Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi, Gαq e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi e Gαq. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi and Gαq protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi nor Gαq. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Introdução: Injúria renal aguda (IRA) é complicação frequente do acidente causado por serpentes do gênero Bothrops, acarretando morbidade e mortalidade significativas. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do extrato aquoso de Schizolobium parahyba (Sp), que é uma planta com efeito anti-botrópico presumido, em modelo experimental de IRA induzida pela peçonha de Bothrops jararaca (Bj). Métodos: Grupos de 8 a 10 ratos machos Wistar (250-300g) receberam infusões de solução salina a 0,9% (grupo controle, C), infusão de Sp 2 mg/kg (SpE), infusão de Bj 0,25 mg/kg (Pe) e infusão de Bj seguida imediatamente por Sp (tratamento, T) nas doses já descritas. Após as respectivas infusões os animais foram estudados quanto ao ritmo de filtração glomerular (RFG, depuração de inulina), fluxo sanguíneo renal (FSR, ultrassom Doppler), pressão arterial média (PAM, transdutor intraarterial), resistência vascular renal (RVR), osmolalidade urinaria (Uosm, ponto de congelamento), NGAL urinário (NGAL, ELISA), láctato desidrogenase (DHL, método cinético), hematócrito (Ht, microhematócrito), fibrinogênio (Fb, Klauss modificado) e histologia renal realizada por patologista que desconhecia o tratamento dos animais (escore de necrose tubular aguda). Resultados: Bj causou quedas estatisticamente significantes no RFG, FSR, Uosm, Ht e Fb, aumento estatisticamente significantes na RVR, NGAL, e DHL e necrose tubular aguda. Estas alterações não foram prevenidas por Sp, que na verdade causou queda estatisticamente significante no RFG quando usado isoladamente. Conclusões: Sp administrado simultaneamente com Bj, em dosagem de aproximadamente 10:1, não foi capaz de prevenir a IRA, nem a hemólise e consumo de fibrinogênio causados pela peçonha botrópica. Sp usado isoladamente causou queda do RFG / Effects of Schizolobium parahyba extract on experimental Bothrops venom-induced acute kidney injury Introduction: Venom-induced acute kidney injury (AKI) is a frequent complication of Bothrops snakebite, carrying relevant morbidity and mortality. Objectives: The aim of this study was to assess the effects of Schizolobium parahyba (SP) extract, a natural medicine with presumed anti Bothrops venom effects, in an experimental model of Bothrops jararaca venom (BV) - induced AKI. Methods: Groups of 8 to10 rats received infusions of 0.9% saline (control, C), SP 2 mg/kg, BV 0.25 mg/kg and BV immediately followed by SP (treatment, T) in the dosis previously described. After the respective infusions animals were assessed for glomerular filtration rate (GFR, inulin clearance), renal blood flow (RBF, Doppler), blood pressure (BP, intra-arterial transducer), renal vascular resistance (RVR), urinary osmolality (UO, freezing point), urinary NGAL (NGAL, ELISA), lactic dehydrogenase (LDH, kinetic method), hematocrit (Hct, microhematocrit), fibrinogen (Fi, Klauss modified) and blinded renal histology (acute tubular necrosis score). Results: BV caused significant decrease in GFR, RBF, UO, HcT and Fi, significant increase in RVR, NGAL, and LDH and acute tubular necrosis. These changes were not prevented by SP, which actually caused a significant GFR decrease when used alone. Conclusions: SP administered simultaneously with BV, in an approximate 10:1 concentration, was not able to prevent BV-induced AKI, hemolysis and fibrinogen consumption. SP used alone caused GFR decrease

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:44:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DizFilho_EduardoBrittodosSantos_D.pdf: 56066109 bytes, checksum: 5145b0aec09dd84e8ea2af9763987d84 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os Anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) constituem uma classe de medicamentos com prescrição mundial, pois são fármacos que auxiliam na terapia de vários processos patológicos visto que oferecem ações farmacológicas: anti-inflamatória, analgésica e antipirética, como efeitos primários. A venda dos AINES no Brasil é de forma ''livre", porém, nos EUA é realizada somente sob prescrição médica. Apesar do grande número de informações acumuladas durante anos de pesquisa a respeito destas drogas sobre as atividades das Ciclooxigenases 1 e 2 (COX 1 e COX 2), respectivamente, do seu papel como ferramenta molecular para o estudo das vias biossintéticas das prostaglandinas e dos avanços em relação a sua síntese e síntese de novos AINES, não se tem conhecimento da atuação dessas drogas sobre a estrutura e função das Fosfolipases A2 secretórias (PLA2s), responsáveis pela produção do acido araquidônico precursor de vários tipos de derivados lipídicos biologicamente ativos e responsável pelo processo inflamatório. O objetivo deste trabalho é responder questões relacionadas à ação dos AINES sobre a ação de PLA2 de serpentes, responsáveis por eventos farmacológicos principalmente relacionados com edema. Esta atividade inflamatória pode ser desencadeada tanto por PLA2 enzimaticamente ativas, como não ativas, ambas induzindo o efeito de inflamação aguda por mecanismos ainda controversos. O trabalho utilizou PLA2 farmacologicamente ativa (destacadamente no processo inflamatório), isoladas do veneno de serpentes Bothrops leucurus, em ensaios de cinética enzimática, atividade farmacológicas relacionados ao edema, agregação plaquetária, mionecrose e neurotoxicidade conduzidos em presença das toxinas puras, das toxinas em presença dos AINES, em ensaios com prévio tratamento dos AINES e posterior aplicação das PLA2. Para uma avaliação mais precisa das alterações induzidas por estes AINES (princípios ativos puros ou drogas comerciais) foram empregadas técnicas de varredura em espectrômetro de UV-Vis (220-700mn) para averiguar possíveis modificações do espectro de absorbância da PLA2 e do AINES após a incubação o que poderia indicar modificações estruturais na PLA2, induzidas por estas drogas. Além de avaliar a ação específica dos AINES sobre as PLA2, secundariamente, o trabalho possibilitou conhecer alguns aspectos físico-químicos e estruturais de PLA2 isoladas do veneno de Bothrops leucuros. Os resultados determinaram que, embora não ocorram interações estruturais entre os AINES e as PLA2, foram evidenciadas alterações de atividade farmacológica / Abstract: Anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are a class of prescription drugs worldwide, as are drugs that help in the therapy of various pathological processes as they offer pharmacological actions: anti-inflammatory, analgesic and antipyretic, such as primary effects. The sale of NSAIDs in Brazil are ''free", but the U.S. is preferred only by prescription. Despite the large amount of information accumulated through years of research on these drugs on the activities of the cyclooxygenases 1 and 2 (COX 1 and COX 2), respectively, of their role as a molecular tool for studying the biosynthetic pathways of prostaglandins and advances in respect of its synthesis and synthesis of new NSAIDs, there are no known performance of these drugs on the structure and function of secretory phospholipase A2 (PLA2s), responsible for the production of arachidonic acid precursor of various biologically active lipid derivatives and responsible for the inflammatory process. This paper aims to answer questions related to the action of NSAIDs on the action of PLA2 of snakes responsible for pharmacological events mainly related to edema. This inflammatory activity can be triggered by PLA2 enzymatically active and non active, inducing both the effect of acute inflammation by still controversial. The paper uses PLA2 pharmacologically active (highlighted in the inflammatory process), isolated from Bothrops leucurus snake venom and Bothrops jararacussu in kinetics assays, pharmacological activity related to edema, platelet aggregation, and neurotoxicity myonecrosis conducted in the presence of pure toxins, the toxins in the presence of NSAIDs, previous treatment trials with NSAIDs and the subsequent application of PLA2. For a more accurate assessment of changes induced by these NSAIDs (pure active ingredients or drugs trade) is employed techniques of scanning UV-Vis spectrophotometer (220-700nm) to ascertain possible modification of the absorbance spectrum of PLA2 and NSAIDs after incubation which could indicate structural changes in PLA2, induced by these drugs. In addition to assessing the specific action of NSAIDs on PLA2 secondarily work enables to know some physical-chemical aspects and structures of PLA2 isolated from the venom of Bothrops leucurus. The results determine that although there occur structural interactions between NSAIDs and PLA2 activity were observed pharmacological