Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LOPES FAC Dissertacao.pdf: 1587334 bytes, checksum: 1fcac951d597992ec49231a64f8eff03 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Devido aos efeitos danosos causados ao meio ambiemte e à procura por métodos mais eficientes, o uso de agrodefensivos vem sendo gradualmente substituído pelo uso de agentes de controle biológico. A utilização do gênero Trichoderma tem sido satisfatória no controle de vários fitopatógenos em diversas culturas agrícolas por meio da competição por nutrientes, produção de antibióticos e do micoparasitismo. Esse gênero possui sua taxonomia bastante discutida, porém com o advento de técnicas moleculares o problema da identificação da espécie do isolado estudado vem sendo resolvido. Os objetivos desse trabalho foram identificar isolados de Trichoderma spp. provenientes de diversas espécies cultivadas, além de visualizar as relações filogenéticas, e realizar a avaliação da atividade específica de enzimas hidrolíticas frente aos fitopatógenos Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum. Dentro os 100 isolados, 96 isolados foram identficados, sendo 43 isolados da espécie T. harzianum, 33 isolados de T. asperellum, 6 isolados de T. tomentosum, 5 isolados de T. koningiopsis, 4 isolados de T. erinaceum, 2 isolados de T. ghanense, 1 isolado de T. virens, 1 isolado de T. brevicompactum e 1 isolado de T. hamatum. Quatro isolados não foram identificados por nenhuma ferramenta molecular ou por análise filogenética. No estudo feito com as enzimas em F. oxysporum, todas as correlações apresentadas entre as atividades específicas são significativas, possuíam valores elevados de coeficiente de Pearson e positivos. Em F. solani, os resultados foram bastante semelhantes aos encontrados em F. oxysporum. Na indução com parede celular de R. solani, foram observadas correlações entre enzimas que desempenham papel fundamental no processo de micoparasitismo. Em S. sclerotiorum, foram observadas correlações entre enzimas envolvidas no processo de micoparasitismo. Os isolados T. asperellum 356/01, que obteve destaque em todas as enzimas estudadas em parede celular de F. oxysporum, T. asperellum 40T/03 e T. harzianum 100T/01, se destacando em praticamente todas as enzimas em F. solani, Trichoderma spp. 55/03, que apresentou as maiores atividades em Fosfatase ácida e Proteases em parede celular de R. solani, e o isolado T. erinaceum 17/06, possuindo atividades expressivas em NAGase nas paredes celulares de F. solani e R. solani e em β-1,3-glicanase na parede celular de R. solani, são alguns organismos que possuem um grande potencial para um futuro uso biotecnológico. Todos esses resultados levantados propiciam um melhor entendimento do mecanismo de micoparasitismo do gênero Trichoderma frente a fitopatógenos de grande importância

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao parte 1 lidiane biologia.pdf: 35041 bytes, checksum: c58f88ce1be4655ee71c7b5ab0bef247 (MD5) Previous issue date: 2008-04-03 / Paracoccidoides brasiliensis is a human pathogenic dimorphic fungus. The recombinant chitinase from P. brasiliensis, Pbcts1r, was overexpressed in Escherichia coli using pET-32a (+) as vector. The enzyme was produced as inclusion bodies and became soluble by Sarkosyl being purified by a single step using a Ni-NTA resin. Pbcts1r showed activity against 4-MU-(GlcNAc)3 and 4-MU-(GlcNAc)2, presenting a endochitinase activity. Immunoblot reaction with anti-Pbcts1r identified two proteins in yeast crude extract. A partial purification of P. brasiliensis yeast crude extract by cationic-exchange chromatography on HPLC revealed two different chitinases, Pbcts1 and Pbcts2, with molecular mass of 45 kDa and 34 kDa, respectively. Pbcts2 has exochitinase activity and Pbcts1 has endochitinase activities. Reactions with anti- Pbcts1r showed the presence of Pbcts1 and Pbcts2 in crude extracts of yeast and transition from mycelium to yeast. On mycelium crude extracts was found only Pbcts1 and on yeast cell wall extract only Pbcts2. Both proteins were found to be secreted by yeast parasitic phase showing their probable importance in the permanence of the fungus in the human host. Phylogenetic relationships between the orthologs Pbcts1 and the putative Pbcts2 indicated the presence of a common ancestral. During evolution, P. brasiliensis could have acquired Pbcts2 and Pbcts1 playing distinct roles in order to growth and survive in diverse environment on saprophytic and parasitic phases / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico humano. A quitinase recombinante de P. brasiliensis, Pbcts1r, foi superexpressa em Escherichia coli utilizando pET-32(a)+ como vetor. A enzima foi produzida em corpos de inclusão e se tornou solúvel pela adição de sarkosyl, sendo purificada em um único passo com a utilização da resina Ni-NTA. Pbcts1r mostrou atividade diante de 4-MU-(GlcNAc)3 e 4- MU-(GlcNAc)2, apresentando atividade de endoquitinase. A reação de imunoblot com anti-Pbcts1r identificou duas proteínas no extrato bruto de levedura. A purificação parcial do extrato bruto de P. brasiliensis por cromatografia de troca-catiônica em HPLC revelou duas quitinases diferentes, Pbcts1 e Pbcts2, com massas moleculares de 45 e 34 kDa, respectivamente. Pbcts2 tem atividade de exoquitinase e Pbcts1 de endoquitinase. Reações com anti-Pbcts1r mostraram a presença de Pbcts1 e Pbcts2 no extrato bruto de levedura e transição de micélio para levedura. No extrato bruto de micélio foi encontrado somente Pbcts1 e no extrato de parede celular de levedura somente Pbcts2. Ambas as proteínas foram encontradas secretadas pela fase parasitária (levedura), mostrando a provável importância dessas proteínas na permanência do fungo no hospedeiro. Relações filogenéticas entre os ortólogos Pbcts1 e a provável Pbcts2 indicam a presença de um ancestral comum. Durante a evolução, P. brasiliensis poderia ter adquirido Pbcts2 e Pbcts1 desempenhando diferentes papéis para o crescimento e sobrevivência do fungo na fase saprofítica e parasitária

