 e IL-10 foram reduzidas em c?lulas estimuladas e cultivadas na presen?a do metal. Foi visto que no ba?o de c?es a express?o de IRP2 aumenta de acordo com a carga parasit?ria, sendo o inverso encontrado para IFN-?, TNF-? e IL-10. Os resultados sugerem que linf?citos T dependem de ferro para produzir IFN-?, TNF-? e IL-10, enquanto em mon?citos o ferro parece ter efeito inibit?rio sobre a produ??o de citocinas, sugerindo um efeito imunomodulat?rio para o ferro em humanos e c?es durante a leishmaniose visceral

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiegoDA_DISSERT.pdf: 2395435 bytes, checksum: d36171b7c7d9b30608e690a447e57864 (MD5) Previous issue date: 2011-11-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In Brazil, accidents with scorpions are considered of medical importance, not only by the high incidence, but also for the potentiality of the venom from some species in determining severe clinical conditions. Tityus stigmurus is a widely distributed scorpion species in Northeastern Brazil and known to cause severe human envenomations, inducing pain, hyposthesia, edema, erythema, paresthesia, headaches and vomiting. The present study uses a transcriptomic approach to characterize the molecular repertoire from the non-stimulated venom gland of Tityus stigmurus scorpion. A cDNA library was constructed and 540 clones were sequenced and grouped into 37 clusters, with more than one EST (expressed sequence tag) and 116 singlets. Forty-one percent of ESTs belong to recognized toxin-coding sequences, with antimicrobial toxins (AMP-like) the most abundant transcripts, followed by alfa KTx- like, beta KTx-like, beta NaTx-like and alfa NaTx-like. Our analysis indicated that 34% include other possible venom molecules , whose transcripts correspond to anionic peptides, hypothetical secreted peptides, metalloproteinases, cystein-rich peptides and lectins. Fifteen percent of ESTs are similar to cellular transcripts. Sequences without good matches corresponded to 11%. This investigation provides the first global view of cDNAs from Tityus stigmurus. This approach enables characterization of a large number of venom gland component molecules, which belong either to known or atypical types of venom peptides and proteins from the Buthidae family / No Brasil, acidentes com escorpi?es s?o considerados de import?ncia m?dicosanit?ria, n?o somente por sua incid?ncia, mas tamb?m pela potencialidade do veneno de algumas esp?cies em determinar quadros cl?nicos graves. Tityus stigmurus ? uma esp?cie de escorpi?o amplamente distribu?da na regi?o Nordeste do Brasil sendo conhecida por causar graves envenenamentos humanos, cujos sintomas incluem: dor, hipoestesia, edema, eritema, parestesia, cefal?ia e v?mitos. A composi??o qu?mica do veneno do escorpi?o T. stigmurus ainda n?o foi bem avaliada, havendo uma car?ncia na literatura de estudos com enfoque na elucida??o do repert?rio molecular dos componentes deste veneno. Neste trabalho, realizamos uma abordagem transcript?mica para caracterizar o repert?rio molecular da gl?ndula de veneno n?o-estimulada do escorpi?o Tityus stigmurus. Para tanto, uma biblioteca de cDNA foi constru?da e, ? partir dela, 540 genes foram clonados e agrupados em 37 clusters com mais de um EST (expressed sequence tag) e 116 singlets (somente um EST). Do total de transcritos, 41% pertencem a sequ?ncias de toxinas conhecidas, sendo os pept?deos antimicrobianos (AMPs) os transcritos mais abundantes, seguido por &#945;-KTX, &#946;- KTX, &#946;-NaTx e &#945;-NaTx, respectivamente. Nossa an?lise revelou ainda que 34% s?o "poss?veis toxinas", cujos transcritos correspondem a pept?deos ani?nicos, pept?deos hipot?ticos secretados, metaloproteases, pept?deos ricos em ciste?na e lectinas. Quinze por cento dos ESTs s?o semelhantes a transcritos celulares. Transcritos sem similaridade com outras sequ?ncias do GenBank, foram chamadas de no hit e correspondem a 11% do total. Este trabalho apresenta a primeira vis?o global de cDNAs das gl?ndulas venenosas do escorpi?o Tityus stigmurus. Esta abordagem permite a caracteriza??o de um grande n?mero de mol?culas componentes da gl?ndula de veneno, que pertencem a tipos conhecidos ou at?picos de pept?deos e prote?nas do veneno da fam?lia Buthidae

