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Rol del fitoestrógeno genisteína en los sistemas vascular y óseoCepeda, Sabrina Belén 09 April 2019 (has links)
Las calcificaciones vasculares y la osteoporosis son patologías prevalentes en mujeres
postmenopáusicas. Ambos trastornos se caracterizan por una distorsión de la
arquitectura natural del tejido, donde la inflamación y el estrés oxidativo son
condiciones que subyacen. La existencia de posibles mecanismos fisiopatológicos
compartidos presupone la posibilidad de nuevas estrategias terapéuticas comunes. Los
resultados controvertidos sobre el riesgo/beneficio de la terapia de sustitución
hormonal para prevenir patologías asociadas a la menopausia, ha incentivado la
búsqueda de nuevas opciones de tratamiento. Los fitoestrógenos se posicionaron
como una opción.
En este trabajo de tesis se investigó el rol del fitoestrógeno Genisteína en los procesos
celulares involucrados en la transformación ósea del lecho vascular, en la
remodelación ósea y en la interacción óseo-vascular.
A nivel vascular demostramos que la Genisteína regula los procesos celulares
involucrados en la calcificación vascular. Empleando cultivos primarios determinamos
que, en células endoteliales Genisteína estimula la síntesis de óxido nítrico, ejerce un
balance positivo sobre el crecimiento celular favoreciendo su supervivencia frente al
estrés oxidativo. Así mismo, en condiciones de inflamación, la Genisteína previene la
expresión de moléculas de adhesión celular endoteliales y de integrinas monocíticas
involucradas en la adhesión de los mononucleares al endotelio vascular. En células
musculares lisas vasculares (CMLV) el tratamiento con el fitoestrógeno previene la
transformación celular a linaje símil osteoblástico. En un modelo experimental de
transdiferenciación ósea de CMLV, demostramos que la isoflavona reduce la actividad
fosfatasa alcalina y la formación de nódulos de calcio en la matriz extracelular de
CMLV. Los resultados se corroboraron por ensayos ex vivo, demostrando una marcada
disminución en la formación de áreas de calcificación en el tejido aórtico intacto.
A diferencia de la acción anti-ósea evidenciada en el sistema vascular, a nivel óseo la
Genisteína estimula la osteoblastogénesis y la osteoclastogénesis. La diferenciación de
preosteoblastos a osteoblastos maduros se demostró por la estimulación de
marcadores tempranos de diferenciación (Runx-2 y REα), por el aumento de la
actividad fosfatasa alcalina y del depósito de colágeno y, por la estimulación de la
mineralización de la matriz extracelular. En cocultivos de osteoblastos-monocitos, y a
través de análisis de cambios morfológicos y expresión de la enzima fosfatasa ácida
tartrato resistente, se demostró que Genisteína favorece la maduración monocítica a
osteoclastos diferenciados. Desde un punto de vista molecular, el mecanismo de
acción del fitoestrógeno incluye la participación del receptor de estrógenos y la vía
óxido nítrico sintasa.
En su conjunto, los resultados de este trabajo de tesis evidencian una acción selectiva y
diferencial de la Genisteína según el tipo celular sobre el cual actúa. Adicionalmente se
demostró la existencia de una interacción bidireccional ósea-vascular favoreciendo el
crecimiento celular y la angiogénesis.
Si bien los datos aportados corresponden a ensayos in vitro en sistemas aislados,
sugieren una potencial acción dual de la Genisteína a favor del mantenimiento de la
arquitectura natural de ambos tejidos. De confirmarse estas acciones en modelos in
vivo se aportaría fundamento para fomentar el consumo de fitoestrógenos como
alternativa para promover la salud ósea y cardiovascular. / Although soy phytoestrogen are proposed to prevent or improve postmenopausal
vascular and bone diseases, the currently available data are controversial and unclear.
In this thesis we investigated the molecular and biochemical action of the isoflavone
Genistein on the cellular events involved in vascular calcification and in bone
remodeling. We also focused our attention on the interactions between bone and
vascular cells.
