Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T20:58:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sant'Ana_ChristinaMariade_M.pdf: 302187 bytes, checksum: 422061925f0c5378a445c566afe71b75 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O envenenamento botrópico leva ao desenvolvimento de eventos como necrose, hemorragia e distúrbios da coagulação, gerando um quadro fisiopatológico de grande complexicidade. O trabalho de Lôbo de Araújo et al. de 1998 descreveu uma proteína de cadeia polipeptídica simples (PII1A), a qual apresentou atividade enzimática tipo esterolítica, proteína esta, proveniente do veneno da Bothrops lanceolatus, uma serpente habitante da ilha da Martinica, no Caribe. A imunodifusão e a imunoeletroforese apresentaram uma linha simples de imunoprecipitado. A fração em questão ainda hidrolisou as cadeias a e b do fibrinogênio, o que levou a classificar esta proteína como uma enzima fibrino(geno)lítica. No presente trabalho, nos propusemos a dar continuidade ao estudo desta proteína parcialmente purificada e caracterizada e investigar sua atividade como ativadora de plasminogênio ou portadora de atividade fibrinolítica, assim a atividade plasmina símile foi determinada pela ação da proteína diretamente sobre substrato cromogênico específico (S-2251ä), estando de acordo com achados publicados por Lôbo de Araújo et al (1998) e que revelou também discreta atividade ativadora de plasminogênio, quando compara-se incubação na presença e ausência deste. Determinamos 71% da seqüência de aminoácidos da PII1A por espectrometria de massa ¿ Q-tof, este método revelou um peso molecular de 28.360 kDa. A análise da seqüência em base de dados mostrou homologia com outras proteínas se serpentes e com enzimas como tripsina e fatores da cascata de coagulação / Abstract: The main symptoms following bothropic envenoming are necroses, hemorrhage and coagulopathies, originating a characteristic and complex phisiopathology. The work of Lôbo de Araújo et al. (1998) described a single polipeptide chain protein (PII-1A) purified from Bothrops lanceolatus venom, a snake inhabitant of the Martinica island. The immunodiffusion and immunoeletrophoresis analysis showed a single immunoprecipitin line. This protein was characterized as a fibrino(geno)lytic enzyme since was able to hydrolyze the a and b chains of fibrinogen. Using synthetic substrates, the authors demonstrated a strong sterolytic activity against p-TAME. In the present work we continue to study this protein (PII-1A) investigating its activity to activate plasminogen or to present a direct fibrinolytic activity using S-2251ä substrate. The determination of its partial sequence, including N-terminal, was carried through by mass spectrometry - Q-tof that showed molecular weight 28.369 kDa / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:08:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vomero_VivianeUrbini_D.pdf: 26340150 bytes, checksum: c1d13ac627e9a92ccb192b6270f0d38b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos. Dentre elas se destaca a B. jararacussu pela capacidade de inoculação de grande quantidade de veneno. O veneno desta espécie se caracteriza pela ação miotóxica, e esta ação causam importantes alterações locais, como a necrose das fibras musculares e conseqüentemente perda da massa muscular. No presente trabalho, estudamos os efeitos do deflazacort (glicocorticóide derivado da predinizona) e da L-Arginina (precursor do óxido nítrico) na regeneração das fibras musculares frente aos efeitos mionecróticos do veneno. Para tanto, utilizamos camundongos Swiss adultos jovens do sexo masculino. O músculo tibial anterior foi injetado com 80 µg do veneno bruto de B. jararacussu diluídos em 0,1 ml de solução fisiológica. Após as injeções dos venenos iniciaram-se a administração das drogas, com injeções intraperitoneais diárias de deflazacort na dosagem de 1,2 mg/kg por 5 e 20 dias. O segundo grupo recebeu a L-arginina junto à água de beber na concentração de 3,75 mg/ml desde o momento da injeção do veneno por 2 meses. O grupo controle foi composto por animais injetados com o veneno sem a realização de tratamento. A regeneração muscular foi avaliada no período de 2 meses e 5 dias através de cortes transversos do terço médio dos músculos, sendo corados com H&E e Tricrômico de Masson, para contagem da população total das fibras musculares e de células com núcleos centrais para análise da regeneração muscular. Quantificações da área muscular e da fibrose tecidual também foram realizadas. Identificou-se que com a L-Arginina ocorreu um aumento na regeneração muscular com a presença de maior número de fibras musculares regeneradas (2.230 ± 478) em relação ao animal injetado não tratado (1.005 ± 134). E no grupo tratado com Deflazacort observou-se um aumento da fibrose tecidual (1.077.051 ± 466.658,2; versus 777.107,3 ± 356.804,8 pixels quadrado) com número menor de fibras musculares (783,5 ± 134) em relação ao grupo não tratado. Desta forma, identificou-se o estímulo da regeneração muscular promovida pela L-arginina e o aumento da fibrose tecidual e diminuição da área muscular causado pela administração do antiinflamatório Deflazacort após o envenenamento pelo veneno bruto de B. jararacussu. / Abstract: The study evaluates the effect of deflazacort (DFZ), an anti-inflammatory oxalazine derivative of prednisone, on muscle regeneration following myonecrosis experimentally induced by B. jararacussu venom. Mice (n=15) right tibialis anterioris muscle was injected with 80 µg of venom. Two groups of animals (n=10) was treated during 5 and 20 days with a daily intraperitoneal injection of deflazacort, an anti-inflammatory oxalazine derivative of prednisone (1,2 mg/kg). The third group was injected with crude venom and did not receive any pharmacological treatment. The animals were killed 5 and 60 days after envenoming and muscle regeneration was evaluated by counting the number of muscle fibers and measuring the fibrosis area. We found that in deflazacort-treated group the area of fibrosis was higher (p< 0.05) than in injected muscles without treatment (1.077.051 ± 466.658,2; versus 777.107,3 ± 356.804,8 pixels square), and the number of muscle fiber was significant different too (755 ± 84; versus 1.221 ± 102). Although it does not reach the level of muscle fiber population of uninjured tibialis anterioris muscle (3.257 ± 478). We conclude that deflazacort treatment is detrimental to muscle fiber regeneration aggravating the loss of muscle mass after B. jararacussu envenoming. / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Stephen Hyslop, Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Saccon_CassiaMariaToledo_M.pdf: 7279478 bytes, checksum: eb7fda24e7d486cd0267a344badc1b36 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O acidente causado por serpentes botrópicas produz intensa hemorragia e mionecrose local, com perda e degradação tecidual. Neste trabalho, investigamos as atividades do proteossomo (via seletiva da degradação