CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Biofilmes sÃo comunidades microbianas que encontram-se irreversivelmente associadas a uma superfÃcie e estÃo inseridas em uma matriz polimÃrica produzida por elas mesmas. Os biofilmes estÃo comumente relacionados a infecÃÃes nosocomiais que apresentam maior resistÃncia a agentes antimicrobianos quando comparadas com cÃlulas planctÃnicas, dificultando assim seus tratamentos e limitando as opÃÃes terapÃuticas. Nesse sentido a busca por novas molÃculas com aÃÃo antimicrobiana e antibiofilme tornou-se uma Ãrea ativa na pesquisa cientÃfica. Os vegetais sÃo fontes de uma variedade de molÃculas com propriedades antimicrobianas, dentre estas podemos citar as lectinas e os metabÃlitos secundÃrios. Diversos estudos tÃm relatado a aÃÃo antimicrobiana e antibiofilme dessas classes de molÃculas como forma alternativa ao uso de antibiÃticos. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a aÃÃo antimicrobiana e antibiofilme de diversas lectinas isoladas de leguminosas e algas, bem como de dois metabÃlitos secundÃrios isolados de plantas, derriotusona A (isolado de Lonchocarpus obtusus) e diterpeno casbano (isolado de Croton nepetaefolius). Os resultados demonstraram que algumas das lectinas testadas foram capazes de inibir o crescimento planctÃnico e/ou a formaÃÃo de biofilme de determinados micro-organismos. A lectina isolada de Vaitarea macrocarpa (VML) mostrou ser a lectina mais promissora, mostrando forte aÃÃo sobre o crescimento planctÃnico e formaÃÃo de biofilmes de Staphylococcus aures e Staphylococcus epidermidis. Derriobstusona A mostrou uma potencial aÃÃo antibacteriana e antibiofilme sobre S. aureus, enquanto que, Escherichia coli apresentou menor sensibilidade ao composto. Em adiÃÃo, derriotusona A demonstrou uma potencial aÃÃo antioxidante. Em relaÃÃo ao diterpeno casbano, em geral o composto foi capaz de inibir o crescimento planctÃnico, formaÃÃo de biofilmes e causar danos nos biofilmes prÃ-formados de S.aures, S. epidermidis, Candida albicans e Candida glabrata, e mostrou ainda ser efetivo contra biofilmes formados pela associaÃÃo entre estas bactÃrias e leveduras. Em conclusÃo, os resultados mostraram que algumas lectinas, assim como os metabÃlitos secundÃrios utilizados nesse estudo, podem ser consideradas potenciais agentes antimicrobianas e antibiofilmes, sugerindo assim o uso dessas molÃculas no tratamento de infecÃÃes associadas a diferentes micro-organismos. / Biofilms are microbial communities that are irreversibly attached to a surface and are embedded in a polymeric matrix produced by them. Biofilms are commonly related to nosocomial infections that showing an enhanced resistance to antimicrobial agents compared to planktonic cells, thus hindering their treatments and limiting therapeutic options. In this context, the search for new molecules with antimicrobial and antibiofilm action has become an active area of research. The plants are sources of a variety of molecules with antimicrobial properties, among them we can mention the lectins and secondary metabolites. Several studies have reported the antimicrobial and antibiofilm action of these molecules classes as an alternative to antibiotics. Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial and antibiofilm of various lectins isolated from leguminous and algae, as well as two secondary metabolites isolated from plants , derriotusone A (isolated from Lonchocarpus obtusus) and casbane diterpene (isolated from Croton nepetaefolius). The results showed that some lectins tested were able to inhibit the planktonic growth and/or the biofilm formation of certain microorganisms. The lectin isolated from Vaitarea macrocarpa (VML) showed to be the most promising lectin, showing strong action on the planktonic growth and biofilm formation of Staphylococcus aures and Staphylococcus epidermidis. The derriobstusone A showed potential antibacterial and antibiofilm activite on S. aureus, whereas Escherichia coli showed lower sensitivity to the compound. In addition, derriotusone showed a potential antioxidant activity. Regarding to casbane diterpene, in general the compound was able to inhibit planktonic growth, formation of biofilms and disrupt the preformed biofilms of the S.aures, S. epidermidis, Candida albicans and Candida glabrata, and also showed to be effective against biofilms formed by the association between these bacteria and yeasts. In conclusion, the results showed that some lectins, as the secondary metabolites used in this study, may be considered as potential antimicrobial and antibiofilm agents, thus suggesting the use of these molecules in the treatment of infections associated with different microorganisms.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The pulsed light (PL) is a technology emergent used as abiotic stressor to increase the content of phytochemicals of fruits and vegetables. However, their effects vary depending on the cultivar, the dose hormetic, the mode of application of dose and the maturation stage of fruits. In this work, we start from the main hypothesis that changes in the metabolism of the fruits of mangoes treated with low doses of pulsed light would trigger responses that result in a positive impact on the content of phytochemicals, without any negative effect on the fruit quality parameters. This work was divided into three chapters. Chapter I is a literature review and state of the art of the main topics covered throughout the study. In the second chapter (experiment I), mangoes mature physiologically (maturation stage 3) were subjected to a hormetic dose of pulsed light 0.6 J cm-2 and analyzed after 7 days storage at 20 ÂC, for the physicochemical characteristics [soluble solid (SS), titratable acidity (TA), SS/TA ratio, overall appearance, color and firmness], enzymatic antioxidant metabolism [superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX)] and non-enzymatic [ascorbate, total carotenoids, total anthocyanins, yellow flavonoids, total phenolic, mangiferin content and total antioxidant activity], membrane integrity [lipid peroxidation (MDA), hydrogen peroxide content and electrolyte leakage], phenylalanine ammonia lyase activity (PAL), enzymes of enzymatic browning [polyphenoloxidase (PPO), peroxidase of guaiacol (GPOD) and activity of enzymes wall cell [pectinmethylesterase (PME) and polygalacturonase (PG)] and the influence of treatment on tissue histology. The activity of antioxidant enzymes such as catalase and superoxide dismutase was found to be substantially enhanced in both the epicarp and the mesocarp of fruits exposed to PL after 7 days at 20 ÂC. There were no differences in indicators of cell wall and membrane integrity such as MDA content suggesting that the PL-associated oxidative stress was effectively prevented by the enhanced activity of antioxidant enzymes after 7 days. Activities of cell wall enzymes were reduced after 7 days in the PL-treated fruits. Microscopic as well as macroscopic observations confirmed that PL-treated fruits were not damaged. We observed that contents in total carotenoids, in total