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielCL_DISSERT.pdf: 3446622 bytes, checksum: 86a8ec4f8ed7a90274cc61a7f0f71422 (MD5) Previous issue date: 2012-09-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The Chromobacterium violaceum is a &#946;-proteobacterium Gram-negative widely found in tropical and subtropical regions, whose genome was sequenced in 2003 showing great metabolic versatility and biotechnological and pharmaceutical potential. Given the large number of ORFs related to iron metabolism described in the genome of C. violaceum, the importance of this metal for various biological processes and due to lack of data about the consequences of excess of iron in free-living organisms, it is important to study the response mechanism of this bacterium in a culture filled with iron. Previous work showed that C. violaceum is resistant to high concentrations of this metal, but has not yet been described the mechanism which is used to this survival. Thus, to elucidate the response of C. violaceum cultured in high concentrations of iron and expecting to obtain candidate genes for use in bioremediation processes, this study used a shotgun proteomics approach and systems biology to assess the response of C. violaceum grown in the presence and absence of 9 mM of iron. The analysis identified 531 proteins, being 71 exclusively expressed by the bacteria grown in the presence of the metal and 100 just in the control condition. The increase in expression of proteins related to the TCA cycle possibly represents a metabolic reprogramming of the bacteria caused by high concentration of iron in the medium. Moreover, we observed an increase in the activity assay of superoxide dismutase and catalase as well as in Total Antioxidant Activity assay, suggesting that the metal is inducing oxidative stress in C. violaceum that increases the levels of violacein and antioxidant enzymes to better adapt to the emerging conditions. Are also part of the adaptive response changes in expression of proteins related to transport, including iron, as well as an increased expression of proteins related to chemotaxis response, which would lead the bacteria to change the direction of its movement away from the metal. Systems Biology results, also suggest a metabolic reprogramming with mechanisms coordinated by bottleneck proteins involved in transcription (GreA), energy metabolism (Rpe and TpiA) and methylation (AhcY) / A Chromobacterium violaceum ? uma &#946;-proteobact?ria Gram-negativa encontrada amplamente em regi?es tropicais e subtropicais, cujo genoma foi sequenciado em 2003 mostrando grande versatilidade metab?lica e potencial biotecnol?gico e farmac?utico. Dada ? grande quantidade de ORFs relacionadas com o metabolismo de ferro descritas no genoma da C. violaceum, a import?ncia deste metal para diversos processos biol?gicos e devido ? car?ncia de dados a respeito das conseq??ncias do excesso do ferro em organismos de vida livre, ? importante estudar o mecanismo de resposta desta bact?ria em meio repleto com ferro. Trabalhos anteriores mostram que a C. violaceum apresenta resist?ncia a grandes concentra??es desse metal, embora ainda n?o tenha sido descrito qual mecanismo ? utilizado para esta sobreviv?ncia. Assim, visando elucidar a resposta da C. violaceum cultivada em alta concentra??o de ferro e esperando-se obter genes candidatos para serem utilizados em processos de biorremedia??o, o presente trabalho utilizou a abordagem de prote?mica em shotgun e Biologia de Sistemas para avaliar a resposta de C. violaceum cultivada na presen?a e aus?ncia de 9 mM de ferro. A an?lise identificou 531 prote?nas, sendo 71 expressas exclusivamente pela bact?ria cultivada na presen?a do metal e 100 apenas na condi??o controle. O aumento na express?o de prote?nas relacionadas com o ciclo do TCA possivelmente representa uma reprograma??o metab?lica na bact?ria causada pela grande concentra??o de ferro no meio. Al?m disso, foi observado um aumento no ensaio de atividade das enzimas Super?xido dismutase e Catalase, bem como no ensaio de Atividade Antioxidante Total, sugerindo que o metal est? induzindo um quadro de estresse oxidativo em C. violaceum, que passou a aumentar os n?veis de violace?na e enzimas antioxidantes para melhor se adaptar ? condi??o emergente. Tamb?m faz parte da resposta adaptativa a altera??o na express?o de prote?nas relacionados a transporte, inclusive de ferro, e com a resposta quimiot?xica, o que levaria a bact?ria a mudar a orienta??o de sua locomo??o afastando-se do metal. Os dados de Biologia de Sistemas tamb?m sugerem uma reprograma??o metab?lica com mecanismos coordenados por gargalos proteicos envolvidos com transcri??o (GreA), metabolismo energ?tico (Rpe e TpiA) e metila??o (AhcY)

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RicheleJAM_DISSERT.pdf: 3022782 bytes, checksum: 46556132e4939175f840346baa8ae21f (MD5) Previous issue date: 2012-10-24 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / A sepse ? uma doen?a complexa, de alta gravidade e durante o seu desenvolvimento pode ocorrer eventos inflamat?rios graves, que podem levar o paciente ao ?bito. Inibidores de peptidases isolados de sementes de leguminosas est?o sendo estudados devido suas variadas atividades biom?dicas ou farmacol?gicas. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na avalia??o das atividades multifuncionais do inibidor de tripsina presente nas sementes de Erythrina velutina (EvTIb). Dois inibidores de tripsina foram purificados por fracionamento com sulfato de am?nio (30-60%), cromatografia de afinidade em tripsina-sepharose e cromatografia de fase reversa. Os inibidores purificados foram denominados de EvTIa e EvTIb e suas massas moleculares determinadas por espectrometria de massa por electrospray (ESI) foram: 19.228,16 Da e 19.210,48 Da, respectivamente. Dentre eles, o EvTIb apresentou maior atividade espec?fica para tripsina e maior percentual de rendimento de extra??o, sendo, portanto, o escolhido para as an?lises adicionais. Os fragmentos desse inibidor gerados por tratamento enzim?tico com tripsina e pepsina foram analisados por espectrometria de massa MALDI-ToF-ToF, permitindo elucidar sua estrutura prim?ria parcial. O EvTIb exibiu uma atividade de inibi??o do tipo n?o-competitiva para a tripsina com IC50 de 22 nmol.L-1 e constante de inibi??o (Ki) de 10 nmol.L-1. Al?m da atividade de inibi??o para tripsina, EvTIb tamb?m inibiu o fator Xa e a elastase neutrof?lica, por?m n?o inibiu trombina, quimotripsina ou peptidase 3. EvTIb se manteve est?vel a varia??o de pH e temperatura. EvTIb n?o foi citot?xico e n?o inibiu o crescimento bacteriano de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. EvTIb foi capaz de prolongar o tempo de coagula??o de maneira dose-dependente. Finalmente, observou-se que EvTIb foi capaz de restabelecer os n?veis hemost?ticos, inibir a migra??o leucocit?ria em camundongos s?pticos e diminuir a secre??o de TNF-&#945; e n?o teve a??o sobre a libera??o de IL-6. Por outro lado, EvTIb promoveu um aumento na libera??o de IFN- &#945; e IL-12. Esses dados sugerem que EvTIb pode constituir em uma nova mol?cula com potencial de uso no tratamento da sepse e doen?as relacionadas ? coagula??o