protéica), catepsinas (proteases lisossomais) e calpaína (protease neutra dependente de cálcio) no envenenamento causado por peçonha de Bothrops jararacussu. Também analisamos a capacidade do MG-132, inibidor proteossômico, em atenuar os efeitos causados pela peçonha. A peçonha (25 µg e 75 µg) foi injetada em músculo gastrocnêmio de camundongos, que foram sacrificados 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 h e 7, 14, 21, 28 dias após o envenenamento. Os músculos tratados e contralaterais foram retirados e processados para histologia e para ensaios fluorimétricos e colorimétricos das enzimas e o sangue foi coletado para quantificação da creatina quinase (CK, indicador da mionecrose). A peçonha de B. jararacussu causou hemorragia e mionecrose (fase 1, até 6 h a 12 h pós-envenenamento - p.e.), a presença de infiltrado inflamatório e desencadeou a formação de miotubos e mioblastos (fase 2, de 12 h a 72 h p.e.) e o aparecimento de células regenerativas com maior deposição de colágeno ao redor dessas células (fase 3, 7-28 dias p.e.). De modo geral, as alterações mais marcantes ocorreram com a dose maior da peçonha. O dano tecidual agudo foi confirmado pelo aumento nos níveis plasmáticos de CK entre 1 h e 6 h p.e., com pico em 3 h. Houve redução na concentração de aminoácidos livres do músculo durante as primeiras 24 h, seguida por retorno a níveis normais. Também houve redução significativa na atividade proteossomal (até 48 h) nos músculos envenenados seguida por recuperação e aumento significativo em alguns períodos da regeneração. Nesses períodos de regeneração, houve aumento da expressão das subunidades 20Sa e 11S do proteossomo, principalmente com a dose maior da peçonha. O inibidor proteossômico diminuiu a atividade quimiotripsina e o número de células regenerativas, mas esses efeitos também foram observados no grupo que recebeu apenas o veículo do inibidor (DMSO). A calpaína foi ativada nas primeiras 6 h após o envenenamento somente com a dose maior da peçonha. As catepsinas (B e H) exibiram ativação significativa no período de regeneração (de 48 h até 28 dias) nas duas doses aplicadas. Esses resultados indicam que a peçonha de B. jararacussu afetou diferencialmente as vias proteolíticas estudadas. É possível que a calpaína esteja envolvida na fase 1 do dano tecidual e que as catepsinas estejam relacionadas à presença de infiltrado inflamatório (fase 2) ou à regeneração (fase 3). O proteossomo parece não estar relacionado à fase aguda de degradação tecidual, mas pode estar envolvido na regeneração muscular embora isso ainda precise ser confirmado / Abstract: Bites by Bothrops snakes produce intense local hemorrhage and myonecrosis, often with extensive tissue degradation. In this work, we investigated the activities of the proteasome (pathway for selective protein degradation), cathepsins (lysosomal proteinases) and calpains (neutral, calcium-dependent proteinases) in envenoming by Bothrops jararacussu. We also examined the ability of MG-132, a proteasome inhibitor, to attenuate the venom-induced effects. Mice were injected with venom (25 µg or 75 µg) in the left gastrocnemius muscle and then killed 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 h and 7, 14, 21 and 28 days post-venom. The venom-injected and contralateral muscles were removed and processed for histological analysis or enzymatic assays using fluorimetric or colorimetric substrates. Blood was also collected for the quantification of plasma creatine kinase (CK, an indicator of myonecrosis). Bothrops jararacussu venom caused hemorrhage and necrosis (phase 1, up to 6-12 h post-venom), an inflammatory cell infiltrate and it generated the formation of myotubes and myoblasts (phase 2, 12-72 h post-venom), and the appearance of regenerative cells with increase of collagen deposition around these cells (phase 3, 7-28 days post-venom). The alterations were generally more marked with the higher dose of venom. The early tissue damage was confirmed by an increase in plasma CK levels 1-6 h post-venom, with a peak at 3 h. The muscle content of free amino acids decreased during the first 24 h, followed by a return to normal levels. Proteasomal activity was significantly inhibited for up to 48 h post-venom, followed by recuperation and a significant increase during muscle regeneration. During regeneration, there was also an increase in the expression of the 20Sa and 11S proteasomal subunits, mainly with the highest dose of venom. The proteasomal inhibitor reduced the chymotrypsin activity of the proteasome and the number of regenerating cells, but these effects were also seen in mice that received vehicle (DMSO) alone. The highest dose of venom caused an increase in calpain activity in the first 6 h whereas both of the venom doses significantly increased the activities of cathepsins B and H during the regeneration phase (48 h¿28 days post-venom). These results indicate that B. jararacussu venom differentially affects the proteolytic activities studied. Calpain may be involved in phase 1 of tissue damage and cathepsin activity may be related to the presence of an inflammatory infiltrate (phase 2) and/or regeneration (phase 3). The lack of proteasomal activation in the early stages of envenoming suggests that this proteolytic pathway is not involved in early venom-induced muscle damage. However, the involvement of proteasomal activity during muscle regeneration remains to be established. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:11:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:12:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:15:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T14:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Bothrops asper is one of the main species of Central America because of its medical importance in countries such as Panamá and Costa Rica, where they cause a high number of accidents. A great number of basic phopholipase A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) this species have been characterized, but a few number of studies have been carried out with acidic isoforms. Moreover, as the snake venom is a rich source of bioactive, the investigation of the biotechnological potential is required. Therefore, from the B. asper venom, this study shows three main lines of research: the caracterization of novel PLA2s isoforms; the study of PLA2s in poisoning pathophysiology and the study of potential antiparasitic of PLA2s. The snake venom was fractionated on three chromatographic methods that have proved effective in purification: ion exchange, hydrophobic interaction and reversed phase, giving rise to nine PLA2, four acidic (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) and five basic (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). The molecular weight was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) showed values ranging between 13.8 and 14.3 kDa. The isoelectric point of the acidic PLA2 were determined by 2D SDS-PAGE, showing pI values between 4.6 and 5.0. The N-terminal sequence of nine PLA2 was determined, and 05 are new [four Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) and one Lys49 (BaspB-II)]. The enzymatic activity and the evaluation of the preferred substrates by PLA2 Asp49 was performed using fluorescent phospholipids which was observed that, among the tested phospholipids, acid PLA2 catalyzed all substrates, however, the basic PLA2 showed the highest specificity for phosphatidyl glycerol and phosphatidic acid. A discussion about the role of acidic PLA2 in case of poisoning by snake bite is performed based on myotoxicity assay. Moreover, it is demonstrated the antiparasitic action of these molecules, since the acidic PLA2 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) showed effects against epimastigote and pomastigotes forms of Trypanossoma cruzi and Leishmania infantum respectively. On the other hand, the basic PLA2, BaspB-II and IV-BaspB showed activity against Plasmodium falciparum. Furthermore, for the first time it demonstrated the synergistic action between Lys49 and Asp49 PLA2s against the malaria parasite, demonstrating that these molecules might be important targets in the development of new therapeutics. Keywords: Snake Venoms, Bothrops Asper, Phospholipase A2, Venomics, Synergism in Parasiticide Action / A serpente Bothrops asper é uma das espécies mais importantes da América Central, principalmente, por sua importância médica em países como Panamá e Costa Rica, onde causam um número elevado de acidentes. Diversas fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) básicas desta espécie já foram caracterizadas, porém poucos estudos foram realizados com as isoformas ácidas. Além disso, sendo o veneno de serpente uma rica fonte de bioativos, faz-se necessária a investigação de seu potencial biotecnológico. Desta forma, a partir do veneno de B. asper, o presente trabalho teve objetivos principais: a caracterização de novas isoformas de PLA2s, o estudo das PLA2s na fisiopatologia do envenenamento e o estudo do potencial antiparasitário das PLA2s. Para tanto, o veneno foi fracionado em três métodos cromatográficos que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa, dando origem a nove PLA2 isoladas, quatro ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e cinco básicas (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). As massas moleculares foram determinadas por espectrometria (MALDI TOF) com valores variando entre 13,8 e 14,3 kDa. Os pontos isoelétricos das PLA2s ácidas foram determinados por 2D-SDS-PAGE com valores de pI variando entre 4,6 e 5,0. A sequência N-terminal das nove PLA2s foram determinadas, sendo observado que dentre as nove, 05 são inéditas [quatro Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e uma Lys49 (BaspB-II)]. A atividade enzimática e a avaliação dos substratos preferenciais das PLA2s Asp49 foram realizadas utilizando-se fosfolipídeos fluorescentes e observou-se que, dentre os fosfolipídeos testados, as PLA2s ácidas catalisaram a degradação de todos os substratos, entretanto, para a PLA2 básica houve preferência para o fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico. Uma discussão a respeito do papel das PLA2s ácidas no envenenamento ofídico é conduzida com base no ensaio de miotoxicidade. Ademais, é demostrado a ação antiparasitária dessas moléculas, já que as PLA2s ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc- IV) tiveram ação contra as formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. infantum e as PLA2s básicas BaspB-II e BaspB-IV apresentaram atividade contra Plasmodium falciparum. Posto isto, pela primeira vez, foi demonstrado a ação sinérgica entre uma PLA2 Lys49 e uma PLA2 Asp49 contra o parasita da malária, demonstrando que estas moléculas podem ser importantes alvos no desenvolvimento de novos terapêuticos.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:15:55Z No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-08 / Venom components from snakes of the Bothrops genus have a wide range of biological actions that are not yet fully identified or understood. Of these compounds, phospholipases A2 have shown different potential for biotechnological applications. The objectives of this study were to isolate and biochemically and biologically characterize a Lys49 phospholipase A2 from Bothrops neuwiedi urutu venom. The protein was obtained with an elevated degree of purity after two chromatographic steps, the first being anion exchange (DEAE column) and the second reverse phase in a C18 column. The degree of purity and relative molecular mass were assessed by SDS-PAGE, obtaining a typical molecular mass of an svPLA2 of approximately 14 kDa, which was later confirmed by Mass Spectrometry, obtaining a mass value (m/z) of 13,733 Da. Analysis of the phospholipase activity, carried out on the substrate 4N3OBA showed that the isolated PLA2 is enzymatically inactive. The analyses using the Edman degradation method and that of the peptide fragments allowed for the identification of 108 of the toxin’s amino acid residues; high identity was observed with other phospholipases present in the venom of other species of snakes of the Bothrops genus. The data confirmed that it is a novel PLA2-Lys49 isoform from B. n. urutu venom, called BnuTX-I. The modeling in the dimeric form of the molecular structure of the toxin showed about 99.15% homology with PLA2-homologue 1 from Bothrops jararacussu (PDB code: 3I03) and identified the tertiary structure and active site. Biological assays in murine models revealed that both BnuTX-I and the venom were able to induce edema and myotoxic responses. Hemorrhagic activity was only observed for the venom. The antimicrobial and parasitic assays with the venom and BnuTX-I showed, mostly, the growth inhibition of P. aeruginosa strains and L. amazonensis promastigote forms with a CC50 of 22.91 μg/mL and a selectivity index (SI) of 0.44. As for the cytotoxic effects of BnuTX-I in murine macrophages, the toxin presented cytotoxicity at different concentrations (μg/mL), and the production of IL 1β cytokines was observed. The results allowed for the identification and characterization of a new myotoxin isoform with potential for future biotechnological applications. / Os componentes do veneno de serpentes do gênero Bothrops apresentam uma variada gama de ações biológicas ainda não completamente identificadas ou esclarecidas. Dos compostos, as fosfolipases A2 vêm demonstrando diferentes potenciais para aplicações biotecnológicas. Os objetivos deste estudo foram isolar e caracterizar bioquímica e biologicamente uma fosfolipase A2 Lys49 do veneno da serpente Bothrops neuwiedi urutu. A proteína foi obtida com elevado grau de pureza após duas etapas cromatográficas, sendo a primeira de troca aniônica (coluna DEAE) e a segunda de fase reversa em coluna C18. O grau de pureza e a massa molecular relativa foram avaliados por SDS-PAGE, obtendo-se uma massa molecular típica de svPLA2 de aproximadamente 14 kDa, que foi posteriormente