phenolic, and, to a lesser extent, in vitamin C, were dramatically increased after 7 days, generally in both the epicarp and the mesocarp PL-treated resulting in fruits with high antioxidant capacity. Carotenoids increased 350% in treated-pulp at J7. The higher levels in phenolics in treated-peel (+97%) were associated with enhanced activity of PAL (+98%) and enhanced content in mangiferin (+42%). Although G-POD in the mesocarp and PPO in the epicarp increased 1268% and 22% respectively, after 7 days in the PL-treated fruits, we did not observe increases in browning. Was observed at the end of the experiment I an increase of phytochemicals in mangoes subjected to hormetic dose of 0.6 J cm-2 without negative changes in fruit quality. In the third chapter (experiment II), mangoes minimally processed (maturation stage 4) were subjected to four different treatments: control (not flashed), 1 pulse, 4 pulses, and 1 pulse (4 days) prior to storage at 6 ÂC in order to assess whether the mode of application of the different doses used could interfere on physiochemical variables [firmness, color, SS, loss weight and rate respiration] the bioactive compounds [ascorbate (AsA) and carotenoids] and total antioxidant activity by a storage period of 7 days at 6 ÂC. Samples flashed with 1 pulse during 4 alternated days (4 x 0.6 J cm-2 = 2.80 J cm-2) increased the total ascorbate (AsA) (~40% more than the control) at time 7 days but the cubes of mangoes are darker than treatment that received the same dose of 4 successive pulses (2.80 J cm-2). At end of storage fresh cut mangoes received 4 successive pulses exhibited a better quality in comparison to the other treatments that was associated a higher content carotenoid (0.894 mg g-1) and antioxidant activity (~145 μmol trolox 100 g-1). In conclusion, our data suggest that a hormetic dose of pulsed light can be used to increase concentrations of phytochemical compounds without negative effects on the quality criteria. / A luz pulsada (LP) à uma tecnologia emergente usada como estressor abiÃtico para aumentar o teor de fitoquÃmicos em frutos e vegetais. No entanto, seus efeitos variam dependendo da cultivar, da dose hormÃtica, do modo de aplicaÃÃo da dose e do estÃdio de maturaÃÃo do fruto. Neste trabalho, partimos da hipÃtese de que alteraÃÃes no metabolismo dos frutos de mangas tratadas por baixas doses de luz pulsada desencadeariam respostas que resultariam em um impacto positivo sobre o conteÃdo de fitoquÃmicos, sem qualquer efeito negativo sobre os parÃmetros de qualidade dos frutos. Este trabalho foi dividido em trÃs capÃtulos. O capÃtulo I trata de uma revisÃo de literatura e estado da arte dos principais tÃpicos abordados ao longo do estudo. No segundo capÃtulo (experimento I), mangas fisiologicamente maduras (estÃgio de maturaÃÃo 3) foram submetidas a uma dose de luz pulsada de 0,6 J cm-2 e analisadas decorridos 7 dias de armazenamento a 20 ÂC, quanto Ãs caracterÃsticas fisico-quÃmicas [sÃlidos solÃveis (SS), acidez titulÃvel (AT), relaÃÃo SS/AT, aparÃncia geral cor, firmeza], metabolismo antioxidante enzimÃtico [dismutase do superÃxido (SOD), catalase (CAT) e peroxidase do ascorbato (APX)] e nÃo-enzimÃtico [vitamina C, carotenÃides totais, antocianinas totais, flavonÃides amarelos, polifenÃis totais, conteÃdo de mangiferina e atividade antioxidante total], integridade de membrana [peroxidaÃÃo lipÃdica (MDA), perÃxido de hidrogÃnio e extravasamento de eletrÃlitos], atividade da fenilalanina amÃnia liase (PAL), atividade das enzimas de escurecimento [polifenoloxidase (PPO) e peroxidase do guaiacol (G-POD)], atividade das enzimas de parede celular [pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG)] e a influÃncia do tratamento na histologia dos tecidos. A atividade das enzimas antioxidantes como a dismutase superÃxido e a catalase encontraram-se elevadas tanto na polpa quanto na casca dos frutos expostos à LP apÃs 7 dias a 20 ÂC. NÃo foram encontradas diferenÃas significativas nos indicadores de parede celular e integridade de membrana como o MDA, sugerindo que o estresse oxidativo associado à LP foi efetivamente prevenido atravÃs do aumento da atividade das enzimas antioxidantes apÃs 7 dias. Atividades das enzimas de parede celular foram reduzidas apÃs 7 dias nos frutos tratados. ObservaÃÃes macroscÃpicas e microscÃpicas confirmaram que os frutos nÃo foram danificados pela LP. O conteÃdo de carotenÃides totais, fenÃlicos, e em menor extensÃo, a vitamina C, foram dramaticamente aumentados apÃs 7 dias, tanto no epicarpo como mesocarpo tratados pela LP, resultando em frutos com alta capacidade antioxidante. CarotenÃides aumentaram 350% na polpa tratada pela LP apÃs 7 dias. Os nÃveis mais elevados de compostos fenÃlicos (+97%) na casca tratada foram associados a uma atividade aumentada da PAL (+98%) e conteÃdo de mangiferina (+42%). As atividades da G-POD no mesocarpo e da PPO no epicarpo aumentaram 1268% e 22% respectivamente, apÃs 7 dias nos frutos tratados, no entanto, nÃo foi observado escurecimento dos frutos. Observou-se, ao final do primeiro experimento, um aumento dos fitoquÃmicos em mangas submetidas a dose hormÃtica de 0,6 J cm-2 sem alteraÃÃes negativas na qualidade dos frutos. No terceiro capÃtulo (experimento II), mangas minimamente processadas (estÃgio de maturaÃÃo 4), foram submetidas a quatro diferentes tratamentos: controle, 1 pulso, 4 pulsos e 1 pulso por dia durante 4 dias, com o objetivo de avaliar se o modo de aplicaÃÃo da LP poderia interferir nas variÃveis fisico-quÃmicas [firmeza, SS, cor, perda de matÃria fresca e taxa de respiraÃÃo], compostos bioativos [carotenÃides e vitamina C] e atividade antioxidante total quando armazenamentos durante 7 dias a 6 ÂC. Amostras que receberam 4 pulsos alternados (4 x 0,7 J cm-2 = 2,80 J cm-2), aumentaram o conteÃdo de ascorbato total (~40%) apÃs 7 dias, no entanto, os cubos apresentaram-se mais escuros do que o tratamento que recebeu a mesma dose de 4 pulsos sucessivos. No final do perÃodo de armazenamento, as mangas minimamente processadas que receberam 4 pulsos sucessivos exibiram uma melhor qualidade em comparaÃÃo com os demais tratamentos, que foi associado ao elevado teor de carotenÃides (0,894 mg g-1 MF) e atividade antioxidante (~145 μmol trolox 100 g-1). Como conclusÃo, nossos dados sugerem que uma dose hormÃtica de luz pulsada pode ser utilizada para aumentar as concentraÃÃes de compostos fitoquÃmicos sem efeitos negativos na qualidade de frutos de mangas âTommy Atkinsâ.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Calotropis procera à uma planta laticÃfera, pertencente à famÃlia Apocynaceae. ProteÃnas de defesa foram descritas no lÃtex com atividade contra insetos fitÃfagos e fungos fitopatogÃnicos. A fraÃÃo proteica do lÃtex tambÃm apresenta atividades farmacolÃgicas, dentre tais efeito citotÃxico seletivo em cÃlulas carcinogÃnicas. A partir da fraÃÃo proteica efetiva sobre cÃlulas neoplÃsicas, o trabalho teve por meta central identificar proteÃna(s) citotÃxica(s) e proceder a sua caracterizaÃÃo bioquÃmica, biolÃgica e suas perspectivas biotecnolÃgicas. As proteÃnas solÃveis do lÃtex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iÃnica e a fraÃÃo proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iÃnica (Mono-Q) acoplada a sistema de mÃdia pressÃo. P4 foi identificado como a fraÃÃo citotÃxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 Âg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A anÃlise proteÃmica da fraÃÃo citotÃxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteÃnas Ãcidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilaÃÃes. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequÃncia amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolÃtica, com pH Ãtimo variando entre 5-6 e temperatura Ãtima de 25 ÂC. A atividade quitinolÃtica foi reduzida quando tratada com concentraÃÃes crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presenÃa de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. AnÃlises por dicroÃsmo circular indicam a presenÃa majoritÃria de alfa-hÃlices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variaÃÃes de temperatura e pH. Imagens de alta resoluÃÃo geradas por microscopia de forÃa atÃmica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamÃrico foi evidenciado. As quitinases nÃo inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinaÃÃo de esporos de C. gloeosporioides. Em consonÃncia as quitinases nÃo induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alteraÃÃes na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticÃferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletÃrio sobre o inseto fitÃfago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de reduÃÃo na sobrevivÃncia larval, reduÃÃo do peso de larvas (7,8 mg  0,2 /4,0  0,8) e emergÃncia de insetos adultos (50%), alÃm de prolongar de 28 para 33 dias o tempo mÃdio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatÃria, reduzindo em 95% a infiltraÃÃo de neutrÃfilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamaÃÃo induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima Ãxido nÃtrico sintase, indicando o possÃvel envolvimento do Ãxido nÃtrico no efeito observado. Esta aÃÃo foi associada à reduÃÃo dos nÃveis das citocinas prÃ-inflamatÃrias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos nÃveis sÃricos das citocinas prÃ-inflamatÃrias TNF-α, IL-6 e IL-1. à concluÃdo que vÃrias isoformas de quitinases coexistem no lÃtex de C. procera. Estas proteÃnas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas tÃm pouca aÃÃo contra fungos. As quitinases laticÃferas foram identificadas como as proteÃnas citotÃxicas do lÃtex sobre cÃlulas neoplÃsicas e ainda foram capazes de modular os nÃveis de citocinas prÃ-inflamatÃrias e sÃntese de Ãxido nÃtrico em modelo de inflamaÃÃo aguda. As quitinases do lÃtex de C. procera representam interessantes molÃculas para prospecÃÃo biotecnolÃgica em defesa vegetal e farmacologia. / Calotropis procera is a latificer plant in the Apocynaceae family. Defensive proteins with activity against phytophagous insects and phytopathogenic fungi in latex have been described. Latexâs proteic fraction also performs pharmacological activities, such as selective cytotoxic effect in carcinogenic cells. From the proteic fraction effective against neoplastic cells, this work had the goal to identify and further characterize cytotoxic protein(s) biochemically, biologically, and evaluate their biotechnological prospects. Soluble proteins in latex (LP) have been fractioned in ion-exchange matrix, and the fraction capable of cytotoxicity was further fractioned in another ion-exchange matrix (Mono-Q) coupled to a medium-pressure system. P4 was identified as cytotoxic fraction, showing an IC50 of 2.2, 1.2 and 2.9 mg/mL for the cell lines HCT-116, Ovcar-8 and SF-295, respectively. Proteomic analysis of the cytotoxic fraction by two-dimensional electrophoresis allowed 15 spots to be identified, comprising acid proteins (pI among 4 and 6) with 30 kDa apparent molecular weight. All spots were identified as chitinases when evaluated by mass spectrometry, and showed intact mass of 27.4 kDa. The sample reacted positively to the Schiff reagent, suggesting glycosilations. The carbohydrate content was estimated at 12.8%. The amino-terminal sequence obtained (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revealed 50% similarity with Solanum lycopersicum, Oryza sativa and Nicotiana tomentosiformes chitinases, among others. The enzymes showed strong chitinolytic activity, with optimal pH varying between 5-6 and optimal temperature of 25 ÂC. The chitinolytic activity was diminished when treated with increasing concentrations of DTT (3, 10 and 30 mM), which suggests the presence of disulfide bonds stabilizing the enzyme. Circular dichroism analyses indicate a larger presence of alpha helices in the structure and that the isoforms has low resistance to pH and temperature variation. High-resolution images generated through atomic force microscopy suggested sample homogeneity and a hexameric configuration. The chitinases did not inhibit mycelial growth of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides, however reduced the germination C. gloeosporioides spores. In consonancy the chitinases did not induce spore oxidative stress, but caused a slight change in membrane permeability of the evaluated spores. Laticifer chitinases (0.1% w/w) showed a strong deleterious effect on the phytophagous insect Callosobruchus maculatus. Effects produced a 57% survival reduction, larval weight reduction (7.8 mg  0.2 / 4.0  0.8), adult insets emergence reduction (50%), in addition to prolonging the mean maturation time from 28 to 33 days. The chitinases (2 mg/Kg, i.v.) showed a strong anti-inflammatory activity, reducing 95% of neutrophil infiltration into the peritoneal cavity in mouse in an inflammation induced by carrageenan assay. L-NAME and Aminoguanidine, two inhibitors of nitric oxide synthase, reversed this effect, possibly indicating involvement of nitric oxide in the effects observed. This action was associated to a reduction of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 levels within the peritoneal cavity and increased serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1. The conclusion is reached that many isoforms of chitinases coexist in C. procera latex. These proteins act possibly in defense against insects, though low action against fungi is shown. Laticifer chitinases were identified as latex proteins cytotoxic on neoplastic cells and they have even been able to modulate pro-inflammatory cytokines levels and nitric oxide in an acute inflammation model. C. procera laticifer chitinases represent interesting molecules for biotechnology prospection in plant defense and pharmacology.