At vascular level, the data obtained supported the hypothesis that Genistein prevents
in vitro vascular calcification. To that end, rat aortic vascular cell cultures and murine
monocytes in vitro, exposed to Genistein were employed. Genistein down-regulated
the expression of endothelial cell adhesion molecules and monocytes integrins,
involved in stable leukocyte attachment induced by a pro-inflammatory environment.
In endothelial cells, promotes nitric oxide synthesis and under oxidative stress favors
cell growth and survival. On vascular muscle cells, the isoflavone markedly reduced cell
proliferation and migration. In order to study vascular calcification, muscle cells
transdifferentiation into osteoblasts like cells was evaluated. The expression of alkaline
phosphatase and the presence of calcified nodules in the extracellular matrix were
selected as features of vascular muscle cells transdifferentiation. Both osteoblastic
markers were significantly reduced after Genistein treatment. These data were
corroborated in ex vivo assays using aortic tissue, where the presence of calcified areas
was significantly reduced by Genistein treatment.
In contrast to this anti-osteogenic action, on bone cells Genistein promoted
osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. The isoflavone promoted calvaria preosteoblast
differentiation with an earlier up-regulation of the estrogen receptor alpha
gene expression and the enhancement of mRNA levels of the Runt-related
transcription factor 1 mRNA expression. The differentiative effect was accompanied
through, an increase of alkaline phosphatase activity, extracellular collagen deposition
and increased matrix mineralization. Using co-cultures of osteoblasts and monocytes,
and tartrate resistant acid phosphatase staining, we found that Genistein induced
osteoclast differentiation from mononuclear blood cells. The mechanisms displayed by
Genistein involved the participation of estrogen receptor and nitric oxide pathway.
We also obtained evidence that Genistein acted through a bidirectional cross link
between bone and vascular cells, that modulates cells growth and enhanced
angiogenesis.
Although our data arise from in vitro assays employing isolated cells and required
confirmation using in vivo animal models, provide knowledge that support the
hypothesis that phytoestrogens could be useful for cardiovascular and bone health.
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Exossomos derivados de células dendríticas como adjuvantes naturais na resposta antitumoral. / Dendritic cells-derived exosomes as natural adjuvants in antitumor responses.Romagnoli, Graziela Gorete 18 May 2012 (has links)
Exossomos (Exo) originados de células dendríticas (DCs) carregam moléculas associadas à apresentação antigênica. Neste trabalho procurou-se estabelecer se Exo de DCs seriam capazes de conferir imunogenicidade às células tumorais. Os Exo isolados de culturas de DCs expressavam as moléculas HLA-ABC, HLA-DR, CD86, CD11c, CD81, CD54 e CD18. Estes foram então adicionados às células da linhagem humana de adenocarcinoma mamário, SK-BR-3, as quais passaram a expressar as moléculas HLA-DR, CD86 e CD11c. As células tumorais modificadas pelos Exo induziram a produção de IL-6 e IL-10, detectados no sobrenadante das co-culturas destas com linfócitos T. Estas células tumorais também induziram aumento do número de linfócitos produtores de IFN-<font face=\"Symbol\">g, pré-sensibilizados contra antígenos tumorais, e aumento da expressão de SOCS3 nestes. Em conclusão, nossos resultados mostram que, Exo de DCs alteram o fenótipo de células tumorais, modificando sua interação com linfócitos T, sem induzir nas mesmas capacidade de ativar respostas proliferativas ou citotóxicas de linfócitos T in vitro. / Exosomes (Exo) originated from dendritic cells (DCs) contain molecules involved in antigen presentation. The present work sought to determine if Exo from DCs would be able to transfer immunogenicity to tumor cells. Exo isolated from DCs cultures carried HLA-ABC, HLA-DR, CD86, CD11c, CD81, CD54 and CD18. These Exo were added to cultures of the human breast adenocarcinoma cell line, SK-BR-3, which gained expression of HLA-DR, CD86 and CD11c. Tumor cells modified by Exo induced IL-6 and IL-10 production, detected in the supernatant of their co-cultures with T lymphocytes. These tumor cells also induced an increase in the frequency of IFN-<font face=\"Symbol\">g-producing T lymphocytes, pre-sensitized against tumor antigens, and an increased expression of SOCS3. In conclusion, our results show that, Exo from DCs affect the phenotype of tumor cells, modifying their interaction with T lymphocytes, without inducing the ability to activate cytotoxic or T cell proliferative responses in vitro.
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Exossomos derivados de células dendríticas como adjuvantes naturais na resposta antitumoral. / Dendritic cells-derived exosomes as natural adjuvants in antitumor responses.Graziela Gorete Romagnoli 18 May 2012 (has links)
Exossomos (Exo) originados de células dendríticas (DCs) carregam moléculas associadas à apresentação antigênica. Neste trabalho procurou-se estabelecer se Exo de DCs seriam capazes de conferir imunogenicidade às células tumorais. Os Exo isolados de culturas de DCs expressavam as moléculas HLA-ABC, HLA-DR, CD86, CD11c, CD81, CD54 e CD18. Estes foram então adicionados às células da linhagem humana de adenocarcinoma mamário, SK-BR-3, as quais passaram a expressar as moléculas HLA-DR, CD86 e CD11c. As células tumorais modificadas pelos Exo induziram a produção de IL-6 e IL-10, detectados no sobrenadante das co-culturas destas com linfócitos T. Estas células tumorais também induziram aumento do número de linfócitos produtores de IFN-<font face=\"Symbol\">g, pré-sensibilizados contra antígenos tumorais, e aumento da expressão de SOCS3 nestes. Em conclusão, nossos resultados mostram que, Exo de DCs alteram o fenótipo de células tumorais, modificando sua interação com linfócitos T, sem induzir nas mesmas capacidade de ativar respostas proliferativas ou citotóxicas de linfócitos T in vitro. / Exosomes (Exo) originated from dendritic cells (DCs) contain molecules involved in antigen presentation. The present work sought to determine if Exo from DCs would be able to transfer immunogenicity to tumor cells. Exo isolated from DCs cultures carried HLA-ABC, HLA-DR, CD86, CD11c, CD81, CD54 and CD18. These Exo were added to cultures of the human breast adenocarcinoma cell line, SK-BR-3, which gained expression of HLA-DR, CD86 and CD11c. Tumor cells modified by Exo induced IL-6 and IL-10 production, detected in the supernatant of their co-cultures with T lymphocytes. These tumor cells also induced an increase in the frequency of IFN-<font face=\"Symbol\">g-producing T lymphocytes, pre-sensitized against tumor antigens, and an increased expression of SOCS3. In conclusion, our results show that, Exo from DCs affect the phenotype of tumor cells, modifying their interaction with T lymphocytes, without inducing the ability to activate cytotoxic or T cell proliferative responses in vitro.