confirmada por Espectrometria de Massa obtendo-se o valor de massa (m/z) de 13.733 Da. A análise da atividade fosfolipásica, realizada sob o substrato 4N3OBA, mostrou que a PLA2 isolada é enzimaticamente inativa. As análises pelo método de degradação de Edman e dos fragmentos peptídicos permitiram a identificação de 108 resíduos de aminoácidos da toxina, sendo observada elevada identidade com outras fosfolipases presentes no veneno de outras espécies de serpentes do gênero Bothrops. Os dados confirmaram tratar-se de uma isoforma inédita de PLA2-Lys49 do veneno de B. n. urutu, denominada BnuTX-I. O modelamento, na forma dimérica, da estrutura molecular da toxina mostrou homologia com cerca de 99,15% com a PLA2-homóloga 1 de Bothrops jararacussu (código PDB: 3I03), bem como a identificação das estruturas terciária e do sítio ativo. Os ensaios biológicos mostraram, em modelos murinos, que tanto a BnuTX-I quanto o veneno foram capazes de induzir respostas edematogênica e miotóxica. A atividade hemorrágica foi observada somente para o veneno. Os ensaios antimicrobianos e parasitários realizados com veneno e BnuTX-I mostraram majoritariamente a inibição do crescimento das cepas de P. aeruginosa e de formas promastigota de L. amazonensis com CC50 de 22,91 μg/mL e com índice de seletividade (IS) de 0,44. Quanto aos efeitos citotóxicos, da BnuTX-I sobre macrófagos murinos, observou-se que a toxina apresentou citotoxidade em diferentes concentrações (μg/mL) e produção de citocinas IL 1β. Os resultados possibilitaram a identificação e caracterização de uma nova isoforma de miotoxina com pontecial para futuras aplicações biotecnológicas.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-20T14:07:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Thaís Silva.pdf: 4741939 bytes, checksum: 340cbefd953468799b561dcd14beba48 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-20T14:07:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Thaís Silva.pdf: 4741939 bytes, checksum: 340cbefd953468799b561dcd14beba48 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-20T14:07:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Thaís Silva.pdf: 4741939 bytes, checksum: 340cbefd953468799b561dcd14beba48 (MD5) Previous issue date: 2015-11-19 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Envenomings resulting from snakebites were classified, in 2009, by the World Health Organization as a neglected tropical disease. In Brazil, the genus Bothrops sp. is responsible for most of these accidents and, in the Amazon region, the majority of snakebite reports is attributed to the species Bothrops atrox. The venom from snakes of the genus Bothrops sp. is composed by proteins such as phospholipase A2, metalloproteinases, among others. The hemorrhagic activity is caused by metalloproteinase which induce vascular damage and ischemic zones which contribute to the appearance of necrosis in the local tissue. The treatment recommended by the Ministry of Health of Brazil against snakebites is the antivenom administration, however, this treatment does not neutralize the local effects satisfactorily. The coastal communities of Northern Brazil, due to long distances from health centers, have limited access to serumtherapy treatment and use plants of folk medicine to block the actions induced by snake venoms. This study investigated the potential of the aqueous extract of Connarus favosus (AECf) to inhibit hemorrhagic and phospholipase A2 activities induced by Bothrops atrox venom (BaV) and to determine the antioxidant and antimicrobial potentials of the extract. AECf was analyzed phytochemically for secondary metabolites and phenolics (condensed tannins and hydrolyzable tannins) by colorimetry. Antioxidant activity was evaluated by quantitative assays using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and Fe3+/phenanthroline. Antimicrobial activity was evaluated by the disk diffusion and minimal inhibitory concentration test, and cytotoxicity was evaluated using human fibroblast cells (MRC-5). Inhibition of BaV-induced hemorrhagic activity was assessed after oral administration of the extract using pre-treatment, post-treatment and combined (BA plus AECf) treatment protocols. Inhibition of indirect hemolysis caused by phospholipase A2 (PLA2) was investigated in vitro. Interaction between AECf and BaV was investigated by SDS-PAGE electrophoresis, Western blot (Wb) and zymography. The phytochemical profile of AECf revealed ten secondary metabolite classes, and colorimetry showed high total phenolic and total (condensed and hydrolyzable) tannin content. AECf exhibited high antioxidant and antimicrobial potentials. The IC50 for the cytotoxic effect was 51.91 (46.86 - 57.50) μg/mL. Inhibition of BaV-induced hemorrhagic activity was significant in all the protocols, and inhibition of PLA2 activity was significant with the two highest concentrations. The BaV/AECf mixture produced the same bands as BaV by itself in SDS-PAGE and Wb although the bands were much fainter. Zymography confirmed the proteolytic activity of BaV, but when the venom was pre-incubated with AECf this activity was blocked. AECf was effective in reducing BaV-induced hemorrhagic activity when administered by the same route as that used in folk medicine. / Os envenenamentos decorrentes de picadas de serpentes foram classificados, em 2009, pela Organização Mundial da Saúde, como doença tropical negligenciada. No Brasil, o gênero Bothrops sp. é responsável pela maioria destes acidentes e, na região Amazônica, grande parte dos relatos de ofidismo é atribuída à espécie Bothrops atrox. Os venenos das espécies do gênero Bothrops sp. são compostos predominantemente por proteínas como fosfolipases A2, metaloproteinases, serinaproteases, entre outros. A atividade hemorrágica é causada pela ação de metaloproteinases que induzem dano vascular e zonas isquêmicas que contribuem para o surgimento de necrose do tecido local. O tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde do Brasil para esses acidentes é a administração de antiveneno, entretanto, este imunobiológico não neutraliza os efeitos locais de forma eficaz. As comunidades ribeirinhas, da região Norte do Brasil, tem dificuldade de acesso ao tratamento soroterápico e utilizam plantas da medicina popular para bloquear as ações induzidas pelos venenos de serpentes. O presente estudo investigou o potencial do extrato aquoso de Connarus favosus (EACf) em inibir as atividades hemorrágica e fosfolipásica A2 induzida pela peçonha da serpente Bothrops atrox (PBa) determinar os potencias antioxidantes e antimicrobianos do extrato. EACf foi analisado fitoquimicamente para metabólitos secundários e os compostos fenólicos (taninos condensados e taninos hidrolisáveis) foram determinadas por ensaios colorimétricos. A ação antioxidante foi avaliada por ensaios quantitativos de 2,2- difenil-1-picril- hidrazila (DPPH) e Fe3+/Fenantrolina. A ação antimicrobiana foi avaliada por difusão em disco e concentração mínima inibitória, e a citotoxicidade foi avaliada utilizando linhagem de fibroblasto humano (MRC-5). A inibição da atividade hemorrágica induzida pelo PBa foi avaliada por administração via oral do EACf, seguindo protocolos de pré-tratamento, pós-tratamento e ação coadjuvante (EACf + soro antibotrópico SAB). A inibição da hemólise indireta causada pela fosfolipase A2 (PLA2) foi testada in vitro. A interação entre EACf e PBa foram avaliadas por eletroforese SDS-PAGE, Western Blot (Wb) e Zimografia. No perfil fitoquímico foram identificadas dez classes de metabólitos secundários, e os ensaios colorimétricos mostraram altas quantidades de fenóis totais e taninos (condensados e hidrolisáveis). O EACf exibiu alto potencial antioxidante e antimicrobiano. O IC50 do efeito citotóxico foi 51,91 (46,86 - 57,50) μg/mL. A inibição da atividade hemorrágica do PBa foi significativa em todos os protocolos testados, e a inibição da PLA2 foi significativa para as duas concentrações mais altas. A mistura PBa/EACf produziu as mesmas bandas do veneno isolado no SDS-PAGE e Wb, porém de forma mais branda. A zimografia confirmou a atividade proteolítica do PBa, mas quando o veneno foi pré-incubado com o EACf houve bloqueio dessa atividade. O EACf foi eficaz no bloqueio da atividade hemorrágica da PBa quando administrado nas doses e via tradicionalmente utilizadas.

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Barros.pdf: 2710465 bytes, checksum: 4f522332291442b7edb66a372b6259ce (MD5) Previous issue date: 2017-12-04 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cutaneous leishmaniasis (CL) is endemic in several regions of the world. In Brazil, despite the wide variety of clinical manifestations, 75% of patients with CL display a typical clinical picture, characterized by one or more ulcers and high round edges with a central necrosis, usually in the lower extremities. Leishmania amazonensis is a major etiologic agent of a wide spectrum of clinical forms of leishmaniasis. The objective of this study was to investigate the in vitro and in vivo antileishmania amazonensis activity of phospholipase A2 (Asp49) isolated from Bothrops jararacussu venom encapsulated in liposomal system. The cytotoxicity of PLA2-Asp49-liposomal was determined by MTT method in J774 macrophages after 48h of incubation. Macrophages treated with PLA2-Asp49-liposomes had cell viability around 82% at the highest concentration (100 μg/mL), while promastigotes treated with the same concentration resulted 78% of inhibition. On the other hand, peritoneal macrophages from Balb/c mice infected and treated with PLA2-Asp49-liposomes showed a 28% reduction in phagocytic index and a 55% reduction (p <0.05) in the number of intracellular amastigotes after 48h of treatment compared to the control group. After the treatments, the supernatants of peritoneal macrophages were collected, and the production of TNF-α, IL-10 and nitric oxide was evaluated. It was observed that there was no IL-10 production by macrophages treated with PLA2-Asp49-liposomes when compared to the untreated control. However, this group presented significant levels of TNF-α and nitric oxide. After the physicochemical characterization of the liposomes it was observed that the size of the vesicles remained close to the diameter of the membrane used in the extrusion, with an average diameter of 205.2 nm for PLA2-Asp49-liposomes and 241.9 nm for the control liposomes. PLA2-Asp49 were also efficiently encapsulated in liposomes (69.6%). The molecular docking showed that lipids strongly interact with the active site of the enzyme PLA2-Asp49. The activity of the toxin-containing liposomes was evaluated in BALB/c mice, previously infected with 1x105 of the parasite's promastigotes. After six weeks of infection, treatments in different groups of animals were initiated and observed for 21 days. The size of the paw lesion in PLA2-Asp49-liposomal treated animals was observed as decreasing by approximately 18% relative to the untreated control group and the Glucantime®-treated animals, which was used as a reference drug. At the end of the treatment, the animals were sacrificed and the paw and lymph node tissues were collected. Part of the collection was used to recover amastigotes and another to quantify cytokines and nitrites. In the group treated with PLA2-Asp49-liposomes the parasitic load was observed to be reduced by 73.5% in the macerated lymph node, compared to the control group. Comparatively, in the paw tissue was observed a reduction of 57.12%. The infected groups treated with PLA2-Asp49-liposomes showed significant production in TNF-α (45 and 80 pg/mL) and nitrite levels (32 and 36 μM), respectively, in lymph node and paw tissues, compared to infected untreated groups. The results indicate that the liposomal system containing PLA2-Asp49 is a promising biotechnological tool to confer an antileishmania activity in infected macrophages. / A leishmaniose cutânea é uma doença endêmica em várias regiões do mundo. No Brasil, 75% dos pacientes com a doença exibem uma forma clínica típica, caracterizada por uma ou mais úlceras de bordas redondas e elevadas com um centro necrótico. Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos de formas clínicas da leishmaniose. O objetivo do presente trabalho foi o de investigar os efeitos in vitro e in vivo da potencial atividade antileishmania amazonensis da Fosfolipase A2 (PLA2) da peçonha de Bothrops jararacussu encapsulada em sistema lipossomal. O método de MTT foi utilizado para avaliação da citotoxicidade da PLA2-Asp49-lipossomal em macrófagos J774 após 48h de incubação. Os macrófagos tratados com a PLA2-Asp49-lipossomal apresentaram viabilidade celular em cerca de 82% na maior concentração utilizada (100 μg/mL). No ensaio com as formas promastigotas tratadas com a mesma concentração da PLA2-Asp49-lipossomal ocorreu uma inibição de 78% dos parasitos. Para o teste de infecção macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c, infectados e incubados com PLA2-Asp49-lipossomal apresentaram redução de 28% no índice fagocítico e de 55% (p < 0.05) na quantidade de amastigotas intracelulares, após 48h de tratamento, comparado ao grupo controle. Os sobrenadantes de cultura dos macrófagos peritoneais foram coletados para a avaliação da produção de citocinas (TNF-α e IL-10) e de óxido nítrico. Não houve produção de IL-10 pelos macrófagos tratados com o PLA2-Asp49-lipossomal in vitro. Entretanto, o grupo tratado com PLA2-Asp49-liposomal produziu níveis significativos de TNF-α e óxido nítrico. Após a caracterização físico-química dos lipossomas foi observado que o tamanho das vesículas permaneceu próximo ao tamanho da membrana utilizada na extrusão, com diâmetro médio entre 205,2 nm para PLA2-Asp49-liposomal e 241,9 nm para os lipossomas controle. A PLA2-Asp49 foi eficientemente encapsulada nos lipossomas (69,6%). A atividade dos lipossomas contendo a toxina foi avaliada em camundongos BALB/c, previamente infectados com 1x105 promastigotas do parasito. Após seis semanas foi iniciado o