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora sÃo plantas laticÃferas. Em seus fluidos laticÃferos, foram encontradas proteÃnas do tipo osmotina. A literatura reporta que osmotinas sÃo proteÃnas relacionadas com mecanismos de defesa vegetal em situaÃÃes de estresse biÃtico e/ou abiÃtico. Entretanto, ainda hà vÃrias inconsistÃncias nessa afirmaÃÃo. Nesse contexto, tÃcnicas in vitro de cultura de tecidos vegetais foram aplicadas como modelo para auxiliar na compreensÃo de como as cÃlulas de calos de C. procera e C. grandiflora respondem ao estresse salino, em termos bioquÃmicos, e se o nÃvel de transcritos para a osmotina seria aumentado em resposta à exposiÃÃo a NaCl. Para induÃÃo desse estresse, NaCl foi adicionado à formulaÃÃo nutritiva de Murashige e Skoog (MS), em concentraÃÃes crescentes (0, 20, 40, 60 e 80 mM). Os resultados mostram que os calos cultivados com NaCl a 80 mM tiveram o crescimento e o teor de umidade reduzidos, respectivamente, em 33% e 10%, em C. procera e de 83% e 39%, em C. grandiflora, em comparaÃÃo ao seu tratamento controle. Nessas mesmas condiÃÃes, foi observado um aumento nas concentraÃÃes dos Ãons Na+ e Cl- de, respectivamente, 98,9% e 98%, em C. procera, e de 98,8% e 96%, em C. grandiflora. Foi tambÃm observada diminuiÃÃo no teor de K+ nos calos tratados com NaCl a 80 mM. Essa reduÃÃo foi de 43%, em C. procera, e de 18% em C. grandiflora, quando comparado ao tratamento controle. Os calos tratados com NaCl a 80 mM, apresentaram uma tendÃncia de acÃmulo de prolina e aÃÃcares solÃveis, alcanÃando, respectivamente valores, 26% e 37% maiores em calos de C. procera, e 55,4% e 45% maiores, em calos de C. grandiflora, que aqueles em condiÃÃes controle. O aumento na atividade das enzimas que degradam H2O2 foi observado em calos de C. grandiflora submetidos a estresse salino, sugerindo um possÃvel dano oxidativo. Esse aumento foi de 73%, para a ascorbato peroxidase, e de 62% para a peroxidase do guaiacol, nos calos tratados com NaCl a 80 mM, em relaÃÃo ao controle. NÃo foi observada qualquer alteraÃÃo significante na atividade das enzimas do sistema antioxidativo em razÃo do estresse salino em calos de C. procera. Em relaÃÃo à transcriÃÃo da osmotina, foi avaliado o perfil de seus transcritos nos intervalos de tempo de 0, 2, 12, 24, 48 horas e de 4, 7, 14 e 28 dias sob estresse. Os transcritos de osmotina foram observados a partir de 12 horas de contato dos calos com NaCl a 80 mM, em ambas as espÃcies. Contudo, nos extratos proteicos dos calos de C. procera e C. grandiflora cultivados em condiÃÃes controle e de 80 mM de NaCl, nÃo foi detectada a presenÃa da proteÃna osmotina quando avaliado pelos ensaios de eletroforese, Dot blotting e espectrometria de massas. Assim, a avaliaÃÃo do estresse salino utilizando como modelo de estudo cÃlulas in vitro foi eficiente, fornecendo informaÃÃes do comportamento celular de duas espÃcies laticÃferas, mostrando suas alteraÃÃes fisiolÃgicas, bioquÃmicas e moleculares. Os resultados sugerem que o estresse salino favoreceu o aumento da transcriÃÃo do gene da osmotina em calos das duas espÃcies em estudo e permite propor uma possÃvel relaÃÃo das osmotinas dessas espÃcies com a tolerÃncia à salinidade. A falha em detectar as proteÃnas correspondentes aos genes propicia a concepÃÃo de vÃrias novas hipÃteses a serem validadas. / Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora are laticiferous plants. It was found osmotin protein. The literature shows that the osmotinas are associated to plant defence mechanisms in situations of biotic or abiotic stress. However, there are still several inconsistencies in this hypothesis. In this context, it was used in vitro tissue culture techniques as model to assist in the understanding of how the C. procera and C. grandiflora callus cells respond to salt stress in biochemical terms, and whether the transcripts level for osmotin has raised in response to exposure to NaCl. It was added NaCl to the culture medium of Murashige e Skoog (MS) in increasing concentrations (0, 20, 40, 60 e 80 mM). The results show that callus treated with 80 mM NaCl have reduced the growth and the humidity percentage of respectively 33% and 10% in C. procera and 83% and 39% in C. grandiflora compared to the control treatment callus. Under the same conditions, it was seen an increase in ions concentrations of Na+ and Cl-, 98.9% and 98% in C. procera and 98.8% and 96% in C. grandiflora respectively. It was also seen a reduction in K+ level in callus treated with 80 mM NaCl, 43% in C. procera and 18% in C. Grandiflora, when compared to the control. The callus treated with 80 mM NaCl, showed a tendency of the proline accumulation and soluble sugars, increasing 26% and 37% in C. procera callus and 55.4% and 45% in C. grandiflora callus, respectively, when compared to control conditions. The increase in the activity of enzymes that break H2O2 has been observed in C. grandiflora callus under the salt stress, suggesting a possible oxidative damage, this increase was 73% in the ascorbate peroxidase activity and 62% in guaiacol peroxidase activity when compared to the activity of enzymes of the control callus with the treaty in 80 mM NaCl. None connection was seen between changes in the activity of the enzymes of the oxidative system and the salt stress in C. procera callus. It was evaluated the behaviour of osmotin in the osmotin transcription at 0, 2, 12, 24, 48 hours and at 4, 7, 14, 28 days of callus contact under stress. The osmotin transcripts were observed from 12 hours of contact of callus in 80mM NaCl in both species. However, it was not found osmotin by electrophoresis assays, dot blotting and mass spectrometry in the protein extracts of C. procera and C. grandiflora callus grown in control conditions and in 80 mM NaCl. Thus, the salt stress evaluation using in vitro cell model study was effective, providing cellular behaviour information for these two laticifers plants species showing their physiological, biochemical and molecular changes. The results suggest that the induced salt stress has favoured the increase of osmotin gene expression in both cases and suggests a possible relationship between osmotin of these species with the protection to salinity conditions. The failure to detect the proteins corresponding to genes provides the conception of several new hypotheses to be validated.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lead (Pb) is one of the most toxic anthropogenic pollutants of widespread occurrence in both terrestrial and aquatic ecosystems. The phytotoxicity of lead is a complex phenomenon that involves changes in development as well as in physiological, biochemical and molecular mechanisms according to different plant survival strategies. It is well known that heavy metals accelerate the production of reactive oxygen species (ROS) which can lead to changes in the concentration of antioxidant enzymes. The aim of this study was to investigate the effect of Pb on growth, physiology, absorption and translocation of Pb, activity and gene expression of antioxidant enzymes in "Sempre Verde" (SV) and "SetentÃo" (SET), Vigna unguiculata cultivars. The seeds were germinated in vermiculite and, after seven days, the seedlings were transferred to Hoagland solution. After seven days in a hydroponic system the plants were supplemented with EDTA-Pb 0.5 mM. Physiological parameters were measured using an infrared gas analyzer. The Pb content in roots and shoots was measured by ICP OES. The activities of catalase (CAT, EC 