Os acidentes ofídicos são considerados um grande problema de saúde pública e no Estado de São Paulo a serpente Bothrops jararaca é o agente considerado mais relevante epidemiologicamente. O antiveneno é o único medicamento oficialmente aprovado para o tratamento de picadas de serpentes e, apesar de ser eficaz em diversos aspectos, mostra-se ineficaz em relação a complicações secundárias do envenenamento, como o estresse oxidativo/nitrosativo, caracterizado por um desequilíbrio no estado redox, que pode ser extremamente deletério aos pacientes. Portanto, vê-se necessária a busca por terapias complementares que possam combater o estresse oxidativo/nitrosativo. Ademais, distúrbios da hemostasia observados em envenenamentos pela B. jararaca, tais como a plaquetopenia, a hipofibrinogenemia e o aumento da atividade do fator tissular (TF) plasmático podem ter também como causa indireta o estresse oxidativo/nitrosativo, induzido por componentes do veneno de B. jararaca (BjV). Recentemente, demonstrou-se que a regulação da atividade biológica do TF, a proteína responsável pela iniciação da cascata de coagulação in vivo, pode ser controlada pela isomerase de dissulfeto proteico (PDI) e que a atividade da PDI é inibida in vivo pela quercetina-3-rutinosídeo (rutina), um antioxidante natural encontrado em plantas e alimentos. Considerando essas premissas, o presente trabalho objetivou investigar em camundongos injetados com o veneno de B. jararaca (BjV): (a) a ocorrência de distúrbios do estado redox; (b) as alterações hematológicas e hemostáticas (em plasma e tecidos) associadas ao desequilíbrio do estado redox; (c) a atividade da rutina como agente modulador sobre essas alterações. Para isso, camundongos Swiss (30-35 g) foram divididos em 4 grupos experimentais: controle salina (salina, controle negativo), controle rutina (rutina+salina), BjV+salina (BjV+salina, controle positivo) e BjV+rutina (BjV+rutina, tratamento). Após 3, 6 e 24 h da administração dos tratamentos (via s.c.), foram coletados sangue e fragmentos de tecidos para posteriores análises. O envenenamento induziu um aumento de espécies reativas, diminuição da capacidade antioxidante total, alterações hematológicas (plaquetopenia, neutrofilia e diminuição de eritrócitos), distúrbios hemostáticos (hipofibrinogenemia, prolongamento do tempo de protrombina e aumento da atividade de TF no plasma), além de diminuir a expressão proteica de PDI no coração. A rutina não inibiu in vitro a atividade biológica de proteínas presentes no BjV (metaloproteinases, serinaproteases, fosfolipases A2 e L-aminoácido oxidases) e nem mesmo a agregação plaquetária induzida pelo veneno. No entanto, a administração do veneno incubado com rutina foi capaz de reduzir os níveis de espécies reativas, impedir a queda de eritrócitos, normalizar os níveis de fibrinogênio e o tempo de protrombina e alterar a atividade de TF e expressão proteica de TF e PDI em tecidos. Desse modo, concluímos que a rutina foi capaz de favoravelmente modular importantes alterações hemostáticas e de estado redox no envenenamento por B. jararaca, o que indica seu grande potencial como agente terapêutico complementar em envenenamentos / Snakebites are a major public health issue and in São Paulo State, and Bothrops jararaca snakes are considered the most important agents epidemiologically. Antivenom is the only officially approved treatment for snakebites and although effective in many aspects, it is ineffective in combating secondary complications induced by envenomation, e.g. oxidative/nitrosative stress (ONS), which can be extremely deleterious to patients. Therefore, it is necessary to search for new complementary therapies that could attenuate ONS. Furthermore, the hemostatic disturbances in B. jararaca envenomation - characterized by the presence of thrombocytopenia, hypofibrinogenemia and increased tissue factor (TF) activity in plasma - could be indirectly evoked by ONS induced by B. jararaca venom (BjV) components. Recently, the biological activity of TF - the protein responsible for initiating the extrinsic pathway of the coagulation cascade - was demonstrated to be regulated by protein disulfide isomerase (PDI), which in turn, can be inhibited in vivo by quercetin-3-rutinose (rutin), a natural antioxidant found in plants and diet. Based on that, the present study aimed to investigate in mice injected with BjV: (a) the alterations in redox status in plasma and tissues; (b) the hematological/hemostatic disturbances (in plasma and tissues) associated with the imbalance in redox status; (c) the activity of rutin as a modulatory agent on