CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As algas marinhas sÃo fontes naturais de polissacarÃdeos sulfatados (PSs) detentores de diversas atividades biolÃgicas, incluindo anticoagulante, antitrombÃtica, antinociceptiva e anti-inflamatÃria. O efeito anti-inflamatÃrio dos polissacarÃdeos sulfatados totais (PSTs) da alga marinha vermelha Gracilaria cornea foram relatados anteriormente. Entretanto, seus mecanismos de aÃÃo ainda nÃo sÃo conhecidos. O presente trabalho teve como finalidade esclarecer o mecanismo de aÃÃo envolvido no efeito anti-inflamatÃrio de G. Cornea. Inicialmente, os PSTs foram extraÃdos por digestÃo enzimÃtica e em seguida, fracionados por cromatografia de troca iÃnica em coluna de DEAE-celulose, originando duas fraÃÃes (FI e FII). Foram utilizados ratos Wistar machos (180-250g) para os modelos experimentais in vivo da inflamaÃÃo. O efeito anti-inflamatÃrio da fraÃÃo FI, nas doses 3, 9 e 27 mg kg-1, foi avaliado utilizando o modelo de edema de pata induzido (s.c.) por dextrana, carragenana, histamina, serotonina, composto 48/80, bradicinina ou L-arginina e mensurado por plestismometria. AlÃm disso, foram feitos os ensaios da atividade da mieloperoxidase (MPO), anÃlise da permeabilidade vascular e anÃlise histopatolÃgica dos tecidos subplantares. Em adiÃÃo, foram realizadas anÃlises dos nÃveis da expressÃo gÃnica e proteica dos mediadores inflamatÃrios TNF-α, IL-1β e COX-2 por PCR em tempo real e imunohistoquÃmica, respectivamente. AlÃm disso, investigamos o envolvimento da via heme-oxigenase 1 (HO-1) no efeito anti-inflamatÃrio da FI. Por fim, FI foi testada localmente quanto à atividade prÃ-inflamatÃria, nas doses 3, 9 ou 27 mg kg-1; s.c. intraplantar. Os resultados mostraram que FI (3, 9 ou 27 mg kg-1, s.c.) inibiu o edema de pata induzido pela carragenana (Cg) e dextrana, como confirmados pela reduÃÃo da atividade da MPO e da permeabilidade vascular no tecido da pata, respectivamente. Na anÃlise histopatolÃgica do tecido subplantar, FI (3, 9 ou 27 mg kg-1, s.c) reduziu a migraÃÃo celular e o edema. Em adiÃÃo, FI (9 mg kg-1) inibiu em 62,8% e 64%, respectivamente, os edemas de pata induzidos por histamina e composto 48/80, mas nÃo inibiu os edemas induzidos por serotonina e bradicinina, sugerindo a participaÃÃo da histamina neste efeito. FI (9 mg kg-1) tambÃm inibiu o edema induzido por Cg em animais com mastÃcitos nÃo degranulados, mas nÃo inibiu o edema no grupo de animais com mastÃcitos degranulados pelo composto 48/80, sugerindo que a mesma estabilize membrana de mastÃcitos. AlÃm disso, FI (9 mg kg-1) inibiu em 76,2% o edema induzido por L-arginina e tambÃm diminuiu a expressÃo gÃnica e proteica dos mediadores IL-1β, TNF-α e COX-2 em relaÃÃo ao grupo Cg. Na presenÃa de Zinco Protoporfirina IX (3 mg kg-1; s.c.), FI-Gc (9 mg kg-1) perdeu sua capacidade em inibir o edema induzido por Cg, exercendo assim seu mecanismo de aÃÃo anti-inflamatÃrio atravÃs do envolvimento da via da HO-1. Com relaÃÃo ao efeito prÃ-inflamatÃrio, FI-Gc (3, 9 ou 27 mg kg-1, s.c.) foi capaz de induzir intenso edema com infiltrado de neutrÃfilos, que foi confirmada pelo aumento da atividade da MPO. No entanto, o edema induzido com a dose de 27 mg kg-1 da FI foi inibido por indometacina, dexametasona, pentoxifilina e meclizina, sugerindo assim o envolvimento de prostaglandinas, histamina e citocinas primÃrias no efeito prÃ-inflamatÃrio da FI-Gc. Logo, conclui-se que apesar da FI de G. cornea apresentar efeito prÃ-inflamatÃrio local, possui efeito anti-inflamatÃrio sistemicamente com mecanismo de aÃÃo relacionado com inibiÃÃo da histamina, estabilizaÃÃo de membrana de mastÃcitos, modulaÃÃo gÃnica e proteica dos mediadores IL-1β, TNF-α e COX-2, alÃm da ativaÃÃo da via da HO-1. / Marine algae are natural sources of sulfated polysaccharides possessing several biological activities, including anticoagulant, antithrombotic, antinociceptivo and anti-inflammatory. Anti-inflammatory effects of total sulfated polysaccharides (PSTs) from the red seaweed Gracilaria cornea have been recently reported. However, their mechanisms of action are not clarified. Therefore, this study aimed to clarify some action mechanism involved in anti-inflammatory effect of G. Cornea. Initially, the PSTs were extracted by enzimatic digestion and following fractioned on DEAE-cellulose column, obtaining two fractions (FI - 0.5 M and FII - 0.75 M). Male Wistar rats (150-250g) were used in the in vivo models of inflammation. The anti-inflammatory activity was evaluated using the model of paw edema (s.c.) induced by dextran (500 μg/paw), carrageenan (700 μg/paw), histamine (100 μg/paw), serotonine (20 μg/paw), compound 48/80 (10 μg/paw), bradykinin (30 μg/paw) or L-arginina (15 μg/paw) and measured by plethysmometry. Moreover, the activity of myeloperoxidase (MPO), analysis of the vascular permeability and histological examination of the subplantar tissue were performed. In addition, was performed analysis of expression levels of genic and protein of inflammatory mediators TNF-α, IL-1β e COX-2 by qRT-PCR and immunohistochemistry, respectively. The involvement of heme-oxygenase-1 (HO-1) pathway in anti-inflammatory effect of FI was also investigated. Lastly, FI was locally injected to evaluate its pro-inflammatory activity, at doses of 3, 9 or 27 mg kg-1 per intraplantar subcutaneous (s.c.) route (i.pl.). The results showed that FI (3, 9 or 27 mg kg-1, sc) inhibited the paw edema induced by carrageenan (Cg) and dextran, as confirmed by reduced MPO activity and of the raise of vascular permeability in the paw tissue, respectively. In addition, histological examination of the subplantar tissue, FI (3, 9 or 27 mg kg-1, sc) was able to reduce cell migration and edema. In addition, FI inhibited in 62,8 and 64%, respectively, the paw edema induced by histamine and compound 48/80, but did not inhibit paw edema induced by serotonin and bradykinin, suggesting the participation of histamine in this effect. FI (9 mg kg-1) also inhibited in 76,2% the pawedema induced by L-arginine, a substrate to nitric oxide formation. Additionally, FI (9 mg kg-1, sc) inhibited the Cg-induced edema in animals with intact mast cells, but did not inhibit of those with degranulated mast cells by compound 48/80, revealing a protective role on mast cell membranes. FI down-regulated the IL-1β, TNF-α and COX-2 mRNA and protein levels, compared with Cg group. After inhibition with ZnPP IX, a specific of HO-1 inhibitor, the anti-inflammatory effect of Gc-FI was not observed in Cg-induced paw edema, suggesting thus that the anti-inflammatory effect of Gc-FI is in part dependent on the integrity of the HO-1 pathway. In relation the effect pro-inflammatory, FI (3, 9 ou 27 mg kg-1, sc) was able to induce intense inflammatory process with neutrophil accumulation, as confirmed by increase MPO activity. However, the induced edema at a dose of 27 mg kg-1 of FI was inhibited by indomethacin, dexamethasone, pentoxifylline and meclizine, suggesting the involvement of prostaglandins, histamine and primary cytokines in pro-inflammatory effect of FI. Thus, it is concluded that FI from G. cornea presents pro- and anti-inflammatory activities depending on the administration route, considered a therapeutic agent potential for future studies in inflammatory processes.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade biolÃgica de uma quitinase recombinante (rVuChi) de feijÃo-caupi (Vigna unguiculata) contra o fungo fitopatogÃnico Lasiodiplodia theobromae. A proteÃna recombinante foi expressa em Pichia pastoris, coletada e purificada apÃs 72h de induÃÃo, utilizando cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A quitinase foi eluÃda a partir da cromatografia de afinidade com Ãcido acÃtico a 0,1 M. Ensaio enzimÃtico foi realizado contra o substrato sintÃtico (quitina coloidal), a fim de determinar a atividade da proteÃna recombinante purificada. A quitinase apresentou atividade especÃfica de 5.637,32 U/mg de proteÃna. Testes biolÃgicos foram realizados. Nestes testes trÃs diferentes isolados de L. theobromae, identificados como CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184, foram utilizados e os experimentos foram realizados em triplicata. Os isolados fÃngicos foram obtidos da coleÃÃo de trabalho do LaboratÃrio de Fitopatologia da Embrapa AgroindÃstria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). Em todos os ensaios biolÃgicos o fungicida Carbomax 500 SC (Carbendazim), a uma concentraÃÃo de 2 mL/L, e Ãgua destilada estÃril foram utilizados como controles positivos e negativos, respectivamente. Um total de 50, 100 e 300 Âg de quitinase recombinante (rVuChi) foi utilizado em todos os testes. O primeiro ensaio foi baseado na metodologia de difusÃo em disco de papel de filtro em que foram investigados os efeitos da proteÃna sobre o crescimento do micÃlio, bem como a formaÃÃo de halo de inibiÃÃo sobre o crescimento micelial do fungo. O segundo ensaio foi baseado no ensaio de difusÃo em Ãgar. Fotografias foram usadas para registrar as observaÃÃes. A quitinase rVuChi mostrou efeito fungistÃtico variando de moderado a forte sobre o crescimento micelial de todos os isolados de L. theobromae, particularmente quando usada nas doses de 100 e 300 Âg, no ensaio de difusÃo em disco. CNPAT CCJ-127 foi o isolado mais resistente à aÃÃo fungistÃtica de rVuChi, como observado pelo menor impacto da proteÃna em seu crescimento micelial. No teste de difusÃo em Ãgar a quantidade de 300 Âg foi a mais efetiva, da mesma forma como observado para o de difusÃo em disco de papel de filtro. AlÃm disso, o efeito da proteÃna foi mais pronunciado nos isolados CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184 e menos impactante no isolado CNPAT CCJ-127. A quitinase recombinante rVuCHi mostrou ser um inibidor do crescimento micelial de trÃs diferentes isolados de L. theobromae. Os efeitos fungistÃticos da proteÃna aqui descritos podem ser devido à sua capacidade de degradar quitina, um biopolÃmero estrutural que faz parte da parede celular de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo L. theobromae. Entretanto, mais estudos precisam ser conduzidos para revelar os possÃveis mecanismos de aÃÃo de rVuChi sobre L. theobromae. / The aim of this work was to evaluate the biological activity of a recombinant chitinase (rVuChi) from cowpea (Vigna unguiculata) against the phytopathogenic fungus Lasiodiplodia theobromae. The recombinant protein was expressed in Pichia pastoris, collected and purified after 72h of induction, using a chitin affinity chromatography. The chitinase was eluted from the affinity chromatography using 0.1 M acetic acid. Enzymatic assay was performed against the synthetic substrate (colloidal chitin) in order to determine the activity of the purified recombinant protein. The chitinase displayed a specific activity of 5,637.32 U/mg of protein. Biological tests were performed. In these tests three different isolates of L. theobromae, identified as CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184, were used and the experiments were performed on triplicate. The fungal isolates were obtained from the collection of work from the laboratory of plant pathology from the Embrapa AgroindÃstria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). In all biological assays the fungicide Carbomax 500 SC (Carbendazim) at a concentration of 2 mL/L and sterile distilled water were used as positive and negative controls, respectively. A total of 50, 100 and 300 Âg of recombinant chitinase (rVuChi) was used in all tests. The first test was based on the disk diffusion methodology using filter paper in which the effects of the protein on the mycelium growth, as well as the formation of an inhibition zone on the fungal hyphae were investigated. The second test was based on the diffusion assay in agar. Photographs were used to register the observations. The rVuChi showed moderate to strong fungistatic activities on the mycelial growth of all L. theobromae isolates when used at 100 and 300 Âg in the disk diffusion assay. CNPAT CCJ-127 was the most resistant specimen to the rVuChi fungistatic action, as observed by the lower impact of the protein on it is mycelial growth. In the agar diffusion test the amount of 300 Âg was the most effective, as observed in the disk diffusion test. In addition, the effect of the protein was most pronounced on the isolates CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184 and less impacting on CNPAT CCJ-127. The recombinant chitinase rVuCHi showed to be an inhibitor of the mycelial growth of three L. theobromae isolates. The fungistatic effects of the protein described here may be due to its ability to degrade chitin, a structural biopolymer that makes part of the cell wall of several phytopathogenic fungi, including L. theobromae. Once this is only a scientific speculation, more studies need to be made to definitely reveal the mechanism of action of rVuChi on L. theobromae.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Amburana cearensis (cumaru) Ã uma leguminosa subutilizada da Caatinga. O alto teor proteico das sementes faz delas uma possÃvel nova fonte de proteÃnas alimentares. Foram determinadas as melhores condiÃÃes de extraÃÃo proteica para posterior produÃÃo do isolado proteico de cumaru (IPAc). As anÃlises tambÃm foram conduzidas com a farinha delipidada (FDAc) e com um isolado proteico de soja comercial (IPS). IPAc apresentou teor proteico > 90% e composiÃÃo de aminoÃcidos comparÃvel a IPS, com notÃvel deficiÃncia em metionina. Foram determinadas algumas propriedades funcionais para predizer sua adequaÃÃo como ingrediente na indÃstria alimentÃcia. Os resultados para FDAc, IPAc e IPS foram, respectivamente: solubilidade 20-79; 9-99 e 3-76%; capacidade de retenÃÃo de Ãgua 1,7; 3,9 e 7,5 g/g; capacidade de retenÃÃo de Ãleo 1,5; 6,3 e 1,6 g/g; capacidade emulsificante / estabilidade 52 / 46%; 55 / 51% e 53 / 21%; capacidade espumante / estabilidade 47 / 32%; 65 / 53% e 33 / 8 e menor concentraÃÃo geleificante 18, 16 e 12%. Para investigar se IPAc e IPS apresentam indÃcios de toxicidade, cÃlulas de adenocarcinoma humano foram expostas por 24 h aos isolados. Para comparaÃÃo, tambÃm foi realizada exposiÃÃo com os isolados de soja (IPGm), feijÃo comum (IPPv), feijÃo de porco (IPCe) e mamona (IPRc), a fraÃÃo proteica de mamona (FPRc), as lectinas PHA-E e ConA e o controle quÃmico (Crtl_Quim). O RNA das cÃlulas foi hibridizado em microarranjos contendo o genoma humano completo. Os perfis de expressÃo gÃnica apÃs exposiÃÃo Ãs proteÃnas foram comparados aos de PBS e Crtl_Quim e agrupados hierarquicamente. Crtl_Quim, IPAc e IPGm se mostraram inadequados para a continuaÃÃo das anÃlises por provocar um efeito superestimado. A anÃlise de vias e processos biolÃgicos afetados apontou que genes envolvidos com a biossÃntese de colesterol, estresse do RE e resposta imune foram superexpressos e genes envolvidos com o ciclo celular e replicaÃÃo do DNA foram subexpressos apÃs exposiÃÃo a IPPv, IPCe, PHA-E e ConA. As amostras IPRc e FPRc regularam para cima genes envolvidos com a apoptose e resposta imune e para baixo genes envolvidos com o ciclo celular e sinalizaÃÃo do cAMP. AnÃlise do mapa conectivo mostrou alta correlaÃÃo de ConA, PHA-E e IPCe com drogas bloqueadoras de canais de Ca2+ e de K+; enquanto IPRc e FPRc apresentam funÃÃo biolÃgica semelhante a pelo menos seis drogas inibitÃrias da sÃntese proteica. Conclui-se que IPAc tem grande potencialidade como novo alimento proteico com grande aplicabilidade na indÃstria de alimentos, devendo, no entanto, sofrer modificaÃÃes no mÃtodo de obtenÃÃo visando a melhora na solubilidade e a eliminaÃÃo do sal residual. / Amburana cearensis (cumaru) is an underutilized legume from Caatinga. Because of their high protein content its seeds are a possible novel source of food protein. Were determined the best conditions for protein extraction and preparation of protein isolate (IPAc).Analysis were carried out also with the defatted flour (FDAc) and with a marketed soybean protein isolate (IPS). IPAc showed protein content of 90% and amino acid composition compatible with the IPSâs composition, with remarkable low methionine content. Some functional properties were measured in order to predict the adequacy of the isolates as an ingredient for food industry. The results for FDAc, IPAc and IPS were, respectively: solubility 20-79; 9-99 e 3-76%; water holding capacity 1.7; 3.9 e 7.5 g/g; oil holding capacity 1.5; 6.3 e 1.6 g/g; emulsion formation / stability 52 / 46%; 55 / 51% e 53 / 21%; foamability / stability 47 / 32%; 65 / 53% e 33 / 8; least gelling concentration (LGC) 18, 16 and 12%. In order to investigate whether IPAc e IPS exhibit signs of toxicity, two cell lines of human adenocarcinoma (MCF-7 e Caco-2) were exposed to these isolates as well as to others prepared from soyabean (IPGm), white bean (IPPv), Jack bean (IPCe) and castor bean (IPRc), to the protein fraction from castor bean (FPRc), to the lectins PHA-E and ConA (50 Âg/mL) and to the chemical control (Crtl_Quim). Subcitotoxic doses were determined by viability test to later exposure assay for 24 h. The MCF-7 cellâs RNA were extracted and hybridized to a microarray containing the complete human genome. The expression profiles after the exposition to the proteins were compared to that ones generated after PBS and Crtl_Quim and hierarchicaly clustered. Crtl_Quim, IPAc and IPGm were unsuitable for further analysis by their overestimated effect. Analysis of biological pathways and process showed that genes involved with the cholesterol biosynthesis, ER stress and immune response were upregulated and genes involved with cell cycle and DNA replication were downregulated after exposure of cells to IPPv, IPCe, PHA-E and ConA. The samples IPRc and FPRc upregulated genes involved with apoptosis and immune response and downregulated genes involved with cell cycle and cAMP signaling. Connectivity Map analysis showed high correlation of ConA, PHA-E and IPCe with drugs that are Ca2+ and K+ channel blockers, while IPRc and FPRc showed biological function similar to at least six drugs inhibitors of protein synthesis. Itâs possible to conclude that the IPAc has a high potentiality as a novel protein food with wide applicability in the food industry and should, however, be modified in the method of obtaining aiming the improvement in its solubility and eliminating the residual salt.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O feijÃo caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] à um alimento de grande importÃncia comercial, sendo a principal fonte alimentÃcia em algumas regiÃes, como no Nordeste brasileiro. Infelizmente, o feijÃo-de-corda està sujeito ao ataque de vÃrios patÃgenos e pestes, acarretando perdas considerÃveis em sua produtividade. Para diminuir essas perdas, existem diversos mÃtodos quÃmicos que sÃo largamente utilizados, porÃm o uso indiscriminado de fungicidas tem causado danos ao meio ambiente e aos seres vivos. Na busca de alternativas ecologicamente saudÃveis, uma opÃÃo promissora seria a induÃÃo de mecanismos de defesa da prÃpria planta atravÃs de molÃculas elicitoras. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo elicitar respostas de defesa em feijÃo-de-corda atravÃs do uso de galactomanana sulfatada isolada de Adenanthera pavonina e induzir a resistÃncia ao fungo Colletotrichum gloeosporioides. Doze dias apÃs germinaÃÃo, plantas de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) foram tratadas com galactomana de A. pavonina (nas concentraÃÃes de 100 mg/L e 200 mg/L), na ausÃncia ou presenÃa do fungo C. gloeosporioides (inoculado apÃs 6 h do tratamento com carboidrato) por 6, 12, 24 e 48 h, tendo sido realizadas as anÃlises bioquÃmicas nos extratos protÃicos obtidos das folhas primÃrias. Para as enzimas POX e APX ocorreu um significativo aumento a partir de 12 h do tratamento com a galactomanana. Em relaÃÃo a atividade das enzimas antifungicas βGLU e CHI, as plantas tratadas com a galactomanana, no geral, apresentaram um aumento acima de 50% em relaÃÃo ao controle. AnÃlises macroscÃpicas revelaram que as folhas tratadas com 200 mg/L da galactomanana e infectadas com o C. gloeosporioides apresentaram lesÃes necrÃticas visivelmente reduzidas em relaÃÃo ao controle. Ademais, a galactomana nÃo foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos e crescimento vegetativo do fungo C. gloeosporioides in vitro. A partir dos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que, a galactomanana isolada de A. pavonina à capaz de aumentar a tolerÃncia da cultura de feijÃo-de-corda (V. unguiculata) contra o fungo C. gloeosporioides. / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] is a food of great commercial importance, being the main food source in some regions such as northeastern Brazil. Unfortunately, cowpea is subject to attack by various pathogens and pests, causing considerable losses in productivity. To reduce these losses, there are several chemical methods that are widely used, but the indiscriminate use of fungicides has caused damage to the environment and living beings. In search of alternative environmentally friendly, a promising option would be the induction of defense mechanisms of the plant itself through elicitor molecules. Given the above, this study aimed to elicit defense responses in cowpea through the use of galactomannan isolated from Adenanthera pavonina and induce resistance to Colletotrichum gloeosporioides. Twelve days after germination, cowpea plants (Vigna unguiculata) were treated with A. pavonina galactomannan (at concentrations of 100 mg/L and 200 mg/L) in the absence or presence of the fungus C. gloeosporioides (inoculated 6 hours after treatment with carbohydrate) for 6, 12, 24 and 48 h were carried out on biochemical analysis of protein extracts obtained from primary leaves. For enzymes POX and APX a significant increase occurred after 12 h of treatment with the galactomannan. With respect to antifungal activity of the enzymes and βGLU CHI, the plants treated with the galactomannan in general, showed an increase above 50% compared to control. Macroscopic analysis revealed that the leaves treated with 200 mg/L of galactomannan and infected with C. gloeosporioides showed necrotic lesions visibly reduced compared to control. Furthermore, the galactomannan was unable to inhibit the germination of spores and vegetative growth of the fungus C. gloeosporioides in vitro. The results of the present study indicate that galactomannan isolated from A. pavonina can increase crop tolerance of cowpea (V. unguiculata) against the fungus C. gloeosporioides.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As sessile organisms, plants are exposed to a plethora of environmental stresses to which they must respond to maintain efficient growth and survival. Therefore, in order to improve our understanding on the complex mechanisms involved in the cowpea response to salt stress and to a compatible interaction with the cowpea severe mosaic virus (CPSMV), we used a label-free quantitative proteomic approach to identify the salt and virus responsive proteins in the leaves of the Pitiuba (CE-31) cultivar. The proteins extracted from the leaves (control and treated) 2 and 6 days post-treatment only with salt (DPS), only infected with CPSMV (DPV) or both of them (DPSV) were analyzed using mass spectrometry. At 2 DPS, 350 proteins with at least two-fold differences in abundance, in comparison with controls, were differentially accumulated in the leaves of the salt-treated (80% up and 20% down-accumulated), 281 at 2DPV (25% up and 75% down-accumulated) and 321 at 2 DPSV (45% up and 55% down-accumulated) plants. At 6 DPS, 350 proteins were differentially accumulated in the leaves of the salt-treated (90% up and 10% down-accumulated), 225 at 6 DPV (80% up and 20% down-accumulated) and 315 at 6 DPSV (94% up and 6% down-accumulated) plants. The qualitative analysis showed biochemical differences when the cowpea plants were challenged concurrently with both stresses. To cope with salinity, cowpea increased the abundance of proteins directly involved with the salt tolerance mechanisms. The results indicated that the CPSMV induce the down-accumulating of several proteins to invade and spread in host at early infection period (2 DPV), but at 6 DPV plant can induce accumulation of diverse proteins related with defense, although these strategies canât avoid the negatives effects of disease. When exposed simultaneously to salt/CPSMV stresses, a balance in protein accumulation involved in many biological process. This is the first work employing this approach in cowpea and providing evidences of the plant biochemical mechanisms involved in the responses of cowpea to these stresses. / Como organismos sÃsseis, as plantas sÃo expostas a uma variedade de estresses ambientais aos quais devem responder para sobreviverem e se desenvolverem. A fim de melhorar a nossa compreensÃo sobre os mecanismos complexos envolvidos na resposta do feijÃo-de-corda ao estresse salino e na interaÃÃo compatÃvel com o vÃrus do mosaico severo do caupi (CPSMV), foi utilizada uma abordagem proteÃmica quantitativa, livre de marcaÃÃo, para identificar proteÃnas, responsivas a essess estresses em folhas de feijÃo-de-corda, cv. CE-31. As proteÃnas extraÃdas a partir de folhas primÃrias, 2 e 6 dias apÃs o tratamento sà com o sal (DPS), somente infectadas (DPV), ou sob aÃÃo combinada dos dois (DPSV) foram analisadas, usando espectrometria de massas e comparadas com grupo controle. No 2 DPS, foram identificadas 350 proteÃnas diferencialmente acumuladas (80% aumentaram em abundÃncia e 20% diminuÃram), no 2 DPV 281 (25% aumentaram em abundÃncia e 75% diminuÃram) e no 2 DPSV 321 (45% aumentaram em abundÃncia e 55% diminuÃram). Jà no 6 DPS, foram identificadas 350 proteÃnas diferencialmente acumuladas (90% mostraram aumento em abundÃncia e 10% diminuiÃÃo), no 6 DPV 225 (80% aumentaram em abundÃncia e 20% diminuÃram) e no 6 DPSV 315 proteÃnas(94% aumentaram em abundÃncia e 6% diminuÃram). Para lidar com a salinidade, o cv. CE-31 aumentou a abundÃncia de proteÃnas envolvidas diretamente com os mecanismos de tolerÃncia ao sal. Em relaÃÃo à infecÃÃo da planta pelo CPSMV, os resultados obtidos indicaram que o vÃrus induz reduÃÃo na abundÃncia de vÃrias proteÃnas nos tempos iniciais de infecÃÃo, provavelmente favorecendo a invasÃo e propagaÃÃo na planta, mas, no 6 DPSV, a planta recupera sua capacidade de acionar mecanismos de defesa, embora esses jà nÃo sejam mais efetivos para evitar o estabelecimento da doenÃa viral. Durante exposiÃÃo simultÃnea da planta ao sal e ao vÃrus, ocorreu um equilÃbrio entre o aumento e diminuiÃÃo em abundÃncia de proteÃnas envolvidas em diversos processos metabÃlicos. Esse trabalho à pioneiro nessa abordagem em feijÃo-de-corda e fornece evidÃncias dos mecanismos bioquÃmicos envolvidos nas resposta da planta a esses estresses.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Sulfated galactans from red marine algae are polysaccharides with heterogeneous structures that have presented a variety of potentially therapeutic biological effects including anticoagulant, anti-thrombotic and anti-inflammatory, however, their potential activity as anti-inflammatory agent in the treatment of atherosclerosis, a chronic inflammatory disease that culminates with thromboembolic disorders, has not been previously studied. Furthermore, experimental data from animal models and clinical studies support connections between the hemostasis and inflammation in atherogenesis. These interfaces among inflammation and thrombogenesis have been suggested as targets for pharmacological intervention to reduce disease progression. Herein, we determined the chemical structure of a novel sulfated galactan obtained from the marine alga Acanthophora muscoides (fraction AmII) and analysed its effect on a mice model of atherosclerosis in 10-week aged apolipoprotein E deficient (ApoE−/−) mice under high-cholesterol diet for additional 4 or 11 weeks. Fraction AmII (10 mg/kg) or Vehicle were subcutaneously injected from week 2 until 4 of the diet or from week 6 until week 11 of the diet. In vitro assays of macrophage chemotaxis were also performed. The structure of the complex sulfated galactan was characterized by solution nuclear magnetic resonance and its molecular mass was determined by gel permeation chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis. The sulfated galactan from A. muscoides presents a molecular mass of ~ 20kDa and an alternating 4-linked α-galactose and 3-linked β-galactose, substituted with sulfate esters and methyl ethers along with the occurrence of 3,6-anhydro-α-galactoses. In the 4 weeks diet model, treatment with fraction AmII did not alter the atherosclerotic plaque size, and other intraplaque features of vulnerability (such as lipid, neutrophil, macrophage, MMP-9 and collagen contents). In the 11 weeks diet model, treatment with fraction AmII reduced intraplaque macrophage and tissue factor (TF) content as compared to Vehicle-treated animals. Intraplaque TF co-localized and positively correlated with macrophage rich-areas. No changes on atherosclerotic plaque size, and other intraplaque features of vulnerability, such as lipid, neutrophil, MMP-9 and collagen contents, were observed. Moreover, mRNA expression of MMPs, chemokines and genetic markers of Th1/2/reg/17 lymphocyte polarization within mouse aortic arches and spleens was not affected by AmII treatment. In vitro, treatment with AmII dose-dependently reduced macrophage chemotaxis without affecting TF production. Overall, the chronic AmII treatment was well tolerated. In conclusion, our results indicate that AmII treatment reduced intraplaque macrophage content, by impacting on cell recruitment, and, concomitantly, intraplaque TF content of potential macrophage origin in atherosclerotic mice. / As galactanas sulfatadas obtidas de algas marinhas vermelhas sÃo polissacarÃdeos de estruturas heterogÃneas que tÃm apresentado uma variedade de efeitos biolÃgicos, potencialmente terapÃuticos, incluindo anticoagulante, antitrombÃtico e anti-inflamatÃrio. No entanto, a sua atividade potencial como agente anti-inflamatÃrio para o tratamento de aterosclerose, uma doenÃa inflamatÃria crÃnica que culmina com distÃrbios tromboembÃlicos, nÃo foi previamente estudada. AlÃm disso, dados experimentais de modelos animais e estudos clÃnicos suportam conexÃes entre a hemostasia e inflamaÃÃo na aterogÃnese. Estas interfaces entre inflamaÃÃo e trombogÃnese tÃm sido sugeridas como alvos para intervenÃÃo farmacolÃgica visando reduzir a progressÃo da doenÃa. No presente trabalho, determinou-se a estrutura quÃmica de uma nova galactana sulfatada obtida da alga marinha Acanthophora muscoides (fraÃÃo AmII) e analisou-se seu efeito sobre um modelo de aterosclerose em camundongos deficientes em apolipoproteÃna E (ApoE−/−) de 10 semanas submetidos a dieta de alto teor de colesterol durante mais 4 ou 11 semanas. A fraÃÃo AmII (10 mg/kg) ou veÃculo (salina) foram injetados por via subcutÃnea durante a segunda atà a quarta semana de dieta ou a partir da sexta atà a dÃcima primeira semana de dieta. Ensaios in vitro de quimiotaxia de macrÃfagos tambÃm foram realizados. A estrutura da galactana sulfatada complexa foi caracterizada por ressonÃncia magnÃtica nuclear em soluÃÃo e a sua massa molecular foi determinada por cromatografia de permeaÃÃo em gel e eletroforese em gel de poliacrilamida. A fraÃÃo AmII apresentou uma massa molecular de ~ 20 kDa e uma alternÃncia de α-galactose 4 ligada e β-galactose 3-ligada, substituÃdo com Ãsteres de sulfato e Ãteres de metil, juntamente com a ocorrÃncia de unidades de 3,6-anidro-α-galactoses. No modelo de dieta de 4 semanas, o tratamento com a fraÃÃo AmII nÃo alteraou o tamanho da placa aterosclerÃtica e demais caracterÃsticas de vulnerabilidade intraplaca, tais como lÃpido, neutrÃfilos, macrÃfagos, metaloprotease de matriz (MMP)-9 e conteÃdo de colÃgeno. No modelo de dieta de 11 semanas, o tratamento com a fraÃÃo AmII reduziu os conteÃdos de macrÃfago intraplaca e de fator tecidual (FT), em comparaÃÃo com animais tratados com veÃculo. O FT intraplaca co-localizou e positivamente correlacionou com Ãreas ricos em macrÃfagos. NÃo foram observadas alteraÃÃes no tamanho da placa aterosclerÃtica e nas outras caracterÃsticas de vulnerabilidade intraplaca, tais como conteÃdos de lipÃdios, neutrÃfilos, MMP-9 e do colÃgeno. AlÃm disso, a expressÃo de mRNA de MMPs, quimiocinas e marcadores genÃticos de polarizaÃÃo de linfÃcitos Th1/2/reg/17 nos arcos aÃrticos e nos baÃos dos camundongos nÃo foi alterada pelo tratamento AmII. In vitro, o tratamento com AmII reduziu de forma dose-dependente a quimiotaxia de macrÃfagos sem afetar a produÃÃo de FT. No geral, o tratamento crÃnico com AmII foi bem tolerado. Em conclusÃo, nossos resultados indicam que o tratamento com AmII em camundongos aterosclerÃticos reduziu o conteÃdo de macrÃfagos intraplaca, agindo sobre o recrutamento celular, e, concomitantemente, o conteÃdo de FT intraplaca de originado potencialmente de macrÃfagos.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. / As plantas estÃo constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto biÃticos como abiÃticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteÃnas denominadas de proteÃnas relacionadas à patogÃnese (PR proteÃna). As Pr-proteÃnas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condiÃÃes de estresse osmÃtico, frio e escassez de Ãgua. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticÃferos e algumas delas estÃo relacionadas com a atividade antifÃngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolÃ- las e avaliar suas atividades antifÃngicas, nos fluidos laticÃferos das seguintes espÃcies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos lÃtex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas atravÃs de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do lÃtex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. AnÃlises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presenÃa de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteÃnicas. A protease cisteÃnica co- purificada no lÃtex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a anÃlise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presenÃa de uma sequÃncia semelhante em ambas as proteÃnas, que pode ser um epÃtopo disponÃvel ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra nÃo apresentaram atividade antifÃngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que nÃo houve correlaÃÃo entre a atividade antifÃngica e à presenÃa destas osmotinas, as atividades proteolÃticas das fraÃÃes proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifÃngica. Nos fluidos laticÃferos, as proteases cisteÃnicas estÃo mais frequentemente relacionadas à atividade antifÃngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a funÃÃo das osmotinas na fisiologia de plantas laticÃferas sÃo necessÃrios.

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T01:57:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MariaFernandadeAndrade_M.pdf: 2919034 bytes, checksum: c3f7796b55fb5ad53b9eaf2ee58536d5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas AMPK e mTOR são as principais moduladoras do balanço energético intracelular, e exercem influência decisiva sobre a ação hipotalâmica da leptina. O exercício agudo, através da produção de IL-6, está associado ao aumento da sensibilidade à ação anorexigênica da leptina. Visando investigar a possível influência das vias AMPK e mTOR, neste aumento da sensibilidade hipotalâmica à leptina induzido pelo exercício agudo, ratos Wistar foram submetidos à natação e posteriormente receberam injeção intracerebroventricular de IL-6, ativadores e/ou inibidores da AMPK e mTOR. A IL-6 reduziu a ingestão alimentar dos animais não exercitados; no entanto, o pré-tratamento com ativador da AMPK ou inibidor da mTOR bloqueou esta ação da IL-6. Ativadores da AMPK aumentaram a ingestão alimentar de forma mais significativa nos animais não exercitados. Inibidores da AMPK reduziram a ingestão mais expressivamente nos animais exercitados. A injeção central de leptina reduziu a ingestão de ratos exercitados mais expressivamente do que foi observado nos animais controle. Tanto o pré-tratamento com inibidor da IL-6, como com ativador da AMPK ou inibidor da mTOR, reverteram esta ação da leptina. O exercício também está associado à redução da fosforilação da via da AMPK e à maior fosforilação da via da mTOR, no hipotálamo. A da resposta das vias em questão ao estímulo com leptina provavelmente seja um dos principais determinantes da modulação do set point hipotalâmico pelo exercício agudo / Abstract: AMP-activated protein kinase (AMPK) and mammalian Target of Rapamycin (mTOR) are key regulators of cellular energy balance and of the effects of leptin on food intake. Acute exerci se is associated with increased sensitivity to the effects of leptin on food intake in an IL-6-dependent manner. To determine whether exerci se ameliorates the AMPK and mTOR response to leptin in the hypothalamus in an IL-6-dependent manner, rats performed two 3-h exercise bouts, separated by one 45-min rest períod. Intracerebroventrícular IL-6 infusion reduced food intake and pretreatment with AMPK activators and mTOR inhibitors prevented IL-6-induced anorexia. Activators of AMPK increased food intake in control rats to a greater extent than that observed in exercised ones, whereas inhibitors of AMPK had the opposite effect. Exercise was associated with both reduced phosphorylation of the AMPK/ ACC signaling pathway and increased phosphorylation of proteins involved in mTOR signal transduction Ín the hypothalamus. The regulatory role of IL-6 in mediating the modulation in AMPK and mTOR pathways in the hypothalamus was also investigated. Treatment with leptin reduced food intake in exercised rats that were pretreated with vehicle, although no increase in sensitivity to leptin-induced anorexia after pretreatment with anti-IL6 antibody, AICAR or Rapamycin was detected. Improved responses of AMPK and mTOR to leptin may contribute to the appetite suppressive actions of exercise / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

O deslocamento de abomaso (DA) é uma doença multifatorial relacionada com o manejo alimentar que afeta vacas leiteiras de alta produção principalmente durante o início da lactação. Este trabalho teve como objetivo avaliar indicadores bioquímicos de diagnóstico e tratamento no deslocamento de abomaso à esquerda (DAE) em vacas leiteiras na Região do Planalto do Rio Grande do Sul. As amostras foram coletadas de um total de quarenta animais, sendo vinte vacas com DAE e vinte vacas clinicamente sadias utilizadas como grupo controle. Foram coletadas amostras de líquido ruminal, sangue e urina para avaliação do perfil bioquímico, hematológico e ruminal. Os animais com DAE apresentaram menor produção de leite diária (6,72 kg ± 3,85 e 26,86 kg ± 8,36), peso corporal (566,5 kg ± 51,12 e 602,9 kg ± 45,68) e escore condição corporal (2,32 ± 0,4 e 602,9 ± 45,68), quando comparados ao grupo controle.A utilização de fitas reagentes para medição do pH ruminal demonstrou-se eficaz a campo quando comparada com potenciômetro digital. A dinâmica ruminal apresenta-se prejudicada nos animais com DAE como foi evidenciado pelos valores aumentados do tempo de redução de azul de metileno (4,70 min. ± 1,89 e 1,66 min. ± 1,14). Além de apresentarem indicadores de desidratação, os valores de pH da urina, e os valores séricos de lactato, aspartato transaminase e colesterol apresentaram-se como ferramentas auxiliares no prognóstico e tratamento. O tratamento deve consistir em além da correção da afecção, restabelecer a condição hídrica do animal, assim como também, repor a flora ruminal. / The displacement of abomasum (DA) is a multifactorial disorder related to feed management affecting high yielding dairy cows mainly during early lactation. This work had the objective to evaluate biochemical profile for diagnose and treatment of left displaced abomasum (LDA) in dairy cows in the Planalto Region of Rio Grande do Sul. The samples were collected from ruminal fluid, blood and urine for the evaluation of biochemical, hematological and ruminal profile. The cows with LDA presented lower values of daily milk production (6,72 kg ± 3,85 and 26,86 kg ± 8,36), body weight (566,5 kg ± 51,12 and 602,9 kg ± 45,68) and corporal condition score (2,32 ± 0,4 and 602,9 ± 45,68). The utilization of reagent strips showed to be functional in the field when compared to a digital phmeter. The ruminal dynamics is much damaged in the cows affected by the LDA, as evidenced by the high values for the blue metilen reduction time (4,70 min. ± 1,89 and 1,66 min. ± 1,14). Besides the presentation of dehydration indicators, the urine pH, and serum lactate, aspartate transaminase and cholesterol presented to be auxiliary tools in the LDA prognoses and treatment. The treatment should consider fluid therapy and reestablish the ruminal dynamics of the cow.

As efusões cavitárias são de ocorrência frequente na rotina clínica de cães. Na maior parte dos casos são efusões benignas, causadas por distúrbios hidrostáticos do sistema circulatório. As neoplasias são causas comuns de efusões em cães, contudo, nem sempre as células tumorais são encontradas no exame citopatológico. A dosagem de marcadores tumorais e o exame imunocitoquímico são alternativas para tornar o diagnóstico de neoplasia em efusões mais preciso. Os objetivos deste trabalho foram dosar os seguintes marcadores tumorais bioquímicos: antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno associado a câncer 72-4 (CA 72-4) e fragmento de citoqueratina 21-1 (CYFRA 21-1), que ainda não tiveram seu desempenho avaliado em efusões neoplásicas e não neoplásicas caninas, bem como marcadores imunocitoquímicos que incluem dois novos anticorpos primários (MOC-31 e D2-40) para a diferenciação entre carcinoma e mesotelioma. Trinta e duas amostras de líquidos cavitários abdominais e torácicos, provenientes do atendimento clínico do Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul foram analisadas. De acordo com o exame citopatológico e ficha clínica do animal essas efusões foram classificadas em dois grupos: neoplásico e não neoplásico. A dosagem dos marcadores tumorais foi realizada pelo método imunoenzimático sanduíche (ELISA), conforme as instruções dos fabricantes. Para a avaliação imunocitoquímica foram utilizadas 14 amostras de efusões neoplásicas. A técnica foi realizada pelo método estreptavidina-biotina ligada a peroxidase ou a fosfatase alcalina, utilizando-se como cromógeno o DAB. Os marcadores tumorais CEA e CA 72-4 não tiveram resultados significativos na diferenciação entre efusões neoplásicas e não neoplásicas, enquanto que o CYFRA 21-1 obteve sensibilidade de 70%, especificidade de 94% e acurácia de 81% para o diagnóstico neoplásico. Em todas as amostras neoplásicas, imunocitoquímica e citopatologia foram compatíveis, verificando-se como válida a padronização dos novos anticorpos para a espécie canina. Este estudo demonstrou que novos marcadores tumorais, tanto bioquímicos como imunocitoquímicos, podem ser empregados no diagnóstico de neoplasias caninas. O marcador tumoral CYFRA 21-1 deve ser utilizado como auxílio diagnóstico para a espécie canina e os anticorpos MOC-31 e D2-40 devem ser incluídos em painéis imunocitoquímicos de rotina para a diferenciação entre carcinomas e mesoteliomas em efusões neoplásicas. / The cavity effusions frequently occur in the clinical routine of dogs. In most cases the effusions are benign caused by circulatory system disorders. Neoplasms are common causes of effusions in dogs, however not always the tumor cells are found in cytopathologycal analysis. The dosage of tumor markers is an alternative to make the neoplastic effusion diagnosis more accurate. The aims of this work were to determine the following biochemical tumor markers: carcinoembryonic antigen (CEA), cancer antigen 72-4 (CA 72-4) and cytokeratin fragment 21-1 (CYFRA 21-1), which have not had their performance evaluated in canine neoplastic and non-neoplastic effusions, as well as immunocytochemical markers including two new primary antibodies (MOC-31 and D2-40) for differentiation between carcinoma and mesothelioma tumors. Thrirtytwo samples of abdominal and thoracic cavity fluids, from the clinical care of the Veterinary Hospital of the Federal University of Rio Grande do Sul were analyzed. According to the cytopathology test and patient’s clinical record the effusions were classified in two groups: neoplastic or non-neoplastic. The tumor markers measurement was performed by sandwich enzyme immunoassay (ELISA) according to the manufacturer instructions. Fourteen neoplastic samples were used for the immunocytochemical tests. The tests were performed by streptavidin-biotin method linked to peroxidase or to alkaline phosphatase using the DAB chromogen. The tumor markers CEA and CA 72-4 had no significant results for differentiating between neoplastic and non neoplastic effusions, whereas the tumor marker CYFRA 21-1 obtained 70% of sensibility, 94% of specificity and 81% of accuracy for the neoplastic diagnosis. In all neoplastic samples the immunocytochemical and cytological tests were compatible, which make valid their use for standardization of those new antibodies for the canine species. This study demonstrated that new tumor markers both biochemical and immunocytochemical could be used in the canine neoplastic diagnosis. The tumor marker CYFRA 21-1 must be used for the canine species, and the antibodies MOC-31 and D2-40 must be included in routine immunocytochemistry panel for the differenciation between carcinoma and mesothelioma in neoplastic effusions.