Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1828.pdf: 1894013 bytes, checksum: 47084c725e570d01b5c72cabdaeed953 (MD5) Previous issue date: 2008-03-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Gram-positive genus Bacillus is of great biotechnological importance. Their ability to secrete enzymes efficiently during fermentation is exploited for the production of extracellular enzymes such as penicillin G acylase (PGA). Bacillus megaterium has proven to be an excellent alternative host to Escherichia coli for heterologous gene expression. Unlike other bacilli strains, proteolytic degradation by alkaline proteases is avoided. In addition, there are no endotoxins found in the cell wall. As a result, protein yields are exceptionally high even if inexpensive substrates are used. In this work, the growth conditions of B. megaterium ATCC 14945 and its preparation for transformation by electroporation with plasmid DNA had been studied. Vegetative cells and protoplasts of B. megaterium had been used. Plasmid DNAs (pET- 32, pETduet-1, pBR322 and pHis 1522) were prepared from E. coli strains DH5α and BL21. Bacteria cultures were growth in Luria-Bertani (LB) broth, Nutrient or LBS (LB containing 0,5 M sorbitol) medium. It had been used the following Electroporation Media: 25% PEG 6000/0.1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0.625 M Sacarose/1.0 mM MgCl2, pH 5.5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7.0 (Belliveau & Trevors, 1989) and SMG (0.5 M sorbitol, 0.5 M manitol and 10% glicerol) (Xue et al., 1999). As Recovery Media after electric pulses, LB and LBSM (LB containing 0,5 M sorbitol and 0.38 M manitol) had been used. Extractions of genomic DNA of B. megaterium and plasmid DNA of E. coli had been carried through. The Colonies Forming Units method (CFU) was applied in order to analyze the B. megaterium viability before and after treatment with Electroporation Media. The biomass produced (Cx) was analyzed spectrophotometrically and by the Dry Mass method. The morphology and pureness of B. megaterium cultures had been studied by optic microscopy preparations and B. megaterium growth in liquid selective media. The best electric conditions for electroporation had been established by preliminary tests. B. megaterium transformations was performed according to protocols described by Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) and Romero et al. (2006). The B. megaterium growth curves in LB, Nutrient and LBS had allowed the identification of growth phases of cultures and the respective electric conditions adjustment for electroporation protocols. The cellular concentration (dry mass) found for 16 hours of culture in Nutrient, LB and LBS medium had been 1.900 g/L, 2.649 g/L and 2.320 g/L, respectively. The viable cells concentration analyses (UFC) had allowed the adjustment of plasmid DNA concentrations employed and transformation efficiencies calculation. It had been found the following cellular densities of B. megaterium grown in Nutrient, LB and LBS medium respectively after PEG/Sorbitol Electroporation Medium treatment: 8.8 x 108; 9,2 x 108 and 2.3 x 109 UFC/mL. For Sacarose/MgCl2, it had been found 2,8 x 107; 4.6 x 108 and 3.7 x 108 UFC/mL and for HEPES 5.6 x 108; 2.93 x 109 and 1.86 x 108. For SMG, it had been found 1,7 x 109; 9.4 x 109 and 1.1 x 1010 UFC/mL for Nutrient, LB and LBS medium, respectively. / Bacillus são bactérias Gram-positivas de grande importância biotecnológica. Sua habilidade para secretar enzimas eficientemente durante a fermentação é utilizada para a produção de enzimas extracelulares como penicilina G acilase (PGA). Bacillus megaterium revelou-se excelente hospedeiro alternativo à Escherichia coli para a expressão de genes heterólogos. Diferentemente de outras linhagens de bacilos, a degradação proteolítica por alcalino-proteases não é verificada. Além disso, não são encontradas endotoxinas em sua parede celular. Consequentemente, os rendimentos de produção de proteínas são excepcionalmente elevados, ainda que substratos econômicos sejam utilizados. Neste trabalho, foram estudadas as condições de crescimento de células de B. megaterium e sua preparação para transformação por eletroporação com DNA plasmidial. Foram utilizadas células vegetativas e protoplastos de B. megaterium ATCC 14945 e as linhagens de E. coli DH5α e BL21 (para amplificação e manutenção dos plasmídeos pET-32, pETduet-1, pBR322 e pHis 1522). Os meios de crescimento empregados foram Nutriente, Luria-Bertani (LB) e LBS (LB contendo 0,5 M sorbitol). Para as eletroporações, foram utilizados os Meios 25% PEG 6000/0,1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0,625 M Sacarose/1,0 mM MgCl2, pH 5,5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7,0 (Belliveau & Trevors, 1989) e SMG (0,5 M de sorbitol, 0,5 M de manitol e 10% de glicerol) (Xue et al., 1999). Como Meios de Recuperação pós-pulso elétrico, foram utilizados os Meios LB e LBSM (LB contendo 0,5 M de sorbitol e 0,38 M de manitol). Foram realizadas extrações de DNA genômico de B. megaterium e de DNA plasmidial de E. coli; ensaios de viabilidade das células de B. megaterium antes e após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, pelo Método de Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC); quantificação de biomassa produzida (Cx) nos cultivos de B. megaterium nos diferentes Meios, pelo Método da Massa Seca, e acompanhamento por leitura espectrofotométrica (DO 600 nm); análise morfológica