those alterations. Swiss mice (30-35 g) were divided in four experimental groups: saline control (saline, negative control), rutin control (rutin+saline), BjV+saline (BjV+saline, positive control) and BjV+rutin (BjV+rutin, treatment) and after 3, 6 and 24 h of the injection of treatments (s.c. route), blood and tissues were collected to further analyses. Envenomation induced an increase in reactive species, a decrease in total antioxidant capacity, hematological alterations (thrombocytopenia, neutrophilia and a decrease in red blood cell counts), hemostatic disturbances (hypofibrinogenemia, prolonged prothrombin time and an increase in the TF activity in plasma), and a decrease in protein expression of PDI in the heart. In vitro, rutin failed to inhibit the biological activity of the main BjV enzymes (metalloproteinases, serine proteases, phospholipases A2 and L-amino acid oxidases) and BjV-induced platelet aggregation. However, when the venom was incubated with rutin, there were reduced reactive species levels, less intense red blood cell drops, recovery of fibrinogen levels and prothrombin time, and alteration of TF activity and protein expression of TF and PDI in tissues. Therefore, we conclude that rutin favorably modulated important hemostatic and redox status alterations in B. jararaca envenomation, indicating its great potential as a complementary therapeutic agent for snakebites

Fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas abundantes em peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, possuindo uma grande variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como miotóxico, causador de necrose muscular. Em busca de novos fármacos de interesse médico e científico, os inibidores de fosfolipases A2 (PLIs) tornaram-se importantes alvos de pesquisa nos últimos anos. Tendo isto em vista, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de fosfolipase A2 miotóxica do tipo alfa (?BaltMIP) de B. alternatus em sua forma recombinante. Para os estudos de neutralização funcional foram utilizadas as toxinas da peçonha de Bothrops jararacussu: Lys49 PLA2-símile BthTX-I e a Asp49 PLA2 BthTX-II. O processo de purificação das toxinas de B. jararacussu consistiu em dois passos cromatográficos: exclusão molecular seguida de troca iônica, sendo o grau de pureza avaliado por HPLC. A expressão heteróloga do inibidor recombinante ?-BaltMIP foi induzida em leveduras Pichia pastoris. O inibidor purificado, denominado rBaltMIP, apresentou-se como uma proteína pura com pI de 5,8, massa molecular de ~21 kDa por SDS-PAGE e 19,5 kDa por MALDI/TOF MS e com conteúdo de carboidratos de 10%. Após o sequenciamento dos peptídeos trípticos obtidos, os resultados foram comparados com outros ?PLIs depositados em bancos de dados, observando-se 100% de identidade entre o rBaltMIP e o seu inibidor nativo ?BaltMIP, e de 92 a 96% com os demais inibidores analisados. Para as toxinas BthTX-I e BthTX-II, as concentrações efetivas (CE50) para as atividades miotóxicas medidas através dos níveis plasmáticos de CK foram de 0,1256 ?g/?L e de 0,6183 ?g/?L, respectivamente, e quando incubadas com o rBaltMIP houve neutralização de até 65% da miotoxicidade induzida por estas enzimas. Já nos ensaios de formação de edema de pata, foram obtidas as CE50 de 0,02581 ?g/?L e 0,02810 ?g/?L, respectivamente, com neutralização do edema pelo rBaltMIP de até 40%, mostrando-se um inibidor viável para complementar a soroterapia antiofídica sem, no entanto, ser imunogênico. Reforçando esta hipótese, experimentos de neutralização da miotoxicidade feitos com a miotoxina BthTX-I mostraram que o rBaltMIP foi mais eficiente em inibir os danos musculares que o próprio soro antiofídico quando usado isoladamente. Assim, devido a gravidade dos envenenamentos e a baixa neutralização de seus efeitos locais, como a miotoxicidade, pelo soro antiofídico usado atualmente, o estudo do rBaltMIP como inibidor de PLA2s do grupo II de serpentes torna-se promissor devido às suas possíveis aplicações clínicas, podendo neutralizar com maior rapidez, eficiência e especificidade as ações tóxicas de peçonhas ofídicas. / Phospholipases A2 are abundant enzymes present in Bothrops venoms which have a wide variety of pharmacological and/or toxic effects, such as myotoxicity, related to muscle necrosis. In search for new drugs of medical and scientific interest, the phospholipase A2 inhibitors (PLls) have become important targets in recent years. Considering this, the present study aimed at the biochemical and functional characterization of an alpha type phospholipase A2 inhibitor (?