1.11.1.6), ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.1) and superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) was determined. The expression of the CAT gene (VuCAT 1 and 2), the APX (VuAPX 1 to 6) and SOD (VuSOD Cu / Zn 1 to 3, VuSODMn1, VuSODCu / chap1, VuSODFe 1 to 3) was evaluated by RT- qPCR using specific primers. Total RNA was extracted from the roots and leaves of control plants and treated. The results showed that the leaf areas were reduced by 60 (SV) and 88% (SET). The inhibition of net photosynthesis was 40 (SV) and 72% (SET). The cultivars showed differences in the accumulation and distribution of Pb, as well as in enzyme activity. SV had more Pb in roots than in leaves unlike SET that accumulates more Pb in leaves than in roots. The activity of the antioxidant enzymes CAT, APX and SOD was enhanced in SET, regardless of the tissue. In SV roots, on the other hand, the CAT activity was not modified whereas in SV leaves the SOD activity underwent an inhibition. All the remaining antioxidant activities in SV were stimulated. The CAT 1 and 2 genes were differently expressed in leaves and roots of SV and SET. The relative expression of the APX multigene family in leaves and roots in these cultivars was partially distinct. Likewise genes SOD in leaves showed a partially distinct profile in the two cultivars. Rather, the relative expression of SOD genes in the roots and SV SET is completely different. Taken together, the two Vigna unguiculata cultivars showed a different behavior towards tolerance, accumulation and detoxification of Pb. These results suggest that Pb induces oxidative stress in SV and SET cultivars and that the high activity of antioxidant enzymes could serve as an important component of defense against the damage caused by Pb, and SV more tolerant to stress than SET / O chumbo (Pb) à um dos poluentes antropogÃnicos mais tÃxicos de ocorrÃncia generalizada em ambos os ecossistemas terrestres e aquÃticos. A fitotoxicidade do chumbo à um fenÃmeno complexo que envolve mudanÃas no desenvolvimento, bem como nos mecanismos fisiolÃgicos, bioquÃmicos e moleculares, de acordo com as diferentes estratÃgias de sobrevivÃncia das plantas. à bem conhecido que os metais pesados aceleram a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs) e que podem provocar mudanÃas na concentraÃÃo das enzimas antioxidantes. O objetivo desse trabalho foi investigar o efeito do Pb no crescimento, fisiologia, absorÃÃo e translocaÃÃo de Pb, a atividade e expressÃo gÃnica das enzimas antioxidantes em "Sempre Verde" (SV) e "SetentÃo" (SET), cultivares de Vigna unguiculata. As sementes foram germinadas em vermiculita e, apÃs sete dias, as plÃntulas foram transferidas para soluÃÃo de Hoagland. Depois de sete dias em um sistema hidropÃnico as plantas foram suplementadas ou nÃo com EDTA-Pb 0,5 mM. Os parÃmetros fisiolÃgicos foram medidos atravÃs de um analisador de gÃs infravermelho. O conteÃdo de Pb nas raÃzes e na parte aÃrea foi medido por ICP OES. As atividades das enzimas catalase (CAT, EC 1.11.1.6), ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.1) e superÃxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) foram determinadas. A expressÃo dos genes da CAT (VuCAT 1 e 2), da APX (VuAPX 1 a 6) e da SOD (VuSOD Cu/Zn 1 a 3, VuSODMn1, VuSODCu/Chap1, VuSODFe 1 a 3), foi avaliada por RTqPCR utilizando iniciadores especÃficos. O RNA total foi extraÃdo a partir das raÃzes e das folhas nas plantas controle e tratadas. Os resultados revelaram que as Ãreas foliares diminuÃram 60 (SV) e 88% (SET). A inibiÃÃo da fotossÃntese lÃquida foi 40 (SV) e 72% (SET). Os cultivares apresentaram diferenÃas na acumulaÃÃo e distribuiÃÃo de Pb, bem como nas atividades enzimÃticas. SV apresentou mais Pb nas raÃzes do que nas folhas ao contrÃrio de SET que acumula mais Pb nas folhas do que nas raÃzes. A atividade das enzimas antioxidantes CAT, APX e SOD foram estimuladas no cultivar SET independentemente do tecido. No entanto, a atividade da CAT em raÃzes do cultivar SV nÃo sofreu modificaÃÃo e a atividade da SOD em folhas, do mesmo cultivar, foi inibida, sendo as demais atividades em SV estimuladas. O aumento das atividades das enzimas em raÃzes e folhas de SV e SET estÃo de acordo com suas expressÃes gÃnicas. Os genes CAT 1 e 2 foram diferentemente expressos nas folhas e nas raÃzes de SV e SET. A expressÃo relativa da famÃlia multigÃnica da APX em raÃzes e folhas nesses cultivares foi parcialmente distinta. Da mesma forma os genes da SOD em folhas apresentaram um perfil parcialmente distinto nos dois cultivares. Ao contrÃrio, a expressÃo relativa dos genes da SOD nas raÃzes de SV e de SET foi completamente diferente. Analisados em conjunto, os dois cultivares de Vigna unguiculata apresentaram um comportamento diferente em relaÃÃo a tolerÃncia, acumulaÃÃo, e desintoxicaÃÃo do Pb. Estes resultados sugerem que o Pb induz estresse oxidativo nos cultivares SV e SET e que a elevada atividade das enzimas antioxidantes poderia servir como um importante componente de defesa contra os danos provocados pelo Pb, sendo SV mais tolerante a esse estresse do que SET.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As algas marinhas vermelhas sÃo consideradas uma rica fonte de molÃculas bioativas, com inÃmeras propriedades farmacolÃgicas descritas na literatura cientÃfica. Neste trabalho a alga marinha vermelha Solieria filiformis foi submetida a uma extraÃÃo enzimÃtica com papaÃna para obtenÃÃo de uma fraÃÃo polissacarÃdica sulfatada (PLS). O material extraÃdo foi submetido a testes espectrofotomÃtricos de composiÃÃo quÃmica, apresentando alto grau de pureza, com teor de sulfataÃÃo elevado (1,08). TambÃm foi realizada a caracterizaÃÃo quÃmica estrutural atravÃs da anÃlise por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e por ressonÃncia magnÃtica nuclear de prÃton 1H e carbono 13C, permitindo concluir que a fraÃÃo PLS Ã classificada como uma iota-carragenana. A massa molar mÃdia do PLS (210,9 kDa) foi verificada atravÃs da Cromatografia por PermeaÃÃo em Gel (GPC), mostrando um sistema homogÃneo. Foram realizados, in vitro, testes antioxidantes (sequestro do radical DPPH, quelaÃÃo do Ãon ferroso e capacidade antioxidante total) da fraÃÃo PLS em vÃrias concentraÃÃes (0,025, 0,050,0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 mg/mL), utilizando como controle o BHT e EDTA nas concentraÃÃes de 2 mg.mL-1 e 4 mg.mL-1, respectivamente. O PLS apresentou uma IC50 de 1,77 mg/mL no sequestro do radical DPPH e na atividade antioxidante total a IC50 encontrada foi de 2,01 mg/mL, enquanto que a capacidade quelante de ferro foi de aproximadamente 39% na dose de 4 mg/mL. Avaliou-se tambÃm o efeito protetor do PLS contra lesÃes gÃstricas induzidas por etanol, com posterior dosagem de marcadores bioquÃmicos, nos quais incluem glutationa (GSH), malondialdeÃdo (MDA) e hemoglobina (Hb). O efeito gastroprotetor do PLS ocorreu de maneira dose dependente, com melhor resposta na dose de 10 mg/Kg. Os nÃveis de GSH permaneceram elevados no grupo tratado com o PLS, com diminuiÃÃo significativa das concentraÃÃes de MDA, sugerindo que a propriedade gastroprotetora se deve, pelo menos em parte, Ãs propriedades antioxidantes pela inibiÃÃo de radicais livres e da peroxidaÃÃo lipÃdica, alÃm de reduzir os nÃveis de Hb, sugerindo reduÃÃo nas lesÃes hemorrÃgicas causadas pelo etanol. Os resultados encontrados, mostram potencial para o PLS da alga Solieria filiformis ser utilizado futuramente como um composto gastroprotetor, devido a sua atividade antioxidante. / The red marine algae are considered a rich source of bioactive molecules with numerous pharmacological properties described in the scientific literature. In this study the red marine algaSolieria filiformis was subjected to extraction with papain enzyme to obtain a sulfated polysaccharide (PLS). The extracted material was submitted to spectrophotometric test of chemical composition having high purity with high quantity of sulfation (1,08). Moreover, a chemical structural characterization by Fourier transformer infrared spectroscopy and by nuclear magnetic resonance spectroscopy of 1H proton and 13C carbon was applied, bringing a conclusion where the PLS is classified as a iota-carrageenan. The average molecular weight (210.9 kDa) was verified through Gel Permeation Chromatography (GPC) showing a homogeneous system. Were performed in vitro tests antioxidants (Scavenging of free radical DPPH, chelating ferrous ability and total antioxidant capacity) of fraction PLS in various concentrations (0.025, 0.050, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0 mg.mL-1), using as control BHT and EDTA in concentrations of 2.0 and 4.0 mg.mL-1, respectively. The PLS showed an IC50 of 1.77 mg.mL-1 in scavenging of DPPH and total antioxidant capacity an IC50 found was of 2.01 mg.mL-1, while the iron chelator capacity was approximately 39% at a dose of 4mg.mL-1. Futhermore, the protective effect of PLS against ethanol-induced gastric lesions with subsequent dosage of biochemical markers, which include the glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) and hemoglobin (Hb).The gastroprotective effect of PLS with dose dependent manner, with better response at a dose of 10 mg.Kg-1. GSH levels remained high in the treated group with PLS, with significant reduction of MDA concentration, suggesting that the gastroprotective property is partly due to the antioxidant properties by inhibition of free radicals and lipid peroxidation. In addition to reducing the levels of Hb, it suggests a reduction in haemorrhagic lesions caused by ethanol. The results obtained from this research show potential for PLS of seaweed Solieria filiformisbe used in future as a gastroprotective compound due to its antioxidant activity.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As plantas sintetizam proteÃnas que possuem propriedades antimicrobianas, podendo ser utilizadas em substituiÃÃo aos defensivos quÃmicos no campo e como fonte de novas drogas para o controle de infecÃÃes bacterianas em humanos. Dentre as diversas estruturas vegetais, ÃrgÃos reprodutivos como as flores parecem ser uma fonte promissora de tais molÃculas ativas contra patÃgenos, particularmente se considerado o seu relevante papel fisiolÃgico, o qual deve ser preservado. Nesse contexto, a presente pesquisa experimental teve como objetivos a prospecÃÃo de proteÃnas com aÃÃo antimicrobiana em flores silvestres e posterior purificaÃÃo, caracterizaÃÃo bioquÃmica e avaliaÃÃo da atividade antimicrobiana de um inibidor de tripsina presente em flores de Cassia fistula Linn. (Chuva-de-ouro). O extrato total das flores de C. fistula foi preparado em tampÃo fosfato de sÃdio 50 mM, pH 7,5. Esse extrato apresentou atividade inibitÃria de tripsina (42,41 Â 0,35 UI/mgP) e de papaÃna (27,10 Â 0,23 UI/mgP), alÃm de mostrar a presenÃa de peroxidase (20,0 Â 0,18 UAP/mgP) e quitinase (1,70 Â 0,21 ηkatal/mgP), estando ausentes as atividades hemaglutinante, β-1,3-glucanÃsica, ureÃsica e proteÃsica. O inibidor de tripsina de C. fistula, denominado CfTI, foi purificado do extrato total por fracionamento com Ãcido tricloroacÃtico (2,5%), seguido de cromatografias de afinidade (anidrotripsina-Sepharose-4B) e fase reversa (Vydac C-18TP 522). CfTI Ã uma glicoproteÃna com massa molecular aparente de 22,2 kDa, pI 5,0 e sequÃncia NH2-terminal exibindo alta similaridade com o inibidor de tripsina da soja do tipo Kunitz (SBTI). O inibidor mostrou-se pouco estÃvel ao calor, reduzindo sua atividade inibitÃria para 23,4% quando incubado a 60 ÂC, durante 15 minutos. No entanto, ele se mostrou bastante estÃvel a variaÃÃes no pH. CfTI (100 Âg/mL) retardou o crescimento dos fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola, Colletotrichum lindemuthianum e Fusarium solani, alÃm de apresentar atividade antibacteriana frente Ãs bactÃrias patogÃnicas ao homem, Staphylococcus aureus e Enterobacter aerogenes. Os resultados obtidos demonstram o potencial das flores como fonte diversificada de proteÃnas bioativas, evidenciando o inibidor de tripsina presente em flores de C. fistula, fomentando sua aplicaÃÃo biotecnolÃgica frente a fungos e bactÃrias de relevÃncia para a Agricultura e SaÃde. / Plants synthesize proteins that have antimicrobial properties, which can be used to substitute chemical pesticides in agriculture and as new drugs for the control of bacterial infections in humans. Among the various plant structures, the flowers seem to be a promising source of active molecules against pathogens, particularly if considered its important physiological role, which should be preserved. Therefore, this experimental research aimed at the prospection of novel proteins with antimicrobial activity in wild flowers and to subsequent purification, biochemical characterization and evaluation of antimicrobial activity of a trypsin inhibitor present in flowers of Cassia fistula Linn (the golden shower tree). The total extract of C. fistula flowers was prepared in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5. This extract presented trypsin inhibitory activity (42.41 Â 0.35 IU/mgP) and papain (27.10 Â 0.23 IU/mgP), besides to the presence of peroxidase (20.0 Â 0.18 UAP/mgP) and chitinase (1.70 Â 0.21 ηkatal/mgP). On the other hand, the hemagglutinating, β-1,3-glucanase, protease and urease activities were not detected. The trypsin inhibitor of C. fistula, named CfTI, was purified by fractionating the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity (anidrotripsina-Sepharose-4B) and reverse phase (Vydac C-18TP 522) chromatographies. CfTI is a glycoprotein with an apparent molecular mass of 22.2 kDa, pI 5.0 and NH2-terminal sequence showing high similarity with Kunitz soybean trypsin inhibitor (SBTI). The inhibitor was not stable to heat, and loss 23.4% when incubated at 60 ÂC for 15 minutes. However, it proved to be stable to changes of pH. CfTI (100 Âg/mL) slowed the growth of pathogenic fungi of agricultural importance, Colletotrichum lindemuthianum and Fusarium solani, and also presented antibacterial activity against the human pathogenic bacteria, Staphylococcus aureus and Enterobacter aerogenes. The results demonstrate the potential of the flowers as a source of diverse bioactive proteins, as the trypsin inhibitor present in C. fistula flowers, promoting its biotechnological potential application against fungi and bacteria of relevance to Agriculture and human health.