e de pureza dos cultivos por meio de preparações permanentes e a fresco e do crescimento de B. megaterium selvagem em diferentes meios seletivos; testes preliminares de eletroporação para estabelecimento das melhores condições elétricas; ensaios de eletroporação segundo os protocolos de Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) e Romero et al. (2006). Foram obtidas as curvas de crescimento de B. megaterium para os Meios de Cultivo Nutriente, LB e LBS. Tais curvas permitiram a identificação da fase de crescimento das culturas e o respectivo ajuste das condições elétricas para os protocolos de eletroporação. As medidas de concentração celular (massa seca) encontradas para 16 horas de cultivo, para culturas crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS foram 1,900 g/L, 2,649 g/L e 2,320 g/L, respectivamente. As análises de concentração de células viáveis (UFC) forneceram a densidade celular após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, de modo a permitir o ajuste das concentrações de DNA plasmidial a serem empregadas e o cálculo das eficiências de transformação. Após o tratamento de células de B. megaterium, crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS, com o Meio de Eletroporação PEG/Sorbitol, foram obtidas, respectivamente: 8,8 x 108; 9,2 x 108 e 2,3 x 109 UFC/mL; para o Meio de Eletroporação Sacarose/MgCl2, 2,8 x 107; 4,6 x 108 e 3,7 x 108 UFC/mL; para o Meio de Eletroporação HEPES, 5,6 x 108; 2,93 x 109 e 1,86 x 108; para o Meio de Eletroporação SMG, 1,7 x 109; 9,4 x 109 e 1,1 x 1010 UFC/mL, respectivamente para os Meios de Crescimento Nutriente, LB e LBS.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-03-29T20:16:13Z No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-11T19:16:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-11T19:16:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T19:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) Previous issue date: 2016-04-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cervical cancer is the second largest cause of deaths from malignant cancer among women worldwide. Many studies show the importance of the HPV virus in the onset of cervical cancer, but because of the monoclonal nature of this cancer, it is suspected that HPV infection may not be considered the only causal factor responsible for the development of cervical carcinoma. Studies have indicated that EBV may have a role in cooperation with the HPV16 tumor development. Such cooperation could influence the tumor microenvironment by creating a favorable niche for its progression. Cancer cells secrete enzymes that degrade the extracellular matrix (ECM). Such enzymes such as matrix metalloproteinases (MMPs) facilitate cell movement in tissues and induce the activity of growth factors that promote angiogenesis. Among the group of MMPs, MMP-7 seems to have a crucial role in the development of carcinogenesis, since its action has been associated with the cleavage and release of adhesion molecules important. In this sense, this study was performed to establish the relationship between the HPV coinfection / EBV and expression of MMP-7. They were examined immunohistochemically histological slides of cervical lesions biopsies of 60 patients aged 35 to 65 years. The samples were divided into high grade lesion and low grade and evaluated semiquantitatively by scoring system ranging from 0 to +++. Histopathological indexes the degree of injury were established. It observed a statistically significant association between high-grade lesion, the expression of MMP-7 and the presence of the HPV virus, with p = 0.007 at the junction portion squamocolumnar and p = 0.023 in the portion of the ectocervix. / O câncer cervical é responsável pela segunda maior causa de mortes por neoplasia malignas entre as mulheres no mundo. Muitos estudos comprovam a importância do vírus HPV no surgimento do câncer cervical, porém devido à natureza monoclonal desta neoplasia, suspeita-se que a infecção pelo HPV não possa ser considerada o único fator causal responsável pelo desenvolvimento do carcinoma de colo de útero. Estudos já apontaram que o EBV pode ter um papel de cooperação com o HPV16 no desenvolvimento tumoral. Tal cooperação poderia influenciar o microambiente tumoral criando um nicho favorável para a sua progressão. Células de câncer secretam enzimas que degradam a matriz extracelular (MEC). Tais enzimas, como as metaloproteinases de matriz (MMPs) facilitam a movimentação celular nos tecidos e induzem a atividade de fatores de crescimento que promovem a angiogênese. Dentre o grupo das MMPs, a MMP-7 parece ter papel crucial no desenvolvimento da carcinogênese, pois sua ação já foi associada com a clivagem e a liberação de importantes moléculas de adesão. Neste sentido, foi realizado este estudo para estabelecer a relação entre a co-infecção HPV/EBV e a expressão da MMP-7. Foram examinadas imunohistoquimicamente lâminas histológicas de biópsias de lesões de colo uterino de 60 pacientes com idades entre 35 e 65 anos. As amostras foram divididas em lesão de alto grau e de baixo grau e avaliados semiquantitativamente através de um sistema de escore variando de 0 à +++. Índices histopatológicos quanto ao grau das lesões foram estabelecidos. Foi observada uma associação estatisticamente significante entre a lesão de alto grau, a expressão da MMP-7 e a presença do vírus HPV, com p=0,007 na porção da junção escamocolunar e p=0,023 na porção da ectocérvice.