changes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:23:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValerianoZapana_JoseAntonio_M.pdf: 9614816 bytes, checksum: f7fe976f2fbaf3eab37af937d9930859 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Em 1987 o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde iniciou o uso do Veneno Botrópico de Referência Nacional (VBRN), que é a primeira extração das serpentes B. jararaca recém-chegadas da natureza. Em 10 anos notou-se uma queda de 67,65% na recepção de serpentes ao Instituto Butantan (IB), e na distribuição geográfica, resultando em uma maior heterogeneidade na composição do VBRN. Assim, comparamos os venenos das serpentes nascidas em cativeiro (VP) do Laboratório de Herpetologia do IB com o VBRN, para verificar a possibilidade de incorporar o VP na preparação dos lotes do VBRN. O VP mostrou-se estatisticamente semelhante ao VBRN nos testes de dosagem de proteínas, SDS-PAGE, 2DE, cromatografia, atividade fosfolipásica, ELISA, Western blotting, dose mínima coagulante (plasma) e hemorrágica, enquanto para as atividades de L-aminoácido oxidase, caseinolítica, zimografia e dose mínima coagulante (fibrinogênio) o VP mostrou-se diferente do VBRN. Para as doses letais e efetiva dos venenos o pool do VP com VBRN foi mais eficaz do que os VP e o VBRN sozinhos. / In 1987, The National Institute of Quality Control in Health in Brazil (INCQS) established the Brazilian Reference Bothrops Venoms (BRBV), which should be composed of the first extractions of newcomers wild snakes. In 10 years there has been a decrease of 67.65% in the reception snakes to Butantan Institute (IB), and geographic distribution, resulting in a higher heterogeneity in BRBV composition. So, we compared the venom samples of snakes born in captivity (SVP) of IB Herpetology Laboratory with BRBV to check the possibility of incorporating the SVP in the preparation of batches of BRBV. SVP was statistically similar to BRBV the proteins dosage, SDS-PAGE, 2DE, chromatography, phospholipase, ELISA, Western blotting, minimum coagulant dose (plasma) and hemorrhage dose, while for L-amino acid oxidase activity, caseinolytic, zymography and minimum coagulant dose (fibrinogen) SVP was shown to be different from BRBV. For effective and lethal doses of pool with SVP and BRBV it was more effective than SVP and BRBV alone.

Na região nordeste é registrado o maior índice de letalidade por acidentes ofídicos do Brasil. As serpentes Bothrops erythromelas (Be) são as responsáveis pela maioria dos acidentes na região, e o veneno dessa serpente não integra o pool de antígenos utilizado pata a obtenção do soro antibotrópico (SAB). Nesse estudo avaliou-se a potência do SAB na neutralização de algumas atividades do veneno (V) de Be. Os resultados mostraram que o SAB neutraliza as atividades do VBe, mas, exceto para a atividade coagulante e letalidade, a potência do SAB foi significativamente menor, quando comparado à neutralização das mesmas atividades do veneno de B. jararaca. A utilização de um soro obtido após a inclusão do VBe ao pool de antígenos não melhorou significativamente a potência do SAB. O SAB neutralizou também o edema inflamatório induzido pelo VBe, mas a associação do SAB à dexametasona inibiu o edema quando aplicado até 45 min após o envenenamento. Nesse tempo, SAB ou dexametasona aplicados isoladamente não foram efetivos em diminuir esse edema. / In the northeast region is registered the higher lethality index by snakebites in Brazil. Bothrops erythromelas (Be) snakes are responsible for the larger number of snakebites in that region, and the venom of these snakes do not integrate the pool of antigens used to obtaining the Bothrops antivenom (BAV). In the present study, the potency of this serum in neutralizing some activities of Be venom (V) was evaluated. Results showed that BAV neutralizes BeV activities, but, except for coagulant activity and for lethality, the potency of the BAV was significantly lower, when compared to the neutralization of the same parameters of the Bothrops jararaca venom. The use of antivenom obtained after inclusion of BeV to the pool of antigens did not ameliorate the BAV potency. The BAV also neutralizes the inflammatory edema induced by BeV, but the association of BAV and dexamethasone decreased the edema when applied up to 45 min after the venom. At this time, antivenom or dexamethasone administered alone were ineffective in inhibiting this edema.

Orientador: Selma Maria de Almeida Santos / Banca: Henrique Bartolomeu Pereira Vaz / Banca: Ligia Pizzatto do Prado / Banca: Leonardo de Oliveira / Banca: Phelipe Oliveira Favaron / Resumo: A reprodução é essencial para a perpetuação das espécies e por esta razão este é um tema central no estudo da biologia de qualquer animal. Nesta tese apresento dados inéditos sobre diversos aspectos reprodutivos de algumas espécies de jararacas, incluindo B. cotiara, B. alternatus, B. pubescens, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi e B. pauloensis. Além da caracterização de eventos reprodutivos como produção de gametas, estocagem de esperma e formação de plugs copulatórios, também descrevo pela primeira vez em serpentes a presença de esperma no segmento sexual renal de B. pubescens e a intersexualidade em B. moojeni e B. erythromelas. A influência dos fatores ambientais e da inércia filogenética sobre a determinação dos padrões reprodutivos nestas serpentes foi avaliada por meio de (1) comparações entre a época de ocorrência dos eventos reprodutivos entre as diferentes espécies que indicaram a influência de ambos os fatores; (2) reconstruções de caráter ancestral que apontaram para um forte conservatismo filogenético em relação ao dimorfismo sexual e alta variabilidade em relação ao padrão de maturidade sexual; (3) análises estatísticas cujos resultados indicam que não há relação entre o aumento de parâmetros como temperatura e pluviosidade e o ciclo dos machos de B. pubescens, espécie utilizada como modelo. Embora a predominância de eventos de acasalamento durante o outono e nascimentos no verão indique um forte componente filogenético na determinação dos eventos... / Abstract: Reproduction is essential for the perpetuation of any species. That is why it is a central theme for studies on the biology of any organism. Here, I present new data on several aspects of reproduction for Bothrops species, including B. cotiara, B. alternatus, B. pubescens, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi and B. pauloensis. The characterization of reproductive events such as gametogenesis, sperm storage, formation of mating plugs and activity of the sexual segment of the kidneys (SSK) is provided. I also describe the presence of sperm inside the SSK for the first time in a snake species and intersexuality in B. moojeni and B. erythromelas. I evaluated the influence of environmental factors and phylogenetic inertia in the determination of reproductive events in these snakes by (1) a comparison of the timing of reproductive events between species which indicates that both factors may be important, (2) ancestral character state reconstructions showing a strong phylogenetic conservatism in sexual dimorphism with females being the larger sex and high variability in sexual maturity between species, (3) statistical analysis indicating that male reproductive variables do not vary according to temperature and rain in B. pubescens. Although there are many observations of reproductive events outside the expected periods for Bothrops species (mainly for timing of ovulation, pregnancy and sperm storage strategies), reports of mating and births are concentrated in autumn and summer, respectively, showing that although phylogenetic inertia has a high influence on the conserved timing of these reproductive events in Bothrops, environmental factors may also play a role in the plasticity observed in some species and individuals / Doutor

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008- Saulo Andrade Caldas.pdf: 2660226 bytes, checksum: 9633b16ad905372a6086d20f9fab7136 (MD5) Previous issue date: 2008-02-20 / Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / The aim of this study was to determine the clinical-pathological alterations and laboratory findings in bovines inoculated with Bothrops alternatus venom, with the intention of providing information for the establishment of diagnosis and differential diagnosis procedures, as well as to elucidate some obscurities observed in the pertinent literature. The lyophilized venom was diluted in 1 ml of physiologic solution. It was administered to 5 bovines by the subcutaneous route at doses of 0.0625, 0.125 and 0.25 mg/kg body weight, and to 2 other bovines by the intramuscular route at doses of 0.25 e 0.45 mg/kg. Six bovines died and the only animal that survived, who had subcutaneously received the venom at a dose of 0.0625 mg/kg, recovered. The first clinical signs were observed from 25 minutes to 5 hours and 30 minutes after the inoculation. The clinical evolution time varied from 7 hours and 18 minutes to 92 hours. Regardless of the dose, the clinical picture was characterized by swelling (hemorrhage/hematoma) at the site of inoculation, increase in bleeding time and capillary refill time, paleness of mucous membranes and apathy. The laboratory exams revealed progressive normocytic normochromic anemia, thrombocytopenia, reduction in fibrinogen and total plasma proteins, decreased hematocrit and hemoglobin, and slight increase in creatine kinase and lactate dehydrogenase. When subjected to necropsy, the animals that received the venom through the subcutaneous route showed large hematomas and hemorrhagic areas in the subcutaneous tissue, extending from the site of inoculation. The animals in which inoculation was performed intramuscularly exhibited, in addition, intramuscular hemorrhage. The left endocardium showed extensive hemorrhagic lesions, and petechiae were found on the serosae of rumen, omasum, abomasum and gall bladder. The colon, rectum and perirenal areas were surrounded by clotted blood in three animals. Besides hemorrhage, the histological examination revealed hemorrhage and coagulative muscle necrosis in the vicinities of the inoculation site in the animals that received the venom by the intramuscular route. These lesions were mild in the muscles close to the site of inoculation in the animals inoculated by the subcutaneous route. The swelling on the site of inoculation and its surroundings was a consequence of blood accumulation and not merely edema. Myoglobinuria and gross or microscopic lesions were not observed in the kidneys. This study indicates that B. alternatus can lead adult bovines to death if they release all their venom during a bite. Conversely, since venomous ophidians can control the amount of poison they inoculate and they probably do not identify bovines as potential preys, it is likely that the number of accidents involving this species is small, which is in agreement with the findings of the majority of the centers for anatomical-pathological diagnosis in the country. / Esse estudo teve como objetivo determinar as altera??es cl?nico-patol?gicas e os achados laboratoriais em bovinos inoculados com a pe?onha de Bothrops alternatus, no intuito de fornecer subs?dios para o estabelecimento do diagn?stico e do diagn?stico diferencial, bem como esclarecer pontos obscuros da literatura pertinente. O veneno liofilizado foi dilu?do em 1 ml de solu??o fisiol?gica e administrado a cinco bovinos, por via subcut?nea, nas doses de 0,0625, 0,125 e 0,25 mg/kg e a dois outros, por via intramuscular, nas doses de 0,25 e 0,45 mg/kg. Seis bovinos foram a ?bito e um que recebeu a dose de 0,0625 mg/kg, por via subcut?nea, recuperou-se. Os sinais cl?nicos tiveram in?cio entre 25 minutos e 5 horas e 30 minutos ap?s a inocula??o. O per?odo de evolu??o variou de 7 horas e 18 minutos a 66 horas e 12 minutos. Um animal recuperou-se ap?s 92 horas. O quadro cl?nico, independentemente das doses, caracterizou-se por aumento de volume (hemorragia/hematoma) no local da inocula??o, tempo de sangramento aumentado, mucosas hipocoradas e apatia. O exame laboratorial revelou progressiva anemia normoc?tica normocr?mica, trombocitopenia, redu??o de fibrinog?nio e prote?nas plasm?ticas totais, hemat?crito e hemoglobina diminu?dos, al?m de leve aumento dos n?veis de creatinaquinase e desidrogenase l?tica. ? necropsia, havia, a partir do local da inocula??o, extensos hematomas e ?reas de hemorragia no tecido celular subcut?neo dos animais que receberam o veneno por via subcut?nea; nos animais inoculados por via intramuscular, adicionalmente, havia hemorragia intramuscular. O endoc?rdio esquerdo apresentava extensas hemorragias e verificaram-se pet?quias na serosa do r?men e do omaso e na mucosa do abomaso e da ves?cula biliar. Em cinco animais, o c?lon, reto e regi?o perirrenal estavam envoltos por co?gulos de sangue. Ao exame histol?gico observouse, al?m do quadro hemorrag?paro, necrose muscular coagulativa, acompanhada de hemorragia, no entorno do local da inocula??o nos animais que receberam o veneno por via intramuscular; essa les?o era discreta nos m?sculos pr?ximos ao local de inocula??o subcut?nea. Nos bovinos deste estudo, o aumento de volume observado no local de inocula??o e adjac?ncias era constitu?do por sangue e n?o edema. N?o foram observadas mioglobin?ria, nem les?es macro ou microsc?picas significativas nos rins. Este estudo indica que exemplares de B. alternatus, caso inoculem todo seu veneno, poderiam levar bovinos adultos ? morte. Por outro lado, pelo fato de of?dios serem capazes de regular a quantidade de veneno inoculada e, possivelmente, n?o considerarem bovinos como presa potencial, ? prov?vel que o n?mero de acidentes nessa esp?cie seja pequeno, o que est? de acordo com o observado na maioria dos centros diagn?stico an?tomo-patol?gico no pa?s.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túnei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor