Résumé : Il est généralement admis que les cassures double-brin (CDB) de l’ADN sont parmi les lésions les plus toxiques induites par les radiations ionisantes (RI). Les CDBs non ou mal réparées peuvent conduire à une instabilité génomique et à la mort cellulaire. La chimioradiothérapie concomitante est l’une des modalités la plus efficace pour le traitement de certains cancers surtout en stade avancé. Le rendement des CDBs a augmenté quand l’ADN a été irradié en présence de cisplatine avec des électrons de basse énergie (EBEs). Notre étude a pour objectif de réévaluer la contribution des CDBs et d’autres lésions induites par les RI dans la létalité cellulaire. L'effet des RI sur la fonctionnalité de l’ADN plasmidique modifié ou non de façon covalente par le cisplatine a été étudié par mesure de l'efficacité de transformation du plasmide dans E. coli. Les complexes cisplatine-ADN ont été préparés de telle sorte qu’il y avait en moyenne deux adduits de cisplatine par plasmide tel que mesuré par ICP-MS. Nos échantillons ont été irradiés en solution avec des doses croissantes de rayonnements gamma (137Cs). La présence de cisplatine a augmenté la formation des CDBs par un facteur de 2.6 par comparaison avec l'ADN non modifié. Malgré cette augmentation, le rendement des CDBs reste très faible et ne peut pas expliquer la perte de fonctionnalité observée. Alors que, les dommages multiples localisés (LMDS) (non-DSB cluster damage) donnant naissance à des CDBs sous l’action des enzymes de réparation la formamidopyrimidine [fapy]-DNA glycosylase (Fpg) et l’endonuclease III (Nth) où leur rendement a été augmenté d’un facteur de 2.1 lorsque l’ADN a été irradié en présence de cisplatine, ont pu expliquer la perte de fonctionnalité observée. Ces résultats suggèrent que le cisplatine peut agir, non seulement comme un agent chimiothérapeutique, mais aussi comme un radiosensibilisateur efficace par addition d’autres lésions à l’ADN. Aussi, pour la première fois nous avons pu évaluer l’effet des EBEs sur la létalité cellulaire. Des films d'ADN ont été préparés en utilisant la méthode d’adsorption douce sur un substrat de graphite pyrolytique, en présence de 1,3- diaminopropane (Dap[indice supérieur]2+) et ont été irradiées avec des EBEs 10 eV. Nous avons pu conclure, qu’en plus des CSBs, CDBs et des dommages de base, les EBEs sont capables aussi d’induire des LMDS (non-DSB cluster damage) et induire la perte de fonctionnalité de l’ADN. Le rendement des CDBs est très faible d’où ils n’ont pas pu expliquer la perte de fonctionnalité de plasmide observée, après irradiation avec les EBEs. Le rendement très faible des LMDS (non-DSB cluster damage) ne peut pas expliquer la perte de fonctionnalité de l’ADN. Il semble que les EBEs sont capables d’induire des dommages très proches les uns des autres et qui ne peuvent pas être révélés par les enzymes de réparation Fpg et Nth. Plus les dommages sont proches les uns des autres, plus leur réparation est difficile, car une de ces lésions peut inhiber la réparation de l’autre la plus proche. // Abstract : It is generally accepted that DNA double-strand breaks (DSB) are among the most toxic lesions induced by ionizing radiation (IR). Unrepaired or misrepaired DSB can lead to genomic instability and cell death. It is known that concomitant chemoradiation therapy is one of the most preferred methods for the treatment of certain cancers especially in advanced stage. The yield of DSBs was increased when DNA was irradiated with low energy electron (LEEs). The aims of our study was to reassess the contribution of DSBs and other lesions induced by indirect and direct effect of IR in cell lethality. The effect of IR on the DNA functionality of the plasmid modified covalently with cisplatin was studied by measuring the transformation efficiency of the plasmid in E. coli. Cisplatin-DNA complexes were prepared such that there was an average of two cisplatin adducts per plasmid as measured by ICP-MS. Aqueous solutions of the samples were irradiated with 137Cs [gamma]-rays at various doses. Gel electrophoresis analysis shows that cisplatin enhances, by a factor of 2.6, the formation of DSB by [gamma]-rays relative to those in unmodified DNA. Despite this increase, the yield of DSBs is very low and cannot explain the loss of functionality observed after transformation with plasmids modified with cisplatin. While locally multiple damaged sites (LMDS) revealed by repair enzymes Fpg (Formamidopyrimidine [fapy]-DNA glycosylase) and Nth (Endonuclease III) as DSB (nonDSB cluster damage), where their yield was increased by a factor of 2.1 when DNA was irradiated in the presence of cisplatin were able to explain the observed loss of DNA functionality. These results suggest that cisplatin may act not only as a chemotherapeutic agent, but also as an effective radiosensitizer by addition of other DNA lesions. For the first time, we could also evaluate the effect of low energy electrons (LEEs) on DNA functionality. Highly ordered DNA films were prepared on pyrolytic graphite by molecular self-assembly using 1,3-diaminopropane ions (Dap[superscript]2+) to bind together the plasmids and irradiated with LEE (10 eV). We concluded that in addition to CSBs, DSBs and base damage, LEEs induced the formation of non-DSB cluster damage and also induced the loss of DNA functionality under LEE irradiation. The yields of DSBs and of non-DSB cluster damage are too low and so one unable to explain the loss of DNA functionality. It seems that LEEs are able to induce a high complex damage that cannot be revealed by repair enzymes Fpg and Nth. The high complex damage is difficult to repair possibly because the repair of one lesion, may inhibit the repair of another.

Le maintien de la stabilité du génome est essentiel pour la propagation de l’information génétique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possèdent des systèmes de prévention des dommages et des réarrangements de l’ADN et nos connaissances sur ces processus découlent principalement de l’étude des génomes bactériens et nucléaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systèmes de protection des génomes d’organelles. Cette étude révèle l’importance des protéines liant l’ADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilité du génome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. L’absence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molécules rearrangées produites par recombinaison non-homologue médiée par des régions de microhomologie. Ce mécanisme est similaire au “microhomology-mediated break-induced replication” (MMBIR) retrouvé chez les bactéries, la levure et l’humain. Nous montrons également que les organelles de plantes peuvent réparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La délétion de différents membres de la famille Whirly entraîne une accumulation importante de réarrangements dans le génome des organelles suite à l’induction de bris double-brin. Ces résultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la réparation fidèle des génomes d’organelles. En se basant sur des données biologiques et structurales, nous proposons un modèle où les Whirlies modulent la disponibilité de l’ADN simple-brin, régulant ainsi le choix des voies de réparation et permettant le maintien de la stabilité du génome des organelles. Les divers aspects de ce modèle seront testés au cours d’expériences futures ce qui mènera à une meilleure compréhension du maintien de la stabilité du génome des organelles. / Maintenance of genome stability is essential for the accurate propagation of genetic information and for cell growth and survival. Organisms have therefore developed efficient strategies to prevent DNA lesions and rearrangements. Much of the information concerning these strategies has been obtained through the study of bacterial and nuclear genomes. Comparatively little is known about how organelle genomes maintain a stable structure. This study implicates the single-stranded nucleic acid-binding proteins of the Whirly family in the maintenance of plant organelle genome stability. Here we report that the plastid-localized single-stranded DNA binding proteins of the Whirly family are required for plastid genome stability in Arabidopsis thaliana and Zea mays. Absence of plastidial Whirlies favors the accumulation of rearranged molecules that arise through a non-homologous recombination mechanism mediated by regions of microhomology. This mechanism is similar to the microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) described in bacteria, yeast and humans. Additionally we show that plant organelles can repair double-strand breaks using a MMBIR-like pathway. Plants lacking Whirly proteins accumulate elevated levels of microhomology-mediated DNA rearrangements upon double-strand break induction, indicating that Whirlies also contribute to the accurate repair of plant organelle genomes. Using biological and structural data, we propose a working model in which Whirlies modulate the access of repair proteins and complementary DNA to single-stranded regions, thereby regulating the choice of repair pathways and maintaining plant organelle genome stability. The various aspects of this model will be tested in future experiments which should allow a better understanding of the mechanisms underlying genome stability in plant organelles.

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA1-Associated Protein1) is a nuclear member of the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) family, previously isolated for promoting the function of the tumor suppressor BRCA1. Importantly, homozygous inactivating mutations of BAP1 have been found in mesothelioma, renal, melanoma and breast cancers strongly suggesting that this deubiquitinase is a tumor suppressor. Indeed BAP1 overexpression reduces cell proliferation and tumor growth in xenograft models. Nonetheless, the biological function and the mechanism of action of this deubiquitinase remain poorly defined. The goals of this thesis are to characterize the biological function of BAP1 and to reveal the molecular basis of its tumor suppressive function. To provide insights into BAP1 biological function, we conducted a tandem affinity immunopurification of BAP1-associated proteins and found that most interacting partners are transcription factors and cofactors. Next, we demonstrated that BAP1 is indeed a transcription regulator. Concomitantly, another group showed that the drosophila BAP1, Calypso, is a Polycomb Group protein that regulates the ubiquitination levels of H2A and gene expression. Indeed, our global gene expression analysis suggests that BAP1 plays important role in DNA damage response. Consistently, loss- and gain- of function experiments (RNAi approach, DT40 chicken B cells KO model and re-introduction of BAP1 in BAP1 null-cells) revealed that BAP1 promotes homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Our data suggest that BAP1 exerts its tumor suppressor function by controlling error-free DNA repair by homologous recombination. Thus, in a situation of BAP1 inactivation, cells might become more reliant on non-homologous end joining, an error-prone DNA repair mechanism, which would result in the accumulation of mutations and chromosomal aberrations, causing genomic instability. Further studies are required to delineate the exact role of BAP1 in transcription and to define how deregulation of H2A ubiquitination pathway contributes to cancer. Defining the mechanisms of tumor suppression is of great interest, not only for understanding cancer development, but also for designing rational cancer therapies.

Chez les plantes, le génome plastidique est continuellement exposé à divers stress mutagènes, tels l’oxydation des bases et le blocage des fourches de réplication. Étonnamment, malgré ces menaces, le génome du plastide est reconnu pour être très stable, sa stabilité dépassant même celle du génome nucléaire. Néanmoins, les mécanismes de réparation de l’ADN et du maintien de la stabilité du génome plastidique sont encore peu connus. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons développé une approche, basée sur l’emploi de la ciprofloxacine, qui nous permet d’induire des bris d’ADN double-brins (DSBs) spécifiquement dans le génome des organelles. En criblant, à l’aide de ce composé, une collection de mutants d’Arabidopsis thaliana déficients pour des protéines du nucléoïde du plastide, nous avons identifié 16 gènes vraisemblablement impliqués dans le maintien de la stabilité génomique de cette organelle. Parmi ces gènes, ceux de la famille Whirly jouent un rôle primordial dans la protection du génome plastidique face aux réarrangements dépendants de séquences de microhomologie. Deux autres familles de gènes codant pour des protéines plastidiques, soit celle des polymérases de types-I et celle des recombinases, semblent davantage impliquées dans les mécanismes conservateurs de réparation des DSBs. Les relations épistatiques entre ces gènes et ceux des Whirly ont permis de définir les bases moléculaires des mécanismes de la réparation dépendante de microhomologies (MHMR) dans le plastide. Nous proposons également que ce type de mécanismes servirait en quelque sorte de roue de secours pour les mécanismes conservateurs de réparation. Finalement, un criblage non-biaisé, utilisant une collection de plus de 50,000 lignées mutantes d’Arabidopsis, a été réalisé. Ce criblage a permis d’établir un lien entre la stabilité génomique et le métabolisme des espèces réactives oxygénées (ROS). En effet, la plupart des gènes identifiés lors de ce criblage sont impliqués dans la photosynthèse et la détoxification des ROS. Globalement, notre étude a permis d’élargir notre compréhension des mécanismes du maintien de la stabilité génomique dans le plastide et de mieux comprendre l’importance de ces processus. / The plant plastidial genome is constantly threatened by many mutagenic stresses, such as base oxidation and replication fork stalling. Despite these threats, the plastid genome has long been known to be more stable than the nuclear genome, suggesting that alterations of its structure would have dramatic consequences on plant fitness. At the moment, little is known about the genes and the pathways allowing such conservation of the organelle genome sequences. To gain insight into these mechanisms, we developed an assay which uses ciprofloxacin, a gyrase inhibitor, to generate DNA double-strand breaks (DSBs) exclusively in plant organelles. By screening mutants deficient for proteins composing the plastid nucleoid on ciprofloxacin, we were able to identify 16 candidate genes, most likely involved in the repair of DSBs in plastid. Among these genes, those of the Whirly family of single-stranded DNA binding proteins are shown to be key factors in protecting the genome from error-prone microhomology mediated repair (MHMR). Two other family of proteins, the plastid type-I polymerases and the plastid recombinases, seem to be involved in the conservative repair pathways. The evaluation of the epistatic relationship between those two genes and the Whirly genes led us to define the molecular basis of MHMR and to propose that they might act as a backup system for conservative repair pathways. Finally, a non-biased screen, using 50,000 different insertion lines, allowed the identification of numerous genes that were already associated with ROS homeostasis, suggesting a link between DNA repair and ROS imbalance. Globally, our study shed light on the mechanisms that allow the maintenance of plastid genome, while explaining the importance of such conservation of the plastid genome.

Dans les cellules eucaryotes, les cassures double-brin sont réparée selon deux voies principales : la recombinaison homologue et la jonction des extrémités non homologues, toutes deux bien connues dans la littérature. Cependant quelques zones d'ombres persistent quant à deux aspects singuliers de leur mise en œuvre :- Si ces deux mécanismes peuvent opérer dans les cellules, quels sont les déterminismes qui président au choix d'une voie de réparation plutôt que de l'autre ?- Dans le cas où les cassures double-brin sont induites dans l'ADN par des rayonnements ionisants – comme ceux employés en radiothérapie anticancéreuse – coment s'opère la réparation lorsque les extrémités générées ne sont pas compatibles avec une ligation immédiate ? Connaître les protéines impliquées dans ce cas permettrait d'élaborer des adjuvants à la thérapie anticancéreuse.Afin de contribuer à répondre à ces questionnements, nous avons voulu élaborer un système analytique intégré qui permît 1) le recrutement spécifique de complexes de réparation des cassures double-brin de l'ADN sur des phases chromatographiques constituées au laboration, 2) la résolution de ces complexes sur gel d'acrylamide non-dénaturants et leur visualisation et 3) la caractérisation biochimique fine des complexes séparés. La méthodologie élaborée au cours de cette thèse a concerné chacun des trois points ci-dessous : 1) nous avons conçu et mis en œuvre un système chromatographique nous permettant de distinguer les protéines recrutées spécifiquement sur des oligonucléotides duplexes d'ADN dotés d'extrémités libres de l'ADN (mimant des cassures double-brin) des autres protéines se fixant sur la séquence interne des oligonucléotides ; 2) nous avons adapté à notre problématique une méthodologie d'électrophorèse non-dénaturante permettant la résolution des complexes purifiés tout en garantissant leur intégrité au cours de la migration ; 3) grâce à la visualisation directe des complexes résolus dans le gel, nous avons pu déterminer leur composition en protéines par spectrométrie de masse.L'étude biochimique des complexes purifiés a démontré que les complexes purifiés étaient fonctionnels, c'est à dire capable de liguer deux oligonucléotides entre eux. La fouille des données de spectrométrie de masse, obtenues à partir d'un grand nombre d'expériences indépendantes, nous a permis de montrer qu'ils étaient de la physiologie de l'ADN et particulièrement représentatifs de la diversité des mécanismes de réparation.De manière intéressante, nous avons pu observer que certaines protéines recrutées spécifiquement sur les mimes de cassures double-brin de l'ADN, ne sont pourtant pas connues pour intervenir dans les processus de réponse aux dommages de l'ADN (synthèse de nucléotides, checkpoint, topologie de l'ADN, cytosquelette).Le rôle des protéines évoquées ci-dessus sera prochainement caractérisé in cellulo notamment avec des stratégies de type RNAi. D'autre part, nous utiliserons les développements méthodologiques décrits ci-dessus pour étudier les mécanismes de réparation des cassures double-brin radio-induites, tels qu'ils sont mis en jeu dans les cellules tumorales en constituants de nouvelles phases chromatographiques avec des oligonucléotides irradiés. / In eucaryotic cells, DNA double-strand breaks are repaired through two main pathways : the homologous recombination and the non homologous end joining . Altough these pathways are well characterized, two particular aspects of the repair remain poorly understood :- If two separated pathways may occur in the cells, which mechanism(s) govern the choice of the pathway that will ultimately lead to the repair ?- If the double-strand break is induced by ionizing radiations – as those employed in anti-cancerous radiotherapy – how does the repair occur if the DNA ends at the edge of the break are not compatible with a direct ligation ? A proper knowledge of the proteins involved in this repair would allow the development of additives, useful to increase the efficiency of the radiotherapy.To investigate these questions, we designed a new analytical system allowing : 1) the specific recruitment of DNA double-strand break repair complexes on home-made chromatographic phases, 2) the separation of these complexes in a non-denaturing polyacrylamide gel and their subsequent visualization and 3) their biochemical characterization.The methodology developped in this work has been focused on the following points : 1) we designed and implemented a chromatographic system allowing the distinction between proteins recruited onto duplex DNA oligonucleotide with free DNA ends (mimicking DNA double-strand breaks) and proteins fixed onto the internal sequence of the same oligonucleotides ; 2) we adapted to our problematic a methodology of non-denaturing electrophoresis thus allowing the separation of the purified complexes while guaranteeing their integrity during the migration, 3) we also determined their composition by mass spectrometry after their visualization.The biochemical study has shown that the purified complexes were still functionnal, that is they were able to efficiently ligate two oligonucleotides. The study of the data provided by the mass spectrometry analysis of independant experiences proved that the complexes belonged to the DNA physiology and were especially representative of the diversity of the DNA repair pathways.Interestingly, we observed that some of the protein specifically recruited onto the the double-strand breaks were not known to be involved in the DNA repair (nucleotide synthesis, checkpoint, DNA topology, cytoskeleton).The rôle of these proteins should be characterized in cellulo especially with siRNA. On the other hand we will also use the methodological development described above to study the repair mechanisms of radio-induced DNA double-strand breaks occuring in the irradiated tumorous cells. To achieve this study we will elaborate new chromatographic phases with pre-irradiated oligonucleotides.

L’élimination programmée d’ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l’introduction de cassures double brin (CDB) de l’ADN et la préservation de l’intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l’introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l’excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l’élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L’implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l’excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n’y a pas de jonctions d’excision formées et les extrémités cassées s’accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L’hypothèse d’une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l’utilisation de microhomologie, a été émise. C’est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d’extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l’ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d’un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l’introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome. / Programmed elimination of germline specific DNA has been described in several eukaryotic organisms. These rearrangements are initiated through introduction of DNA double strand breaks (DSB). To ensure genome integrity, efficient repair is needed. In Paramecium tetraurelia, the genome is widely rearranged during development of a new somatic nucleus after introduction of tens of thousands of DSBs by the domesticated transposase PiggyMac (Pgm)These rearrangements consist in: the precise excision of thousands of unique and non coding sequences called IESs that interrupt 47% of genes in the germline; and the heterogeneous elimination of repeated sequences. It leads to internal deletions of variable sizes or to chromosome fragmentation with telomere addition at DNA ends.Implication of the Non Homologous End Joining Pathway (NHEJ) in precise IES excision has been proved. In cells depleted for Ligase IV or XRCC4, DSBs at IES boundaries are introduced normally but broken DNA ends accumulate without being repaired nor degraded. The repair pathway implicated in heterogeneous rearrangements is still unknown. An hypothesis would be that heterogeneous rearrangements involve a Ku independent alternative NHEJ (alt-NHEJ) pathway characterized by end resection and use of microhomologies. During my thesis I studied the role of Ku proteins in programmed genome rearrangements.Two KU70 genes and three KU80 genes has been identified in the Paramecium genome. KU70a and KU80c are specifically induced during programmed genome rearrangements. Encoded proteins localize in developing somatic nuclei. Gene extinction by RNA interference experiments proved that these genes are necessary for programmed genome rearrangements. At molecular level, non rearranged DNA is amplified in cells depleted for Ku. And more surprisingly, no programmed DSBs are introduced at IES boundaries in these cells.My results indicate that Ku is a part of a pre excision complex with the domesticated transposase Pgm and necessary for the introduction of programmed DSB during programmed genome rearrangements.

Les gènes ING (Inhibitor of Growth) sont des gènes candidats suppresseurs de tumeurs conservés de la Levure à l'Homme. Les protéines ING ont des fonctions suppressives de tumeurs de type I ou « caretaker » car elles participent aux processus de maintien de la stabilité du génome en régulant la réplication et la réparation de l'ADN. Elles ont aussi des fonctions suppressives de tumeurs de type II ou « gatekeeper » puisqu'elles sont impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire de façon dépendante et indépendante de p53 et car elles contrôlent la transcription génique en participant au remodelage de la chromatine. L'objectif de ma thèse est de mieux comprendre l'implication de ING1, ING2 et ING3 dans les voies de suppression des tumeurs. Nos travaux montrent que ING1 est sumoylée sur la lysine 193 principalement par l'E3 SUMO ligase PIAS4, afin de réguler l'ancrage de ING1 sur le promoteur de gènes cibles pour réguler leur transcription. Nous avons aussi décrit pour la première fois l'implication de ING2 et de ING3 dans la réponse aux cassures double brin de l'ADN. Nous montrons que cette fonction est conservée entre ING2, ING3 et leur orthologues, respectivement, Pho23 et Yng2 chez la Levure Saccharomyces cerevisiae. ING2 contrôle l'accumulation de PIAS4 au niveau des sites de dommages et régule la sumoylation de l'E3 ubquitine ligase RNF168, afin de permettre la signalisation et la réparation des cassures double brin de l'ADN. ING3 est nécessaire à l'accumulation de 53BP1 et contrôle la réparation de ces dommages. Ces travaux contribuent donc à une meilleure connaissance du rôle des ING dans les voies de suppression des tumeurs. Ils permettent de mieux comprendre comment ING1 régule la transcription génique et décrivent une nouvelle fonction suppressive de tumeur de type I ou « caretaker » pour ING2 et ING3 dans le maintien de la stabilité du génome. / ING (Inhibitor of Growth) genes are tumor suppressor gene candidates conserved from Yeast to Humans. ING proteins have type I tumor suppressive functions or "caretaker" because they participate in the maintenance of genome stability by regulating DNA replication and repair processes. They have also tumor suppressive functions of type II or "gatekeeper" because they are involved in the regulation of cell proliferation in p53 dependent and independent manners. They also participate in the regulation of gene transcription by regulating chromatin remodeling. The aim of my thesis was to better understand how ING1, ING2 and ING3 are involved in tumor suppressive pathways. Our work shows that ING1 is sumoylated on lysine 193 mainly by the SUMO E3 ligase PIAS4 to regulate ING1 anchoring on target gene promoters to control gene transcription. We have also described the involvement of ING2 and ING3 in the DNA double strand breaks response. We show the conservation of this function between ING2, ING3 and their orthologs, respectively, Pho23 and Yng2 in Yeast Saccharomyces cerevisiae. ING2 controls the accumulation of PIAS4 at DNA damage sites and regulates the sumoylation of the E3 ubiquitin ligase RNF168, to regulate DNA double strand break signaling and repair. ING3 is necessary for the accumulation of 53BP1 and promotes DNA damage repair. This work contributes to a better understanding of the role of ING proteins in tumor suppression. It thus provides new insights of how ING1 regulates gene transcription and emphasizes a new tumor suppressive function of type I or "caretaker" for ING2 and ING3 in the genome stability maintenance.

Les cassures double-brin (DSB) sont des dommages dangereux de l’ADN et représentent un facteur de risque pour la stabilité du génome. Le maintien de l'intégrité du génome est essentiel pour les cellules souches adultes, qui sont responsables de la régénération des tissus endommagés et de l'homéostasie tissulaire tout au long de la vie. La régénération musculaire chez l'adulte repose sur les cellules souches musculaires (cellules satellites, SCs) qui possèdent une remarquable capacité de réparation des DSB, mais dont le mécanisme sous-jacent reste inconnu. Ce projet de thèse consistait à étudier comment la différenciation musculaire est affectée lorsque la réparation des DSB est altérée, et quels sont le(s) mécanisme(s) et les conséquences de ce défaut de réparation sur la régénération musculaire. Au cours de cette étude, il est apparu de façon originale que les facteurs de réparation des DSB peuvent affecter la myogenèse, indépendamment de leur fonction dans la réparation de l'ADN. La présente étude a porté sur le rôle de la protéine kinase dépendante de l'ADN (DNA-PK), un facteur crucial pour la réparation non-homologue des DSBs (NHEJ), au cours de la différenciation musculaire chez la souris. L’étude a ciblé l'activation des SCs et la régénération musculaire in vitro et in vivo et a également abordé la régulation de cette kinase. Le rôle "canonique" de la DNA-PK, et donc du NHEJ, dans les SCs a également été étudié en présence de lésions de l'ADN radio-induites. Le rôle d’ATM, une kinase qui orchestre les réponses cellulaires aux DSB, a également été abordé dans le contexte de la régénération musculaire. Ces résultats confirment la notion émergente du rôle multifonctionnel des protéines de réparation de l’ADN dans d’autres processus physiologiques que la réparation elle-même, ce qui m’a également permis de réaliser une étude bibliographique. Ce travail i) identifie de nouveaux régulateurs de la myogenèse et ii) contribue à la compréhension de la résistance des cellules souches musculaires au stress génotoxique. Ces résultats pourraient avoir des implications dans l'amélioration des thérapies cellulaires de la dysfonction musculaire en agissant sur les régulateurs nouvellement découverts. / DNA double-strand breaks (DSBs) are dangerous DNA damages and a risk factor for genome stability. The maintenance of genome integrity is crucial for adult stem cells that are responsible for regeneration of damaged tissues and tissue homeostasis throughout life. Muscle regeneration in the adult relies on muscle stem cells (satellite cells, SCs) that have a remarkable DSB repair activity, but the underlying mechanism is not known. The aims of the present PhD project were to investigate how muscle differentiation is affected when DSB repair is impaired, and which are the mechanism(s) and the consequences on muscle regeneration. During this study, a novel possibility has arisen, namely that DSB repair factors affects myogenesis independently of their DNA repair activity, suggesting a novel function, not previously anticipated, of these factors. The present study has addressed the role of DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), a crucial factor in non-homologous end-joining (NHEJ) repair of DSBs, in muscle differentiation in the mouse. Studies have targeted SC activation and muscle regeneration in vitro and in vivo and also addressed the regulation of this kinase. In parallel the more “canonical” role of DNA-PK, and thereby of NHEJ, has been investigated in SCs via radiation-induced DNA damage. The role of ATM, a kinase that orchestrates cellular responses to DSBs in muscle regeneration has also been addressed. These results support the emerging notion of multifunctional repair proteins in a variety of physiological processes beyond the repair process itself, on which I have conducted a bibliographical study. This work i) identifies novel regulators of myogenesis, and ii) helps understanding the resistance of muscle stem cells to genotoxic stress. It has potential implications for improving cellular therapies for muscle dysfunction by acting on the newly discovered regulators.

Les « DNA beacons » sont des molécules composées de simple brins d'ADN dont les deux bouts contiennent des bases complémentaires et auxquels on attache un fluorophore et un quencher. Ainsi, ces deux extrémités peuvent s'assembler pour former un bout de double hélice d'ADN que nous appelons « stem », la partie centrale du brin forme alors une sorte de boucle. On appelle cette structure la configuration en « épingle à cheveux ». Un aspect important de cette structure est qu'elle représente des systèmes simples permettant une étude détaillée de l'assemblage/désassemblage de la double hélice d'ADN. Nous avons développé deux modèles différents pour étudier la thermodynamique et la cinétique de ces systèmes. Le premier est un modèle sur réseau inspiré des modèles utilisés pour l'étude des repliements des protéines. Le deuxième est un modèle qui inclut les ingrédients physiques du premier modèle mais sans la contrainte apportée par le réseau. Il combine la théorie des polymères et le modèle de Peyrard-Bishop et Dauxois (PBD) pour la double hélice. Avec cette nouvelle approche, nous sommes capable de comparer quantitativement nos résultats théoriques avec les résultats expérimentaux.

Le maintien de la stabilité du génome est essentiel pour la propagation de l’information génétique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possèdent des systèmes de prévention des dommages et des réarrangements de l’ADN et nos connaissances sur ces processus découlent principalement de l’étude des génomes bactériens et nucléaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systèmes de protection des génomes d’organelles. Cette étude révèle l’importance des protéines liant l’ADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilité du génome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. L’absence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molécules rearrangées produites par recombinaison non-homologue médiée par des régions de microhomologie. Ce mécanisme est similaire au “microhomology-mediated break-induced replication” (MMBIR) retrouvé chez les bactéries, la levure et l’humain. Nous montrons également que les organelles de plantes peuvent réparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La délétion de différents membres de la famille Whirly entraîne une accumulation importante de réarrangements dans le génome des organelles suite à l’induction de bris double-brin. Ces résultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la réparation fidèle des génomes d’organelles. En se basant sur des données biologiques et structurales, nous proposons un modèle où les Whirlies modulent la disponibilité de l’ADN simple-brin, régulant ainsi le choix des voies de réparation et permettant le maintien de la stabilité du génome des organelles. Les divers aspects de ce modèle seront testés au cours d’expériences futures ce qui mènera à une meilleure compréhension du maintien de la stabilité du génome des organelles. / Maintenance of genome stability is essential for the accurate propagation of genetic information and for cell growth and survival. Organisms have therefore developed efficient strategies to prevent DNA lesions and rearrangements. Much of the information concerning these strategies has been obtained through the study of bacterial and nuclear genomes. Comparatively little is known about how organelle genomes maintain a stable structure. This study implicates the single-stranded nucleic acid-binding proteins of the Whirly family in the maintenance of plant organelle genome stability. Here we report that the plastid-localized single-stranded DNA binding proteins of the Whirly family are required for plastid genome stability in Arabidopsis thaliana and Zea mays. Absence of plastidial Whirlies favors the accumulation of rearranged molecules that arise through a non-homologous recombination mechanism mediated by regions of microhomology. This mechanism is similar to the microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) described in bacteria, yeast and humans. Additionally we show that plant organelles can repair double-strand breaks using a MMBIR-like pathway. Plants lacking Whirly proteins accumulate elevated levels of microhomology-mediated DNA rearrangements upon double-strand break induction, indicating that Whirlies also contribute to the accurate repair of plant organelle genomes. Using biological and structural data, we propose a working model in which Whirlies modulate the access of repair proteins and complementary DNA to single-stranded regions, thereby regulating the choice of repair pathways and maintaining plant organelle genome stability. The various aspects of this model will be tested in future experiments which should allow a better understanding of the mechanisms underlying genome stability in plant organelles.