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Lead (Pb) is a toxic metal without biological function, which can cause various undesirable changes in organism. Developing animals are more sensitive to external aggressions, and exposure to Pb may cause pronounced and even irreversible damage. Studies show detoxifyng action by zinc chloride (ZnCl2) and N-acetylcysteine (NAC), suggesting same protective effect against intoxication with Pb. Therefore, we investigated the toxic effect of lead acetate (AcPb) on biochemical and behavioral parameters, in developing animals, and the possible protective effect of ZnCl2 and NAC. For this young Wistar rats received subcutaneously: saline, ZnCl2 (27 mg/kg), NAC (5 mg/kg) or more NAC ZnCl2 from the 3rd to 7 th; and AcPb (7 mg/kg) or saline from the 8th to 12th day of age. The animals were subjected to behavioral tasks: negative geotactismo, the tail immersion test beaker and open field to assess neurological damage and motors. They were sacrificed at 33 days and the biological samples were stored for further analysis. We assessed the body weight, the activity of porphobilinogen synthase (PBG synthase) in blood, acetylcholinesterase (AChE) in brain and cerebellum, hemoglobin (Hb) in whole blood, serum urea and creatinine, and blood, cerebrum and cerebellum levels. Pups exposed to AcPb presented a decrease of blood PBG-synthase activity, without changes in Hb content. ZnCl2 pre-exposure partially prevented the PBG-synthase inhibition. Pb caused a decrease in the activity of brain AChE, while the treatment with ZnCl2, NAC and ZnCl2 more NAC prevented this change. In addition, animals exposed to AcPb presented Pb accumulation in blood and brain; all preventive treatments decreased Pb levels. In summary, the results show that there was an accumulation of Pb and inhibition of the activity of two enzymes, which are important biomarkers of toxicity. As preventive treatments, the protector effect of ZnCl2 may related to its capacity of to induce the biosyntese of metal ligant proteins. As to NAC, it is probable that its protective effect is related to chelating effects. / O chumbo (Pb) é um metal tóxico, sem função biológica, o qual pode provocar várias alterações indesejadas no organismo. Animais em desenvolvimento apresentam maior sensibilidade à agressões externas, e a exposição ao Pb poderá provocar danos pronunciados e até mesmo irreversíveis. Alguns trabalhos sugerem que o cloreto zinco (ZnCl2) e a N-acetilcisteína (NAC) possuem ação detoxificante, podendo então, ter um efeito protetor frente a uma intoxicação com Pb. Sendo assim, buscamos investigar o efeito tóxico do acetato de chumbo (AcPb) em parâmetros bioquímicos e comportamentais, quando administrado em animais em desenvolvimento, e a possível ação protetora do ZnCl2 e da NAC sobre esta toxicidade. Para isso ratos Wistar jovens receberam subcutaneamente: salina, ZnCl2 (27 mg/kg), NAC (5 mg/kg) ou ZnCl2 mais NAC do 3o ao 7o; e AcPb (7 mg/kg) ou salina do 8o ao 12o dia de idade. Os animais foram submetidos às tarefas comportamentais: geotactismo negativo, imersão da cauda, teste do becker e campo aberto para avaliação de danos neurológicos e motores. Foram sacrificados aos 33 dias e as amostras biológicas foram guardadas para análises posteriores. Avaliou-se: o peso corporal; a atividade das enzimas porfibilinogênio-sintase (PBG-sintase) em sangue, acetilcolinesterase (AChE) em cérebro e cerebelo; níveis de hemoglobina (Hb) em sangue total, de ureia e creatinina em soro; níveis de metalotioneíanas (MT) em sangue, fígado e cérebro; dosagem de metais em sangue, cérebro e cerebelo. Filhotes expostos ao AcPb apresentaram diminuição da atividade da PBG-sintase de sangue, sem alterações no conteúdo de Hb. O ZnCl2 preveniu parcialmente a inibição PBG-sintase. O AcPb causou diminuição na atividade da AChE de cérebro, enquanto os tratamentos com ZnCl2, NAC e ZnCl2 mais NAC preveniram essa alteração. Além disso, os animais expostos ao AcPb apresentaram acúmulo de Pb em sangue e cérebro; todos os tratamentos preventivos diminuiram os níveis de Pb. Em resumo, os resultados mostram que houve um acúmulo de Pb nos tecidos onde houve inibição das enzimas, que são importantes biomarcadores de toxicidade; acredita-se que a inibição ocorra através da ligação do metal aos grupamentos tiois das enzimas. Quanto aos tratamentos preventivos, o efeito protetor do zinco pode estar ligado a indução de proteínas ligantes de metais. Ainda, sugere-se que a proteção exercida pela NAC está ligada a sua capacidade quelante.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2085482 bytes, checksum: 22303ee6597c676fbc153930781c403e (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / Geminivirus are plant virus packed as geminate semi- icosahedral particles and single-stranded circular DNA genomes. They can be either mono or bipartite and in the bipartite geminivirus, the genomic components are designated DNA-A and DNA-B. DNA-A encodes the proteins needed for replication, transactivation and encapsidation of the viral genome. DNA-B encodes two movement proteins, Movement Protein, MP, and Nuclear Shuttle Protein, NSP, both required for the establishment of a systemic infection. NSP transports the viral DNA between the nucleus and cytoplasm and acts cooperatively with MP to move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The geminivirus are highly dependent on the host factors for proliferation and spread. NSP interacts with a