Malignant melanoma is the most lethal skin cancer with no effective therapeutic treatment in its metastatic stages. RAS and PI3K pathways have been shown to play a critical role in melanoma development and progression. In this study, we assessed the in vitro and in vivo inhibition potential of a BRAF inhibitor (Sorafenib, Bayer) and a PI3K/mTOR inhibitor (PI-103, PIramed-Genentech) in primary melanoma cell lines. We used primary cell lines isolated from spontaneous melanomas obtained in the UV induced HGF transgenic melanoma mouse model.Although PI-103 and sorafenib inhibited melanoma in vitro cell proliferation and viability, the inhibition of RAS pathway was more effective. The combination of the two drugs showed a synergistic effect inhibiting RAS and PI3K pathways and in vitro melanoma cell proliferation in a cell line dependent manner. However, the combined treatment of orthotopic xenographs in immunocompetent FVB mice did not cooperate blocking tumor growth. Surprisingly, the in vivo treatment with PI-103 enhanced tumor growth. Our results also revealed that PI-103 caused immunosuppression inducing thymus atrophy and upregulating the intratumoral transcriptional levels of inmunosuppressors. In addition, PI-103 induced the antiapoptotic BH3 family proteins Mcl-1, Bcl-2 and BclXL, which correlated with the lower apoptotic rate observed within the PI-103 treated tumors. These data indicates that due to melanoma heterogeneity, some precautions should be taken when using these inhibitors for treatment. Moreover, these results certainly make an argument for investigating unexpected effects of rational drug combinations on immunocompetent animal models before conducting clinical studies.

Cancer is one of the leading causes of death in countries throughout the world. Increase in the production of Reactive Oxygen Species (ROS) has been implicated in many human disease processes, including aging and carcinogenesis. Detoxification of ROS in the cell is provided by both enzymatic and non-enzymatic systems, which constitute the antioxidant defence systems and is crucial to the survival of organisms. The cancer inhibitory propierties of antioxidant compounds such as polyphenols have been well established in experimental and epidemiological studies, showing the intake of these antioxidants within our diet can carry out an effective protective action toward the oxidative stress created in the body by imbalance between ROS and its endogenous defence mechanism. However, the molecular mechanisms responsibles for these effects are not so well known and more studies are needed to provide clear evidence of their protective effects.The aim of this study is to determine and compare the posible antitumoral properties of several polyphenolic fractions, obtained from the extraction and fractionation of wine by-products consisting of grape skins, seeds and stems. These polyphenolic fractions have high antiradical potential and are mainly composed by flavanol monomers with or without gallate groups, glycosylated flavonols and mostly procyanidin oligomers. The effect of these fractions is analysed on cancer cells at cellular and metabolic levels. Moreover, as solar radiation in the UV range is the major source of adverse reactions in the skin and is one of the most efficient environmental carcinogen known, the possible capacity of these fractions to protect against cellular damage induced by ultraviolet radiation is evaluated and compared. The results obtained in this study let us to confirm the polyphenolic fractions studied are very specific antiproliferative agents with very low cytotoxicity to non-proliferative normal cells, such as peripherial blood lymphocites (PBLs). Moreover, treatment with these fractions results in intracellular metabolic changes, restricting the ability of tumoral cells to proliferate and inhibiting glycolysis, being higher for the fraction rich in ECG containing oligomeric flavanols.Like for the study of antitumoral effect at cellular and metabolic levels, the results obtained in the analysis of the protective capacity of these polyphenolic fractions against UV-induced damage, confirm them as potential natural chemopreventive agents. Briefly, the results obtained in this study let us to conclude the polyphenolic fractions rich in procyanidin oligomers and gallate esters are the most efficient as antitumoral agents, active at both cellular and metabolic levels with low cytotoxicity. Additionally, polymerization and percentge of galloylation are also important in the efficacy of the polyphenolic fractions as protectors against damage induced by ultraviolet radiation, suggesting they may be useful for the prevention and treatment of a variety of solar UV light-induced human skin disorders.

The cell is governed by the complex interactions among various types of biomolecules. Coupled with environmental factors, variations in DNA can cause alterations in normal gene function and lead to a disease condition. Often, such disease phenotypes involve coordinated dysregulation of multiple genes that implicate inter-connected pathways. Towards a better understanding and characterization of mechanisms underlying human diseases, here, I present GUILD, a network-based disease-gene prioritization framework. GUILD associates genes with diseases using the global topology of the protein-protein interaction network and an initial set of genes known to be implicated in the disease. Furthermore, I investigate the mechanistic relationships between disease-genes and explain the robustness emerging from these relationships. I also introduce GUILDify, an online and user-friendly tool which prioritizes genes for their association to any user-provided phenotype. Finally, I describe current state-of-the-art systems-biology approaches where network modeling has helped extending our view on diseases such as cancer. / La cèl•lula es regeix per interaccions complexes entre diferents tipus de biomolècules. Juntament amb factors ambientals, variacions en el DNA poden causar alteracions en la funció normal dels gens i provocar malalties. Sovint, aquests fenotips de malaltia involucren una desregulació coordinada de múltiples gens implicats en vies interconnectades. Per tal de comprendre i caracteritzar millor els mecanismes subjacents en malalties humanes, en aquesta tesis presento el programa GUILD, una plataforma que prioritza gens relacionats amb una malaltia en concret fent us de la topologia de xarxe. A partir d’un conjunt conegut de gens implicats en una malaltia, GUILD associa altres gens amb la malaltia mitjancant la topologia global de la xarxa d’interaccions de proteïnes. A més a més, analitzo les relacions mecanístiques entre gens associats a malalties i explico la robustesa es desprèn d’aquesta anàlisi. També presento GUILDify, un servidor web de fácil ús per la priorització de gens i la seva associació a un determinat fenotip. Finalment, descric els mètodes més recents en què el model•latge de xarxes ha ajudat extendre el coneixement sobre malalties complexes, com per exemple a càncer.

INTRODUCCIÓEls tumors malignes són la primera causa de mort als països desenvolupats. El càncer colorectal (CCR) és la neoplàsia del tub digestiu més freqüent. Es diagnostiquen 20.000 nous casos de CCR a Espanya a l'any, i afecta a un de cada 10.000 espanyols. Mostra una incidència creixent i suposa el 15% dels nous diagnòstics de càncer. Els esforços investigadors es centren en la prevenció i cerca de noves possibilitats terapèutiques.Sembla evident el paper què els processos de proliferació, diferenciació i destrucció cel·lular juguen en el desenvolupament de les neoplàsies i en el disseny de futures estratègies diagnòstiques i terapèutiques. Pocs articles en la literatura han demostrat interès per l'estudi de la proliferació cel·lular i la mort cel·lular programada de les lesions preneoplàsiques del còlon.En la última dècada alguns treballs han investigat el paper que diversos oncogens, gens supressors de tumor, marcadors de proliferació cel·lular i inhibidors de la mateixa juguen en el desenvolupament de lesions canceroses a partir d'un pòlip adenomatós colorectal preexistent. De tots ells destaca per les seves possibles aplicacions diagnòstiques i terapèutiques els dedicats a l'estudi citomètric del contingut d'ADN en la seqüència adenoma-càncer colorectal, encara que la seva importància no ha estat demostrada de forma concloent. L'establiment definitiu del paper que juga la inhibició de l'apoptosi en l'esmentada seqüència podria condicionar el maneig clínic futur dels pacients amb pòlips adenomatosos colorectals.Aquest treball pretén valorar de forma simultània la influència del contingut d'ADN i la inhibició de la mort cel·lular programada en la seqüència adenoma càncer colorectal, i fer una correlació d'ambdues amb variables clinicodemogràfiques i antomopatològiques. HIPÒTESIS1. L'estudi del contingut d'ADN i proliferació cel·lular per citometria de flux pot ser un indicador important per al diagnòstic precoç de transformació maligna dels pòlips colorectals.2. El fracàs o inhibició de l'apoptosi pot conduir a la formació de pòlips colorectals i a la seva transformació maligna.MATERIAL I MÈTODESEstudio retrospectiu. Mostres: 134 vàlides obtingudes a partir de blocs parafinats procedents de pòlips colorectals extrets per polipectomia endoscòpica des de 1996 fins 2001 (22 adenomatosos, 94 tubulovellosos, 18 vellosos). En 33 pòlips es va detectar adenocarcinoma intramucós (16) o invasor (17). Controls: 128 biòpsies endoscòpiques de mucosa normal que es corresponen als quatre segments d'intestí gros (36 a còlon ascendent, 32 a còlon transvers, 31 a còlon descendent, 29 a recte-sigma). Processament i anàlisi per citometria de flux del contingut d'ADN i fases del cicle cel·lular, amb tècnica de Hedley modificada. Contatge mitjançant un citòmetre de flux EPICS PROFILE I. Estudi d'apoptosi: protocol de tinció sobre talls de 4 &#61549;m amb el mètode TUNEL modificat; contatge cel·lular segons criteris predeterminats, i càlcul de l'índex d'apoptosi (IA). Els resultats obtinguts es van correlacionar amb variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques.En les mostres en les quals coincidien una porció adenomatosa i una altra neoplàsica en el mateix pòlip es van diferenciar ambdues seccions.RESULTATS-Mucosa normal: al recte-sigma vam trobar el menor índex de proliferació cel·lular (p<0,001) i en aquesta mateixa localització en el terç superior glandular és on existeix major índex d'apoptosi (p=0,009).-Pòlips sense càncer focal: els pòlips amb diploidia són els que presenten major índex d'apoptosi (p=0,05). De forma global l'I.A. és major en la zona superior glandular i disminueix de forma progressiva fins a ser mínim en la zona inferior (p<0,001). La major distribució de l'apoptosi correspon a la zona superior dels pòlips amb displàsia moderada i a la zona inferior dels pòlips d'entre 1 i 2 cm. (p=0,02).-Pòlips amb càncer focal: en menors de 65 anys presenten major índex d'apoptosi (p=0,02). De forma global el IA és major en la zona inferior (p=0,014).No hi ha relació entre la distribució de l'apoptosi i les variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques tan en la porció adenomatosa com en la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal.Al comparar la porció adenomatosa i la tumoral, el major índex de proliferació (major % fase S) correspon a la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal invasor (p=0,039); no hi ha diferències significatives en la distribució i l'índex d'apoptosi.Els pòlips amb càncer focal intramucós amb histologia túbulo-vellosa són els que tenen major IA (p=0,035). En els pòlips amb càncer focal invasor els majors índexs d'apoptosi s'observen en els d'histologia túbulo-vellosa (p=0,03), grandària menor d'1cm (p=0,002) i menors de 65 anys (p=0,02).-Comparació mucosa normal versus pòlips sense i amb càncer focal: el major índex de proliferació s'obté en el grup de pòlips amb càncer focal i els subgrups intramucós i invasor tan en les seves porcions adenomatoses com tumorals (p<0,001). L'índex d'apoptosi total, per zones, i la distribució de l'apoptosi per zones són majors en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001).-Comparació mucosa normal versus pòlips sense càncer focal: els pòlips sense càncer focal tenen major índex de proliferació, essent una variable predictiva independent (p<0,001). La distribució de l'apoptosi per zones i l'índex d'apoptosi total i per zones també és major en els pòlips sense càncer focal però en aquest cas només té valor predictiu independent en els terços mig (p<0,001) i inferior (p=0,001).-Comparació mucosa normal versus pòlips amb càncer focal: els pòlips amb càncer focal tenen major índex de proliferació, tan en la porció adenomatosa com tumoral, que el grup de mostres normals, amb valor predictiu independent (p=0,003). La distribució i l'índex d'apoptosi, ambdós per zones, són majors en la zona superior del grup de mostres normals (p=0,007) i en la zona inferior del grup de pòlips amb càncer focal (p=0,007). Les esmentades variables tenen valor predictiu independent.-Comparació pòlips adenomatosos versus pòlips amb càncer focal: els segons presenten major percentatge d'aneuploidia (p<0,001), sense diferències a l'índex de proliferació.El IA total és superior en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001), de la mateixa manera que la distribució i IA en els terços superior i mig (p<0,001), amb valor predictiu independent tan si es considera la part adenomatosa com la part tumoral dels pòlips amb càncer focal. La menor apoptosi en el terç superior dels pòlips amb càncer focal pressuposa transformació maligna.Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part adenomatosa dels pòlips amb càncer focal, les variables grandària major de 2 cm (p=0,027), displàsia severa (p=0,036) i presència d'aneuploidia (p=0,043) tenen valor predictiu independent, i suggereixen la presència de transformació maligna.Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part tumoral dels pòlips amb càncer focal només les variables grandària major de 2 cm (p=0,017) i presència d'aneuploidia (p=0,005) tenen valor predictiu independent per indicar transformació maligna. CONCLUSIONSEl major percentatge de cèl.lules en fase S junt amb l'aneuploidia constitueixen un indicador precoç, amb valor predictiu independent, de transformació maligna dels pòlips colorectals.Els pòlips amb càncer focal, intramucós o invasor, presenten un índex d'apoptosi major en la zona inferior glandular, essent una variable amb valor predictiu independent de transformació maligna.Les variables grandària > 2 cm., displàsia severa, aneuploidia i major índex d'apoptosi en la zona inferior glandular, totes elles amb valor predictiu independent, permeten diferenciar entre els pòlips amb i sense càncer focal.La inhibició de l'apoptosi afavoreix el creixement dels pòlips colorectals així com la seva transformació maligna. / INTRODUCCIÓNLos tumores malignos son la primera causa de muerte en los países desarrollados. El cáncer colorrectal (CCR) es la neoplasia más frecuente del tubo digestivo. Se diagnostican 20.000 nuevos casos de CCR en España cada año, y afecta a uno de cada 10.000 españoles. Muestra una incidencia creciente, y supone el 15% de los nuevos diagnósticos de cáncer. Los esfuerzos investigadores se centran en la prevención y la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas.Parece evidente el papel que los procesos de proliferación, diferenciación y destrucción celular juegan en el desarrollo de las neoplasias y en el diseño de futuras estrategias diagnósticas y terapéuticas. Pocos artículos en la literatura han demostrado su interés por el estudio de la proliferación celular y la muerte celular programada de las lesiones preneoplásicas del colon.Durante la última década algunos trabajos investigan el papel que diversos oncogenes, genes supresores de tumor, marcadores de proliferación celular e inhibidores de la misma juegan en el desarrollo de lesiones cancerosas a partir de un pólipo adenomatoso colo-rectal preexistente. De todos ellos destacan por sus posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas los dedicados al estudio citométrico del contenido de ADN celular en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, aunque su importancia no se ha demostrado de forma concluyente. El establecimiento definitivo del papel que juega la inhibición de la apoptosis en dicha secuencia podría también condicionar el manejo clínico futuro de los pacientes afectos de pólipos adenomatosos colo-rectales.El presente trabajo pretende valorar de forma simultánea la influencia del contenido de ADN celular y la inhibición de la muerte celular programada en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, correlacionando ambaos con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas.HIPÓTESIS1. El estudio del contenido de ADN y proliferación celular por citometría de flujo puede ser un indicador importante para el diagnóstico precoz de transformación maligna de los pólipos colorrectales.2. El fracaso o inhibición de la apoptosis puede conducir a la formación de pólipos colorrectales así como a su transformación maligna.MATERIAL Y MÉTODOSEstudio retrospectivo. Muestras: 134 válidas obtenidas a partir de bloques parafinados procedentes de pólipos colorrectales extraídos por polipectomía endoscópica desde 1996 hasta 2001 (22 adenomatosos, 94 túbulo-vellosos, 18 vellosos). En 33 pólipos se detectó adenocarcinoma intramucoso (16) o invasor (17). Controles: 128 biopsias endoscópicas de mucosa normal correspondientes a los cuatro segmentos de intestino grueso (36 a colon ascendente, 32 a colon transverso, 31 a colon descendente, 29 a recto-sigma). Procesado y análisis mediante citometría de flujo del contenido de ADN y fases del ciclo celular, con técnica de Hedley modificada. Contaje mediante un citómetro de flujo EPICS PROFILE I. Estudio de apoptosis: protocolo de tinción sobre cortes de 4 &#61549;m con método TUNEL modificado; contaje celular siguiendo criterios predeterminados, y cálculo del índice de apoptosis (IA). Los resultados obtenidos se correlacionaron con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas.En las muestras en las que una porción adenomatosa y otra neoplásica coincidían en el mismo pólipo se diferenciaron ambas secciones.RESULTADOS-Mucosa normal: en recto-sigma encontramos el menor índice de proliferación celular (p<0,001) y en esa misma localización en el tercio superior glandular es donde existe mayor índice de apoptosis (p=0,009).-Pólipos sin cáncer focal: los pólipos con diploidia son los que presentan mayor índice de apoptosis (p=0,05). Globalmente el I.A es mayor en la zona superior glandular y disminuye de forma progresiva hasta ser mínimo en la zona inferior (p<0,001). La mayor distribución de la apoptosis corresponde a la zona superior de los pólipos con displasia moderada y a la zona inferior de los pólipos de entre 1 y 2 cm. (p=0,02).-Pólipos con cáncer focal: en menores de 65 años presentan mayor índice de apoptosis (p=0,02). Globalmente el IA es mayor en la zona inferior (p=0,014).No hay relación entre la distribución de la apoptosis y las variables clínico-demográficas y anatomopatológicas tanto en la porción adenomatosa como en la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal.Al comparar entre sí la porción adenomatosa y la tumoral, el mayor índice de proliferación (mayor % fase S) corresponde a la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal invasor (p=0,039); no hay diferencias significativas en la distribución y el índice de apoptosis.Los pólipos con cáncer focal intramucoso con histología túbulo-vellosa son los que tienen mayor IA (p=0,035). En los pólipos con cáncer focal invasor los mayores índices de apoptosis se observan en aquellos con histología túbulo-vellosa (p=0,03), tamaño menor de 1cm (p=0,002) y menores de 65 años (p=0,02).-Comparación mucosa normal versus pólipos sin y con cáncer focal: el mayor índice de proliferación se obtiene en el grupo de pólipos con cáncer focal y los subgrupos intramucoso e invasor tanto en sus porciones adenomatosas como tumorales (p<0,001). El índice de apoptosis total, por zonas, y la distribución de la apoptosis por zonas son mayores en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001).-Comparación mucosa normal versus pólipos sin cáncer focal: los pólipos sin cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, siendo ésta una variable predictiva independiente (p<0,001). La distribución de la apoptosis por zonas y el índice de apoptosis total y por zonas también es mayor en los pólipos sin cáncer focal pero en este caso sólo tienen valor predictivo independiente en los tercios medio (p<0,001) e inferior (p=0,001).-Comparación mucosa normal versus pólipos con cáncer focal: los pólipos con cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, tanto en porción adenomatosa como tumoral, que el grupo de muestras normales, con valor predictivo independiente (p=0,003). La distribución y el índice de apoptosis, ambos por zonas, son mayores en la zona superior del grupo de muestras normales (p=0,007) y en la zona inferior del grupo de pólipos con cáncer focal (p=0,007). Dichas variables tienen valor predictivo independiente.-Comparación entre pólipos adenomatosos versus pólipos con cáncer focal: los segundos presentan mayor porcentaje de aneuploidia (p<0,001), sin diferencias en cuanto al índice de proliferación.El IA total es superior en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001), al igual que la distribución e IA en los tercios superior y medio (p<0,001), con valor predictivo independiente tanto si se considera la parte adenomatosa como la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal. La menor apoptosis en el tercio superior de los pólipos con cáncer focal presupone transformación maligna.Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte adenomatosa de los pólipos con cáncer focal, las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,027), displasia severa (p=0,036) y presencia de aneuploidia (p=0,043) tienen valor predictivo independiente, sugiriendo la presencia de transformación maligna.Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal sólo las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,017) y presencia de aneuploidia (p=0,005) tienen valor predictivo independiente para indicar transformación maligna. CONCLUSIONESEl mayor porcentaje de células en fase S junto con la aneuploidia constituyen un indicador precoz, con valor predictivo independiente, de transformación maligna de los pólipos colorrectales.Los pólipos con cáncer focal, intramucoso o invasor, presentan un índice de apoptosis mayor en la zona inferior glandular, convirtiéndose en una variable con valor predictivo independiente de transformación maligna.Las variables tamaño > 2 cm., displasia severa, aneuploidia y mayor índice de apoptosis en la zona inferior glandular, todas ellas con valor predictivo independiente, permiten diferenciar entre los pólipos con y sin cáncer focal.La inhibición de la apoptosis favorece el crecimiento de los pólipos colorrectales así como su transformación maligna. / INTRODUCTIONMalignant tumors are the first cause of death in developed countries. Colon cancer is the most frecuent tumor of digestive tract. 20.000 colorectal cancer new cases are diagnosed in Spain every year and the problem involves one over 10.000 people. Colonic cancer shows and increasing incidence and causes about 15% of new diagnostics of tumor. Investigation efforts are focused on prevention and discovery of new treatment lines.Cell proliferation, differentiation and destruction mechanisms are fundamental for tumor growth and for development of new diagnostic and therapeutic methods.A few works have shown interest in the study of cellular proliferation and programmed cellular death mechanisms in preneoplasic colonic injures.During last decade some works tried to find out the paper that oncogenes, tumor growth supressor genes, cell growth proliferation markers and inhibitors issues have in the outcome of malignant injures on a previous adenomatous colorectal polyp. Of all of them, those measuring cellular DNA content by flow cytometry in the colorectal adenoma- colorectal cancer secuence are important because of their diagnostic and therapeuthic applications, but they-re not conclusive. To stablish definitly the paper of apoptosis inhibition in that process could conditioning the clinical practise on the patient with adenomatous colo-rectal polyps in the future.The present study pretends measuring both the influence of cellular-DNA content and the programmed cellular death on the adenoma-colorectal cancer secuence, and their correlation with clinical, demographical and anatomopathological items.HYPOTHESIS1. The study of DNA content and cell proliferation rate measured by flow citometry can be a good indicator of malignant tranformation in colonic polyps.2. Apoptosis inhibition can induce colonic polyps´ growth and their malignant tranformation. MATERIAL AND METHODSRetrospective study. Specimens: 134 colorectal polyps obtained by endoscopic polypectomy between 1996 and 2001 (22 adenomatous, 94 tubulovillous and 18 villous polyps). Controls: 128 specimens obtained by endoscopical resection of normal mucosa in colonic tract (36 in ascending colon, 32 in transverse colon, 31 in descending colon and 29 in sigmoid colon and rectum). Specimens were prepared using a modification of the method described by Hedley et al. and DNA content was messured by flow analysis. Flow citometry was carried out on EPICS PROFILE I cell sorter.Identification of apoptosis: 4 &#61549;m slides of tissue samples were treated with a modification of TUNEL method. We described the labeling pattern and apoptosis index.Obtained results were related to clinical-demographical and histopathological items.When adenomatous and malignant sections were found together in the same polyp sample, both of them were treated as independent sections.RESULTS-Normal mucosa: the lowest cell proliferation index is found in rectal and sigmoid location. There, in the upper crypt section we found the higher apoptosis index (p=0,009).-Non malignant polyps: diploid polyps present the highest apoptosis index (p=0,005). Apoptosis index is higher in upper crypt section and it decrease to be minimun in lower crypt section (p>0,001). Apoptotic cells are mainly located in the upper zone of mild displasic polyps and lower zone of polyps being between 1 and 2 cm sized (p=0,02).-Malignant polyps: apoptosis index is higher in people being under 65 year-old (p=0,02) and in lower crypt section (p=0,014). It doesn-t exist a relation between apoptosis distribution and clinical, demographical or anatomopathological items nor in the adenomatous or the tumoral sections of malignant polyps.Malignant section in malignant polyps shows the highest proliferation rate (p=0,039), if we compare adenomatous and malignant sections. It doesn´t exist a significative difference on apoptosis distribution or index. Intramucosal malignant tubulovillous polyps show the higher AI (p=0,035).-Comparison between normal mucosa and polyps: the highest proliferation index is obtained in adenomatous and neoplasic sections of malignant polyps (p<0,001). Apoptosis index and apoptotic cells rate are higher in non malignant polyps (p<0,001).-Comparison between normal mucosa and non malignant polyps: non malignant polyps have a higher proliferation rate with an independent predictive value (p<0,001). Apoptotic cells rate and apoptosis index is higher in non malignant polyps. Both of them have independent predictive value when messured in medium (p<0,001) and lower (p=0,001) crypt sections.-Comparison between normal mucosa and malignant polyps: malignant polyps have higher proliferation index than normal mucosa, in both adenomatous and tumoral sections with an independent predictive value (p=0,003).Apoptosis distribution and index are higher in the upper crypt section of normal mucosa (p=0,007) and in the lowest crypt section of malignant polyps (p=0,007); both of them with independent predictive value.-Comparison between adenomatous polyps and malignant polyps: malignant polyps present higher aneuploidy rate (p<0,001) with no differences in proliferation rate. AI is higher in non malignant polyps (p<0,001) as well as apoptotic cells rate and AI in upper ad medium crypt sections (p<0,001) with independent predictive value, both in adenomatous and neoplasic sections of malignant polyps. The lowest apoptosis rate is found in upper crypt section in malignant polyps and it correlates with potencial malignant transformation .If we compare non malignant polyps and adenomatous section of malignant polyps, the items size higher than 2 cm (p=0,027), severe displasia (p=0,036) and aneuploidy (p=0,043) have independent predictive value showing a malignant transformation.If we compare non malignant polyps and neoplasic section of malignant polyps, only size higher than 2cm (p=0,017) and aneuploidy (p=0,005) have independent predictive value to shown a malignant transformation. CONCLUSIONSHigher cell proliferation rate and aneuploidy are a predictive item of malignant transformation in colorectal polyps, with independent value.Lower crypt section in malignant polyps presents a higher apoptosis index, with independent predictive value, showing malignant transformation.Items size higher than 2 cm, severe displasia, aneuploidy and higher apoptosis index in lower crypt section, all of them with independent predictive value, are useful to discriminate between malignant and no malignant polyps.Apoptosis inhibition promoves growing in colorectal polyps, as well as their malignant transformation.

La línea celular HT-29 M6 es una línea tumoral humana derivada de adenocarcinoma de colon, con capacidad de diferenciación in vitro hacia un fenotipo mucosecretor, obtenida por selección con 10-7 M y 10-6 M de metotrexato, en tratamientos sucesivos, de la línea parental indiferenciada HT-29 (Lesuffleur T, et al, 1990). Nosotros utilizamos esta línea celular como modelo para estudiar el proceso de diferenciación in vitro que ocurre de manera espontánea durante el crecimiento hacia confluencia. Los resultados que presentamos en este trabajo aportan evidencias sólidas acerca del papel del calcio extracelular como modulador no sólo de la epitelialización, sino también del ciclo celular y de la expresión génica durante la diferenciación in vitro. Aunque puede existir más de un mecanismo por el que el calcio extracelular sea responsable de los efectos observados, los resultados obtenidos son consistentes con el requerimiento de contactos de adhesión para la diferenciación epitelial. Además, los resultados sugieren que reguladores del ciclo celular, concretamente ciclina D1 y p27, desempeñan un papel determinante en el control del programa de expresión génica durante la diferenciación. Este resultado es muy relevante ya que: (1) su función parece tener lugar de manera general sobre el programa de expresión génica, y (2) al estar estas proteínas implicadas en la progresión tumoral, su mecanismo de acción emerge como una diana para manipular el fenotipo de diferenciación celular y con ello la tumorigenicidad. Por otro lado, hemos descubierto que parte del proceso de diferenciación in vitro es independiente de la formación de contactos de adhesión y de la epitelialización, concretamente niveles basales de expresión génica asociada a diferenciación y la producción de vesículas de moco. Asimismo, en condiciones de no adherencia celular, las células no adquieren capacidad invasiva, lo cual nos está indicando que la desdiferenciación celular observada en tumores y la adquisición de capacidad invasiva podría tener lugar por vías separadas. Finalmente, hemos obtenido evidencias preliminares acerca de la existencia de una vía de regulación de APC sobre p21CIP1 cuya inactivación podría estar relacionada con la reversibilidad del programa de diferenciación in vitro y con su incapacidad para llevar a término un programa de diferenciación terminal.

OBJETIVO. El objetivo de este estudio fue explorar la capacidad de la ecografía tridimensional con Power Doppler (3DPD) para discriminar los tumores benignos y malignos dentro del grupo de masas anexiales sólido-quísticas con vascularización central y definir los puntos de corte de los índices 3DPD que se deben utilizar en un entorno clínico. MÉTODOS. Un total de 143 mujeres consecutivas (edad media, 50,4 años, rango, 17-82 años) con diagnóstico de lesión sólido-quística o sólida en modo B y con vascularización central en el 2DPD fueron evaluadas con ecografía 3D PD antes de la cirugía. El 3DPD se utilizó para evaluar la vascularización en las proyecciones papilares y áreas sólidas. Los índices vasculares (índice de vascularización [VI], índice de flujo [FI], y el índice vascularization-flujo [VFI]) se calculan automáticamente. El diagnóstico histológico definitivo se obtuvo en cada caso. RESULTADOS. Un total de 113 masas (74%) eran malignas y 39 (26%) fueron benignoa. La evaluación morfológica reveló 30 uniloculares sólidas (19,7%), 43 multilocular sólidas (28,3%), y 79 masas sólidas (52%). La media VI (9,365% frente al 3,3%, P <.001), FI (34,318 versus 28,794; p <.001), y VFI (3,233 frente a 1,15; P <0,01) fueron significativamente mayores en los tumores malignos. No se encontraron diferencias en el índice de resistencia, índice de pulsatilidad, y la velocidad pico sistólica. El análisis de la curva ROC reveló un área bajo la curva de 0,77 (intervalo de confianza del 95%, 0.69-0.85), 0,71 (0.60-0.81) y 0.75 (0.66-0.83) para la VI, FI y VFI, respectivamente. Para reducir la tasa de falsos positivos en casi una tercera parte, los valores de sensibilidad para el VI (corte, 1,556%), FI (25,212), y VFI (0,323) fueron 92%, 95% y 93%, respectivamente. CONCLUSIONES. Los índices vasculares con 3DPD son útiles para reducir la tasa de falsos positivos en lesiones sólidas y sólido-quísticas con vascularización central. PALABRAS CLAVE: masa anexial; cáncer de ovario; Power Doppler, 3DPD / OBJECTIVE. The purpose of this study was to explore the role of 3-dimensional (3D) power Doppler (PD) sonography to discriminate between benign and malignant cystic-solid and solid vascularized adnexal masses and to define cutoff values for 3D PD indices to be used in a clinical setting. METHODS. A total of 143 consecutive women (mean age, 50.4 years; range, 17-82 years) with diagnoses of cystic-solid or solid vascularized adnexal masses on B-mode and 2-dimensional PD sonography were evaluated by 3D PD sonography before surgery. Three-dimensional PD sonography was used to assess vascularization within papillary projections and solid areas with a virtual organ computer-aided analysis program.Three-dimensional PD vascular indices (vascularization index [VI], flow index [FI], and vascularizationflow index [VFI]) were automatically calculated. A definitive histologic diagnosis was obtained in each case. RESULTS. A total of 113 masses (74%) were malignant, and 39 (26%) were benign. Morphologic evaluation revealed 30 unilocular solid masses (19.7%), 43 multilocular solid masses (28.3%), and 79 mostly solid masses (52%). The mean VI (9.365% versus 3.3%; P < .001), FI (34.318 versus 28.794; P < .001), and VFI (3.233 versus 1.15; P < 0.01) were significantly higher in malignant tumors. No differences were found in the resistive index, pulsatility index, and peak systolic velocity. Receiver operating characteristic analysis revealed an area under the curve of 0.77 (95% confidence interval, 0.69-0.85), 0.71 (0.60-0.81), and 0.75 (0.66-0.83) for the VI, FI and VFI, respectively. For reducing the false-positive rate by almost one-third, sensitivity values for the VI (cutoff, 1.556%), FI (25.212), and VFI (0.323) were 92%, 95%, and 93%, respectively. CONCLUSIONS. Three-dimensional PD vascular indices could be helpful for reducing the false-positive rate in cystic-solid and solid vascularized adnexal masses. KEY WORDS: adnexal mass; ovarian cancer; 3-dimensional power Doppler sonography.

- Tesi presentada com a compendi de sis publicacions internacionals realitzades entre els anys 2002 a 2006, i amb un factor d'impacte total de 35,9 segons l'ISI JCR del 2005.- La investigació presenta un disseny prospectiu i fou realitzada de juliol de 1994 a agost de 1997. La mostra d'estudi inclou 220 pacients afectats de càncer hematològic i que reberen un trasplantament de medul·la òssia (TMO) a l'Hospital Clínic de Barcelona. Durant l'hospitalització per a realitzar el TMO, s'avaluaren de forma setmanal diversos aspectes de qualitat de vida i patologia psiquiàtrica segons criteris diagnòstics psiquiàtrics DSM-IV. Es realitzaren un total de 1062 valoracions psiquiàtriques.- Entre els resultats i conclusions principals de cada publicació cal destacar:1) Es demostra la validesa i fiabilitat de les quatre escales de qualitat de vida dissenyades pel nostre grup de recerca pel seu ús en la fase hospitalització per a realitzar el TMO.2) El nivell d'ansietat és màxim en el moment d'ingrés hospitalari mentre el nivell de depressió ho és en la segona setmana posterior a l'ingrés. El curs evolutiu durant la fase d'hospitalització de paràmetres físics segueix un evolució paral·lela als nivells de depressió. En comparació amb el grup de trasplantats al·logènics, els grup de trasplantats autòlegs presenta un curs evolutiu més favorable a nivell físic sense evidenciar-se diferències en relació als símptomes depressius i d'ansietat. En base a aquests resultats es pot orientar en l'adopció de determinades decisions de tractament, facilitar l'afrontament al procés de trasplantament i millorar en el disseny d'estratègies de prevenció i tractament.3) Entre múltiples factors de risc significatius, la variable símptomes depressius és el factor que s'associa amb el més alt nivell de significació i consistència amb la variable fatiga durant la fase hospitalària del TMO. Es subratlla la importància de realitzar un cribatge acurat de la depressió en aquells pacients amb càncer que presentin queixes de fatiga.4) Durant la fase d'hospitalització pel TMO un 44.1% de la població d'estudi presenta un trastorn psiquiàtric segons criteris DSM-IV. El trastorn adaptatiu es diagnostica en un 22.7% dels pacients, el trastorn de l'estat d'ànim en un 14.1%, el trastorn d'ansietat en un 8.2% i el delirium en un 7.3%. Després d'ajustar per múltiples factors de confusió, el diagnòstic de trastorn psiquiàtric (trastorn adaptatiu, de l'estat d'ànim o d'ansietat) s'associa de forma significativa amb un increment de l'estada hospitalària. En relació a aquests resultats, es fa especial esment a la necessitat d'una detecció precoç i d'un tractament efectiu de la patologia psiquiàtrica.5) Després d'ajustar per múltiples variables de confusió, els factors associats amb un increment de risc de patir un trastorn psiquiàtric durant la fase hospitalària del trasplantament són: edat jove, dona, antecedents d'historial psiquiàtric, baix estat funcional, dolor, retirada del consum de tabac, i elevada toxicitat del tractament citotòxic. Els resultats d'aquest estudi poden facilitar una millora en el reconeixement d'aquells pacients amb risc de desenvolupar un trastorn psiquiàtric durant la fase de TMO.6) Divuit (9.0%) pacients compleixen criteris DSM-IV de depressió major i disset (8.5%) de depressió menor durant la fase d'hospitalització pel TMO. Després de controlar l'efecte de múltiples factors de confusió, la depressió major prediu de forma significativa un increment de la mortalitat a l'any i al tercer any, sense cap influència en la mortalitat al cinquè any posttrasplantament. La depressió menor no demostra cap efecte en la mortalitat. En base als resultats d'aquest estudi, es fa especialment esment a la importància de diagnosticar i tractar de forma adequada la depressió major. / - Doctoral thesis presented as a compendium of six international medical publications, representing a total impact factor of 35,9 (ISI JCR 2005)- In a prospective inpatient study, 220 patients aged 16-65 years received hematopoietic stem cell transplantation (SCT) for hematologic cancer at a single institution. Patients were assessed at hospital admission and then on a weekly basis during hospitalization until discharge or death. The assessment included different quality of life aspects and structured psychiatric interviews applying standardized diagnostic criteria. A total of 1,062 psychiatric interviews were performed.- Summary of main findings for each publication:1) The results demonstrated the instruments' reliability and validity of the four patient-rated scales specifically devised by the authors to be used during hospitalization for SCT.2) Anxiety was highest at hospital admission; a marked worsening in physical health status variables corresponded with a sharp increase in depression during the first two weeks after admission. Compared to allogeneic SCT, a better physical outcome was demonstrated for autologous SCT. These findings have implications for treatment decision making, coping with the transplantation process, and improving prevention and treatment strategies.3) After adjusting for multiple risk factors, we found that depression was the variable most consistently and strongly associated with fatigue. Our findings may help to shed light on the mechanisms underlying fatigue and may also guide future interventions.4) Overall psychiatric disorder prevalence was 44.1%; an adjustment disorder was diagnosed in 22.7% of patients, a mood disorder in 14.1%, and anxiety disorder in 8.2%. After adjusting for multiple risk factors, diagnosis of any mood, anxiety, or adjustment disorder was associated with a longer length of hospital stay. Our data underscores the need for early recognition and effective treatment of psychiatric morbidity.5) After adjusting for multiple confounders, we found that younger age, women, a past psychiatric history, lower functional status, pain, smoking cessation, and higher regimen-related toxicity were significantly associated with psychiatric disorder risk.6) After adjusting for multiple factors, major depression predicted higher 1- and 3-year mortality among cancer patients after SCT, underscoring the importance of adequate diagnosis and treatment of major depression.

L’objectiu d’aquest treball és la identificació i caracterització de les principals alteracions en metàstasi hepàtica (MH) de càncer colorectal (CCR) tant a nivell d’expressió gènica com de metilació de l’ADN. Els resultats obtinguts han de servir per millorar la comprensió del procés metastàtic i aportar nous coneixements que puguin ser aplicats en el diagnòstic molecular i en la recerca de noves opcions terapèutiques. Els resultats de la tesi estan estructurats en 2 articles: “LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació de marcadors moleculars d’expressió gènica importants en el procés metastàtic. 19 mostres aparellades de tumor primari de còlon i MH han estat hibridades en un microarray de cDNA (Affymetrix). S’obté un llistat de 1374 sondes diferencialment expressades de forma significativa entre tumors i metàstasis. S’ha creat una signatura metastàtica (algoritme de Golub) que consta de 7 gens específics de MH: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. La capacitat de pronòstic de MH d’aquesta signatura en tumors i en mucosa normal de còlon també ha estat avaluada, mitjançant RT‐PCR quantitativa. Segons un anàlisi de regressió logística univariant, els gens MS4A12, CYP1B1 i CLCA4 estan significativament sobreexpressats en tumors metastàtics (n=61) en comparació amb els no metastàtics (n=40). L’anàlisi estadístic Random Forest, a partir dels nivells d’expressió de MS4A12 i CYP1B1 (en tumors i en còlon normal), permet pronosticar disseminació al fetge amb una probabilitat d’encerts del 80%. Ambdós gens mostren major expressió gènica en el component estromal que en el tumoral quan s’analitzen mostres de microdissecció per captura làser. D’altra banda, s’ha desenvolupat un model murí per injecció intraesplènica de línies cel∙lulars humanes de CCR (KM12C i HCT116) capaces de metastatitzar específicament a fetge reproduint així el procés de disseminació en pacients. “ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació d’alteracions en la metilació de l’ADN específiques de MH. S’han utilitzat dues metodologies: l’AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) i l’array de metilació. En cap cas s’han trobat diferències de metilació entre tumors primaris i MH aparellades. Tot i això, s’ha validat mitjançant seqüenciació per bisulfit i corbes de melting dues bandes d’AUMA amb canvis de metilació recurrents (28 i 33% dels casos) entre mucosa normal de còlon i tumors, anomenades banda B (19q13.32) i banda C (16p13.3). Per limitar l’àrea afectada per aquests canvis de metilació, s’ha fet seqüenciació per bisulfit de les illes CpG veïnes a les bandes B i C concloent que es tracta d’alteracions poc extenses dins el genoma. L’anàlisi transcripcional dels gens propers amb l’array d’expressió (Affymetrix) ens indica que no hi ha regulació de l’expressió gènica per metilació dins una regió de fins a 2Mb lluny de les bandes d’AUMA. Tot i la manca de significació, la línia cel∙lular HCT116 desmetilada (tractament amb AZA i TSA) ha servit per analitzar una possible correlació entre la metilació de les bandes B/C i l’expressió de gens propers. La majoria de gens analitzats estaven sobreexpressats en la línia tractada. Les conclusions principals d’aquesta tesi són dues: ‐ S’ha obtingut una signatura metastàtica de 7 gens específics de MH de CCR. Dos d’aquests gens, MS4A12 i CYP1B1, tenen capacitat per pronosticar MH, fet de gran importància clínica. ‐ No s’han trobat canvis de metilació específics de MH indicant que els canvis epigenètics succeeixen en estadis inicials de la tumorigènesis. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide being liver metastasis (LM) a significant prognostic factor and the main cause of cancer related deaths. Despite of its clinical relevance, metastatic spread process is poorly understood. The aim of this study is to clarify the mechanisms of colorectal cancer LM discovering new molecular markers (transcriptional and epigenetic ones) with significant role in the metastatic process to improve its diagnostics, treatment and prevention. The results can be classified in 2 manuscripts: 1) LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER 19 paired subjects (colorectal tumor/LM) have been used in cDNA microarrays (Affymetrix) in order to identify specific LM genes. A metastatic signature of 7 specific liver metastasis related genes has been built: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. Two of them, MS4A12 and CYP1B1, have an important liver metastasis prognosis capability which could be very useful in clinics for CRC prognosis. 2) ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER Specific liver metastasis (LM) epigenetic alterations would be interesting for better dissemination process understanding. Two different methodologies have been used: AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) and methylation microarray. However, specific LM methylation changes have not been identified being, therefore, early events in adenoma‐carcinoma sequence.

El carcinoma mucoepidermoide, es el tumor maligno más frecuente de glándulas salivales (GS). Tanto su expresión de mucinas, MUC1 y MUC4, como el número de copias del gen EGFR (receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico) y la expresión de pERK1/2 (quinasas de regulación extracelular 1 y 2, fosforiladas), se correlacionan con el grado histológico y con el pronóstico de estos tumores. Los carcinomas mucoepidermoides (CMEs) de alto grado de GS, tienen una alta expresión de MUC1 y baja de MUC4, así como, un aumento del número de copias del gen EGFR y alta expresión de pERK1/2. Estas características se correlacionan con la progresión de la enfermedad. Teniendo en cuenta estos resultados, la alta expresión de MUC1 y la activación de la vía efectora EGFR/ERK de los CMEs de alto grado de GS, podrían seleccionar pacientes como candidatos a tratamientos dirigidos contra estas dianas terapéuticas. / Expression of mucins and related molecules in the mucopeidermoid carcinomas of the salivary glands: diagnostic and prognostic implications. SUMMARY Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most frequent tumour arising in salivary glands. The expression of mucins MUC1 and MUC4, the number of EGFR (epidermal growh factor receptor) gene copies and the expression of pERK1/2 (phosphorylated extracellular regulated kinases 1 and 2) correlate with the histological grade and the behavior of the tumours. The high-grade mucoepidermoid carcinomas of salivary glands have a high expression of MUC1 and low-expression of MUC4, as well as a high EGFR copy number and a high expression of pERK1/2. These characteristics are associated with the disease progression. Taking into account these results, the MUC1 high-expression and the activation of the EGFR/ERK pathway in the high-grade MECs could select these patients to be treated with targeted therapies.

Els dos principals objectius d'aquesta tesis són: (1) la realització d'un estudi global, (2) anàlisi i caracterització d'alteracions recurrents, en els canvis de metilació genòmica associats al càncer de còlon. Amb la finalitat d'assolir aquests objectius, vàrem desenvolupar una nova tècnica d'anàlisi dels canvis de metilació. Amplification of InterMethylated Sites (AIMS). A partir de la descripció d'aquesta tècnica, la tesis consta de dos grups de resultats, obtinguts a partir de la mateixa tècnica AIMS, i clarament diferenciats. Un primer bloc de resultats on realitzem dos estudis globals (objectiu número 1), i un segon bloc format per dos estudis específics (objectiu número 2) . En el primer treball global es va analitzar la contribució dels guanys i les pèrdues de la metilació genòmica en el procés tumoral. La principal conclusió d'aquest treball va ser el paper independent que juguen els dos tipus de canvi, tant a nivell de característiques tumorals (fisiològiques i genètiques), com de valor pronòstic i contribució al llarg de la progressió tumoral. En el segon estudi global, ens vàrem centrar més amb les pèrdues de metilació genòmica. En aquest, mostrem l'estreta associació entre aquestes pèrdues amb el grau de dany genòmic i mal pronòstic. El segon bloc de resultats ve constituït per els estudis específics. En un primer treball, descrivim el silenciament epigenètic del gen sintasa de prostaciclines (PTGIS). Aquest silenciament, es dona en una freqüència elevada de tumors i presenta una associació estadísticament significativa amb el grau d'aneuploidia del tumor. Finalment, un segon treball específic on mostrem el silenciament epigenètic de tota una banda citogenètica, concretament 2q14.2. En aquest silenciament no tant sols s'hi troba implicada la metilació genòmica, sinó que també descrivim un efecte general de silenciament a través de la modificació post-transcripcional de les histones. / The main focus of this thesis is to better understand the role of genomic methylation changes in colorectal cancer. We approached it at two different levels: (1) global assessment and (2) analysis of specific recurrent changes. A new technique called Amplification of InterMethylated Sites (AIMS) was developed to obtain information at both levels. At global level we report the relative contribution of losses and gains of DNA methylation on the tumour progression. DNA methylation signatures associate with different tumour features, including physiological, genetic and clinical characteristics. Furthermore, we demonstrate that global genomic demethylation correlates with cumulated genomic damage and poor prognosis. At specific level we show the epigenetic silencing of the prostacyclin synthase gene (PTGIS) in 43% of colorectal cancers. PTGIS inactivation is associated with the aneuploid status of the tumour, suggesting a possible role of this gene in the maintenance of the genomic integrity. Finally, we have detected a new type of epigenetic alteration affecting a large proportion of colorectal cancers. It consists in a long range epigenetic silencing due DNA methylation and Histone modification changes and affects an entire cytogenetic band (2q14.2). All the genes and transcripts present in this region showed downregulation independently of the promoter methylation status suggesting that the regional condition prevails over the local status.