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao FINAL_EF_corrigida_BC-UFG.pdf: 1485117 bytes, checksum: ecdc9729cc08da2832a6566c39052f65 (MD5) Previous issue date: 2010-01-28 / The cell wall of pathogenic microbes acts as an initial barrier that is in contact with hostile environments. Besides functioning as a mechanical barrier, it harbours an immunogenic macromolecules arsenal. One of the ways that proteins can be associated to the cell wall, it is through GPI anchor. The hydrophobic C-terminal end of the β-1,3-glucanosyltransferase enzyme of the human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis is characteristic of GPI anchored proteins. The β-1,3-glucan assembling and rearrangement are essential since this molecule acts as a scaffold to support cell wall proteins and polysaccharides. In the thermodimorphic fungus P. brasiliensis, β-1,3-glucan is found predominantly in mycelium form and α-1,3-glucan is predominant in the yeast form. In this work, it was screened possible protein-protein interactions performed by β-1,3-glucanosyltransferase 1 of P. brasiliensis (PbGel1p). To obtain these results, a P. brasiliensis cDNA library was screened with PbGel1p using the Saccharomyces cerevisiae two hybrid system. In addition, pull-down assay was used as an in vitro complementary technique to isolate proteins that interact direct or indirectly with PbGel1p. It was screened 38 gene products using two hybrid system and it was identified 3 proteins using the pull-down assay associated with mass spectrometry. The PbGel1p role in the cell wall maintenance and remodeling was indicated through the analysis of screened interactions, like alpha-glucosides permease, acid phosphatase, GDSL lipase, septin, actin, tubulin, HSP90 and pyruvate kinase. Furthermore, nuclear localization of PbGel1p and its role in the locus-specific transcriptional silencing were suggested based on such interactions: Qde2 argonaute, transcription elongation factor spt6, others transcription factors and ATP-citrate synthase. Therefore, this study indicated, for the first time, that PbGel1p has multiple location and it participates either in roles classically described for glucanosyltransferases, as the cell wall remodeling, or in recently described functions for this family of proteins, as the locus-specific transcriptional silencing. / A parede celular de microrganismos patogênicos atua como uma barreira inicial no contato entre o parasito e o hospedeiro. Além de funcionar como uma barreira mecânica, ela abriga um arsenal de macromoléculas imunogênicas. Uma forma pela qual as proteínas estão associadas à parede celular é por meio de âncoras-GPI. A extremidade carboxila hidrofóbica da enzima β-1,3-glicanosiltransferase do fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis é característica de proteínas GPI-ancoradas. A montagem e o rearranjo de β-1,3- glicana são de fundamental importância porque esta molécula serve como um esqueleto sobre o qual outros polissacarídeos e proteínas da parede celular estão associados. No fungo termodimórfico P. brasiliensis, β-1,3-glicana é encontrada prioritariamente em micélio, sendo α-1,3-glicana predominante em levedura. Foram rastreadas neste trabalho possíveis interações proteína-proteína realizadas pela β-1,3-glicanosiltransferase 1 de P. brasiliensis (PbGel1p). Para isso utilizou-se a técnica de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisiae, rastreando-se uma biblioteca de cDNA do fungo P. brasiliensis com a enzima estudada. Adicionalmente, foi utilizado, como técnica complementar, o ensaio de pull-down, que isolou in vitro proteínas que interagem direta ou indiretamente com a PbGel1p. Foi possível rastrear 38 produtos gênicos através do sistema de duplo híbrido e isolar três proteínas pelo ensaio de pull-down, identificadas por espectrometria de massas. O papel da PbGel1p na manutenção e no remodelamento da parede celular do fungo foi indicado através da análise das interações rastreadas, como permease de α-glicosídeos, fosfatase ácida, lipase da família GDSL, septina, actina, tubulina, HSP90 e piruvato quinase. Além disso, foram sugeridos a localização da PbGel1p no núcleo das células do fungo e seu papel no silenciamento gênico mediado por alterações estruturais, por meio do rastreamento das seguintes proteínas ligantes a PbGel1p: argonauta Qde2, fator de alongamento transcricional spt6, outros fatores transcricionais e ATP-citrato sintase. Portanto, este estudo indicou, pela primeira vez, que PbGel1p tem localização múltipla e participa tanto de funções classicamente descritas para glicanosiltransferases, como o remodelamento da parede celular, quanto de funções recentemente descritas para essa família de proteínas, como o silenciamento transcricional sítio-específico.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Brazil is one of the largest producers of cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.], a very important legume for human dietary protein and carbohydrate supply. Nevertheless, there are some factors which limit its productivity and utilization. The insect Callosobuchus maculatus (cowpea weevil) is considered the principal pest that attacks stored grains. In the Northeast of Brazil, breeding efforts involving cowpea have been directed towards the selection of high yielding varieties associated with traits of resistance to diseases and pests. However, studies on the nutritional quality of these improved genotypes are scanty. In this study, the research was conducted with two cowpea genotypes, BR9 Longà e IT81D 1053, susceptible and resistant to cowpea weevil, respectively, to evaluate whether the probable factors related to the resistance would interfere with the nutritional value. Proximate composition showed that both genotypes are good sources of proteins (23.45 and 26.61 g/100 g dry matter), carbohydrates (61.62 and 62.94 g/100 g dry matter) and crude fiber (4.32 and 5.20 g/100 g dry matter), presenting low contents of oil (3.30 and 3.89 g/100 g dry matter). Polyacrylamide gel electrophoresis of the seed flours showed similar patterns for both genotypes, except for the presence of a very prominent 29 kDa band in the resistant genotype. The presence of antinutritional factors such as lectin, urease and trypsin inhibitor was detected in both cowpea genotypes. Lectin (0.10 UH/mgF) and urease (25.13 and 25.41 U/gF) amounts were similar in the susceptible and resistant genotypes. The resistant genotype presented a higher content of trypsin inhibitor (18.55 mg trypsin inhibited/gF) than the susceptible one (12.57 mg trypsin inhibited/gF). Feeding trial conducted with rats fed the experimental diets containing seed flour of BR9 Longà and IT81D 1053 as the sole protein source, at 10% level, were not sufficient to promote animal growth compared to the animals fed the high quality diet containing egg white. However, when compared the treatments containing susceptible and resistant cowpea genotypes most of parameters analyzed were similar. Diets containing the chitin binding proteins (CBP), purified from susceptible and resistant cowpea genotypes and complemented / O Brasil à um dos grandes produtores de feijÃo caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], uma importante leguminosa para consumo humano por ser boa fonte proteÃnas e carboidratos. Todavia, hà vÃrios fatores que limitam a produtividade e utilizaÃÃo dessa cultura, destacando-se o ataque pelo inseto Callosobruchus maculatus (gorgulho), conhecido como uma das principais pragas de armazenamento. No Nordeste do Brasil, genÃtipos de feijÃo caupi foram criados atravÃs de melhoramento genÃtico, visando aumento da produtividade e resistÃncia a doenÃas e pragas. PorÃm, à detectada a escassez de informaÃÃes relacionando resistÃncia e valor nutricional. Assim sendo, no presente estudo, dois genÃtipos melhorados geneticamente, BR9 Longà e IT81D 1053, suscetÃvel e resistente ao gorgulho, respectivamente, foram selecionados, para verificar se as alteraÃÃes promovidas pelo melhoramento afetariam sua qualidade nutricional. Os dados de composiÃÃo centesimal mostraram que ambos os genÃtipos constituem-se em boa fonte de proteÃnas (23,45 e 26,61 g/100 g de matÃria seca), carboidratos (61,62 e 62,94 g/100 g de matÃria seca) e fibra bruta (4,32 e 5,20 g/100 g de matÃria seca), apresentando baixos conteÃdos de lipÃdios (3,30 e 3,89 g/100 g de matÃria seca). Os perfis eletroforÃticos da farinha de sementes dos dois genÃtipos mostraram-se muito semelhantes entre si, exceto a existÃncia de uma banda mais proeminente na regiÃo de 29 kDa verificada no genÃtipo resistente. Fatores antinutricionais tais como lectina, urease e inibidor de tripsina foram verificados nos dois genÃtipos de feijÃo caupi avaliados. Os teores de lectina (0,10 UH/mgF) e de urease (25,13 e 25,41 U/gF) se mostraram bem similares nos genÃtipos suscetÃvel e resistente. Jà os conteÃdos de inibidor de tripsina foram diferentes, tendo o genÃtipo resistente apresentado maior atividade (18,55 mg de tripsina inibida/gF) em comparaÃÃo ao suscetÃvel (12,57 mg de tripsina inibida/gF). Farinhas dos genÃtipos BR9 Longà e IT81D 1053, quando incluÃdas em dietas para ratos como Ãnica fonte protÃica, a 10%, nÃo foram capazes de promover o crescimento dos animais de forma similar à albumina da clara do ovo (proteÃna padrÃo). Todavia, quando comparado o tratamento AvaliaÃÃo da BiosseguranÃa Alimentar de GenÃtipos... contendo farinha do genÃtipo suscetÃvel com aquele contendo o genÃtipo resistente, para a maioria dos parÃmetros analisados, as respostas foram bem parecidas. Dietas contendo proteÃnas ligantes à quitina (PLQ), purificadas do genÃtipo suscetÃvel e do resistente, complementadas com albumina da clara do ovo, apresentaram valor nutricional igual ou superior ao padrÃo (somente clara do ovo). Diante dos parÃmetros analisados, os resultados permitem concluir que o melhoramento genÃtico do feijÃo caupi, o qual conferiu resistÃncia ao Callosobruchus maculatus, nÃo foi capaz de alterar a qualidade nutricional dessa leguminosa. AlÃm disso, diferentemente ao verificado com o Callosobruchus maculatus, nÃo foram observados efeitos antinutricionais, tÃxicos e/ou alergÃnicos para os animais testados (ratos e camundongos), associados ao consumo das PLQ provenientes do genÃtipo suscetÃvel ou do resistente

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Dioclea megacarpa Rolfe is the correct synonym for D. relexa var. grandiflora. This species belongs to Fabaceae, the legume family. Previous studies, realized in our research group, showed the presence of active proteins for several phytopathogenic fungi in the seeds of this species, among of them Aspergillus niger. Thus, the present work was proposed with the objective of determining the bioactivity of protein(s) from D.megacarpa seeds against fungi, leading to its/their purification and partial characterization and further investigation of its/their action mechanism. Another approach of this work it was analyze the insecticidal potential of glucose/mannose-specific lectin, isolated from D.megacarpa seeds (Moreira et al., 1983), against the cowpea bruchid Callosobruchus maculatus. For this, seed flour was placed in contact with 0.15 M NaCl (1:5, w/w), followed by stirring for 3 h, filtration through a nylon cloth, re-extraction for 1 h, centrifugation at 11,500 x g, for 30 min, at 4 oC. The supernatant obtained, named total extract, showed antifungal activity against A. niger and presented several bioactive proteins, including lectin (129.27 UH/mgP, using trypsinized rabbit erythrocytes), trypsin inhibitor (18.91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47.50 U/gF), toxin (LD50 119.60 mgP/Kg mice body weight ), chitinase (1.66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0.55 nKat/mgP). On the other hand, peroxidasic and proteolytic activities were not detected. For purification of antifungal principle, several chromatographies were performed on Sephadex G-50, Chitin and Resource Q, this last connected to an FPLC system. The purified antifungal protein, named Dm-PAF, with apparent molecular mass of 67-68 kDa (SDS-PAGE), did not show any haemagglutinating or chitinolytic activity and presented its NH2-terminal sequence blocked. Dm-PAF, at a very low concentration (0.015 ÂgP/ÂL), it was able to inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis yeasts. The investigation of the antifungal action mechanism excluded the possibility of interaction between Dm-PAF and H+-ATPase pumps. In addition, the glucose/mannose-specific lectin, obtained from Sephadex G-50 column, exhibited a potent insecticidal activity against C. maculatus, interfering in important parameters related to life cycle of this insect. These data show to be the D. megacarpa seeds a rich source of biologically interesting proteins, possibly involved in the defense mechanism of plants / Dioclea megacarpa Rolfe à usada como sinonÃmia de D. relexa var. grandiflora, uma espÃcie pertencente à famÃlia Fabaceae (Leguminosae). Estudos prÃvios, realizados por nosso grupo de pesquisa, demonstraram a presenÃa em suas sementes de proteÃnas ativas contra fungos fitopatogÃnicos, dentre esses Aspergillus niger. Assim, o presente trabalho foi proposto no intuito de avaliar a bioatividade de proteÃnas de sementes de D. megacarpa contra fungos, conduzindo à sua purificaÃÃo e caracterizaÃÃo parcial, bem como à investigaÃÃo de seu mecanismo de aÃÃo. Outro objetivo deste trabalho foi examinar o potencial inseticida da lectina com especificidade por glucose-manose, isolada de sementes de D. megacarpa (Moreira et al., 1983), contra o bruquÃdeo do feijÃo-caupi Callosobruchus maculatus. Para tanto, farinha de sementes foi posta em contato com NaCl 0,15 M (1:5, p/v), seguida de agitaÃÃo contÃnua por 3 h, filtraÃÃo em pano de trama fina, re-extraÃÃo por 1 h e centrifugaÃÃo a 11.500 x g, 30 min, 4 oC. O sobrenadante obtido, denominado de extrato total, se mostrou ativo contra A. niger e apresentou vÃrias proteÃnas bioativas, compreendendo lectina (129,27 UH/mgP, com eritrÃcitos tripsinizados de coelho), inibidor de tripsina (18,91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47,50 U/gF), toxina (DL50 119,60 mgP/Kg de peso corpÃreo de camundongo), quitinase (1,66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0,55 nKat/mgP). Por outro lado, atividades peroxidÃsica e proteolÃtica nÃo foram detectadas. Para purificaÃÃo da proteÃna antifÃngica, foram realizadas cromatografias em matrizes de Sephadex G-50, Quitina e Resource-Q, essa Ãltima acoplada ao sistema de FPLC. A proteÃna antifÃngica purificada de sementes de D. megacarpa, denominada de Dm-PAF, com massa molecular aparente de 67-68 kDa (PAGE-SDS), nÃo mostrou atividades hemaglutinante e quitinÃsica e apresentou sua seqÃÃncia NH2-terminal bloqueada. Dm-PAF, em concentraÃÃo baixÃssima (0,015 ÂgP/ÂL), se mostrou capaz de inibir o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, cuja investigaÃÃo do mecanismo de aÃÃo nÃo revelou envolvimento dessa proteÃna com bombas de H+-ATPase. Em adiÃÃo, a lectina ligante a glucose-manose, obtida na cromatografia em Sephadex G-50, mostrou potente atividade inseticida contra C. maculatus, interferindo em parÃmetros importantes relacionados ao ciclo de vida do inseto. Os dados apresentados mostram as sementes de D. megacarpa como uma rica fonte de proteÃnas interessantes, possivelmente envolvidas no mecanismo de defesa das plantas

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-05-19T13:06:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Bruna Ferreira Silva - 2014.pdf: 2919390 bytes, checksum: 2190735798cc33f163fa7a9b67edf9ca (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-05-19T14:23:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Bruna Ferreira Silva - 2014.pdf: 2919390 bytes, checksum: 2190735798cc33f163fa7a9b67edf9ca (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-19T14:23:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Bruna Ferreira Silva - 2014.pdf: 2919390 bytes, checksum: 2190735798cc33f163fa7a9b67edf9ca (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study was divided in two chapters. The first one focused the quantification of 26 chemical elements by ICP OES in 56 marine microalgae samples, which are potential raw material for biodiesel production. The results showed that most of these biomasses have more than 18% dry mass of these elements, when added, being much superior to freshwater microalgae and oilseeds already used in the process. These high contents were determined by Na, followed by, Mg, K and Ca, which are natural seawater constituents. It was possible to observe biosorption patterns of some chemical elements by the use of chemmometrics analysis. Among analyzed strains, P. tricornutum cultivated in f/2 media, washed with ammonium formiate and dried in incubator at 60ºC, seems to be the most promising to biodiesel destination. However, in order to get the main purpose of this study, elements profiles presented by microalgae aren't favorable, since small amounts of these elements are allowed in biodiesel because they are responsible for its oxidation and reaction with engine parts. Thus, in the second chapter it was evaluated biomass washing with water, in order to approach their compositions to conventional oilseeds. This step presents considerable removal of these elements by using 43 mL water to 1 g biomass, reaching 8% dry weight washed biomass. Therefore, it becomes preferable the use of freshwater microalgae for biodiesel production, leaving marine microalgae to other uses. / O presente estudo foi dividido em dois capítulos sendo que o primeiro focou à quantificação de 26 elementos químicos por ICP OES em 56 amostras de microalgas marinhas, que são potencial matéria-prima para a produção de biodiesel. Os resultados mostraram que a maioria destas biomassas continha mais de 18% em massa desses elementos, quando somados, sendo muito superior ao encontrado na literatura para microalgas dulcícolas e oleaginosas já utilizadas no processo. Além disso, estes elevados conteúdos foram determinados pelo elemento Na, seguido por Mg, K e Ca, que são constituintes naturais da água do mar. Foi possível observar, também, padrões de biossorção de alguns elementos químicos por meio da utilização de análise quimiométrica. Dentre as cepas analisadas, P. tricornutum cultivada em meio f/2, lavada com formiato de amônio e seca em estufa a 60ºC mostrou-se a mais promissora para tal destinação. Todavia, em vista do principal objetivo, os perfis de elementos apresentados por grande parte das microalgas não são favoráveis, já que pequenas quantidades destes elementos são permitidas no biodiesel por serem responsáveis pela oxidação do combustível e reações com partes do motor. Dessa forma, no segundo capítulo avaliou-se a lavagem da biomassa com água, a fim de aproximar suas composições às de oleaginosas convencionais. Os resultados dessa etapa mostraram que tais elementos são removidos consideravelmente com a proporção de 43 mL de água para 1 g de biomassa, atingindo até 8% em massa da microalga lavada. Assim, torna-se preferível o uso de microalgas dulcícolas para a produção de biodiesel, deixando as microalgas marinhas para outras finalidades.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas de plantas sÃo proteÃnas de origem nÃo-imune contendo pelo menos um domÃnio nÃo-catalÃtico, capaz de se ligar especÃfica e reversivelmente a mono ou oligossacarÃdeos, podendo ou nÃo apresentar sÃtios catalÃticos. As lectinas de planta sÃo o grupo mais estudado dessas proteÃnas. Apesar da alta similaridade dos membros da subtribo Diocleinae, apresentam diferenÃas na especificidade a carboidratos e atividades biolÃgicas variadas. A lectina de sementes de Canavalia boliviana foi purificada utilizando cromatografia de afinidade em matriz de Sephadex G-50 e cristalizada por difusÃo de vapor a 293 K. ApÃs otimizaÃÃes bons cristais foram obtidos utilizando a condiÃÃo de 0,1M de HEPES pH 7,5 com 3,0 M de formato de sÃdio. Os cristais apresentavam o grupo espacial monoclÃnico C2, com parÃmetros de cela de a = 126,70 Ã, b = 66,64 Ã, c = 64,99 à e Ãngulos de α = 90,0 β = 120,8 γ = 90,0Â. Observando a presenÃa de um dÃmero na unidade assimÃtrica foi estimada uma concentraÃÃo de 46% de solvente no cristal. A estrutura foi resolvida a 1,6 à usando substituiÃÃo molecular para resolver o problema das fases e as coordenadas da CGL foram utilizadas como modelo. O refinamento foi satisfatÃrio com Rfator e Rfree 17,89 e 20,71 respectivamente e todos os resÃduos de aminoÃcidos se mostraram em regiÃes permitidas no grÃfico de Ramachandran. A estrutura primaria apresentou identidade de 98% com a ConA e outras lectinas do tipo ConA. A estrutura tridimensional se mostrou semelhante com outras estruturas jà descritas, mas algumas diferenÃas foram observadas principalmente em regiÃes de âloopâ. Essas diferenÃas podem ser responsÃveis pelas diferenÃas nas atividades biolÃgicas dessas proteÃnas / Lectins are proteins of non immune origin with non-catalytic site that bind reversibly and specific carbohydrates, containing or not a catalytic-site. Plant lectins are the most studied group of carbohydrate binding proteins. Despite the high similarity between the members of the Diocleinae sub tribe (Leguminosae) group, they present different biological activities. Canavalia boliviana lectin (Cbol) was purified using a Sephadex G-50 column and crystallized in the presence of X-Man by hanging-drop vapor diffusion at 293K. After optimizations crystals suitable for diffraction were obtained under the condition 0.1 M HEPES pH 7.5 and 3.0 M sodium formate. The crystal belongs to the monoclinic space group C2, with unit-cell parameters a = 126.70 Ã, b = 66.64 Ã, c = 64.99 à and the angles α = 90.0 β = 120.8 γ = 90.0Â. A complete data set was collected at 1.5 à resolution. Assuming the presence of a dimmer in the asymmetric unit, the solvent content was estimated to be about 46%. The structure was solved at 1.6 à using molecular replacement to solve the phase problem and CGL coordinates was used as model. The refinement was satisfactory Rfactor and Rfree were respectively 17.98 and 20.71 and all amino acids residues were found in allowed regions. The primary structure showed 98% of identity to ConA and others ConA like lectins. The tridimensional structure observed showed high similarity to others already described structures, but some differences could be observed mainly on loop regions. These differences could be responsible for the distinct biological effects of these proteins

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Plumeria rubra L. à uma planta laticÃfera pertencente à famÃlia Apocynaceae popularmente conhecida como Jasmim. Por apresentar flores vistosas e perfumadas, essa Ãrvore à comumente vista ornamentando praÃas e jardins residenciais dos grandes centros urbanos. Plantas laticÃferas sÃo assim denominadas por que produzem endogenamente um fluido de aspecto geralmente leitoso - o lÃtex - que à exsudado da planta quando esta sofre algum tipo de ferimento, seja por dano mecÃnico ou por ataque de predadores. O lÃtex à um material vegetal que tem sido alvo de estudos bioquÃmicos e farmacolÃgicos que mostram ser ele uma fonte promissora de compostos com potencial aplicaÃÃo biotecnolÃgica. No presente trabalho o lÃtex de P. rubra foi alvo de investigaÃÃes bioquÃmicas e biolÃgicas com Ãnfase na pesquisa de proteÃnas que pudessem apresentar alguma aÃÃo deletÃria contra insetos pragas agrÃcolas. Procedimentos laboratoriais que empregam centrifugaÃÃes e diÃlises permitiram o fracionamento do lÃtex em trÃs componentes distintos: borracha (BL), proteÃnas (PLPr) e molÃculas de baixa massa molecular (DL). A fraÃÃo PLPr foi alvo de caracterizaÃÃo bioquÃmica e enzimÃtica e foi utilizada em bioensaios com o caruncho do feijÃo-de-corda, Callosobruchus maculatus e com a mosca-das-frutas, Ceratitis capitata. O lÃtex Ãntegro e suas fraÃÃes foram utilizados em ensaios de repelÃncia da ovoposiÃÃo de C. maculatus e Zabrotes subfasciatus. A fraÃÃo BL à o componente majoritÃrio do lÃtex, 70 %, enquanto as fraÃÃes PLPr e DL constituem cerca de 15 % cada uma. O teor de proteÃnas solÃveis na fraÃÃo PLPr foi de 0,33 mg/mL. AnÃlises eletroforÃtica e espectromÃtricas revelaram a presenÃa de proteÃnas com massas moleculares que variaram de 12 a 117 kDa, com um mÃximo de proteÃnas com 26 kDa e pI<6,0. A caracterizaÃÃo enzimÃtica mostrou que as enzimas antioxidantes superÃxido dismutase e peroxidase foram detectadas na fraÃÃo protÃica, assim como, uma atividade quitinÃsica. As proteÃnas do lÃtex foram capazes de degradar azocaseÃna (substrato inespecÃfico) e BANA (substrato especÃfico para proteases cisteÃnicas). As enzimas proteolÃticas detectadas foram principalmente do tipo cisteÃnica, e em menor proporÃÃo, serÃnica. O pH e a temperatura Ãtimos para esta atividade foram 6,0 e 37 ÂC, respectivamente, onde valores de temperatura superiores anulam a atividade. Utilizando experimentos de dieta artificial pÃde-se observar que a fraÃÃo protÃica do lÃtex a 0,4 % foi capaz de diminuir em 50 % a sobrevivÃncia, e a 0,1 %, diminuir 50 % do ganho de massa das larvas de C. maculatus. Quando essas proteÃnas foram desnaturadas por aquecimento o desenvolvimento larval foi igual ao controle, sugerindo que a manutenÃÃo da estrutura protÃica à essencial para o efeito observado. As proteÃnas do lÃtex nÃo foram digeridas pelas proteases endÃgenas do trato digestÃrio das larvas, sugerindo que as mesmas ficariam livres para causar o efeito deletÃrio. Nenhum efeito no desenvolvimento das larvas de C. capitata foi observado quando as proteÃnas foram adicionadas à dieta, mesmo na concentraÃÃo de 4 %. O lÃtex Ãntegro, quando adsorvido em sementes de feijÃo, apresentou atividade inibitÃria do tipo repelente sobre a ovoposiÃÃo de ambos os bruquÃdeos testados, sendo mais evidente em Z. subfasciatus. A aÃÃo repelente observada foi dose e tempo dependente. O lÃtex nÃo foi capaz de afetar a viabilidade dos ovos e nem o desenvolvimento larval. As fraÃÃes PLPr e DL nÃo apresentaram atividade repelente, mostrando que nem proteÃnas nem molÃculas de baixa massa molecular estÃo envolvidas nessa aÃÃo. Os insetos, quando expostos diretamente ao lÃtex por longo perÃodo de tempo nÃo tiveram sua fecundidade nem ovoposiÃÃo afetados, sugerindo que o efeito observado nÃo altera a fisiologia do animal / Plumeria rubra L. is a laticÃfera plant belonging to the family Apocynaceae popularly known as Jasmim. For spicy and fragrant flowers make this tree is commonly seen ornate squares and gardens of residential urban centers. LaticÃfer plants are well known for producing a fluid endogenously generally milky in appearance - latex - that exudates from the plant when it undergoes some type of injury, either by mechanical damage or attack by predators. Latex is a material that has been the subject of biochemical and pharmacological studies show that it is a promising source of compounds with potential biotechnological application. In this study the latex of P. rubra was the subject of biochemical and biological research with emphasis on the search for proteins that could make any deleterious action against agricultural insect pests. Laboratory procedures that employ centrifugation and dialysis allowed the fractionation of latex into three distinct components: rubber (BL), proteins (PLPr) and low molecular weight molecules (DL). The PLPr fraction was subject to biochemical and enzymatic characterization and was used in bioassays with the bean weevil-of-rope, Callosobruchus maculatus and the fruit fly, Ceratitis capitata. The full latex and its fractions were used in testing the repellency of oviposition of C. maculatus and Zabrotes subfasciatus. The BL fraction is the major component of latex, 70 %, while PLPr and DL fractions are about 15 % each one. The content of soluble protein in PLPr fraction was 0.33 mg / mL. Espectrometric and electrophoretic analysis revealed the presence of proteins with molecular weights ranging from 12 to 117 kDa, with a maximum of protein with 26 kDa and pI <6.0. The characterization showed that the enzyme antioxidativas enzymes superoxide dismutase and peroxidase were detected in the protein fraction, as well as activity chitinases. Proteins of latex were able to degrade azocasein (nonspecific substrate) and BANA (specific substrate for cysteine proteases). The proteolytic enzymes were detected mainly of type cysteine and to a lesser extent, serine proteases. The pH and temperature optimum for this activity was 6.0 and 37 ÂC respectively, where higher values of temperature cancel the activity. Through experiments with artificial diet can be observed that the protein fraction of latex in 0.4 % was able to reduce by 50 % the survival and, in 0.1 %, reduce the by 50 % the weight gain of larvae of C. maculatus. When these proteins were denatured by heating the larval development was similar to the control, suggesting that the maintenance of protein structure is essential for the observed effect. Proteins of latex were not digested by endogenous proteases of the digestive tract of larvae, suggesting that they would be free to cause deleterious effects. No effect on the development of the larvae of C. capitata was observed when the proteins were added to the diet, even at a concentration of 4 %. Whole latex when adsorbed in bean seeds, showed repellent activity on oviposition of both bruchid, being more evident in Z. subfasciatus. The repellent activity was observed time and dose dependent. The latex was unable to affect the viability of eggs or larval development. The PLPr and DL fractions showed no repellent activity, showing that neither protein nor molecules with low molecular weight are involved in this action. The insects, when exposed directly to the latex for a long period of time had not affected their fecundity or oviposition.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O lÃtex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui molÃculas com diferentes atividades farmacolÃgicas, dentre estas, prÃ- e antiinflamatÃria. Neste trabalho, o efeito imunomodulatÃrio da fraÃÃo de proteÃnas solÃveis do lÃtex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculaÃÃo de S. Typhimurium. Aspectos bioquÃmicos das proteÃnas do lÃtex foram investigados e parÃmetros bioquÃmicos, hematolÃgicos e histopatolÃgicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivÃncia de atà 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e nÃo tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da induÃÃo da sepse. PL nÃo apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de aÃÃo indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A populaÃÃo microbiana no fÃgado, baÃo e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas apÃs inoculaÃÃo bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactÃrias viÃveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteÃnas do lÃtex. O efeito protetor de PL foi revisto atravÃs de suas trÃs sub-fraÃÃes protÃicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas atravÃs de fracionamento por cromatografia de troca iÃnica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As trÃs sub-fraÃÃes protÃicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento tÃrmico de PL (100 ÂC, 30 min.) ou inibiÃÃo de suas proteases endÃgenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O Ãxido nÃtrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram nÃveis similares ao controle apÃs 24 horas da infecÃÃo. Este resultado corroborou com a observaÃÃo de que animais com sepse letal apresentaram falÃncia na migraÃÃo de neutrÃfilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de cÃlulas para a cavidade peritoneal. AlÃm disto, nestes animais, o nÃvel de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provÃvel atividade dos neutrÃfilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, apÃs 4 e 24 horas de infecÃÃo, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas nÃo em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migraÃÃo de neutrÃfilos, enquanto que a linfopenia à parte da imunossupressÃo estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias apÃs a infecÃÃo, sugerindo um estÃmulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no inÃcio da sepse (24 h), sà ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutÃmico oxalacÃtica estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutÃmico pirÃvica nÃo teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. AnÃlises histopatolÃgicas do fÃgado e baÃo mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado apÃs sete dias. A anÃlise integrada de todos os resultados sugere que as proteÃnas do lÃtex modulam a resposta imunoinflamatÃria por mecanismo indireto, revertendo à falÃncia da migraÃÃo de neutrÃfilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunolÃgica ainda nÃo esclarecida, que permite a sobrevivÃncia dos animais, mesmo sob infecÃÃo. Os resultados sugerem que a modulaÃÃo de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacolÃgicas de PL previamente descritas em modelos clÃssicos de inflamaÃÃo sÃo agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatÃria sistÃmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido. / Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 &#61616;C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection.

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The secretion of proteins in a cell is a highly dynamic mechanism and is directly involved in the first pathogen contact with the host cells, enabling their survival, multiplication and dissemination. In order to try to elucidate this diversity the proteomic profile of secretome of two isolates of Paracoccidioides, PbEpm83 and Pb01, that in our experimental conditions of infection showed different behaviors was characterized. The use of Ultra Performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MSE) allowed the identification of 92 proteins / isoforms among the strains. Of the 92 proteins identified, 36 were preferentially secreted in PbEpm83 and 35 preferentially secreted in Pb01. Among the identified we can highlight proteins related to various biological processes: adhesion to the ECM, proteins related to thermal and oxidative stress, cell rescue, defense and virulence, proteins with immunogenic capacity, proteins related to defense against antifungal, heat shock proteins, among others. Our analysis showed that most of the proteins identified using non-conventional secretory pathways. Among the identified proteins there are already related proteins as virulence factors, such as, ATP synthase, mitochondrial Peroxiredoxin PRX 1, fructose bisphosphate aldolase, Didpeptidil peptidase, Thioredoxin, TCTP, Hsp70 and Hsp88. Our results highlight the importance of secreted proteins in the establishment of infection and that these species, within the same genus, maintain differences in the levels of protein expression that may reflect their behavior in the success of the infection. / Paracoccidioides é um fungo termodimórfico causador da paracoccidioidomicose (PCM), a mais frequente micose sistêmica que afeta, principalmente, a população rural na América Latina. O fungo cresce como levedura quando cultivado à 35-37 °C e como micélio à temperaturas inferiores à 28 °C. O estabelecimento e severidade da doença dependem de fatores inerentes ao fungo bem como ao hospedeiro. A diversidade apresentada entre isolados de um mesmo gênero tem sido explorada entre micro-organismos e procura elucidar diferenças possivelmente relacionadas à virulência existentes entre isolados que causam a mesma doença. A secreção de proteínas em uma célula é um mecanismo altamente dinâmico e que está diretamente envolvido nos primeiros contatos do patógeno com as células do hospedeiro, capacitando sua sobrevivência, multiplicação e disseminação. A fim de tentar elucidar essa diversidade o perfil proteômico do secretoma de dois isolados de Paracoccidioides, PbEpm83 e Pb01, pertencentes à duas espécies filogenéticas diferentes, que em nossas condições experimentais de infecção apresentaram comportamentos diferentes foi caracterizado. A utilização da Cromatografia Líquida de Ultraperformance acoplada à Espectrometria de Massas (UPLC-MSE) permitiu a identificação de 92 proteínas/isoformas entre as amostras testadas. Das 92 proteínas identificadas, 36 foram preferencialmente secretadas em PbEpm83 e 35 preferencialmente secretadas em Pb01. Dentre as identificadas podemos destacar proteínas relacionadas à vários processos biológicos: adesão à MEC, proteínas relacionadas ao estresse térmico e oxidativo, resgate celular, defesa e virulência, proteínas com capacidades imunogênicas, proteínas relacionadas à defesa contra antifúngicos, proteínas de choque térmico, entre outras funções. Nossas análises mostraram que a maioria das proteínas identificadas utilizam vias secretórias não-convencionais. Entre as proteínas identificadas estão proteínas já relacionadas como fatores de virulência: ATP sintase, Peroxirredoxina mitocondrial PRX 1, Frutose bifosfato aldolase, Didpeptidil peptidase, Tioredoxina, TCTP, Hsp70 e Hsp88. Nossos resultados ressaltam a importância das proteínas secretadas no estabelecimento da infecção e que estas espécies dentro do mesmo gênero mantêm diferenças nos níveis de expressão proteica que podem refletir em seu comportamento no sucesso da infecção.