plasma membrane receptor kinase, designated NIK (NSP- interacting kinase), from tomato, soybean and Arabidopsis. It has been demonstrated previously that inactivation of NIK gene enhances the susceptibility of the mutant to geminivirus infection. To elucidate the possible role of NIK in the protection mechanism to geminivirus infection, we investigated here the effects of NIK overexpression in the tomato response to geminivirus infection. The NIK gene from Arabidopsis thaliana was used to transform tomato. The primary transformants were confirmed by PCR, selected by RT-PCR according to the transgene expression, in vitro replicated and used for developmental analysis in vitro and in green house. NIK overexpression affected the overall developmental performance of transgenic lines which display delayed and stunted growth, with lower stem, less developed root and shoot systems and a leaf curly phenotype. These transgenic line phenotypes overexpression NIK were similar to that displayed by inhibition of Brassinosteroid synthesis or signaling. Infectivity assays in tomato with ToYSV-[MG-Bi2] revealed that overexpression of NIK caused attenuation of symptom, as the transgenic lines developed less severe symptoms in comparison with the untransformed lines. These results are consistent with a protective role of NIK against viral infection and suggest that the NIK-mediated signaling communicates to some level with the brassinosteroid signaling. / Geminivírus são vírus de plantas com partículas semi- icosaédricas geminadas e genoma de DNA circular de fita simples, podendo ser mono ou bissegmentados, sendo, no último caso, os dois componentes genômicos, denominados DNA-A e DNA-B. No DNA-A, encontram-se os genes que codificam as proteínas necessárias para a replicação viral e encapsidação. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein, MP e Nuclear Shuttle Protein, NSP, ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. Os geminivírus são altamente dependentes de fatores do hospedeiro para sua proliferação. A proteína NSP interage com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada NIK (NSP-Interacting Kinase) de tomate, soja e Arabidopsis. Foi demonstrado, em estudos anteriores, que a inativação do gene NIK aumenta a suscetibilidade dos mutantes à infecção viral. Visando elucidar o possível papel de NIK no mecanismo de proteção à infecção por geminivírus, este estudo propôs uma avaliação dos efeitos da superexpressão de NIK na resposta de tomate à infecção por geminivírus. Assim sendo, o gene NIK de Arabidopsis thaliana foi utilizado para transformar tomateiro. Os transformantes primários foram confirmados por PCR, selecionados por RT- PCR, de acordo com a expressão do transgene, repicados in vitro e utilizados em experimentos de análise de desenvolvimento in vitro e em casa-de-vegetação. Análises fenotípicas demonstraram que a superexpressão da proteína promoveu retardo de crescimento dos transformantes, os quais apresentaram baixa estatura, menor comprimento caulinar, menor desenvolvimento de sistema radicular e aéreo, folhas enrugadas/encarquilhadas. O fenótipo observado nas linhagens transgênicas superexpressando NIK é muito similar àquele resultante da inibição da via de biossíntese ou sinalização de brassinosteróides. Os ensaios de infectividade em tomateiro com o vírus ToYSV-[MG-Bi2] revelaram que a superexpresão de NIK causou atenuação dos sintomas uma vez que os transformantes apresentaram menor severidade de sintomas em relação ás linhagens não transformadas. Estes resultados são consistentes com o papel protetor de NIK contra a infecção viral e sugere que a sinalização mediada por NIK comunica-se, em algum nível, com a via de sinalização de brassinosteróides.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 478603 bytes, checksum: 2f73d62b9c5b69dd70468c095488ebaf (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / NIK (NSP-Interacting Kinase) is a receptor-like kinase involved in defense against geminiviruses, which was first identified as a virulence target of the begomovirus transport protein NSP (Nuclear Shuttle Protein). We have previously identified that NIK activation mediates an indirect phosphorylation of the ribosomal protein L10 causing the translocation of the cytosolic protein to the nucleus, where it interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to regulate genes involved in the translation machinery resulting in a global translation suppression. Constitutive activation of NIK, through ectopic expression of the mutant T474D in Arabidopsis, has been previously shown to induce the plant immune system. In this investigation, we examined further whether activation of the signaling module NIK-RPL10-LIMYB would transduce a typical defense signal that promotes the induction of the plant immune system. However, the current results suggest that the NIK-mediated antiviral signaling does not induces the basal immune system. Firstly, the global variation of gene expression by ectopic expression of the constitutively activated mutant receptor T474D or LIMYB does not cause a gene enrichment in the up-regulated list of typical defense categories, such as response to pathogens, response to virus and virus-induced gene silencing. Secondly and very importantly, quantitative RT-PCR of a representative sample of defense genes confirmed that they are not up-regulated by expression of T474D or LIMYB. In contrary, expression of LIMYB in the transgenic lines caused a down-regulation of the defense genes examined. We have also examined new host targets that interact with NSP. Initially, we used a 12000 Arabidopsis protein expression-based microarray to isolate a t-SNARE-like protein with the capacity to bind NSP in vitro. This interaction NSP-At4g30240 protein was further confirmed by two- hybrid assay in yeast and by bimolecular fluorescence complementation assay in planta. Our results indicate that At4g30240 interacts with NSP in vivo to mediate or facilitate the viral protein transport among cell compartments. / NIK (NSP-Interacting Kinase) é um receptor cinase envolvido na resposta de defesa contra geminivírus, e foi primeiramente identificado como alvo de virulência da proteína de transporte NSP (Nuclear Shuttle Protein) de begomovírus. Previamente, foi identificado que a ativação de NIK medeia a fosforilação indireta da proteína ribossomal L10, promovendo a translocação da proteína citosólica para o núcleo, onde interage com a proteína LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein), para regular genes envolvidos na maquinaria de tradução da célula, resultando em supressão da tradução global. Foi também demonstrado que a ativação constitutiva de NIK1, através da expressão ectópica do mutante T474D, induz o sistema imune de plantas em Arabidopsis. Nesta investigação, foi analisado em maiores detalhes se a ativação do módulo de sinalização NIK-RPL10-LIMYB também transmitiria um sinal típico de defesa, resultando na indução do sistema imune de plantas. Entretanto, os resultados encontrados sugerem que a via de sinalização antiviral mediada por NIK não transmite o sinal de defesa típico que culmina na ativação de genes relacionados ao sistema imune de plantas. Em primeiro lugar, por meio de estudos de variação global de expressão gênica, induzida por expressão ecotópica do mutante constitutivo T474D ou LIMYB, foi constatado que não houve enriquecimento gênico significativo na lista dos genes regulados positivamente nas categorias de defesa, como resposta de defesa a patógenos, resposta de defesa a vírus e silenciamento gênico induzido por vírus. Além disso, RT- PCR quantitativo de uma amostra representativa dos genes de defesa confirmou que estes genes de defesa não foram regulados positivamente pela expressão de T474D ou LIMYB. Ao contrário, a expressão de LIMYB nas linhagens transgênicas promoveu a regulação negativa dos referidos genes de defesa. Nesta investigação, também se avaliou novos alvos do hospederio que interagem com NSP. Inicialmente, foi isolada, por meio de microarranjos de expressão de 12.000 proteínas de Arabidopsis, uma proteína com características de uma t-SNARE, codificada pelo locus At4g30240 com a capacidade de interagir com NSP in vitro. Esta interação NSP- proteína At4g30240 foi confirmada em ensaios de duplo hibrido em leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular in planta. Os resultados indicam que At4g30240 interage com NSP in vivo, e pode mediar ou mesmo facilitar o transporte dessa proteína viral entre compartimentos celulares.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 835531 bytes, checksum: 813caac126d354619ba3de602cddedc4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Feline coronavirus (FCoV) is an enveloped virus RNA single-stranded, which belongs to the family Coronaviridae and the order Nidovirales. This virus is an important pathogen of wild and domestic cats and can cause a mild or inapparent enteric infection and also a rare and fatal disease called feline infectious peritonitis (FIP). The precise cause of FIP is still unknown but some hypotheses are suggested. The most accepted hypothesis is the theory of internal mutation that suggests a less virulent biotype of FCoV (FECV), would lead to other more pathogenic biotype (FIPV), capable of infecting monocytes and macrophages leading to FIP. However, despite being the most mentioned, there are still uncertainties in the relationship of the FCoV genome with the disease phenotype. This work presents a review from different FCoV studies attempt to elucidate existing theories on the pathogenesis of FCoV infection and tested through phylogenetic and phylogeographic approaches, the 7b gene of the first Brazilians FCoV sequences of asymptomatic and symptomatic cats in order to study the correlation between genetic diversity of this gene and differentiation of the two biotypes (FECV and FIPV). The 7b gene was shown to be highly conserved among the isolates and there was no differentiation between FIPV and FECV biotypes in phylogeographical and phylogenetic analysis, calling into question the theory of mutation. / O Feline coronavirus (FCoV) é um vírus envelopado de RNA fita simples, pertencente a família Coronaviridae e a ordem Nidovirales. Esse vírus é um importante patógeno de felinos domésticos e selvagens e pode causar uma inaparente ou leve infecção entérica e também causar uma doença imunomediada e fatal denominada peritonite infecciosa felina (PIF). A causa precisa da PIF ainda é desconhecida, mas algumas hipóteses são sugeridas. A hipótese mais aceita é a teoria da mutação interna que sugere que um biotipo menos virulento do FCoV (FECV), daria origem a outro biotipo mais patogênico (FIPV), capaz de infectar monócitos e macrófagos levando a PIF. Entretanto, apesar de ser a mais citada, ainda existem incertezas da relação do genoma do FCoV com o fenótipo da doença. Este trabalho, apresenta uma revisão com as diferentes pesquisas que tentam elucidar as teorias existentes sobre a patogênese da infecção pelo FCoV e testa, por meio de abordagens filogenética e filogeográfica, o gene 7b das primeiras sequências brasileiras de FCoV de gatos assintomáticos e sintomáticos, a fim de estudar, a correlação entre a diversidade genética desse gene e a diferenciação dos dois biotipos (FIPV e FECV). O gene 7b se mostrou altamente conservado entre os isolados virais e não houve diferenciação, na análise filogenética e filogeográfica, dos biotipos FIPV e FECV, pondo em questionamento a teoria da mutação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The present study aims shows that Scientific Literacy involves more than the domain of scientific theories and concepts, it shows that it is necessary to incorporate understanding about the Nature of Science, thus promoting the development of scientific skills in the classroom. The History of Science is an important component when trying to understand the Nature of Science. This study was carried out in a rural elementary school with 12-to-15-year-old students. It was developed through a collaborative activity which aimed at rewriting the classic Micrographia book written by Robert Hooke in 1665. It was tested if this activity improve the possibility to teach aspects about the History and Nature of Science by developing scientific competences. In order to rewrite the book, students were first introduced to the historical context in which Robert Hooke lived, demonstrating cultural and scientific aspects related to that historical period. In the next step, students explored their home and school environments using a microscope made by themselves, built with PET bottles and lenses obtained from CD / DVD players to unravel an invisible world in which they had not previously known. After these steps, students had to draw and describe the structures observed using the microscopes, where they collaboratively rewrote the classic book, creating a replica. The learning evidences were evaluated through a quantitative tool called the Historical Word Association Test (HWAT), which aims to evaluate the general view of students about the historical period and the sociocultural circumstances involved. The students who participated in the didactic activity showed improvement in the identification and retention of ideas associated to the history of the discovery of the microscopic world, comparing to students who did conventional activities. / O presente estudo busca mostrar que a Alfabetização Científica envolve mais do que o domínio das teorias científicas e conceitos, mostra que é preciso incorporar a compreensão sobre a Natureza da Ciência, assim promovendo o desenvolvimento de competências científicas em sala de aula. A História da Ciência é um componente importante para compreender a Natureza da Ciência. Este estudo realizou-se em uma escola rural de ensino fundamental, com estudantes entre 12 a 15 anos de idade, foi desenvolvido por meio de uma atividade colaborativa visando reescrever o livro clássico Micrographia, escrito por Robert Hooke, em 1665, testamos a hipótese de que com esta atividade é possível ensinar aspectos sobre a História e a Natureza da Ciência desenvolvendo competências científicas. Para reescrever o livro, primeiramente os alunos foram apresentados ao contexto histórico em que viveu Robert Hooke, demonstrando aspectos culturais e científicos relacionados ao período histórico. Na próxima etapa, os alunos exploraram o ambiente escolar e domiciliar utilizando um microscópio feito por eles mesmos, construído com garrafas PET e lentes obtidas em leitores de CD/DVD para desvendar um mundo invisível que até então não conheciam. Após estas etapas, os alunos tiveram que desenhar e descrever as estruturas observadas nos microscópios, de forma colaborativa reescreveram o livro clássico criando uma réplica. As evidências de aprendizagem foram avaliadas por meio de uma ferramenta quantitativa, denominada Teste de Associação de Palavra Histórica (TAPH), que visa avaliar a visão geral de estudantes sobre o período histórico e as circunstâncias socioculturais envolvidas. Os alunos que participaram da atividade didática mostraram melhoria na identificação e retenção de ideias associadas à história da descoberta do mundo microscópico, comparando com estudantes que fizeram atividades convencionais.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-13. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:17:09Z : No. of bitstreams: 1 000865794.pdf: 288082 bytes, checksum: 4caa937ffe33b2b4487a6a35ea700ffd (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As deficiências nos compostos antioxidantes podem acelerar a progressão da doença por HIV influenciando no aumento do estresse oxidativo, que tem sido relacionado tanto com o uso da terapia antirretroviral (TARV) quanto com a própria infecção pelo HIV. O selênio tem um papel importante na infecção pelo HIV, sobretudo devido ao seu envolvimento na regulação do estresse oxidativo. Seus efeitos são dependentes da sua forma química e concentração, destacando-se a importância da especiação química. O presente estudo buscou avaliar se a infecção pelo HIV e o tempo de uso da TARV estão associados com maior dano oxidativo, baixas concentrações de selênio e seus metabólitos e uma menor proteção antioxidante da glutationa e da glutationa peroxidase. Trata-se de um estudo transversal, constituído por 120 indivíduos de ambos os sexos agrupados em: Grupo Controle (GC), HIV negativo, n=40; Grupo 1 (G1) HIV positivos em uso de TARV há mais de 5 anos, n=40; e Grupo 2 (G2), HIV positivos em uso de TARV há menos de 5 anos, n=40. Foram avaliados o selênio plasmático, selênio eritrocitário e a selenometionina. Os parâmetros antioxidantes foram a concentração da glutationa e a atividade da glutationa peroxidase. O estresse oxidativo foi medido por meio do malondialdeído. Avaliou-se ainda a ingestão alimentar e antropometria. A análise atual indicou que os indivíduos do presente estudo possuem a ingestão de selênio adequada e que a ausência de deficiência de selênio plasmático está associada ao uso da TARV. Foi observado que a infecção pelo HIV e o uso da TARV influenciam no estresse oxidativo, que por sua vez promove um aumento na expressão das defesas antioxidantes, medidas pela glutationa e glutationa peroxidase. Em relação a selenometionina, é possível que o aumento na sua concentração esteja relacionado à forma química... / The antioxidant components deficiencies may hasten the progression of HIV disease increasing the oxidative stress, which has been associated with both use of antiretroviral therapy (ART) and HIV infection. Selenium has an important role in HIV infection mainly due to its involvement in oxidative stress regulation. Its beneficial effects are dependent on their chemical form and concentration, highlighting the importance of selenium speciation. The present study aimed to evaluate whether HIV infection and ART time of use are associated with increased oxidative damage, low concentrations of selenium and its metabolites, and reduced antioxidant protection of glutathione and glutathione peroxidase. This is a cross-sectional study consisted of 120 individuals that were classified as: Control Group (GC), HIV negatives, n=40; Group 1 (G1), HIV positives under ART for more than 5 years, n=40; and Group 2 (G2), HIV positives under ART for less than 5 years, n=40. Plasma selenium, erythrocyte selenium and selemethionine were evaluated. The antioxidant parameters were glutathione concentration and glutathione peroxidase activity. Oxidative stress was measured by malondialdehyde. In addition, we evaluated the dietary intake and anthropometry. The current analysis indicated that the subjects in this study had adequate selenium ingestion and the absence of plasma selenium deficiency was associated with the use of ART. We observed that HIV infection and use of ART influence oxidative stress, which in turn promotes an increase of the expression of antioxidant defenses, measured by glutathione and glutathione peroxidase. About selenomethionine, it is possible that its concentration increase is related to the chemical form of the ingested selenium and that the use of ART contributes to its decrease. However, further studies are necessary to understand the influence of ...

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RoberioMN.pdf: 839058 bytes, checksum: 1087756ecda3734e7aef07c3e72cb26c (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / ?-D-glucosidase (EC 3.2.1.21) is one of the most interesting glycosidases, especially for hydrolysis cellobiose releasing glucose, is last step degradation of cellulose. This function makes the ?-D-glucosidase is of great interest as a versatile industrial biocatalyst, being critical to various bio-treatment / biorefinery processes, such as bioethanol production. Hen in the report, a ?-D-glucosidase was extracts from protein extracted of the invertebrate marine Artemia franciscana was purified and characterized with a combination of precipitation with ammonium sulfate (0 - 30%, 30 to 50%, 50 to 80%), the fraction saturated in the range of 30 to 50% (called F-II) was applied in a molecular exclusion chromatography, in Sephacryl S-200, the fractions corresponding to the first peak of activity of ?-D-glucosidase were gathered and applied in a chromatography of ion exchange in Mono Q; the third peak this protein obtained chromatography, which coincides with the peak of activity of ?-D-glucosidase was held and applied in a gel filtration chromatography Superose 12 where the first peak protein, which has activity of ?-D-glucosidase was rechromatography on Superose 12. This enzyme is probably multimerica, consisting of three subunit molecular mass of 52.7 kDa (determined by SDS-PAGE) with native molecular mass of 157 kDa (determined by gel filtration chromatography on Superose 12 under the system FPLC). The enzyme was purified 44.09 times with a recovery of 1.01%. Using up p-nitrophenyl-?-D-glucopiranoside as substrate obtained a Km apparent of 0.229 mM and a Vmax of 1.109 mM.60min-1.mL-1mM. The optimum pH and optimum temperature of catalysis of the synthetic substrate were 5.0 and 45 ?C, respectively. The activity of the ?-D-glucosidase was strongly, inhibited by silver nitrate and N- etylmaleimide, this inhibition indicates the involvement of radical sulfidrila the hydrolysis of synthetic substrate. The ?-D-glucosidase of Artemia franciscana presented degradativa action on celobiose, lactose and on the synthetic substrate ?-nitrophenyl-?-D-glucopiranoside indicating potential use of this enzyme in the industry mainly for the production of bioethanol (production of alcohol from the participating cellulose), and production hydrolysate milk (devoid of milk lactose) / ?-D-glicosidase (EC 3.2.1.21) ? uma das mais interessantes glicosidases, especialmente por hidrolisar celobiose liberando glicose, ?ltimo passo de degrada??o de celulose. Esta fun??o faz com que a ?-D-glicosidase seja de grande interesse como um vers?til biocatalizador industrial, sendo critica para v?rios processos de bio-tratamento / biorrefinaria, como produ??o de bioetanol. Neste trabalho, uma ?-D-glicosidase extra?da de extratos prot?icos do invertebrado marinho Artemia franciscana foi purificada e caracterizada com uma combina??o de precipita??o com sulfato de am?nio (30; 50; 80%), a fra??o saturada na faixa de 50% (chamada F-II) foi aplicada em uma cromatografia de exclus?o molecular em Sephacryl S-200, as fra??es correspondentes ao primeiro pico de atividade da ?-D-glicosidase foram reunidas e aplicadas numa cromatografia de troca i?nica em Mono Q; o terceiro pico prot?ico obtido nessa cromatografia, o qual coincide com o pico de atividade da ?-D-glicosidase, foi reunido e aplicado numa cromatografia gel filtra??o Superose 12 onde o primeiro pico prot?ico, o qual possui atividade da ?-D-glicosidase, foi recromatografado em Superose 12. Esta enzima provavelmente ? multimerica, constitu?da por tr?s subunidades, de massa molecular de 52,7 kDa (determinado por SDS-PAGE) e com massa molecular nativa de 157 kDa (determinado por cromatografia gel filtra??o em Superose 12 sob o sistema FPLC). A enzima foi purificada 44,09 vezes com uma recupera??o de 1,01%. Utilizando-se ?-nitrofenil-?-D-glicopiranos?deo como substrato obtivemos uma Km aparente de 0,229 mM (12,7 ?M de produto/cm/hora) e Vm?x de 1,109 mM.60min-1.mL-1. O pH ?timo e a temperatura ?tima de cat?lise do substrato sint?tico foram 5,0 e 45?C, respectivamente. A atividade ?-D-glicosid?sica foi fortemente inibida por nitrato de prata e N-etilmaleimida, esta inibi??o indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidr?lise do substrato sint?tico. A ?-D-glicosidase de Artemia franciscana apresentou a??o degradativa sobre celobiose, lactose e sobre o substrato sint?tico ?-nitrofenil-?-D-glicopiranos?deo, indicando potencial uso desta enzima na ind?stria principalmente para produ??o de bioetanol (produ??o de ?lcool a parti de celulose) e produ??o de leite hidrolisado (leite destitu?do de lactose)

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielleSM.pdf: 1455943 bytes, checksum: 8efcc0f4d0f0ac8dfc93b332700f07cb (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Four different sponge species were screened using Ouchterlony agarose gel and immunodiffusion tests to identify cross-reactivity with the polyclonal antibody IgG anti-deglicosilated CvL, a lectin from Cliona varians. Crude extract from the sponge Cinachyrella apion showed cross-reactivity and also a strong haemmaglutinating activity towards human erythrocytes of all ABO groups. Thus, it was submitted to acetone fractionation, IgG anti-deglicosilated CvL Sepharose affinity chromatography, and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC-AKTA) gel filtration on a Superose 6 10 300 column to purify a novel lectin. C. apion lectin (CaL) agglutinated all types of human erythrocytes with preference for papainized type A and O erythrocytes. The haemagglutinating activity is independent of Ca2+, Mg2+ and Mn2+ ions, and it was strongly inhibited by the disaccharide D-lactose, up to a minimum concentration of 6.25 mM. CaL molecular mass determined by FPLC-AKTA gel filtration on a Superose 12 10 300 column and SDS gel electrophoresis was approximately 124 kDa, consisting of eight subunits of 15.5 kDa, assembled by hydrophobic interactions. The lectin was relatively heat- and pH-stable. Leishmania chagasi romastigotes were agglutinated by CaL, indicating that lactose receptors could be presented in this parasite stage. These findings are indicative of the physiological defense roles of CaL and its possible use in the antibiosis of pathogenic protozoa / Uma varredura de lectinas foi realizada em extratos prot?icos de quatro esp?cies de esponjas utilizando t?cnicas de imunodifus?o para identificar lectinas imunorreativas ao anticorpo policlonal gerado contra CvL, uma lectina de Cliona varians. O extrato bruto da esponja Cinachyrella apion foi imunorreativo e apresentou atividade hemaglutinante a eritr?citos humanos de todos os grupos do sistema ABO. Assim, ele foi submetido ao fracionamento com acetona, ? cromatografia de afinidade com IgG anti-CvL desglicosilada ligada a Sepharose e ? romatografia de gel filtra??o em uma coluna Superose 6 10 300 GL em istema FPLC-AKTA (Fast Protein Liquid Chromatography) para a purifica??o de uma lectina imunorreativa ao anticorpo IgG anti-CvL. A lectina de C. apion (CaL) aglutinou todos os tipos de eritr?citos humanos, com prefer?ncia por eritr?citos papainizados dos tipos A e O. A atividade hemaglutinante mostrou-se independente dos ?ons Ca2+, Mg2+ e Mn2+, e foi fortemente inibida pelo dissacar?deo D-lactose, at? a concentra??o m?nima de 6,25 mM. A massa molecular da CaL, determinada por gel filtra??o em uma coluna Superose 12 10 300 GL em sistema FPLC-AKTA e eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, foi de aproximadamente 124 kDa, consistindo de oito subunidades de 15,5 kDa, unidas por intera??es hidrof?bicas. A lectina foi relativamente est?vel em extensas faixas tanto de pH quanto de temperatura. Promastigotos de Leishmania chagasi foram aglutinados por CaL, indicando que receptores de lactose podem estar presentes nesse est?gio do parasita. Esses achados s?o indicativos do papel de defesa fisiol?gica da CaL e do seu poss?vel uso na antibiose de protozo?rios patog?nicos