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Caracterização imunoistoquímica comparativa de subgrupos de células dendríticas e oncogênese viral no carcinoma espinocelular oral e orofaríngeo /Silveira, Heitor Albergoni. January 2020 (has links)
Orientador: Jorge Esquiche León / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço (CECCP) é o quinto tipo de câncer mais comum e a sexta causa de morte por câncer. Recentes estudos enfatizam o CEC oral (CECO) como uma entidade distinta do CEC de orofaringe (CECorof), com este último apresentando melhor prognóstico e estreitamente associado com infecção pelo papilomavírus humano (HPV). A etiologia do CECCP é multifatorial; porém, o CECO está relacionado com abuso do tabaco e álcool, enquanto o CECorof está frequentemente associado com infecção pelo HPV. As células dendríticas (CDs) são importantes células as quais regulam repostas imunes, incluindo aquelas vinculadas à tumorigênese, estabelecendo conexão entre o sistema imune inato e adaptativo. Estão divididas em dois grupos: CDs mieloides (CDmi) e CDs plasmocitóides (CDp), incluindo CDs imaturas (CDim) e CDs maduras (CDm). O objetivo do nosso estudo foi analisar comparativamente, através da técnica de imunoistoquímica (IQ) e hibridização in situ (HIS), a infiltração de CDmi e CDp, incluindo subgrupos de CDim e CDm, no CECO (n=109) e CECorof (n=126), bem como analisar a oncogênese viral (HPV amplo espectro, alto risco (ARHPV) e baixo risco (BRHPV) oncogênico e vírus Epstein-Barr [VEB]) por HIS. O CECOrof (25%) comparado com o CECO (11%) mostrou associação significativa com o HPV. No CECorof e no CECO, 19 e 7 mostram positividade para ARHPV (somente), 6 e 3 BRHPV (somente) e 3 e 2 ARHPV/BRHPV (co-infecção), respectivamente. Os tumores HPV-positivos compara... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre
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Diseño de sistema para experimentación y exhibición de bioceldas solares para laboratorios de nanotecnologiaNorris Squirrell, Constance January 2015 (has links)
Memoria para optar al título de Diseñador Industrial / Sistema experimental y exhibidor desarrollado para facilitar la investigación de celdas solares biosintetizadas, configuradas en modelo por capas con vidrio FTO. Dicho sistema, representa las siguientes ventajas para el trabajo del investigador:
1)Actúa como complemento en instancias complejas y propensas a error del proceso de investigación. Siendo sus resultados más verídicos, ya que se utiliza un modelo experimental estandarizado. Y por otra parte, una menor cantidad de errores derivados a las herramientas experimentales y al operador.
2)Comunicación de los alcances principales de la investigación, a través de un medio que permite la interacción de los científicos con un público fuera del área académica, apoyados en el acto empírico que sustenta los alcances alcanzados .Complementando la teoría con la demostración in situ.
La implementación del sistema experimental en la investigación, significa para el proceso
a) Estandarización de las muestras y disminución de errores en su preparación, gracias a la preparación de los elementos para la experimentación, a través de plantillas de demarcación y de ensamblaje.
b) Aplicación del electrolito de manera más eficiente (capa homogénea) y como un proceso más cómodo para el científico.
c) Estandarización y simplificación del contexto experimental (fuente de luz y circuito eléctrico
d) Mejora de los parámetros fotovoltaicos de las celdas
e) Extensión de la vida útil de las células solares, de 43 minutos en promedio a 7 días. Lo que representa una gran ventaja en la investigación, ya que le otorga más confiabilidad a los resultados (puesto que descarta bajas significativas en las propiedades eléctricas de la celda v/s tiempo transcurrido). Además permite la repetición de las evaluaciones con la misma muestra.
f) Disminución del tiempo promedio total de experimentación (desde la preparación de los elementos hasta la evaluación de todas las muestras.) De 8,5 horas a 3,3 horas (en un 61%). Es importante aclarar, que este tiempo promedio considera repeticiones por errores del investigador y de las evaluaciones en sí.
g) Mejor aprovechamiento de los recursos, ya que se requieren menos repeticiones en la construcción de las celdas, se cuida la integridad de los vidrios FTO (extendiendo su vida útil). Además, se requiere de una menor cantidad de electrolito por celda. / 01-01-2021
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Relación estructura/función entre la proteína kinasa ck2 y la enzima convertidora de endotelina - 1c, y evaluación de su efecto en la progresión tumoral de células de cáncer colorrectalNiechi Gaete, Ignacio Alfredo January 2016 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa
de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado
que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La
región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por
la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por
CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer
de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza
a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”.
El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c
en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en
el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se
plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila
a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal;
2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c
en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía
ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal.
Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene
tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a
este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la
región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que
CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados
al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando
que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la
fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento
con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1.
La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1
total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición
de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-
1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó
los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de
ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron
ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que
la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal
de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de
colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y
no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron
tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos
funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de
transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial
migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión
de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar
la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos
resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta
la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión
de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo
por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora
enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease
involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in
invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region
of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we
studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion
in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein
kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness
of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether
CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability
and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal
cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were
considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal
region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether
CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal
cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion
of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation.
An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three
putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this
background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive
ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing
that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing
phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the
phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation
occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation
assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1
phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark.
Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition
in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition
using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1
and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally,
assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed
that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region
of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this
context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2
expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability,
respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion
using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing
the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable
by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive
capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion
is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting
enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal
end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes
malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt
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Determinación de la eficiencia de transfección de un plásmido portador del gen de proteína de fluorescencia verde en células madres mesenquimales bovinas obtenidas desde médula ósea fetalDíaz Pérez, Paulina Veronica January 2015 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El potencial de autorenovación y diferenciación multilinaje ha generado expectativas respecto del uso de células madres mesenquimales (CMM) para ingeniería tisular y medicina regenerativa. En este sentido es relevante evaluar el potencial de manipulación genética de las CMM. El objetivo del presente estudio fue determinar la eficiencia de transfección del plásmido pTracer/CMV/Bsd mediante la utilización de Lipofectamina LTX en CMM aisladas desde medula ósea bovina. CMM aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) mediante adherencia al plástico, fueron cultivadas en presencia de una combinación en concentraciones crecientes de pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) y de Lipofectamina LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μl/ml). Luego de 24 horas, el número de CMM positivas a la proteína de fluorescencia verde (GFP) fue determinado por conteo visual mediante microscopía de epifluorescencia y confirmado por citometría de flujo. Los niveles de mRNA de GFP en CMM fueron determinados mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La utilización de 750 ng/ml de pTracer/CMV/Bsd y 9 μl/ml de Lipofectamina LTX permitieron alcanzar una mayor proporción de células positivas a GFP (15,7%, P<0,05). La concentración mínima efectiva de blasticidina fue de 2 μg/ml. Cultivos de CMM transfectadas y seleccionadas con blasticidina por 21 días, generaron escasas colonias de CMM positivas a GFP. Estas células expresaron mRNA de GFP con un valor CT de 9,94. En conclusión, a pesar de presentar una baja eficiencia de transfección, es posible incorporar de manera estable el plásmido pTracer/CMV/Bsd utilizando Lipofectamina LTX en CMM bovinas fetales. / The self-renewal and multilineage differentiation potential has generated expectations for the potential use of mesenchymal stem cells (MSC) in tissue engineering and regenerative medicine. In this respect, it is relevant to evaluate the potential for genetic manipulation of MSC. The main objective of the present study was to determine the transfection efficiency of the plasmid pTracer/CMV/Bsd using Lipofectamine LTX in bovine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC). MSC were isolated from bone marrow collected from bovine fetuses (7-9 months of gestation, n=3), based on the capacity to adhere to plastic culture flasks. Thereafter, MSC were cultured in presence of a combination of increasing concentrations of pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) and Lipofectamine LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μL/mL). After 24 hours, the number of GFP-positive MSC was determined by visual counting using an epifluorescense microscope and corroborated by flow cytometry. The levels of GFP mRNA were determined by quantitative PCR (Q-PCR). The use of 750 ng/mL of pTracer/CMV/Bsd and 9 μL/mL of Lipofectamina LTX allowed to achieve the highest proportion of GFP-positive MSC (15.7%, P<0.05). The lowest effective blasticidin concentration was of 2 μg/mL. Culture of transfected MSC and selection for 21 days using blasticidin resulted in reduced number of isolated GFP-positive MSC colonies. These cells expressed a GFP mRNA with a CT value of 9.94. In conclusion, despite the low transfection efficiency, it is possible to incorporate a pTracer/CMV/Bsd plasmid using Lipofectamine LTX in MSC isolated from bovine fetuses. / Proyecto Fondecyt 11100205
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Papel de VRAC en la esteroidogenesis inducida por gonadotrofina en células de la granulosa humanaOlivero Rebolledo, Pablo Esteban January 2007 (has links)
La estimulación por LH induce la continuación de la meiosis en el ovocito, cambios en las propiedades secretoras de las células del cúmulo y la reprogramación de las células de la granulosa del muro con destino lúteo. Sin embargo, sólo las células de la granulosa del muro expresan el receptor en el folículo. Entonces, la gonadotropina activa la reprogramación de las células de la granulosa del muro y a la información química y eléctrica fluye hacia todo el folículo. La esteroidogénesis es dependiente de los flujos iónicos de membrana, especialmente, de una salida de cloruro inducida por hCG similar a las de regulación de volumen. Nuestro objetivo fue determinar el papel de la salida de cloruro en la esteroidogénesis aguda inducida por hCG en cultivos primarios de células de la granulosa del muro humana. Resultados: hCG aumenta 2,4 veces la acumulación de progesterona. Las maniobras que favorecen la salida de cloruro, como la disminución del anión extracelular y la hipotonicidad, aumentan la acumulación de progesterona. Además, la acumulación de progesterona inducida por hCG es inhibida por DIDS, tamoxifeno y hipertonicidad. hCG induce activación de VRAC, y concomitantemente, disminución del volumen celular y despolarización de membrana. Además, hCG activa oscilaciones del Ca2+ intracelular, dependiente de actividad PLC, y una tardía entrada de calcio activada por despolarización por salida de Cl-. La actividad de cPKC es necesaria para la acumulación de progesterona. Nuestros resultados sugieren que la activación de VRAC es necesaria para la esteroidogénesis aguda inducida por hCG, a través del control sincrónico de la expresión y activación de la proteína reguladora de la esteroidogénesis aguda (StAR) paso limitante de la velocidad de la biosíntesis de esteroides en células de la granulosa humana en cultivo primario.
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Efecto inmunomodulador de las células madre mesenquimales sobre linfocitos TH17 : evaluación en un modelo murino de encefalomielitis autoinmune experimentalBravo Alegría, Javiera Beatriz January 2012 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / Las Células Madre Mesenquimales (MSCs) se han propuesto como una nueva terapia para las enfermedades autoinmunes debido a la inmunosupresión que ejercen sobre linfocitos T. Sin embargo, estudios in vitro han demostrado que bajo ciertas condiciones, las MSCs son capaces de favorecer la generación de linfocitos T CD4+ IL-17+ (Th17) proinflamatorios pero siempre suprimen a linfocitos T CD4+ IFNy+ (Th1). En el siguiente trabajo, decidimos evaluar el efecto in vivo de las MSCs en ratones con Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE), a diferentes tiempos de la enfermedad y estudiar las poblaciones linfocitarias Th1 y Th17 en Sistema Nervioso Central (SNC), bazo y nódulos linfáticos. Para ello, se indujo EAE en ratones hembras C57BL/6 (de 5 a 8 semanas) con 50 μg MOG35-55. 1x106 de MSCs fueron administradas intravenosamente a días 10 (n=6), 18 (n=7) y 30 (n=6) en diferentes grupos experimentales, manteniendo un control sin tratamiento (n=5). El puntaje clínico clásico y atípico fue asignado según se describió previamente por Domingues et al en el 2010. Al día 52 post inducción, se extrajeron nódulos linfáticos, bazo y SNC. Linfocitos Th1 y Th17 obtenidos de bazo y nódulos linfáticos fueron analizados a través de citometría de flujo y se observó la presencia de linfocitos Th17 en SNC mediante la detección de RORγT por PCR en tiempo real.
El tratamiento con MSCs a los días 10 y 18 tiende a disminuir la severidad de la enfermedad, y el tratamiento al día 30 tiende a aumentarla, comparando con un control sin tratamiento, aunque no se observan diferencias significativas. La razón de linfocitos Th17/Th1 tiende a aumentar en ratones tratados al día 30 en bazo y en nódulos linfáticos, sin embargo el porcentaje de Th17 es mayor en ratones tratados con MSCs al día 10, lo que se observa tanto en nódulos linfáticos como en médula espinal. Luego del tratamiento con MSCs se observó en todos los grupos experimentales la aparición de signos atípicos relacionados con la infiltración de Th17 en cerebro.
Aparentemente, la inyección de MSCs genera un aumento de Th17 en ratones con EAE, aunque de forma diferente, dependiendo del órgano observado y el tiempo de la inyección. A pesar de la disminución de severidad que se ha observado en este modelo en publicaciones anteriores, estos resultados nos indican que el tratamiento con MSCs genera la aparición de estirpes pro inflamatorias que pueden afectar la estabilidad de una enfermedad autoinmune / Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have been proposed as a new therapy in autoimmune pathology, due to the immune suppression exerted on T lymphocytes. Nevertheless in vitro studies show that in certain conditions MSCs favor the generation of CD4+ IL-17+ T Lymphocytes (Th17) but always suppresses CD4+ IFNy+ T Cells (Th1). We decided to evaluate the in vivo effect of MSCs in Experimental Autoimmune Encephalitis (EAE) at different times of the disease and to study the Th1 and Th17 population in Central Nervous System (SNC), spleen and lymph nodes. With this aim, EAE disease in female C57BL/6 (5-8 weeks) mice was induced with 50 μg MOG35-55. 1x106 MSCs was administrated intravenously at days 10 (n=6), 18 (n=7) and 30 (n=6), considering a not treatment control (n=5). The classical and atypical EAE scores were given as was describe previously (Domingues et al, 2010). At day 52, lymph nodes, spleen and spinal cord and where extracted. Th1 and Th17 cells from spleen and lymph nodes were evaluated through flow cytometry and Th17 were check in spinal cord by the detection of RORγT by Real Time PCR.
Day 10 treatment with MSCs tends to ameliorate the disease as at 18, and day 30 treatment tends to increase the disease, compares with EAE control. No-significant changes were observed in cumulate score between groups. Th17/Th1 Ratio tends to increase in mice treated at day 30 in spleen and in lymph nodes, but Th17 percent is higher in day 10 MSCs treated mice lymph nodes similar what is shown in spinal cord. After MSCs Treatment, the appearance of atypical EAE signs, related to Th17 cells brain infiltration was observed.
Apparently, the MSCs injection causes an increase of Th17 cells in EAE mice, but in a differently, depending on the tissue and the time of injection. Despite the decrease in the severity that was observed in this model in previous publications, these results indicate that treatment with MSCs creates the appearance of pro-inflammatory strains that may affect the stability of an autoimmune disease / Fondo de Ayuda a la Investigación Código FAI-MED-02-2010
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Extractos de maqui y calafate inhiben mecanismos inflamatorios característicos de la obesidad, en un modelo in vitro de adipocitos y macrófagos humanosOvalle Marín, Angélica Paz January 2015 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / La obesidad se ha posicionado como un alarmante problema de salud por su alta
prevalencia a nivel mundial, realidad de la que Chile no queda exento. Esta patología se
presenta debido a un desbalance energético positivo mantenido en el tiempo, que
conduce a la expansión del tejido adiposo y a una posterior infiltración de monocitos al
tejido. Como consecuencia, se establece una interacción adipocito-macrófago que
desencadena un característico estado inflamatorio crónico de bajo grado. Dicho estado
inflamatorio se asocia al desarrollo de co-morbilidades tales como diabetes tipo 2,
enfermedades cardiovasculares, entre otras. Por ello, es de gran interés investigar nuevas
estrategias nutricionales que logren contrarrestar los mecanismos proinflamatorios
asociados al desarrollo de obesidad. En este sentido, se ha descrito que los frutos nativos
chilenos, Aristotelia chilensis (Maqui) y Berberis microphylla (Calafate), tienen un alto
contenido de polifenoles, los cuales se han asociado a respuestas anti-inflamatorias en
diversos modelos de experimentación. De esta manera, la presente investigación evaluó
los efectos anti-inflamatorios de extractos acuosos de Maqui y Calafate sobre la respuesta
patogénica de adipocitos y macrófagos humanos activados con LPS y TNF-α in vitro,
respectivamente, considerando a Vaccinium corymbosum (Arándano) como un control
positivo no nativo. Para este propósito, se utilizó una línea celular monocítica humana
(THP-1) y una línea celular comercial de preadipocitos viscerales humanos, y se
realizaron ensayos para determinar los efectos antinflamatorios, adipogénicos,
antilipolíticos, antioxidantes e insulino-sensibilizadores de los extractos. Los resultados
obtenidos muestran que ambos extractos inhibieron la apoptosis y promovieron viabilidad
celular; el extracto de maqui disminuyó la secreción de óxido nítrico y la expresión génica
de IL-10; y el extracto de calafate disminuyó la secreción de IL-6 en macrófagos. Además,
ambos extractos disminuyeron la apoptosis y la secreción de IL-6, aumentaron los niveles
de GSH y no presentaron efecto sobre la adipogénesis; el extracto de maqui aumentó la
actividad de la superóxido dismutasa, la captación de glucosa y los niveles de p-PI3K; el
extracto de calafate inhibió la lipólisis, la secreción de MCP-1 en adipocitos. En
conclusión, los extractos de maqui y calafate presentaron respuestas antiinflamatorias en
macrófagos y adipocitos humanos, por lo que podrían tener implicancia en la prevención o
el tratamiento de comorbilidades asociadas a obesidad / Obesity has emerged as an alarming health problem given its high prevalence worldwide,
reality that Chile is not exempt. This condition occurs due to a positive energy imbalance
maintained over time leading to the expansion of adipose tissue and subsequent tissue
infiltration of monocytes. Consequently, an adipocyte-macrophage interaction triggers a
chronic low-grade inflammatory state is established. This inflammatory condition is
associated with the development of co-morbidities such as type 2 diabetes, cardiovascular
diseases, among others. It is therefore of great interest to investigate new nutritional
strategies that can counteract the proinflammatory mechanisms associated with the
development of obesity. In this regard, it has been described that Chilean native fruits,
Aristotelia chilensis (Maqui) and Berberis microphylla (Calafate), have a high content of
polyphenols, which have been associated with antioxidant and anti-inflammatory
responses in various experimental models. Thus, this research evaluated the antiinflammatory
effects of Maqui and Calafate aqueous extracts on the pathogenic response
of in vitro activated human macrophages and adipocytes with LPS and TNF-α,
respectively, considering a Vaccinium corymbosum (Blueberry) as a nonnative positive
control. Human monocytic cell line (THP-1) and visceral preadipocytes was used for this
purpose, and assays were performed to determine the anti-inflammatory, adipogenic,
antilipolytic, antioxidants and insulin sensitizers effects of extracts. The results exhibit that
both extracts inhibited apoptosis andpromoted cell viability; maqui extract decreased nitric
oxide secretion and gene expression of IL-10; and calafate extract decreased IL-6
secretion in macrophages. Also, both extracts decreased apoptosis and IL-6 secretion,
increased levels of reduced glutathione and exhibit no effect on adipogenesis; maqui
extract increased the activity of superoxide dismutase, glucose uptake and p-PI3K levels;
calafate extract decreased lipolysis and MCP-1 secretion in adipocytes. In conclusion,
Maqui and Calafate extracts showed anti-inflammatory responses in human adipocytes
and macrophages, which could have implications in the treatment or prevention of
comorbidities associated with obesity / Fondecyt
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