tratamento com as preparações dos diferentes grupos de animais, acompanhados por 21 dias. Foi observado nos animais tratados com PLA2-Asp49-lipossomal diminuição de aproximadamente 18% do tamanho da lesão das patas, em relação ao grupo controle sem tratamento e aos animais tratados com o fármaco referência (Glucantime®). Ao término do tratamento, os animais foram mortos, os tecidos das patas e linfonodos foram coletados para recuperação de amastigotas e quantificação de citocinas e nitritos nos sobrenadantes destes tecidos. No macerado do linfonodo, no grupo tratado com PLA2-asp49-liposomal observou-se redução da carga parasitária de 73,5%, comparado com o grupo controle. Ainda nessa comparação, no macerado do tecido da pata houve redução de 57,12% dos números de amatigotas transfomadas para promastigotas. Os grupos infectados e tratados com PLA2-Asp49-lipossomal apresentaram aumentos significativos, respectivamente, nos tecidos dos linfonodos e patas, nos níveis de IL-12 (1.200 e 400 pg/mL), fator de necrose tumoral (TNF-α) (50 e 100 pg/mL), e de nitritos (32 e 36 μM), quando comparados aos grupos infectados e sem tratamento. Os resultados sugerem que o sistema lipossomal contendo PLA2-Asp-49 é uma ferramenta biotecnológica promissora para conferir atividade antileishmania a macrófagos infectados, aumentando seus mecanismos celulares microbicidas e auxiliando para o estabelecimento de uma resposta imunológica mais eficiente.

nÃo hà / A serpente Bothrops neuwiedi possui veneno que tem aÃÃo principalmente do tipo prÃ-coagulante, hemorrÃgica e proteolÃtica. O veneno da Bothrops neuwiedi quando inoculado, possui aÃÃo primariamente local e secundariamente sistÃmica. Os efeitos sistÃmicos do envenenamento compreendem alteraÃÃes em diferentes sistemas como: hematolÃgico, cardiovascular, hepÃtico, urinÃrio, respiratÃrio, imunolÃgico, digestÃrio e nervoso. Os mecanismos que ocasionam tais alteraÃÃes sÃo complexos e os vÃrios componentes tÃxicos dos venenos podem agir direta ou indiretamente nas cÃlulas. Este trabalho teve como objetivo investigar as possÃveis alteraÃÃes hematolÃgicas e histolÃgicas induzidas pelo veneno total e pelas fraÃÃes fosfolipase A2 e lectina C da serpente Bothrops neuwiedi, nos tempos 2, 4, 8, 16 e 24 horas em camundongos Swiss e avaliar as cabenegrinas A-I e A-II na neutralizaÃÃo das atividades biolÃgicas do veneno total da serpente Bothrops neuwiedi analisando seu potencial antiofÃdico para possÃvel complementaÃÃo da soroterapia. Foram estudadas as aÃÃes do veneno total, fosfolipase A2 e lectina C sobre o sistema hematolÃgico, avaliando o hemograma, mielograma e esplenograma em diferentes tempos. O hemograma foi realizado pelo contador de cÃlulas sanguÃneas Sysmex-Roche, modelo KX-21N, o mielograma atravÃs da contagem diferencial e morfolÃgica das cÃlulas da medula Ãssea atravÃs de lÃminas obtidas apÃs citocentrifugaÃÃo (centrÃfuga citolÃgica modelo IncibrÃs) e o esplenograma atravÃs da quantificaÃÃo e morfologia das cÃlulas em âimprintâ do baÃo. ApÃs o estudo hematolÃgico, rins, baÃo, fÃgado e coraÃÃo foram submetidos à anÃlise histolÃgica. Todos os parÃmetros estudados foram analisados pelo teste de ANOVA e pelo teste nÃo-paramÃtrico exato de Kruskal-Wallis, com p< 0,05. Os resultados mostraram que as principais alteraÃÃes quantitativas nas cÃlulas hematolÃgicas com o uso do veneno total e as fraÃÃes lectina C e fosfolipase A2 da serpente Bothops neuwiedi foram: discreto aumento do nÃmero de hemÃcias e no hematÃcrito, leucocitose e plaquetopenia no sangue perifÃrico; aumento das cÃlulas eritrÃides e mielÃides no mielograma e aumento das cÃlulas mielÃides no esplenograma. Estas alteraÃÃes foram mais evidentes nos tempo de duas e quatro horas apÃs o envenenamento. As alteraÃÃes histolÃgicas no baÃo, rins, coraÃÃo e fÃgado, caracterizaram-se principalmente, por congestÃo, edema intersticial, hemorragia, degeneraÃÃo hidrÃpica e processo inflamatÃrio. Quando os animais foram tratados com as cabenegrinas, foi verificado que estas nÃo conseguiram reverter Ãs alteraÃÃes quantitativas das cÃlulas no baÃo provocadas pelo veneno total. PorÃm, as cabenegrinas A-I e A-II em todas as diluiÃÃes utilizadas foram capazes de inibir a plaquetopenia, reduzir o aumento da concentraÃÃo de cÃlulas mielÃides no mielograma e reverter todas as alteraÃÃes histolÃgicas encontradas em todos os ÃrgÃos estudados. TambÃm foi visto que a cabenegrina A-I na diluiÃÃo 2,5:1 e as cabenegrinas A-II nas diluiÃÃes 2,5:1 e 5:1 neutralizaram as alteraÃÃes na contagem diferencial, ou seja, as referidas cabenegrinas diminuÃram o nÃmero de neutrÃfilos segmentados, refletindo tambÃm no nÃmero de neutrÃfilos totais. Estes resultados sugerem que as cabenegrinas A-I e A-II poderÃo no futuro ser utilizadas como coadjuvantes no tratamento do acidente provocado pela serpente Bothrops neuwiedi. / The venom of the Bothrops neuwiedi provokes an action mainly of the hemorrhagic, proteolytic and coagulant type. When inoculated, the venom cause primarily a local action, and secondarily a systemic action. The systemic effects of poisoning include changes in various systems such as hematological, cardiovascular, liver, urinary, respiratory, immune, digestive and nervous. The mechanisms that cause the changes are complex and the various toxic components of the venom may act directly or indirectly on the cells. This study aimed first to investigate possible histological and hematological caused by the whole venom and by the phospholipase A2 and lectin C fractions from Bothrops neuwiedi snake, at 2, 4, 8, 16 and 24 hours intervals in mice, and then evaluate the cabenegrins A-I and A-II in the neutralization of the biological activities of the snake whole venom, analyzing its anti-ophidian potential for possible complementation of serum therapy. We studied the actions of the whole venom and of the phospholipase A2 and lectin C fractions on the hematological system, evaluating the hemogram, the myelogram and the splenogram, at different times. The hemogram was performed by the Sysmex-Roche blood cell counter model KX-21N; the myelogram was performed through the differential and morphological count of bone marrow cells using slides obtained after cytospin (using Cytological Centrifuge model IncibrÃs); and the splenogram, by quantifying and morphology of the cells in "imprint" of the spleen. After the hematological study, the kidneys, spleen, liver and heart were subjected to histological analysis. All studied parameters were analyzed by the ANOVA test and by the nonparametric Kruskal-Wallis exact test, with p<0.05. The results showed that main quantitative changes in the hematological cells, using the whole venom and the phospholipase A2 and lectin C fractions were: slight increase in erythrocytes and hematocrit, leukocytosis and thrombocytopenia, with repercussion in the peripheral blood; increase of erythroid and myeloid cells in myelogram and increase in myeloid cells in the splenogram. These changes were more evident two and four hours after the poisoning. The histological changes in the kidneys, spleen, liver and heart were characterized mainly by congestion, interstitial edema, hemorrhage, hydropicdegeneration and inflammatory process. When animals were treated with cabenegrins it was detected that these could not revert the quantitative changes of the spleen cells caused by the whole venom. However, all dilutions of cabenegrins AI and A-II were able to inhibit the thrombocytopenia and the increase of myeloid cells in the myelogram, and reverse all the histological changes found in all the studied organs. The treatment with cabenegrins also showed that the cabenegrins A-I (in the 2.5:1 dilution) and the cabenegrins A-II (in the 2.5:1 and 5:1 dilutions) neutralized the changes in the differential count, i.e., these cabenegrins decreased the number of segmented neutrophils, reflecting in the total number of neutrophils. These results suggest that the cabenegrins AI and A-II may be used in the future as an adjunctive treatment of treatment of snake accidents caused by Bothrops neuwiedi.

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Huaco_FrankDenisTorres_D.pdf: 4738657 bytes, checksum: 14194646f90e694d6d1598ef9b7fc870 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Neste trabalho descrevemos a purificação, caracterização estrutural e os efeitos locais e sistêmicos de uma nova metaloprotease de baixa massa molecular, denominada BtaHF (Bothriopsis taeniata Hemorrhagic Factor). A proteína foi purificada a partir do veneno total da serpente Bothriopsis taeniata usando cromatografía exclusão molecular convencional (Sephadex G-75), seguida de uma cromatografia de alta eficiência de troca iônica (coluna DEAE 8HR APMinicolumn). A nova metaloprotease BtaHF apresenta um alto grau de pureza e homogeneidade molecular e possui uma massa molecular de 25968,16 Da. A BtaHF apresentou atividade caseinolítica com uma temperatura e pH ótimos de 37-40 oC e 8, respectivamente. A atividade caseinolítica da BtaHF foi inibida por EGTA, EDTA e DTT, mas os inibidores PMSF e SBTI não apresentaram efeito. O íon Ca+2 é importante para a estabilidade da metaloprotease BaHF, aumentando atividade caseinolítica da enzima, entretanto, os íons Zn+2 e Mn+2 inibem a atividade enzimática desta enzima. A BtaHF é uma enzima ?-fibrinogênolítica por degradar rapidamente à cadeia A do fibrinogênio após 15 minutos de incubação, enquanto a cadeia B? é completamente degradada após 6 horas. Por outro lado, a BtaHF não possui atividade fibrinolítica ou arginine amidase. A análise de composição de aminoácidos mostrou que a BtaHF possui caráter ácido e apresenta 6 resíduos de cisteína. No estudo de homologia a BtaHF apresentou maior identidade sequencial com metaloproteases com atividade hemorrágica da classe P-I como a BaP1 (Bothrops asper). A metaloprotease BtaHF possui atividade hemorrágica fraca com uma dose hemorrágica mínima de 20,14 ?g/animal. Esta metaloprotease mostrou atividade edematogênica que mostrou ser dose-dependente e teve um efeito permaneceu após 6 horas de injeção. Ambos os efeitos estão relacionados à atividade proteolítica e ao correto enovelamento da BtaHF, una vez que foram inibidas por agentes quelantes (EDTA e EGTA) e redutor (DTT). A metaloprotease BtaHF não possui atividade miotóxica, embora tenha atividade citotóxica em fibroblastos C2C12. A análise histológica do músculo gastrocnêmio de camundongo confirmou a atividade hemorrágica e edematogênica da metaloprotease, assim como, a ausência de atividade miotoxica. A metaloprotease BtaHF produz efeitos sistêmicos específicos quando injetado via endovenosa em camundongos. A nível do tecido pulmonar, a toxina produz alteração da estrutura alveolar com hemorragia significativa, engrossamento dos septos alveolares e inflamação. A BtaHF não produz hemorragia no tecido renal, mas alterou a estrutura glomerular, além de alterações no citoplasma das células dos túbulos proximal e distal. Contrariamente, esta toxina não produz efeito nenhum a nível hepático. A BtaHF consome o fibrinogênio plasmático de modo dose e tempo-dependente, produzindo incoagulabilidade sanguínea após uma hora. Estudos in vitro revelaram atividade pro-coagulante dose-dependente, ao reduzir os índices PT e APPT. A utilização de metodologias de purificação de alta eficiência permitram a purificação da metaloprotease BtaHF. Assim, esta abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo deduzir o papel desenvolvido pela metaloprotease purificada nos efeitos biológicos produzidos pelo veneno total de Botriopsis taeniata. As informações produzidas no presente trabalho permitiram sugerir que as principais funções das metaloproteases de veneno de serpente da classe P-I são manter a hemorragia característica dos envenenamentos botrópicos e participar da imobilização da presa promovendo rápidos efeitos próinflamatórios / Abstract: In this work we described the purification, structural characterization and the local and systemic effects of a new low molecular weight snake venom metalloproteinase, named BtaHF. This protein was purified from the Bothriopsis taeniata crude venom combining conventional molecular exclusion (Sephadex G-75 column) followed by an ion exchange (DEAE 8HR APMinicolumn) chromatography on a HPLC system. The new metalloproteinase BtaHF showed a high degree of purity and molecular homogeneity with a molecular mass of 25968.16 Da. BtaHF showed caseinolytic activity with an optimum temperature and pH of 37-40 °C and 8, respectively. The caseinolytic activity was inhibited by EGTA, EDTA and DTT, but PMSF and SBT-I did not show inhibitory effect. The Ca+2 ion shown to be important for protein stability enhancing its caseinolytic activity, on the contrary, Z+2 and Mn+2 showed inhibitory effects upon the enzymatic activity of this protein. The metalloproteinase BtaHF is an ?-fibrigenolytic enzyme, rapidly degraded fibrinogen A? chain within 15 minutes, while fibrinogen B? chain is degraded after 6 hours. This enzyme did not show fibrinolytic or arginine amidase activities BtaHF is an acidic protein due the mayor proportion of acidic amino acid in its amino acid composition with 6 cysteinyl residues. By the homology study BtaHF share a high sequence identity other weakly hemorrhagic P-I class SVMP such BaP1 isolated from Bothrops asper snake venom This new metalloproteinase, BtaHF, have a weak hemorrhagic with a minimum hemorrhagic dose of 20.14 ?g. Also, this metalloproteinase showed dose-dependent paw edemaforming activity, this effect remain six hours after inoculation. Both hemorrhage and edemaforming activities were related to the enzymatic activity and correct fold of BtaHF, since chelating (EDTA and EGTA) and reducing (DTT) agents inhibited these activities. On the other hand, this enzyme did not show miotoxic activity, although, showed citotoxic activity on C2C12 fibroblast. Histological analysis of mice gastrocnemius muscle confirmed that the metalloproteinase produce local hemorrhage and pro-inflammatory effects, as well as, the absence of miotoxic activity. This metalloproteinase, BtaHF, produce specific systemic effects when injected endovenously in mice. On lung tissue level these toxin produce alteration of alveolus structure with significant hemorrhage, thickness of alveolus septum and inflammation. On renal tissue BtaHF did not produce hemorrhage, but, was observe alteration of glomerulus structure, along with cytoplasmatic alterations of distal and proximal tubulus cells. On the other hand, were not observed any alterations on hepatic tissue. BtaHF deplete completely plasma fibrinogen levels in a time and dose-depended manner, reaching blood incoagulability after one hour. BtaHF shown dose-dependent pro-coagulant activity "ex vivo" reducing PT and APPT index. The metalloproteinase BtaHF was purified using a high efficient system. Thus, this approach can be applied to biochemical, structure-function, physiologic and pharmacologyc studies which allow infer the role of this enzyme in the biological effects produce by Bothriopsis taeniata crude venom. The information here presented suggest that the mainly functions of P-I class snake venom metalloproteinases are the maintenance of the characteristic hemorrhagic effect of the botropic venoms and participate of prey immobilization by promoting rapid inflammatory effects / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Stephen Hyslop / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T08:32:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_KiaraCarolina_D.pdf: 27750375 bytes, checksum: a1ca027909bfd58421b986e75bfcd515 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O estudo do transcriptoma de bibliotecas de cDNA da glândula venenífera de serpentes, realizado a partir da análise de ESTs (expressed sequence tags), tem se mostrado útil na identificação de genes expressos neste tecido, inclusive no gênero Bothrops, responsável pela maioria dos acidentes ofídicos no Brasil. Neste trabalho utilizamos uma abordagem transcriptômica para analisar a composição gênica da glândula venenífera da serpente Bothrops alternatus, uma espécie encontrada no sudeste e sul do Brasil, Uruguai, norte da Argentina e leste do Paraguai. Também clonamos e caracterizamos parcialmente a enzima dipeptidilpeptidase IV (DPP IV), uma enzima que cliva peptídeos com prolina ou alanina na penúltima posição em sua porção N-terminal e que tem sido detectada em diversas peçonhas ofídicas. A construção de bibliotecas de cDNA usando métodos convencionais de clonagem, sequenciamento e análise bioinformática resultou em 5,350 ESTs que foram reunidas em 838 contigs and 4512 singletons. Pesquisas a partir de bancos de dados relevantes (BLAST) mostraram 30% de hits e 70% no-hits. Os transcritos relacionados a toxinas correspondem a 23% do total de transcritos e 78% dos hits, respectivamente. A análise por ontologia gênica (GO) detectou genes relacionados ao metabolismo geral, transcrição, tradução, processamento, degradação de polipeptídeos, funções estruturais, e regulação celular. Os principais grupos de toxinas identificados foram metaloproteinases (81%), peptídeos potenciadores da bradicinina/peptídeos natriuréticos do tipo C (8,8%), fosfolipases 'A IND. 2' ('PLA IND. 2'; 5,6%), serinoproteinases (1.9%) e lectinas do tipo C (1,5%). As metaloproteinases eram quase queexclusivamente da classe PIII, com poucas da classe PII e nenhuma da classe PI. As 'PLA IND. 2' eram todas ácidas; nenhuma 'PLA IND. 2' básica foi detectada. Outras toxinas encontradas incluíram a L-aminoácido oxidase, proteínas secretadas ricas em cisteína, DPP IV, hialuronidase, toxinas three-finger e ohanina. Foram identificadas duas proteínas não-tóxicas, a tioredoxina e a Dusp6 (fosfatase de dupla especificidade) que mostraram alto grau de similaridade a proteínas semelhantes de outras serpentes. Também foram observados polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs - single-nucleotide polymorphisms), microssatélites, transposons e repetições invertidas, todos os quais podem contribuir de alguma forma para a multiplicidade de toxinas na glândula. Estes resultados mostram que a glândula venenífera de B. alternatus possui as principais classes de toxinas encontradas em estudos transcriptômicos e proteômicos de outras espécies botrópicas. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Transcriptomic studies of snake venom gland cDNA based on the analysis of expressed sequence tags (ESTs) have been useful in identifying the genes expressed in this organ in a variety of species, including the genus Bothrops, which is responsible for most venomous snakebites in Brazil. In this work, we used a transcriptomic approach to analyze the gene composition of the venom gland of Bothrops alternatus (urutu), a species found in southeastern and southern Brazil, Uruguay, northern Argentina e eastern Paraguay. We also cloned and partially characterized dipeptidylpeptidase IV (DPP IV), an enzyme that cleaves peptides with proline or alanine as the penultimate residue in the N-terminal region and has been identified in several snake venoms. A cDNA library constructed using conventional methods of cloning, sequencing and bioinformatic analysis yielded 5,350 ESTs that formed 838 contigs and 4512 singletons. Databank BLAST searches yielded 30% hits and 70% no-hits. Toxin-related transcripts accounted for 23% of the total transcripts and 78% of the hits. Gene ontology analysis detected genes related to general metabolism, transcription, translation, processing, polypeptide degradation, structural functions and cellular regulation. The main toxin groups identified were metalloproteinases (81%), bradykinin-potentiating peptides/C-type natriuretic peptides (8.8%), phospholipases 'A IND. 2' ('PLA IND. 2'; 5.6%), serine proteinases (1.9%) and C-type lectins (1.5%). Metalloproteinases were almost exclusively class PIII, with few class PII and no class PI enzymes. The 'PLA IND. 2' were all acidic; no basic 'PLA IND. 2' were detected. Other toxins identified included L-amino acid oxidase, cysteine-rich secretory proteins, DPP IV, hyaluronidase, three-finger toxins and ohanin. Two non-toxic proteins, thioredoxin and a dual specificity phosphatase (Dusp6), shared high sequence homology with similar proteins from other snakes. Single-nucleotide polymorphisms (SNPs), microsatellites, transposons and inverted repeats were also observed and may contribute to the toxin diversity of the gland. These results show that the venom gland of B. alternatus contains the major toxin classes identified in transcriptomic and proteomic studies of other Bothrops species. The predominance of class PIII metalloproteinases agrees with the hemorrhagic activity of this venom, while the low content of serine proteinases and C-type lectins could account for the less intense coagulopathy observed after envenoming by this species. The lack of basic 'PLA IND. 2' agrees with the lower myotoxicity of this venom compared to other Bothrops species. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia