Malformações ou anomalias congênitas são deformidades que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e que, no caso dos répteis podem ter diversas causas, como genética, temperatura, radiação ou contaminantes entre outros fatores. Este estudo verificou as malformações em filhotes recém-nascidos de jararaca (Bothrops jararaca) e cascavel (Crotalus durissus) de fêmeas prenhes recém-capturadas na natureza (323 e 41 ninhadas respectivamente) do sudeste brasileiro. Após o nascimento, os filhotes foram medidos, pesados e o sexo foi verificado. Realizamos análise macroscópica em busca de malformações perceptíveis e conduzimos exames radiográficos a fim de descrever e documentar as anomalias. As jararacas apresentaram 129 indivíduos malformados entre 5427 recém-nascidos (2,4%); e as cascavéis ttiveram 50 serpentes malformadas em 391 nascidos (12,7%). Anomalias na coluna vertebral foram as mais comuns para as duas espécies, seguidas de fusão nas placas ventrais e malformações oculares. Os filhotes de jararaca apresentaram uma maior variedade de malformações como esquistossomia, cauda retorcida, bicefalia e hidrocefalia, não encontradas em cascavéis. O Ensaio do Cometa não apresentou diferença estatística significativa no índice de dano do DNA (ID) das células das mães que pariram filhotes normais e das que pariram filhotes malformados. Os dois grupos apresentaram células com diferentes graus de dano no DNA. Quando comparamos o tamanho das mães e a frequência de malformações encontramos uma regressão positiva (r2= 0,67). Devido à relação positiva entre idade e tamanho nos répteis concluímos que serpentes com idade mais avançada tendem a apresentar mais filhotes com malformações. O padrão de uso do solo (urbanização, agricultura, pecuária e vegetação nativa), foi correlacionado com a presença de filhotes com malformações, utilizando o Coeficiente de Spearman. Houve uma correlação positiva entre a presença de malformações e as áreas agrícolas (rs= 0,67; p=0,01), mas negativa quando comparados às áreas de vegetação nativa (rs= -0,57; p=0,03). Não houve correlação entre a pecuária ou urbanização e malformações em jararaca. Malformações em cascavel não apresentaram quaisquer correlações com o padrão de uso do solo, sendo que tal condição pode ser resultado da baixa amostragem desta espécie no presente estudo. Serpentes são animais de topo de cadeia e se mostram como bons indicadores biológicos. A presença e diversidade de malformações apresentadas, aliadas ao fato de haver correlação com os padrões do uso do solo, demonstram a necessidade de se realizar um estudo mais aprofundado e interdisciplinar das causas destes fenômenos e um monitoramento destas espécies para se ter um panorama temporal do problema / Malformations or congenital anomalies are deformities that occur during embryonic development and in the case of reptiles may have several causes, such as genetics, temperature, radiation, contaminants and other factors. This study assessed malformations in newborn of pit viper (Bothrops jararaca) and South American rattlesnake (Crotalus durissus,) from wild captured pregnant females (323 and 41 litters respectively) in southeastern Brazil. Newborn snakes were measured, weighed, sexed and studied grossly and by radiography for the presence of malformations. We performed macroscopic analysis in search of noticeable defects and radiographic examinations conducted in order to describe and document the deficiencies. A hundred twenty -nine malformed pit vipers were identified from 5,427 births (2.4%), while 50 malformed rattlesnakes were found from 391 births (12.7%). Spinal abnormalities were the most common in both species, followed by fusion of ventral scales. Pit vipers showed a greater range of malformations including schistosomia, kinked tail, bicephaly and hydrocephaly. There was no statistically significant difference in the index of DNA damage (ID) determined by the Comet Assay in the erythrocytes of mothers that delivered normal litters compared to the erythrocytes of the ones that delivered malformed neonates, both groups containing cells with different degrees of DNA damage. When comparing the length of the pit viper mothers with the frequency of malformations, a positive regression (r2 = 0.67) was found. Due to the positive relationship between age and size in snakes we conclude that older animals tend to have more malformed offspring. The patterns of land use (urbanization, agriculture, livestock and native vegetation) have been correlated with the presence of neonates with malformations. There was a positive correlation between the presence of malformations in pit viper neonates and agricultural areas (rs = 0.67, p = 0.01) but a negative one when compared to areas of native vegetation (rs = -0.57, p = 0.03). There was no correlation between urbanization or livestock and malformations in pit vipers. Malformations in rattlesnake did not show any correlation with the pattern of land use, and such condition could be the result of the poor sampling of this species in the present study. As snakes are in the top of the animal food-chain they are good biological indicators. The presence and diversity of malformations presented, coupled with the correlation with the patterns of land use, demonstrate the need to undertake further interdisciplinary study of the causes of these phenomena and the behavior of these species to have a temporal overview of the problem

Este estudo teve por objetivos: a) caracterizar o influxo de leucócitos (LC) induzido pelo veneno de Bothrops moojeni (VBm); b) avaliar o papel dos mastócitos (MC) e da histamina neste evento; c) analisar a liberação de TXA2, PGD2, LTB4, MCP-1 e KC e d) avaliar a capacidade do VBm desgranular MC in vivo e in vitro. A injeção intraperitoneal de VBm, em camundongos, causou o recrutamento de LC e neutrofilia. O tratamento dos animais com cromoglicato aboliu o influxo de LC enquanto a difenidramina, ranitidina e a tioperamida, antagonistas da histamina, reduziram o influxo de neutrófilos. Ainda, o veneno induziu a liberação de PGD2, TXA2, LTB4, MCP-1 e de KC e causou a desgranulação de MC in vivo e a liberação de -hexosaminidase de MC in vitro. Em conclusão, o VBm induz influxo de LC para o local de sua injeção. Este efeito depende da histamina, via receptores H1, H2 e H4 e da desgranulação de MC, que decorre de ação direta do veneno nestas células. A neutrofilia e o TXA2, LTB4, MCP-1 e KC devem contribuir para o influxo de leucócitos causado pelo VBm. / In this study the effects of Bothrops moojeni venom (BmV) on the cellular component of inflammatory responses and the mechanisms involved in this effect were investigated. The effects of venom on peritoneal and circulating leukocyte numbers and on the release of inflammatory mediators, such as LTB4, TXA2, PGD2, MIP-1 and KC, were assessed. The role of both mast cells and histamine receptors in leukocyte recruitment induced by BmV was assessed by selected pharmacological treatments. BmV caused a marked infiltration of leukocytes (3-24 h) when injected into the peritoneal cavity of mice. Neutrophils (PMN) were the predominant cell type in the early stages of response whereas macrophages (MN) were accumulated from 3 up to 24 h. Moreover, BmV increased blood neutrophil numbers at 3 h after injection. The BmV-induced leukocyte influx was abrogated by cromoglicate and significantly reduced either by difenidramine or ranitidine or tioperamide, histamine H1, H2 and H4 receptor antagonists, respectively, at 6 h after injection. Significant increments in peritoneal levels of LTB4, TXA2, PGD2, MIP-1 and KC were detected at distinct periods of time after venom injection. In addition, BmV induced mast cell degranulation both in vivo and in vitro. In conclusion, obtained data demonstrated the ability of BmV induce leukocyte recruitment into the site of its injection. This effect is dependent on mast cell activation and degranulation, which may be due to a direct effect of venom on these cells, and is mediated at least in part by histamine via H1, H2 and H4 receptors. Moreover, the ability of venom to mobilize leukocytes from bone marrow reserve compartments and to release the chemotactic mediators TXA2, LTB4, MCP-1 and KC may be relevant for leukocyte infiltration.

Bothrops jararaca é uma das principais serpentes responsáveis por acidentes ofídicos em São Paulo. O efeito do envenenamento pode ser local ou sistêmico, os quais são mediados por uma variedade de componentes do veneno. Considerando que, em animais vertebrados, o fígado desempenha atividades metabólicas essenciais, além de ser o principal órgão responsável pela síntese de proteínas do plasma, a obtenção do transcriptoma deste é de extrema importância para o estudo destas proteínas. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão de RNA no fígado de B. jararaca. Para isto foram obtidas 1700 sequências nucleotídicas denominadas Expressed Sequences Tags (ESTs). As sequências de nucleotídeos foram reunidas em 260 contigs, que foram submetidos ao banco de dados NCBI GenBank usando os algorítimos Blastx e Blastn. dos transcritos tiveram hit com banco de dados NR enquanto 30,5% das ESTs não tiveram homologia. De acordo com a análise do Gene Ontology (GO), os transcritos foram designados para processo biológico, componente celular e função molecular. A maioria dos transcritos foram agrupados em processo biológico, distribuídos em processo metabólico, processo celular e regulação biológica. No entanto, as atividades de ligação proteica, catalítica e de atividade regulatória enzimática foram as principais categorias relacionadas à função molecular. A análise do componente celular apresentou maior número de transcritos envolvidos com a parte celular, região extracelular e restrito a membrana de organela. O maior grupo de transcritos foi relacionado a inibidores de metaloproteases, inibidores de serinoproteases e inibidores de PLA2. Estudos de expressão gênica de alguns alvos selecionados na biblioteca de cDNA de B. jararaca foram realizados para comparação da expressão entre serpentes jovens e adultas. Esses resultados fornecem dados que poderão auxiliar nos estudos filogenéticos entre as diferentes espécies de serpentes e investigar a diferença no padrão da expressão gênica, fornecendo dados importantes sobre a biologia desses animais, contribuindo assim para a elucidação da fisiologia desses animais. Além disso, será útil na identificação de moléculas que possam ser candidatas a alvos terapêuticos. / Bothrops jararaca is the main responsible for snake bites in São Paulo. There are both local and systemic envenomation effects, which are mediated by a variety of venom components. Considering that in vertebrate animals the liver is an important organ responsible for synthesis of plasma proteins, it would be valuable to get transcriptomic information about it. Thus, the aim of this work was to analyze expression profile at RNA level in B. jararaca liver. For this purpose, we sequenced 1700 Expressed Sequence Tags (ESTs) from a cDNA library of B. jararaca liver. Nucleotide sequences were assembled into 260 contigs, which were submitted to the GenBank NCBI database using BLASTX and BLASTN algorithms. Transcripts showed 43% hits with NR database while 30.5% of ESTs had no homology. According to Gene ontology (GO) analysis, transcripts were assigned for biological process, cellular component and molecular function. Majority of transcripts were classified in biological process category distributed in metabolic process, cellular processes and biological regulation, whereas binding and catalytic activities were the main category in molecular function. Cellular component analysis identified transcripts related to cell part, extracellular region and membrane-bounded organelle. The major group of transcripts was related to metalloproteinase inhibitors, followed by serine proteinase inhibitors and phospholipase A2 inhibitors. Studies of gene expression of some selected targets in the cDNA library of B. jararaca, by real time PCR were performed to compare expression in juvenile and adult snake specimens. Our results will help in studies of phylogenetic relationships between different snake species, and investigate differences in gene expression pattern. In addition, our findings are also helpful in the identification of active compounds for development of improved therapeutics for snake bites.

Malformações ou anomalias congênitas são deformidades que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e que, no caso dos répteis podem ter diversas causas, como genética, temperatura, radiação ou contaminantes entre outros fatores. Este estudo verificou as malformações em filhotes recém-nascidos de jararaca (Bothrops jararaca) e cascavel (Crotalus durissus) de fêmeas prenhes recém-capturadas na natureza (323 e 41 ninhadas respectivamente) do sudeste brasileiro. Após o nascimento, os filhotes foram medidos, pesados e o sexo foi verificado. Realizamos análise macroscópica em busca de malformações perceptíveis e conduzimos exames radiográficos a fim de descrever e documentar as anomalias. As jararacas apresentaram 129 indivíduos malformados entre 5427 recém-nascidos (2,4%); e as cascavéis ttiveram 50 serpentes malformadas em 391 nascidos (12,7%). Anomalias na coluna vertebral foram as mais comuns para as duas espécies, seguidas de fusão nas placas ventrais e malformações oculares. Os filhotes de jararaca apresentaram uma maior variedade de malformações como esquistossomia, cauda retorcida, bicefalia e hidrocefalia, não encontradas em cascavéis. O Ensaio do Cometa não apresentou diferença estatística significativa no índice de dano do DNA (ID) das células das mães que pariram filhotes normais e das que pariram filhotes malformados. Os dois grupos apresentaram células com diferentes graus de dano no DNA. Quando comparamos o tamanho das mães e a frequência de malformações encontramos uma regressão positiva (r2= 0,67). Devido à relação positiva entre idade e tamanho nos répteis concluímos que serpentes com idade mais avançada tendem a apresentar mais filhotes com malformações. O padrão de uso do solo (urbanização, agricultura, pecuária e vegetação nativa), foi correlacionado com a presença de filhotes com malformações, utilizando o Coeficiente de Spearman. Houve uma correlação positiva entre a presença de malformações e as áreas agrícolas (rs= 0,67; p=0,01), mas negativa quando comparados às áreas de vegetação nativa (rs= -0,57; p=0,03). Não houve correlação entre a pecuária ou urbanização e malformações em jararaca. Malformações em cascavel não apresentaram quaisquer correlações com o padrão de uso do solo, sendo que tal condição pode ser resultado da baixa amostragem desta espécie no presente estudo. Serpentes são animais de topo de cadeia e se mostram como bons indicadores biológicos. A presença e diversidade de malformações apresentadas, aliadas ao fato de haver correlação com os padrões do uso do solo, demonstram a necessidade de se realizar um estudo mais aprofundado e interdisciplinar das causas destes fenômenos e um monitoramento destas espécies para se ter um panorama temporal do problema / Malformations or congenital anomalies are deformities that occur during embryonic development and in the case of reptiles may have several causes, such as genetics, temperature, radiation, contaminants and other factors. This study assessed malformations in newborn of pit viper (Bothrops jararaca) and South American rattlesnake (Crotalus durissus,) from wild captured pregnant females (323 and 41 litters respectively) in southeastern Brazil. Newborn snakes were measured, weighed, sexed and studied grossly and by radiography for the presence of malformations. We performed macroscopic analysis in search of noticeable defects and radiographic examinations conducted in order to describe and document the deficiencies. A hundred twenty -nine malformed pit vipers were identified from 5,427 births (2.4%), while 50 malformed rattlesnakes were found from 391 births (12.7%). Spinal abnormalities were the most common in both species, followed by fusion of ventral scales. Pit vipers showed a greater range of malformations including schistosomia, kinked tail, bicephaly and hydrocephaly. There was no statistically significant difference in the index of DNA damage (ID) determined by the Comet Assay in the erythrocytes of mothers that delivered normal litters compared to the erythrocytes of the ones that delivered malformed neonates, both groups containing cells with different degrees of DNA damage. When comparing the length of the pit viper mothers with the frequency of malformations, a positive regression (r2 = 0.67) was found. Due to the positive relationship between age and size in snakes we conclude that older animals tend to have more malformed offspring. The patterns of land use (urbanization, agriculture, livestock and native vegetation) have been correlated with the presence of neonates with malformations. There was a positive correlation between the presence of malformations in pit viper neonates and agricultural areas (rs = 0.67, p = 0.01) but a negative one when compared to areas of native vegetation (rs = -0.57, p = 0.03). There was no correlation between urbanization or livestock and malformations in pit vipers. Malformations in rattlesnake did not show any correlation with the pattern of land use, and such condition could be the result of the poor sampling of this species in the present study. As snakes are in the top of the animal food-chain they are good biological indicators. The presence and diversity of malformations presented, coupled with the correlation with the patterns of land use, demonstrate the need to undertake further interdisciplinary study of the causes of these phenomena and the behavior of these species to have a temporal overview of the problem

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - Ana Paula de Aragao Gama.pdf: 3298309 bytes, checksum: 4431d39927607e7468491c92864e1b38 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / This study had as a purpose determine the clinic-pathological and laboratory changes in inoculated sheeps with the Bothrops jararaca and B. jararacussu poison, for the purpose to provide subsidies for the establishment of the diagnosis and differential diagnosis of snake bites. The liofilized venoms were diluted in 1 ml saline and administrated subcutaneously into four sheep. Three of the animals died, and the one that received 0. 5mg/kg (B. jararaca) recovered. Clinical signs were observed from 7 minutes to 1 hours after inoculation. The evolution period varied from 7 hours and 9 minutes up to 21 hours and 59 minutes. The symptoms, independent of the dosage, were swelling (hemorrhage/oedema) of the inoculation site, increased bleeding time and capillary filling; tachycardia, dyspnea, hipocorated mucous membranes and diminished reaction to external stimuli in some animals. Laboratory exam revealed pronounced normocytic and normochromic anemia, trombocytopenia, slight reduction of fibrogen and total plasmatic protein, diminished hematocrit in too animals, besides pronounced increase of the creatinaquinase and lactic dehydrogenase. The main findings at necropsy were large hemorrhagic or oedema areas in the subcutaneous tissue of the inoculation site. Besides hemorrhages/oedema, the main histopathologic alteration was hyalinization of muscle fibers and vessels, most severe at the inoculation site. This study it was seen, that the swelling at the inoculation site and adjacency was due to blood, for B. jararaca venom and oedema, for B. jararacussu venom. / Esse estudo teve como objetivo determinar as altera??es cl?nico-patol?gicas e laboratoriais em ovinos inoculados com a pe?onha de Bothrops jararaca e B. jararacussu, no intuito de fornecer subs?dios que possam facilitar o estabelecimento do diagn?stico e do diagn?stico diferencial dessa condi??o. Os venenos liofilizados foram dilu?dos em 1 ml de solu??o fisiol?gica e administrados a quatro ovinos por via subcut?nea. Tr?s ovinos foram a ?bito e um que recebeu a dose de 0,5 mg/kg (B. jararaca), recuperou-se. Os sinais cl?nicos tiveram in?cio entre 7 minutos e 1 horas. O per?odo de evolu??o variou de 7 horas e 9 minutos a 21 horas e 59 minutos. O quadro cl?nico, independentemente das doses, caracterizou-se por aumento de volume (hematoma/edema) no local da inocula??o, tempo de sangramento e de preenchimento capilar aumentados; taquicardia, dispn?ia, mucosas hipocoradas e apatia em alguns animais. O exame laboratorial revelou acentuada anemia normoc?tica normocr?mica, trombocitopenia, acentuada redu??o de fibrinog?nio e prote?nas plasm?ticas totais, hemat?crito diminu?do em dois animais, al?m de acentuado aumento de creatinaquinase e desidrogenase l?tica em todos os animais. ? necropsia, os principais achados eram extensos hematomas/edemas no local da inocula??o e tecidos adjacentes e, em dois animais, acentuado edema pulmonar agudo (B. jararacussu). Al?m de hemorragias/edema, a principal altera??o histopatol?gica verificada foi necrose das fibras musculares e de vasos, no local de inocula??o e adjac?ncias. Nos ovinos deste estudo, o aumento de volume observado no local de inocula??o e adjac?ncias era constitu?do por sangue (B. jararaca) e edema (B. jararacussu).

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.

As peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de enzimas e proteínas tóxicas. No Brasil, as serpentes dos gêneros Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos, os quais provocam dano tecidual local (como hemorragia, necrose e edema) e efeitos sistêmicos (como alterações na coagulação sanguínea). Envenenamentos por picadas de serpente são frequentemente tratados com a administração parenteral de soro antiofídico, visando a neutralização de toxinas. No entanto, apesar do sucesso da soroterapia, é importante a busca de inibidores capazes de neutralizar o dano tecidual local. Os extratos de plantas constituem uma fonte extremamente rica de compostos farmacologicamente ativos, e muitos extratos possuem atividade antiofídica. Neste estudo, o extrato metanólico das folhas de Serjania erecta, planta medicinal com propriedade anti-inflamatória foi submetido ao fracionamento cromatográfico, obtendo-se quatro frações principais que foram avaliadas por testes fitoquímicos, revelando a presença de saponinas, terpenos, flavonóides (SF3) e taninos (SF4). O isolamento e a caracterização de duas flavonas glicosiladas da fração rica em flavonóides (isovitexina e vitexina) também foram alcançados. Além disso, foi realizado o estabelecimento de culturas in vitro de S. erecta para assegurar, em um futuro próximo, a produção constante de metabólitos secundários, bem como a conservação desta espécie vegetal. Nos testes de inibição de atividade de peçonha de serpentes, a atividade fosfolipásica induzida pelas peçonhas de B. jararacussu e C. d. terrificus, e toxinas isoladas (BthTX-II e crotoxina) foi inibida pelas amostras testadas, sendo que as frações SF3 e SF4 inibiram completamente a ação da toxina BthTX-II, enquanto que a crotoxina foi inibida com sucesso pela ação da fração SF4. O extrato metanólico de S. erecta e a fração SF3 foram capazes de prevenir a ação fibrinogenolítica da peçonha de B. moojeni. Já os extratos metanólicos in natura e dos calos, as frações SF3 e SF4, e as flavonas promoveram proteção parcial das cadeias do fibrinogênio quando incubados juntos com a peçonha de B. jararacussu. Nos ensaios sobre atividade coagulante, a vitexina e as frações SF3 e SF4 atuaram como potentes inibidores desta atividade induzida pela peçonha de B. jararacussu. O mesmo foi observado no ensaio sobre a inibição do edema induzido por BthTX-I. A atividade hemorrágica das peçonhas de B. jararacussu e B. neuwiedi foi inibida pela ação do extrato metanólico das folhas de S. erecta e de suas frações. Sendo assim, as frações SF3 e SF4, ricas em flavonóides e taninos, respectivamente, apresentam compostos capazes de inibir a ação de toxinas presentes nas peçonhas. Os estudos sobre modelagem molecular feito entre a miotoxina BthTX-I e os compostos isolados demonstraram que o complexo toxinainibidor é estabilizado por pontes de hidrogênio com as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos da região do sítio catalítico da toxina. Além disso, os espectros de ii dicroísmo circular não revelaram mudanças significativas nas estruturas secundárias das miotoxinas BthTX-I e II quando quando na presença das flavonas (vitexina e isovitexina). Entre as flavonas tanto a vitexina como a isovitexina mostraram resultados semelhantes em quase todas as atividades testadas, porém na atividade anticoagulante induzida pela peçonha de B. jararacussu, a vitexina impediu a coagulação do plasma testado, sugerindo que a posição do açúcar pode ter influenciado a inibição da atividade. Estes resultados sugerem que parte da ação antiofídica do extrato metanólico de S. erecta ocorre devido a ação dos compostos isolados em conjunto com outras classes de compostos presentes nesta planta medicinal. / Snake venoms are a complex mixture of enzymes and toxic proteins. In Brazil, Bothrops snakes are responsible for most accidents with venomous animals, which cause local tissue damage (hemorrhage, edema and necrosis) and systemic effects (blood clotting disorders). Snakebites are often treated with parenteral administration of antivenom, aimed at the neutralization of toxins. However, despite the success of serum therapy, it is important to search for inhibitors that can neutralize the local tissue damage. Plant extracts constitute a rich source of pharmacologically active compounds, and many extracts present antiophidian activity. In this study, the methanolic extract of leaves of Serjania erecta, a medicinal plant with antiinflammatory properties, was subjected to chromatographic fractionation, resulting in four main fractions that were evaluated by phytochemical tests, revealing the presence of saponins, terpenes, flavonoids (SF3) and tannins (SF4). The isolation and characterization of two flavone glycosides of the flavonoid-rich fraction (isovitexin and vitexin) were also achieved. Moreover, the in vitro cultures of Serjania erecta also established to allow, in the near future, the continuous production of secondary metabolites, as well as the conservation of this plant species. The aim of this study was to evaluate the effect of methanolic extract of aerial parts of S. erecta and its fractions, isolated compounds and methanolic extract of callus against the enzymatic and pharmacological effects induced by snake venoms and isolated toxins. The phospholipase A2 activity induced by snake venoms of B. jararacussu and C. d. terrificus, and isolated toxins (BthTX-II and crotoxin) was inhibited by the samples tested, and the fractions SF3 and SF4 completely inhibited the toxin BthTX-II, whereas crotoxin was inhibited successfully by the action of fraction SF4. The methanolic extract of S. erecta and fraction SF3 were able to prevent the fibrinogenolytic action of B. moojeni venom. The methanolic extracts of callus and aerial parts of S. erecta, fractions SF3 and SF4, and flavones promoted partial protection of fibrinogen chains when incubated together with the B. jararacussu venom. Vitexin, SF3 and SF4 were potent inhibitors of the coagulant activity induced by B. jararacussu venom. BthTX-I edema-inducing activity was inhibited by vitexin, SF3 and SF4. The hemorrhagic activity of B. jararacussu and B. neuwiedi venoms were inhibited by the action of methanolic extract of aerial parts of S. erecta and its fractions. This extract is a promising source of natural inhibitors, as flavonoids and tannins, which act forming complexes with metal ions and proteins, inhibiting the action of serine proteases, metalloproteases and phospholipases A2. The molecular modeling studies done between myotoxin BthTX-I and the compounds showed that the toxin-inhibitor complex is stabilized by hydrogen bonds with the side chains of amino acid residues in the region of the catalytic site of toxin. Moreover, the circular dichroism spectra revealed no significant changes in the secondary structures of iv BthTX-I and II in the presence of flavones (vitexin and isovitexin). Vitexin and isovitexin showed similar results in almost all tested activities, but in the anticoagulant activity induced by B. jararacussu snake venom the vitexin prevented plasma coagulation, suggesting that the position of the sugar may have influenced the inhibition of this activity. These results suggest that part of the action antiophidic the methanol extracts of S. erecta occurs due the action of the compounds isolated in conjunction with other compounds present in this medicinal plant.

Os venenos de serpentes são ricos em proteínas, enzimas e peptídeos biologicamente ativos. Diversas enzimas tais como fosfolipases A2 (PLA2s), metaloproteases (MP), L-aminoácido oxidases (LAAOs) são responsáveis pelo quadro clínico do envenenamento ofídico. Atualmente, o isolamento e a caracterização funcional e estrutural destas enzimas têm auxiliado na compreensão do mecanismo de ação destas toxinas e nas formas alternativas de tratamento. Além disso, estas enzimas se tornaram valiosas ferramentas de aplicação biotecnológica, na busca de novos fármacos de interesse na clínica médica. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquímica e funcionalmente a L-aminoácido oxidase do veneno de Bothrops atrox. O isolamento da LAAO de B. atrox (LAAOBatrox) envolveu três etapas cromatográficas: a exclusão molecular em Sephadex G-75, troca iônica em ES-502N utilizando CLAE e, por último, a cromatografia de afinidade com uso da Lentil-Lectina, conferindo um alto grau de pureza à proteína confirmado por SDS-PAGE. Após a caracterização bioquímica, a LAAOBatrox demonstrou ser uma glicoproteína com 12% de açúcar, massa molecular relativa de 67.000 e pI de 4,4 confirmando seu caráter ácido pela composição em aminoácidos, predominando Asx (Ácido aspártico ou asparagina) e Glx (Ácido glutâmico ou glutamina). LAAOBatrox apresentou especificidade de substrato para L-Met e L-Leu. Com o seqüenciamento dos peptídeos trípticos internos e em comparação com as LAAOs de outros venenos, a LAAOBatrox apresentou homologia de 100% com LAAOs isoladas de B. moojeni e B. jararacussu e apresentou sequenciamento N-terminal de ADDN-NPLEE-NIRRDD que é homólogo ao das LAAOs já descritas. A LAAOBatrox apresentou atividade edematogênica moderada quando comparada ao veneno bruto, atividade coagulante baixa sobre o plasma humano citratado, atividade de agregação plaquetária sendo que 25µg/mL foi capaz de agregar aproximadamente 100% de plaquetas, onde o efeito obtido pela proteína pode ser devido à liberação de H2O2, sendo que a catalase foi adicionada ao meio tratado com LAAOBatrox e o efeito de agregação plaquetária obtido foi próximo à 0%. LAAOBatrox apresentou efeito citotóxico sobre diferentes linhagens tumorais: B16F10 onde as células apresentaram 70% de morte por apoptose e PC12 que apresentaram uma viabilidade celular de 20% após o tratamento com a enzima. LAAOBatrox não apresentou efeito citotóxico significativo sobre células normais. Portanto, a LAAOBatrox consiste de uma enzima multifuncional que poderá servir como ferramenta para investigação dos processos celulares que estão envolvidos no envenenamento. / Snake venoms are rich in proteins, enzymes and biological active peptides. Many enzymes, like phospholipases A2, metalloproteinases, L-amino acid oxidases are responsible by clinical aspects of ophidian poisoning. Nowadays, isolation and the functional and structural characterizations of these enzymes have been useful to elucidate their mechanisms of action. Besides, these enzymes have great value for biotechnology on searching of new molecules for medicine development. The aim of this work was isolate Lamino acid oxidase from B. atrox venom (LAAOBatrox) and characterize biochemical and functionally LAAOBatrox. The isolation consisted of 3 chromatographic steps: molecular exclusion using a G-75 Sephadex column, ion exchange using ES-502N column in HPLC and affinity chromatography with Lentil-Lectin column. Afterward, LAAOBatrox was analyzed by SDS-PAGE to confirm an expected high purity level. Biochemical characterization showed LAAOBatrox is a glycoprotein of 12% sugar-containing with relative molecular weight of 67000, pI estimated in 4,4 pointing to acid character due to its amino acids composition, rich for Asx and Glx residues. LAAOBatrox displays high specificity to hydrophobic L-amino acids (best substrates: L-Met and L-Leu). The Nterminal amino acid sequence (ADDN-NPLEE-NIRRDD) and the internal peptide sequences showed close structural homology to other snake venom L-amino acid oxidades, presenting 100% homology to LAAO from B. moojeni and B. jararacussu. This enzyme induces moderate edema compared to crude venom, low coagulating activity in human plasma and 100% of in vitro platelet aggregation induction with 25 g/mL, but this can be due to H2O2 production by LAAOs once added catalase has inhibited aggregation induced by LAAOBatrox and the effect was close to 0%. LAAOBatrox presents citotoxicity effect for tumor cell lines: 70% of death by apoptosis in B16F10 and 20% cellular viability for PC12, after LAAOBatrox treatment. LAAOBatrox did not display citotoxicity effect in normal cells (peripheral blood mononuclear cells). Thus, LAAOBatrox is a multifunctional enzyme of huge potential for investigation of cellular processes involved on poisoning and also for developing new medicines.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Os acidentes ofídicos constituem um problema de saúde pública, afetando regiões de clima tropical e subtropical e áreas rurais e pobres de países da América Latina, África, Ásia e Oceania. No Brasil, o gênero Bothrops é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos notificados, cujo envenenamento é caracterizado por intensa mionecrose local ineficientemente neutralizada pela soroterapia. O veneno botrópico possui uma classe de proteínas miotóxicas estruturalmente semelhantes às fosfolipases A2 (PLA2), responsáveis por induzir lesões musculares por um mecanismo não-catalítico parcialmente explicado por diferentes hipóteses. Contudo, há evidências que os efeitos miotóxico e paralisante in vitro são decorrentes de sua atividade desestabilizadora de membranas e que atuam em sinergia com as PLA2 catalíticas no envenenamento. Neste estudo, foi desenvolvido um novo protocolo de purificação da miotoxina não-catalítica (PLA2 homólogas ou proteínas PLA2-like) botrópica BthTX-I, a qual foi avaliada em testes cristalográficos, calorimétricos, miográficos e morfológicos. Potenciais inibidores vegetais da classe dos cinamatos foram co-cristalizados com a BthTX-I e testados em inibir as lesões e paralisia musculares in vitro promovida pela toxina a fim de evoluir no conhecimento da relação estrutura/atividade das PLA2 homólogas miotóxicas. Dentre todos os compostos testados, os ácidos chicórico e caftárico apresentaram-se como excelentes inibidores da BthTX-I. Contudo, foi possível ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snakebites are a public health problem, concerning tropical and subtropical regions, rural and poor areas of Latin America, Africa, Asia and Oceania countries. In Brazil, Bothrops genus accounts for about 90% of reported snakebites, whose envenomation is characterized by intense local myonecrosis inefficiently neutralized by antivenom. A class of myotoxic proteins found in Bothrops venoms which is structurally similar to phospholipases A2 (PLA2), is responsible for inducing muscle injuries by a non-catalytic mechanism, partially explained by different hypotheses. However, there are evidences that myotoxic and in vitro paralyzing effects are due to their destabilizing-membrane activity and they act in synergy with the catalytic PLA2 myotoxins in envenomation. In this study, it was developed a new protocol for purification of a non-catalytic botropic myotoxin (PLA2 homologues or PLA2-like proteins) BthTX-I, which was evaluated by crystallographic, calorimetric, myographic and morphologic assays. Potential plant inhibitors of cinnamates class were co-crystallized with BthTX-I and tested to inhibit in vitro paralysis and muscle injuries promoted by the toxin. Among all the compounds tested, the chicoric and caftaric acids presented excellent BthTX-I inhibition characteristiscs. However, only chicoric acid (CA) we were able to perform crystallographic experiments, which presented different structural characteristics compared to other ligands and bothropic toxins. According to the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-13T17:28:10Z No. of bitstreams: 1 carlos-correa-netto.pdf: 1990428 bytes, checksum: 3a150480f1f6590c44a4c85210b6ccbb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-13T17:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlos-correa-netto.pdf: 1990428 bytes, checksum: 3a150480f1f6590c44a4c85210b6ccbb (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os animais peçonhentos são aqueles capazes de produzir e inocular veneno (peçonha) em suas vítimas. No Brasil, foram catalogadas, até o momento, 326 espécies de serpentes, dentre as quais cerca de 50 são peçonhentas e de grande interesse para a Saúde Publica. A Bothrops jararacussu é a espécie brasileira que possui a capacidade de produzir e inocular a maior quantidade de veneno. Nos acidentes ofídicos causados por estaespécie, a ação do veneno não é totalmente neutralizada pelo soro específico, o antibotrópico, sendo importante nestes casos a adoção de uma conduta terapêutica diferenciada através da administração do soro poliespecífico, o antibotrópico-crotálico. No entanto, considerando-se apenas os sintomas clínicos do paciente, o médico não tem como discriminar se o acidente foi provocado por B. jararacussuou por outra espécie do gênero. Vale ainda ressaltar que para as demais espécies do gênero Bothrops, o soro antibotrópico é o mais indicado, fato que impossibilita o médico de adotarcomo estratégia geral, a utilização do soro antibotrópico-crotálico como umaterapêutica única no acidente botrópico. Esta tese teve como objetivo a caracterização, através de técnicas de imunoquímica, do veneno de B. jararacussu e a identificação de possíveis biomarcadores para este veneno. Para a triagem dos biomarcadores foram produzidos soros espécie-específicos para os venenos de B. jararacussu (soro anti-jararacussu) e para B. jararaca(soro anti-jararaca). Nas análises por “imunoblotting” a partir do fracionamento por 2D-PAGE foi visto um bom reconhecimento por ambos os soros, principalmente das frações de alto peso do veneno de B. jararacussu, mostrando que estas frações são as mais imunogênicas neste veneno. A partir destes dados, foram identificadas no mapa bidimensional, as principais proteínas de baixa imunogenicidade deste veneno. Uma proteína de 60kDa e pI ácido foi identificada como uma serino proteinase. Esta identificação foi obtida a partir da homologia com uma protease com domínio tripsina, denominada BOTIN, presente no banco de dados de ESTs de B. insularis. Esta proteína de pI ácido (denominada Bjssu-pI2,2) foi, pela primeira vez, descrita nesta espécie. Na região básica, foram identificadas duas outras proteínas, as quais demonstraram um baixo reconhecimento tanto pelo soro homólogo (soro anti-jararacussu) como pelo heterólogo (soro anti-jararaca). A proteína de 29kDa foi identificada como uma serino proteinase da família S1 e a de 16kDa foi identificada como Botropstoxina-I (BthTX-I), a principal miotoxina doveneno de B. jararacussu. Desta forma, a abordagem desta tese através de técnicas como eletroforese bidimensional somado a técnicas sensíveis como "imunoblotting” e espectrometria de massas, se mostrou muito interessante para o estudo imunoquímico das frações do veneno de B. jararacussu. As diferenças no reconhecimento dos soros espécie-específicos frenteao veneno de B. jararacussupermitiram a identificação de três proteínas com potencial para serem utilizadas como ferramenta para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial para esta espécie. Além disso, os resultados deste trabalho reforçam a questão da ineficiência do soro antibotrópico para a neutralização do veneno no acidente causado por esta espécie, podendo se relacionar a importância da fração crotálica para a neutralização de toxinas pouco imunogênicas do veneno de B.jararacussu, como é o caso da BthTX-I. / Poisonous animals are characterized by the ability to produce and inject venom (poison) in their victims. Until nowadays there are326 different species of snakes catalogued in Brazil and, among them 50 species are venomous and important regarding public health. The Bothrops jararacussuis the Brazilian specie that has the ability to produce and inoculates higher amounts of venom. In the reported cases concerning this specie, the action of this venom can not be efficiently neutralized with specific antivenin,the antibotropic serum. In such cases, the attendant must adopt a differentiated therapeutic conduct that consists in the administration of the antibotropic – crotalic serum. However, in considering just the clinical symptoms of the patient, the doctor is not able to distinguish if the accident was caused by B. jararacussuor another specimen from Bothrops genus. It is important to emphasize the fact that for other specimens from Bothrops genus, the antibotropic serum is the most indicated treatment and for this reason, it is inadequate forthe doctor adopt antibotropic – crotalic serum as a single therapeutic strategy. Inthis study we aimed to characterize specific biomarkers present in the venom of B. jararacussutrough the use 2D-PAGE combined with immunoblotting. To achieve this goal, we produced sera anti-jararacussu and anti-jararaca and cross-reacted this sera against their specific venom as well against each other. 2D-gel analyses reveled that the high–molecular–weight fractions ofboth venoms were well recognized by each specific anti-sera as well as bythe non-specific one. This suggests that the proteins present in the high–molecular–weight fraction of each venom are the most immunogenic. Also, the 2D PAGE allowed us to identify the less immunogenic proteins in these venoms. Among them is a 60 kDa acid protein identified as a serine protease due to its high homology with a protease called BOTIN that possess a trypsin domain present in ESTs data bank from B. insularis. This acidic protein characterized in this work was called Bjssu-pI2,2 and was for the first time described in this specie. The other proteins displaying low immunogenic properties were a 29 kDa protein identified as a serine protease from S1-family and a 16 kDa protein identified as a Bothropstoxin-I (BthTX-I),the major myotoxin from B. jararacussuvenom. Thus, the approach used in this thesis, based on bidimensional electrophoresis in combination with sensitive techniques such as immunoblotting and mass spectrometry, showed to be interesting for the immunochemistry study of the B. jararacussuvenom proteins. The three proteins here identified in thevenom of B. jararacussu present a potential use as biomarkers. Moreover, this study also shed light into the reasons why the anti-bothropic serum is so ineffective against the B.jararacussuvenom reinforcing the role of the anti-crotalic serum in neutralizing low immunogenic proteins from the B. jararacussuvenom, such as the BthTX-I.