-BaltMIP) from B. alternatus in its recombinant form. For the functional neutralization studies, toxins from Bothrops jararacussu venom were used: Lys49 PLA2-like BthTX-I and Asp49 PLA2 BthTX-II. The process of purification of B. jararacussu toxins consisted of two chromatographic steps: molecular exclusion followed by ion exchange, evaluating their purity by HPLC. The heterologous expression of the recombinant ?BaltMIP inhibitor was induced in Pichia pastoris yeast. The purified inhibitor, called rBaltMIP, presented itself as a pure protein with pI of 5.8, molecular mass of ~21 kDa by SDS-PAGE and 19.5 kDa by MALDI/TOF MS, with 10% carbohydrate content. After tryptic peptides sequencing, the results were compared with other ?PLIs deposited in databases, observing a 100% identity between rBaltMIP and its native inhibitor ?BaltMIP, and from 92 to 96% identity with the other analyzed inhibitors. Toxins BthTX-I and BthTX-II showed effective concentrations (EC50) for myotoxic activities measured via plasma CK levels of 0.1256 ?g/?L and 0.6183 ?g/?L, respectively, and incubation with rBaltMIP indicated neutralization of up to 65% of myotoxicity. In paw edema formation assays, EC50 of 0.02581 ?g/?L and 0.02810 ?g/?L, respectively, were observed, with edema neutralizations of up to 40% by rBaltMIP, showing viability to complement antivenoms without, however, being immunogenic. Reinforcing this hypothesis, myotoxicity neutralization experiments performed with the myotoxin BthTX-I showed that rBaltMIP was more effective in inhibiting muscle damage than the actual antivenom by itself. Thus, considering the severity of envenomations and the low neutralization of their local effects, such as myotoxicity, by the antivenoms currently used, the study of rBaltMIP as a PLA2 inhibitor becomes promising due to its possible clinical applications, neutralizing quickly and with more efficiency and specificity the toxic actions of venoms

Esse trabalho teve como objetivo estudar aspectos importantes das estratégias reprodutivas de machos e fêmeas de Bothrops jararaca do clado norte (CN) e sul (CS) e das ilhas de Búzios (SP), Ilhabela (SP) e ilha dos Franceses (ES). Para isso, foram analisados exemplares de B. jararaca preservadas de diversas coleções zoológicas. Machos e fêmea de B. jararaca do CN foram significativamente maiores que os machos e fêmeas CS, no entanto tiveram cabeças relativamente menores e foram menos robustos. Fêmeas do CN têm em média maior fecundidade e filhotes maiores do que fêmeas do CS. O ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de ambas as populações é sazonal e não variou entre as estações do ano. Fêmeas do CN e do CS tem cópula outonal. A vitelogênese tem início no final do verão e fêmeas grávidas são observadas a partir do final do inverno. Nascimentos de B. jararaca de ambos os clados podem ser observados principalmente no verão e podem se estender até o início do outono. A estocagem de espermatozoides no útero e no infundíbulo foi observada principalmente no outono e inverno. Ciclos reprodutivos de machos de ambos os clados são considerados do tipo pós-nupcial ou do tipo I. O início da produção de espermatozoides é na primavera e a fase ativa pode ser observada no verão. No outono e no inverno, os testículos estão inativos. Estocagem de espermatozoides nos ductos deferentes foi observada durante todos os meses do ano e o segmento sexual renal (SSR) apresentou a fase mais ativa (fase secretora) na primavera e verão (sincronizado com a espermatogênese nos testículos) e fase não secretora no outono e no inverno. Esse padrão dos ciclos dos machos foi observado em ambos os clados. Dessa forma, foram observadas variações geográficas nas características de histórias de vida entre as populações do CN e CS, porém, não foram observadas diferenças entre os padrões de ciclos reprodutivos. Assim, o ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de B. jararaca do CN e do CS são conservativo na espécie. / This research aimed to study important aspects of reproductive strategies in male and female of Bothrops jararaca from north clade (CN), south clade (CS) including the islands of Búzios (SP), Ilhabela (SP), and Franceses (ES). We analyzed specimens of B. jararaca preserved on several zoological collections. Male and female of B. jararaca from CN were significantly longer than male and female from CS, however they had relatively smaller heads and were less robust. Male and female of B. jararaca from CN were significantly larger than individuals from CS, had relatively smaller heads and were less robust. Females from CN had on average higher fecundity and larger offspring than females of CS. The reproductive cycle of males and females from both populations was seasonal and the timing of events was also similar between clades. Females of CN and CS have autumn mating season. The vitellogenesis starts in the end of the summer and pregnant females are observed from late winter. Births of B. jararaca occurred from early summer to the beginning of autumn. Sperm storage in the uterus and infundibulum was mainly observed during autumn and winter. Reproductive cycles of male of both clades are type postnuptial or a type I. The beginning of the sperm production occurs in spring and the active phase was observed in the summer. During autumn and winter, the testicles are inactive. Sperm storage in the different ducts was observed throughout the year and the sexual segment of the kidney (SSK) shows a more active phase during spring and summer and non-secretory phase on autumn and winter. This pattern of cycles of male was observed in both clades. In conclusion, there is geographical variation in life-history characteristics between CN and CS populations. However, differences among the reproductive cycle pattern were not evident. Then, the reproductive cycles of male and female of CN and CS are conservative in the species.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2600688 bytes, checksum: 925d18dd7ebd669f58ba726884baa97c (MD5) Previous issue date: 2013-02-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brazil is the country with the highest rate of reported snakebites. The venomous snakes that occur in the country belong to the Viperidae and Elapidae families. Snakebites cause the release of pharmacologically active substances with local effects such as hemorrhage, oedema, necrosis, myotoxicity, cardiotoxicity, neurotoxicity and cytotoxicity, as well as systemic effects such as blood coagulation, spontaneous bleeding, renal and respiratory failure. Snake venoms are rich sources of proteins, peptides, organic and inorganic compounds. The phospholipase A2 (PLA2s) are the most abundant proteins in the snake venom of different genera and exhibit toxic and pharmacology effects of strong medical and scientific interest. The aim of this study was to characterize physic-chemically B-linear epitopes of three phospholipases A2 (BhtTX-I, BthTX-II and BthA-I) isolated from Bothrops jararacussu snake venom recognized by the therapeutic horse anti-ophidic sera; in silico comparative analysis of the B-linear epitopes recognized by the sera that are present and / or absent in other PLA2s isolated from snake venoms; and describe molecules isolated from plant extracts that are able to inhibit the toxic and pharmacological effects of PLA2s. Parallel spot synthesis peptides experiments on cellulose membranes allowed identifying, by chemiluminescence, twelve PLA2s regions recognized by anti-ophidic sera (anti-bothropic and/or anti-crotalic). Comparative analyzes between PLA2s enabled to identify that some regions recognized by anti-ophidic sera are responsible for neurotoxic, anticoagulant and myotoxic activities performed by snakes. Therefore, this work enables interaction regions elucidate molecular serum-protein as well as assist in proposing new inhibitors. / O Brasil é o país com maior índice de acidentes ofídicos registrados. As serpentes peçonhentas que ocorrem no país pertencem às famílias Viperidae e Elapidae. Acidentes ofídicos causam a liberação de substâncias farmacologicamente ativas com efeitos locais como hemorragia, edema, necrose tecidual, miotoxicidade, cardiotoxicidade, neurotoxicidade e citotoxicidade, além de efeitos sistêmicos como coagulação sanguínea, sangramentos espontâneos, insuficiência renal e respiratória. Peçonha de serpentes são fontes ricas de proteínas, peptídeos, compostos orgânicos e inorgânicos. As fosfolipases A2 (PLA2s) são as proteínas mais abundantes nas peçonhas dos diferentes gêneros de serpentes e apresentam efeitos tóxicos e farmacológicos de grande interesse médico-científico. O presente estudo teve por objetivos caracterizar físico-quimicamente epitopos B-lineares de três PLA2s isoladas da peçonha de Bothrops jararacussu reconhecidos pelos soros antiofídicos; analisar comparativamente, in silico, os epitopos B-lineares reconhecidos pelos soros que estão presentes e/ou ausentes em demais PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes; relatar moléculas isoladas de extratos vegetais que possibilitem inibir os efeitos tóxicos e farmacológicos das PLA2s. Experimentos de síntese paralela de peptídeos realizadas em membranas de celulose permitiram identificar, por quimiluminescência, doze regiões das PLA2s (BthTX-I, BthTX-II e BthA-I) presentes na peçonha de Bothrops jararacussu reconhecidas por soros antiofídicos (antibotrópico e/ou anticrotálico). Análises comparativas entre PLA2s possibilitaram identificar que algumas regiões específicas que foram reconhecidas pelos soros antiofídicos são responsáveis pelas atividades neurotóxica, miotóxica e anticoagulante desencadeadas pelo ofidismo. Portanto, o presente trabalho possibilita elucidar regiões de interação molecular soro-proteína bem como auxiliar na proposição de novos inibidores.

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops representam cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Um componentes presente em venenos de serpentes são as fosfolipases A2 (PLA2s), que podem apresentar diversas atividades biológicas. Diversos estudos com PLA2s e PLA2s-homólogas de venenos de serpentes buscam melhor compreender o mecanismo da ação miotóxica, sugerindo diferentes sítios de ação. Neste trabalho, são apresentados estudos com PLA2s-homólogas do veneno de Bothrops moojeni, conhecida popularmente como caiçaca. A miotoxina II (MjTX-II) foi estudada na forma nativa, complexada com ácidos graxos e os inibidores ácido rosmarínico e suramina, enquanto a miotoxina I (MjTX-I) foi estudada em complexo com o ligante suramina. Para a obtenção dos dados, foram utilizadas diferentes técnicas biofísicas como espalhamento dinâmico de luz, calorimetria por titulação isotérmica e cristalografia de raios X. Estes estudos foram complementados com estudos funcionais por técnicas miográficas e estudos computacionais por dinâmica molecular realizados por outros membros do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural. As estruturas cristalográficas da MjTX-II nativa e complexada com ácidos graxos revelaram particularidades para esta toxina, como a independência da ligação de ácidos graxos na estrutura para a sua ativação - alinhamento dos resíduos importantes para a atividade miotóxica. A estrutura da MjTX-II com o ácido rosmarínico revelou que o ligante interage com uma das regiões rela... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops genus represents approximately 90% of the ophidian accidents that occur in Brazil. One of the compounds of the venom is the phospholipases A2 (PLA2s), which are proteins with a wide range of biological activities. Several studies with PLA2s and PLA2-homologues from snake venom were performed to better understanding the myotoxic mechanism, suggesting different activity sites. This work presents studies with PLA2s-homologues isolated from Bothrops moojeni, known in Brazil as caiçaca. The myotoxin II (MjTX-II) was studied in native, complexes to fatty acids, rosmarinic acid and suramin inhibitors. Myotoxin I (MjTX-I) was studied complexed to suramin. X-ray crystallography, dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry were used to characterize the protein and complexes. Furthermore, functional studies by myographic techniques and computational studies using molecular dynamics were performed by other members of the Laboratory. Crystallographic structures of MjTX-II in native form and complexes to fatty acids reveals particularities for these toxin, such as the independence of the fatty acids binding for myotoxic residues alignment. The structure of MjTX-II complexed to rosmarinic acid showed that this ligand interact to a of regions related to myotoxic activity of toxin, which probably explaining its inbitory action demonstrated by myographic techniques and is according to previous proposed mechanism. Crystallographic data of the MjTX-II/suramin complex s... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: The snake venom is composed by a diversity of biomolecules with many actions on physiological processes. The serine peptidases are a group of proteases present in the constitution of the venom, capable of interfering on several points of hemostasis. Some serine peptidases has thrombin-like activity, what makes them targets on the development of therapeutics agentes on the treatment of many hemostatic disorders. In this study, a recombinant thrombin-like serine peptidase called rBpSP-II was obtained from the cDNA of the venom gland of the snake Bothrops pauloensis and biochemically characterized. The cDNA correspondent to rBpSP-II was cloned on the pPICZαA vector and inserted on the methylotrophic yeast Pichia pastoris KM71H for the heterologous expression. This enzyme showed single band when analised on SDS-PAGE with approximated molecular mass of 44,5 kDa under reducing conditions. The enzyme rBpSP-II showed clotting activity on bovine plasma and proteolytic activity on fibrinogen, cleaving exclusively the Aα chain. The evaluation of rBpSP-II activity on chromogenic substrates showed that the enzyme has thrombin-like activity due to its capacity to hydrolyze the thrombin substrate. / CAPÍTULO II: A peçonha de serpente é composta por uma diversidade de biomoléculas com inúmeras ações sobre os processos fisiológicos. As serinoproteases são um grupo de proteases presentes na constituição da peçonha, capazes de interferir em diversos pontos da hemostasia. Algumas serinoproteases possuem atividade semelhante à trombina, o que as tornam alvos de interesse no desenvolvimento de agentes terapêuticos no tratamento de desordens hemostáticas. Neste estudo, uma serinoprotease thrombin-like recombinante denominada rBpSP-II foi obtida a partir do cDNA da glândula da peçonha da serpente Bothrops pauloensis e caracterizada bioquimicamente. O cDNA correspondente à rBpSP-II foi clonado no vetor pPICZαA e inserido na levedura metilotrófica Pichia pastoris KM71H para a realização da expressão heteróloga. Esta enzima apresentou banda única quando analisada em SDS-PAGE com massa molecular aproximada de 44.5 kDa sob condições redutoras. A rBpSP-II apresentou atividade coagulante sobre plasma bovino e atividade proteolítica sobre o fibrinogênio, clivando preferencialmente a cadeia Aα. A avaliação da atividade da rBpSP-II sobre substratos cromogênicos demonstrou que a enzima possui atividade thrombin-like devido a sua capacidade de hidrolisar o substrato da trombina. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Proteases are enzymes widely found in all five life being kingdoms. These proteolytic enzymes have been studied and can be used as therapeutic tools due to their actions on physiopathologic events. Metalloproteinase are hydrolytic zinc-binding dependent enzymes which interfere in physiological processes. Snake venom metalloproteinase are widely studied animal toxins. They are divided into classes (PI, PII and PIII) and PI metalloproteinase are composed of a pro-domain and a catalytic domain in its structure. In the present work, we demonstrated the biochemical and functional characteristics of a PI- metalloproteinase (BpMP-II) isolated from B. pauloensis venom. BpMP-II was purified in three chromatography steps on cation exchange resin CM-Sepharose Fast flow, filtration Sephacryl S-300 and anion exchange Capto-Q. The isolated enzyme was homogeneous on SDS-PAGE under reduction and non-reduction conditions, with a molecular weight of 23kDa determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The isoeletric focalization demonstrated a slight acid pI (6,1) of BpMP-II. The partial sequence of protein was determined by MS/MS (MALDI-TOF/TOF) and showed high structural similarity with others SVMPs as well as a significant score match. BpMP-II showed high proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at temperatures higher than 60oC. Concentrations higher than 20μg of BpMP-II was able to decrease tEnd cells viability. A slight increase in creatine kinase (CK) levels was noticed when BpMP-II was administrated an intramuscular route on mice. Therefore, the present work permitted the identification and characterization of a molecule with great therapeutic potential. / Proteases são enzimas abundantemente encontradas em todos os cinco grandes reinos de seres vivos. Essas enzimas proteolíticas provenientes da natureza têm sido alvos de estudos com a finalidade de buscar ferramentas de uso terapêutico por atuarem em diversos processos fisiopatológicos. Metaloproteases são enzimas proteolíticas da classe das hidrolases que dependem da ligação de um metal em seu sítio ativo (geralmente o zinco) para exercer suas atividades. Essas enzimas participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos. As metaloproteases de peçonha de serpentes (SVMPs) estão entre as toxinas animais mais estudadas. Elas são divididas em classes (PI, PII e PIII) de acordo com a composição estrutural e a presença de domínios. As metaloproteases da classe PI contêm um pró-domínio e o domínio catalítico em sua estrutura. No presente trabalho, nós descrevemos as características bioquímicas e funcionais de uma metaloprotease da classe PI denominada Bothrops pauloensis Metalloproteinase-II (BpMP-II), isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. BpMP-II foi purificada utilizando-se três passos cromatográficos em resinas de troca catiônica CM-Sepharose Fast Flow, coluna de gel filtração Sephacryl S-300 e resina de troca aniônica HisTrap Capto-Q. A enzima isolada apresentou-se homogênea em eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e não-redutoras, com uma massa molecular de 23kDa determinada por espectrometria de massas MALDI-TOF. O ensaio de focalização isoelétrica resultou em um pI levemente ácido de 6,1 para a BpMP-II. A sequência parcial da proteína determinada por MS/MS (MALDI TOF/TOF) apresentou alta similaridade estrutural com outras SVMPs com score bastante significativo. BpMP-II mostrou alta atividade proteolítica sobre azocaseína sob diferentes condições experimentais e sobre o fibrinogênio bovino com variação de dose, pH. BpMP-II foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina (agentes quelantes) e β-mercaptoetanol (agente redutor ligação S-S). Além disso, esta protease apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas (60ºC). BpMP-II mostrou ser citotóxica para células tEnd em concentrações acima de 20μg/μL. Um leve aumento nos níveis de creatina quinase (CK) foi observado quando injetada intramuscularmente em camundongos. Assim, o presente trabalho permitiu identificar e caracterizar uma molécula com grande potencial de aplicação terapêutica. / Mestre em Genética e Bioquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CAPÍTULO II: Peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de compostos orgânicos e inorgânicos, proteínas e peptídeos, tais como as aminotransferases, acetilcolinesterases, hialuronidases, L-aminoácido-oxidases, fosfolipases A2, metaloproteases, serinoproteases, lectinas, desintegrinas, entre outros. As fosfolipases A2 influenciam direta ou indiretamente no efeito fisiopatológico no envenenamento, pois além de sua participação na digestão das presas, elas apresentam várias outras atividades como ação hemolítica indireta, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, ação agregadora de plaquetas, atividades anticoagulante, edematogênica, miotóxica e inflamatória. Neste trabalho, descrevemos a caracterização funcional de BaltMTx, uma PLA2 de Bothrops alternatus que inibe a agregação plaquetária e apresenta efeito bactericida. A purificação de BaltMTx foi realizada por uma combinação de três passos cromatográficos (cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephacel, seguido de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose, e cromatografia de afinidade em Heparina HiTrap™ HP). A proteína foi purificada até à homogeneidade, tal como avaliado pelo seu perfil de migração em SDS-PAGE, corado com azul de Coomassie, que mostrou uma massa molecular de cerca de 15 kDa sob condições redutoras e cerca de 25 kDa em condições não redutoras. BaltMTx mostrou um efeito inibidor específico sobre a agregação plaquetária induzida por epinefrina em plasma humano rico em plaquetas, de uma maneira dose dependente. Todavia, apresentou pouco ou nenhum efeito sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno e adenosinadifosfato. BaltMTx, também, mostrou atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Altas concentrações de BatlMTx estimulou a proliferação de Leishmania (Leishmania) infantum e Leishmania (Viania) braziliensis. BaltMTx induziu a produção de mediadores inflamatórios tais como IL-10, IL-12, TNF-α e NO. BaltMTx apresenta grande interesse médico, tanto como uma nova ferramenta para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para a prevenção e tratamento de distúrbios trombóticos, quanto como agente bactericida. / CHAPTER II: Snake venoms are a complex mixture of organic and inorganic compounds, proteins and peptides such as aminotransferases, acetylcholinesterase, hyaluronidases, L-amino acid oxidase, phospholipase A2, metalloproteases, serine proteases, lectins, disintegrins, and others. Phospholipase A2 directly or indirectly influence the pathophysiological effect on envenomation, as well as their participation in the digestion of the prey. They have several other activities such as hemolytic indirect action, cardiotoxicity, aggregating of platelets, anticoagulant, edema, myotoxic and inflammatory activities. In this work, we describe the functional characterization of BaltMTx, a PLA2 from Bothrops alternatus that inhibits platelet aggregation and present bactericidal effect. The purification of BaltMTx was carried out through three chromatographic steps (ion-exchange on a DEAE-Sephacel column, followed by hydrophobic chromatography on Phenyl–Sepharose and affinity chromatography on HiTrap™ Heparin HP). The protein was purified to homogeneity as judged by its migration profile in SDS–PAGE stained with coomassie blue, and showed a molecular mass of about 15 kDa under reducing conditions and approximately 25 kDa in non-reducing conditions. BaltMTx showed a rather specific inhibitory effect on platelet aggregation induced by epinephrine in human platelet-rich plasma in a dose-dependent manner, whereas it had little or no effect on platelet aggregation induced by collagen or adenosine diphosphate. BaltMTx also showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. High concentrations of BatlMTx stimulated the proliferation of Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viania) braziliensis. BaltMTx induced production of inflammatory mediators such as IL-10, IL-12, TNF-α and NO. BaltMTx could be of medical interest as a new tool for the development of novel therapeutic agents for the prevention and treatment of thrombotic disorders as well as bactericidal agent. / Dissertação (Mestrado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER II: Bothrops snake venoms contain proteins that contribute to the local and systemic effects seen after envenoming, such as edema, myonecrosis, coagulation disorders and hemorrhage. These effects can be triggered by the toxic action of metalloproteinases present in the bothropic venom. This study aimed to perform the purification, biochemical and functional characterization of a metalloproteinase called Moozincin, from Bothrops moojeni snake venom. Moozincin has approximate molecular mass of 28 kDa, displays relevant fibrinogenolytic activity and can be classified as a non-hemorrhagic fibrinogenolytic metalloprotease, in the class P-I. Moozincin was also able to induce edema, myonecrosis and hyperalgesia in experimental animals. Morphological analysis of the evolution of muscle injury revealed the occurrence of degenerative events and leukocyte infiltration already at three hours after application of Moozincin. These effects dominate until 48 hours after administration of the metalloprotease, when hemorrhagic effect was also demonstrated later in skeletal muscle, probably triggered by the action characteristic of metalloproteinases on vascular components and / or indirect action resulting from muscle injury. / CAPÍTULO II: As peçonhas de serpentes do gênero Bothrops contêm toxinas que contribuem com efeitos locais e sistêmicos vistos no envenenamento, como edema, mionecrose, distúrbios de coagulação e hemorragia. Grande parte desses efeitos pode ser desencadeada pela ação tóxica de metaloproteases presentes na peçonha botrópica. Este trabalho teve o objetivo de realizar a purificação e caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease, denominada Moozincina, presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni. A Moozincina tem massa molecular aproximada de 28 kDa e apresenta atividade fibrinogenolítica relevante, podendo ser classificada como uma metaloprotease fibrinogenolítica não-hemorrágica, pertencente à classe P-I. A Moozincina também foi capaz de induzir edema, hiperalgesia e mionecrose em animais experimentais. A análise morfológica da evolução da lesão muscular evidenciou a ocorrência de eventos degenerativos e infiltrado leucocitário já na terceira hora após a aplicação da toxina (Moozincina). Esses efeitos predominam até 48 horas após a administração da metaloprotease, quando também foi evidenciado efeito hemorrágico tardio no músculo esquelético, provavelmente desencadeado pela ação característica de metaloproteases sobre componentes vasculares e/ou por ação indireta decorrente da lesão muscular. CAPÍTULO III: Moozincina é uma metaloprotease recentemente isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. No presente trabalho foi realizada a caracterização farmacológica de efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. A aplicação intraplantar da Moozincina (5, 25 and 50 μg/pata) induziu edema e hiperalgesia na pata de ratos. Os efeitos edematogênico e hiperalgésico máximos foram observados 3 e 4 horas após a injeção da toxina, respectivamente. Alguns fármacos como dexametasona (2,5 mg/kg) e indometacina (8,0 mg/kg) reduziram significantemente o edema e a hiperalgesia, já a prometazina (15 mg/kg) e o ácido nordiidroguaiarético (100 mg/kg) reduziram apenas o efeito edematogênico, enquanto HOE-140 (10 μg/pata) e NG-monometil-I-arginina (100 μg/pata) reduziu apenas a hiperalgesia. Esses resultados demonstram a participação de metabólitos de ácido araquidônico em ambos os efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. Além disso, a ativação de receptores H1 de histamina está especificamente relacionada ao edema e a ação de bradicinina e de óxido nítrico à hiperalgesia. / Mestre em Genética e Bioquímica