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente à crescente o nÃmero de estudos com base na alteraÃÃo de perfis glicoproteÃmicos em diversas doenÃas, principalmente na busca de biomarcadores sÃricos para o cÃncer. A identificaÃÃo e quantificaÃÃo direta, de glicoproteÃnas sorolÃgicas pouco abundantes, sÃo difÃceis, pois proteÃnas muito abundantes no sangue podem dificultar a identificaÃÃo. Assim, ferramentas de fracionamento sÃo necessÃrias para isolar, eficientemente, glicoformas proteicas aberrantes no proteoma sanguÃneo. Tendo em vista a interaÃÃo especÃfica e reversÃvel de lectinas com glicoconjugados, o uso de lectinas imobilizadas em matriz cromatogrÃfica tem sido frequente, visando fracionar misturas complexas, envolvendo glicoproteÃnas, para posterior anÃlise por espectrometria de massas. Mediante este contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o uso da lectina glucose/ manose ligante de sementes de Dioclea altÃssima (DaL) imobilizada em matriz cromatogrÃfica Sepharose 4B (DaL-Sepharose), no fracionamento de glicoproteÃnas sÃricas e na pesquisa de potenciais biomarcadores para o cÃncer de prÃstata (CaP). As glicoproteÃnas da fraÃÃo retida, obtidas pela cromatografia do soro sanguÃneo na matriz de DaL-Sepharose, foram identificadas e quantificadas, por espectrometria de massas, e assim, foi obtido o perfil proteico para os trÃs grupos estudados: controle, hiperplasia prostÃtica benigna e CaP. A identificaÃÃo das proteÃnas diferentemente expressas entre os grupos revelou 132 glicoproteÃnas, destas, 29 foram unicamente identificadas no grupo com cÃncer de prÃstata ou apresentaram uma razÃo de ln maior que 1,2, quando comparado à quantificaÃÃo no grupo controle. ApÃs uma anÃlise considerando a confiabilidade da identificaÃÃo, estimada pelo escore, e as evidencias na literatura que justifiquem um possÃvel envolvimento da proteÃna no cÃncer de prÃstata, destacaram-se: alfa-1-glicoproteÃna Ãcida, trombospondin-5, complemento C4 A, heptaglobina, pregnancy zone protein, isoforma 3 de alfa-1-antitripsina, alfa-2-glicoproteÃna rica em leucina e Zinc finger protein. A anÃlise do soro sanguÃneo fracionado pela matriz DaL-Sepharose, com prÃvia depleÃÃo de Albumina sÃrica humana e IgG, permitiu a identificaÃÃo de alfa-1-antitripsina e a proteÃna IGK âÃnicasâ no grupo com CaP e a pregnancy zone protein e a proteÃna like alfa 1 mieloma up reguladas no CaP quando comparadas ao grupo controle. A identificaÃÃo destas glicoproteÃnas gera novas perspectivas e servem de indicativo para nortear a pesquisa e desenvolvimento de mÃtodos de validaÃÃo destes resultados para usos clÃnicos. / Nowadays there are an increase number of studies based on the change of glycoproteomics profiles in several diseases, especially in the search for serum biomarkers for cancer. The direct identification and quantification of serum glycoprotein of low abundance are difficult, because proteins very abundance in the blood can difficult the identification. Thus, fractionation tools are necessary to isolate efficiently changed protein glycoforms on the blood proteome. Given the specific and reversible interaction of lectins to glycoconjugates, the use of immobilized lectins on chromatographic matrix has been frequent in order to fractionate complex mixtures, involving glycoprotein for analysis for mass spectrometry. In this context, the goal of this work was to investigate the use of binding glucose/ mannose lectin from Dioclea altÃssima seed (DaL) immobilized on Sepharose chromatography matrix 4B (DaL-Sepharose), on the fractionation of serum glycoproteins and research of potential biomarkers for prostate cancer (PC). Glycoproteins from the retained fraction obtained by chromatography of blood serum on DaL-Sepharose matrix were identified and quantified by mass spectrometry and it was obtained the protein profile to the three groups: control, benign prostatic hyperplasia and PC. The identification of differentially expressed proteins between the groups showed 132 glycoproteins, in which 29 were only identified on the group with prostate cancer or showed one reason of ln greater than 1.2 when compared to quantification on control group. After an analysis, considering the confiability of the identification, estimated by score, and the evidences on the literature that justified a possible involvement of the protein on prostate cancer, stood out: alpha-1-acid glycoprotein, thrombospondin-5 complement C4 A, haptoglobin, pregnancy zone protein, isoform 3 of alpha 1-antitrypsin, alpha-2 glycoprotein rich in leucine and Zinc finger protein. The analysis of fractionated bood serum by DaL-Sepharose matrix with prior depletion of Human Serum Albumin and IgG allowed the identification of alpha 1-antitrypsin and the IGK protein âonlyâ on the group with CaP and the pregnancy zone protein and protein like alfa-1 mieloma up regulated on CaP when compared to the control group. The identification of these glycoproteins generates new perspectives and suit as indicative for guiding research and validation methods development of these results for clinical uses.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) à uma das principais leguminosas cultivadas no Brasil. Entretanto, devido à presenÃa de fatores biÃticos e abiÃticos sÃo geradas perdas significativas na produtividade desta cultura. O VÃrus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV) tem atacado com grande frequÃncia os cultivos brasileiros. AlÃm disso, devido o feijÃo-de-corda ser cultivado em regiÃes onde os Ãndices pluviomÃtricos sÃo baixos, a deficiÃncia hÃdrica à bastante comum. Esse estresse promove impacto negativo substancial no crescimento e desenvolvimento das plantas, resultando em diminuiÃÃo na produÃÃo de biomassa. Em condiÃÃes de campo, os estresses mencionados acima podem ocorrer tanto individualmente quanto simultaneamente. Portanto, o presente estudo teve como objetivo estudar as respostas do feijÃo-de-corda (genÃtipo CE-31, sin. PitiÃba) submetido ao estresse hÃdrico, infectado com o CPSMV e sob pressÃo dos dois estresses combinados. Sob essas condiÃÃes, a cinÃtica enzimÃtica de proteÃnas antioxidantes (superÃxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase) e PR-proteÃnas (glucanase, quitinase e guaiacol peroxidase), bem como a dosagem de perÃxido de hidrogÃnio e quantificaÃÃo do CPSMV em folhas de feijÃo-de-corda foram realizadas. AlÃm disso, proteÃnas diferencialmente acumuladas em folhas de feijÃo-de-corda submetidas à esses estresses foram quantificadas e identificadas por LC-MS/MS e bancos de dados disponÃveis. A infecÃÃo viral nÃo alterou a maioria dos parÃmetros fisiolÃgicos. Jà a deficiÃncia hÃdrica contribuiu para a diminuiÃÃo da fotossÃntese lÃquida, transpiraÃÃo e condutÃncia estomÃtica. Atà 6 dias apÃs inoculaÃÃo do CPSMV, o vÃrus nÃo agravou os efeitos negativos da seca. Os resultados da cinÃtica enzimÃtica revelaram que as respostas sÃo alteradas de formas diferentes frente aos estresses quando impostos individualmente ou simultaneamente e que a presenÃa do estresse hÃdrico favoreceu a infecÃÃo viral apÃs 2 dias de inoculaÃÃo. A anÃlise proteÃmica revelou 117 proteÃnas diferencialmente acumuladas pertencentes a diferentes categorias de acordo com as funÃÃes fisiolÃgicas: energia e metabolismo, fotossÃntese, metabolismo de proteÃnas, homeostase redox, fatores de regulaÃÃo e processamento de RNA, resposta ao estresse, defesa de plantas e outras. Estes resultados sÃo importantes para a compreensÃo dos mecanismos celulares que atuam no feijÃo-de-corda, genÃtipo CE-31, quando submetido ao estresse hÃdrico, à infecÃÃo pelo CPSMV e a ambos os estresses de forma combinada. / Cowpea (Vigna unguiculata) is a legume (Fabaceae) with high nutritional value grown in Brazil. However, biotic and abiotic factors are responsible for causing significant losses to the growth and yield of leguminous plants. Cowpea mosaic severe virus (CPSMV) is one of the more severe problems affecting cowpea production in Brazil. Also, cowpea are mainly grown in regions where rainfall is low, thus water deficit is quite common. This stress promotes substantial negative impact on growth and development of plants, resulting in decreased of biomass production. Under field conditions, the stresses mentioned above can occur both individually and simultaneously. Therefore, this work aimed to study the responses of cowpea (CE-31 genotype, syn. Pitiuba) subjected to water deficit, infected with CPSMV and under pressure of the two combined stresses. Under these conditions, enzyme kinetics of antioxidant protein (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase) and PR-proteins (glucanase, chitinase and guaiacol peroxidase) as well as hydrogen peroxide dosage and quantification of CPSMV in cowpea leaves were performed. In addition, differentially accumulated proteins from cowpea leaves subjected to these stresses were identified and quantified by LC-MS/MS. Viral infection did not affect the majority of physiological parameters. Already water deficit contributed to the decrease in net photosynthesis, transpiration and stomatal conductance. At 6 days after CPSMV inoculation, the virus did not worsen the negative effects of drought. The results revealed that the enzyme kinetics of the responses was changed across different ways when the stress imposed individually or simultaneously and the presence of water deficit favored viral infection after 2 days of CPSMV inoculation. The proteomic analysis revealed 117 differentially accumulated proteins belonging to different categories according to the physiological functions: energy and metabolism, photosynthesis, protein metabolism, redox homeostasis, regulation factors and RNA processing, response to stress, plant defense and others. These results are important for understanding the cellular mechanisms that operate in cowpea (CE-31 genotype), when subjected to water deficit, CPSMV infection and both combined stresses.

nÃo hà / Algas marinhas do filo Rhodophyta sÃo fontes naturais de polissacarÃdeos sulfatados que sÃo amplamente utilizados na indÃstria alimentÃcia e na indÃstria farmacÃutica. O presente trabalho teve como finalidade obter os polissacarÃdeos sulfatados totais da alga marinha vermelha Gracilaria caudata (PSG) por extraÃÃo enzimÃtica, determinar a sua estrutura quÃmica e testar o seu potencial antioxidante. As anÃlises quÃmicas revelaram a presenÃa de 85% de aÃÃcares totais e 1% de proteÃnas contaminantes no extrato obtido. AtravÃs de espectrometria de emissÃo Ãptica com plasma (ICP-OES), os PSG apresentaram 0,9% de Ãtomos de enxofre e um grau de sulfataÃÃo de 0,14%. A massa molar mÃdia dos PSG foi determinada por cromatografia em permeaÃÃo em gel (GPC) e mostrou ser da ordem de 116,51 kDa. Os polissacarÃdeos sulfatados totais foram submetidos a testes de caracterizaÃÃo estrutural atravÃs da anÃlise por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN) de prÃton (1H) e carbono (13C), identificando os PSG como galactana do tipo agarana. A atividade antioxidante in vitro dos PSG foi avaliada atravÃs de testes, tais como, ensaios de eliminaÃÃo do radical DPPH, quelaÃÃo do Ãon ferroso e capacidade antioxidante total. Os resultados indicaram que tais polissacarÃdeos possuem capacidade de sequestrar radicais livres de maneira significativa e concentraÃÃo-dependente. A atividade antioxidante in vivo dos PSG foi avaliada em modelo de estresse oxidativo induzido pelo 2,2â-azobis-2-amidinopropano (AAPH) em ratos, com posterior dosagem de marcadores do sistema antioxidante enzimÃtico, como catalase (CAT) e superÃxido desmutase (SOD), alÃm da quantificaÃÃo de marcadores de dano oxidativo, como nitrito e tiol. O resultado demonstrou uma melhora no desequilÃbrio redox pelo aumento da atividade da CAT e aumento da atividade da SOD, com melhor resposta na dose de 3 mg/kg. Devido a estes resultados, os polissacarÃdeos sulfatados obtidos a partir da alga marinha Gracilaria caudata mostram potencial de virem a ser utilizados na indÃstria alimentÃcia e farmacÃutica. / Red algae are natural sources of sulfated polysaccharides, which are widely used in the food and pharmaceutical industries. This study aims to obtain the total sulfated polysaccharides from the red seaweed Gracilaria caudata (PSG) through enzymatic extraction, determine their chemical structure and their antioxidant potential. Chemical analysis revealed that the obtained extract is comprised of 85% total sugars and 1% of contaminating proteins. Through Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry (ICP-OES), the PSG showed a percentage of 0.9% sulfur atoms and a degree of sulfation of 0.14%. The average molar mass of PSG was determined through gel permeation chromatography (GPC) and was determined as 116.51 kDa. The total sulfated olysaccharides were subjected to structural characterization tests through infrared Fourier transform spectroscopy and C13 and H1 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analysis, identifying the PSG as galactan from the agaran type. The in vitro antioxidant activity of PSG was determined using tests such as elimination of DPPH radical, chelation of ferrous ion and total antioxidant capacity. The results indicated that such polysaccharides have the capacity to scavenge free radicals significantly and in a concentration-dependent maner. The in vivo antioxidant activity of PSG was valuated in an oxidative stress model induced by 2,2'-azobis- -amidinopropane (AAPH) in rats, with subsequent dosage of antioxidant enzyme system markers, such as catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD), and the quantitation of oxidative damage markers such as nitrite and thiol. The results showed an improvement in the redox imbalance through increased CAT activity and increased SOD activity with the best response found at a dose of 3 mg / kg. Because of these results, the sulfated polysaccharide obtained from seaweed Gracilaria caudata shows potential for their being used in the food and pharmaceutical industry.