CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O lÃtex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) à um produto quÃmico complexo, constituÃdo de uma diversidade de molÃculas e tem sido amplamente utilizado na medicina popular sobre enfermidades dermatolÃgicas. O potencial da fraÃÃo de proteÃnas do lÃtex (PL) em induzir danos celulares foi avaliado pelos testes de MTT e LDH. AlÃm disso, PL foi utilizada no preparo de uma biomembrana associada ao poli (Ãlcool vinÃlico) (BioMem PVA/PL 0,2% e 1%). As propriedades fÃsico-quÃmica das membranas controle (PVA 1%) e teste (BioMem PVA/PL 1%) foram avaliadas atravÃs da espectroscopia de absorÃÃo na regiÃo do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e anÃlise termogravimÃtrica (TGA). O efeito das proteÃnas do lÃtex na cicatrizaÃÃo foi investigado apÃs induÃÃo de feridas incisionais ou excisionais no dorso de camundongos, seguido da implantaÃÃo da BioMem PVA/PL 0,2% ou 1%. O processo cicatricial foi avaliado de acordo com os parÃmetros: anÃlise macroscÃpica (induÃÃo da neoformaÃÃo tecidual em feridas incisionais e edema, hiperemia, reduÃÃo da Ãrea e reepitelizaÃÃo em feridas excisionais); microscÃpica (degranulaÃÃo de mastÃcitos, edema, infiltrado de leucÃcitos, nÃmero de fibroblastos e colagÃnese). Marcadores e mediadores da fase inflamatÃria (MPO, nitrito, IL-1β e TNF-α) foram avaliados em feridas incisionais e excisionais. O efeito da BioMem PVA/PL sobre a densidade microvascular foi avaliado em feridas incisionais. O possÃvel efeito de PL em estimular diretamente macrÃfagos foi investigado em uma cultura de cÃlulas. PL nÃo apresentou in vitro citotoxicidade sobre neutrÃfilos humanos, visto pela baixa atividade de LDH e a alta viabilidade dos neutrÃfilos pelo teste do MTT. A anÃlises fÃsico-quÃmicas demonstraram que nÃo ocorreram interaÃÃes fortes do PVA com PL, jà que nÃo foi observada a formaÃÃo de novas bandas ou o deslocamento destas. AlÃm disso, a solubilizaÃÃo destes compostos tornou a BioMem PVA/PL termicamente mais estÃvel. Nos modelos experimentais de cicatrizaÃÃo, as anÃlises macroscÃpicas demonstraram que BioMem PVA/PL 0,2% e 1% induziram a neoformaÃÃo tecidual em feridas incisionais nos dias 2, 7 e 14 apÃs a implantaÃÃo das membranas. Entretanto, nÃo interferiu na densidade da microvascularizaÃÃo ao tecido neoformado. Em feridas excisionais, BioMem PVA/PL 0,2% induziu aumento do edema, mas nÃo interferiu na hiperemia na fase inflamatÃria. Na fase proliferativa da cicatrizaÃÃo, acelerou a reduÃÃo da Ãrea das feridas e favoreceu a reepitelizaÃÃo. A anÃlise microscÃpica de feridas incisionais e excisionais evidenciou que BioMem PVA/PL 0,2% ou 1% conferiu um estÃmulo à degranulaÃÃo de mastÃcitos, edema e migraÃÃo de leucÃcitos na fase inflamatÃria do processo cicatricial. Na fase proliferativa foi evidenciado aumento na populaÃÃo de fibroblastos e colagÃnese. A anÃlise da reepitelizaÃÃo de feridas excisionais evidenciou um aumento da espessura do epitÃlio neoformado. A implantaÃÃo da BioMem PVA/PL 0,2% aumentou os nÃveis de marcadores e mediadores da resposta inflamatÃria, tais como MPO, nitrito, IL-1β e TNF-α. MacrÃfagos cultivados de camundongos e estimulados com PL foram induzidos a liberaÃÃo de TNF- e IL-1β. A anÃlise integrada de todos os resultados sugerem que as proteÃnas do lÃtex (PL) atuam significativamente na fase inflamatÃria da cicatrizaÃÃo, o que parece influenciar diretamente as fases subseqÃentes do processo cicatricial. / The latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) is a complex chemical, consisting of a variety of molecules and has been widely used in folk medicine on skin diseases. The potential of the latex proteins fraction (LP) in induce cell damage was assessed by MTT and LDH tests. Moreover, LP was used to prepare a biomembrana associated with poly (vinyl alcohol) (BioMem PVA/PL 0,2% and 1%).The physical-chemical properties of control (PVA 1%) and test (BioMem PVA/PL 1%) were assessed by infrared spectroscopy (FTIR) and thermogravimetric (TGA) analysis. The effect of laticifers proteins at healing was investigated after induction of incision or excision wounds on the back of mices, followed by implantation of BioMem PVA/PL 0,2% or 1%. Healing process was evaluated by the parameters: macroscopic analyses (induction of tissue neoformation of incisional wounds and edema, hyperemia, area reduction and re-epithelialization of excision wounds); microscopic (mast cell degranulation, edema, leucocyte infiltrate, number of fibroblasts and collagenesis). Inflammatory markers and mediators (MPO, nitrite, IL-1β e TNF-α) were evaluated in incision and excision wounds. Microvessel density was evaluated in incision wounds. The possible effect of soluble protein fraction (LP) to directly stimulate macrophages was investigated in a cell culture. PL shows no cytotoxicity in vitro in human neutrophils, since the low activity of LDH and high vibility of neutrophils by MTT test. The physico-chemical analysis showed that no strong interaction with PVA and LP occurred, since was not observed the formation of new bands or the displacement of these. Futhermore, the solubility of these compounds became the BioMem PVA/PL more thermally stable. At experimental healing models, macroscopic analyses showed that BioMem PVA/PL 0,2% e 1% leads tissue neoformation in incisional wounds at the 2, 7 and 14 days after membrane implantation. However, no effect on the microvascular density to neoformed tisse of incisional wounds were seen. At excisional wounds, BioMem PVA/PL 0,2% induce increase of edema, but not hyperemia at inflammatory phase. Moreover, accelerated the reduction in the wound area and an improved re-epithelialization at proliferative phase of wound healing. Microscopic analysis of incisional and excisional wounds showed that BioMem PVA/PL 0,2% or 1% lead a stimulus to mast cell degranulation, edema, leucocyte migration at inflammatory phase of the cicatricial process. At the proliferative phase, was evidenced an increase in the population of fibroblasts and collagenesis. Re-epithelialization of excisional wounds showed an increased thickness of the newly formed epithelium. BioMem PVA/PL 0,2% implantation increased the levels of markers and mediators of the inflammatory response, such as MPO, nitrite, IL-1β and TNF-α. Culture mouse macrophages stimulated with PL were induced to release of TNF- e IL-1β. Integrated analysis of all results suggest that PL act significantly in the inflammatory phase of healing, which seems to directly influence the subsequent phases of the healing process.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8501_1.pdf: 601697 bytes, checksum: 7ee6721021fee939e3e94dba413acf94 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) conhecida popularmente como algodão-deseda é um arbusto selvagem de origem africana rico em substâncias bioativas que determinam o potencial medicinal dessa espécie. Visto que o Diabetes mellitus é uma doença que atinge cerca de dez por cento da população mundial.e que o látex de C. procera já demonstou ser eficaz contra esta doença. Este trabalho buscou avaliar a atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera de ocorrência no litoral de Pernambuco - Brasil. Foram usados cinco grupos (n=6/grupo) de ratos Wistar machos para indução do diabetes com estreptozotocina (50 mg/kg, i.p). Em seguida, os animais foram tratados por via oral durante 4 semanas consecutivas com extrato liofilizado das folhas de Calotropis procera (300 e 600 mg/kg), metformina (500 mg/kg), insulina (6U, s.c.) e controle (água). Ao final do período de tratamento foram determinados a variação de massa corporal, o consumo de água e ração e indicadores bioquímicos (glicose, uréia, ácido úrico, creatinina, aminotransferases, colesterol total e triglicerídeos). Também foi conduzido o teste de tolerância oral à glicose (2 g/kg). Os resultados mostraram que o extrato de Calotropis procera (300 e 600 mg/kg) reduziu significativamente o nível de glicemia dos animais diabético durante o período integral de avaliação e melhorou o estado metabólico dos animais. Em adição, no teste de tolerância oral a glicose o extrato produziu diminuição estatisticamente significativa na glicemia aos 30 e 60 minutos. A triagem fitoquímica revelou e quantificou a presença de fenóis totais e flavonóides em 29,1 e 2,9% em unidades de ácido gálico e rutina, respectivamente. Desta forma conclui-se que o extrato das folhas de Calotropis procera possui atividade antihiperglicemiante possivelmente relacionado à presença de fenóis totais e flavonóides

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A planta Calotropis procera, pertencente à famÃlia Apocinaceae, tem como uma de suas principais caracterÃsticas a produÃÃo constitutiva de lÃtex. Este fluido à amplamente utilizado na medicina popular, principalmente da Ãndia, por apresentar diversas propriedades curativas. Na literatura, o produto da extraÃÃo do lÃtex Ãntegro com solvente aquoso e/ou orgÃnico desta planta à citado por apresentar atividade antinociceptiva e antiinflamatÃria. Por outro lado, a mesma preparaÃÃo do lÃtex tambÃm à relatada por induzir processos inflamatÃrios. O presente trabalho teve como objetivo fracionar o lÃtex da planta Calotropis procera para separar as atividades prÃ- e antiinflamatÃria; caracterizar estes mecanismos e avanÃar na identificaÃÃo das molÃculas envolvidas na atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva. O lÃtex coletado em Ãgua destilada (1:1; v/v) foi submetido Ãs etapas de centrifugaÃÃo e diÃlise e trÃs fraÃÃes foram obtidas (FD, PL e B) e inicialmente avaliadas quanto à presenÃa de atividade prÃ- e antiinflamatÃria, utilizando o modelo de peritonite em ratos. A fraÃÃo FD, rica em compostos de massa molecular inferior a 8.000 Da, nÃo se mostrou antiinflamatÃria quando administrada por via endovenosa nos animais. Por outro lado, uma forte atividade prÃ-inflamatÃria foi observada quando esta foi injetada na cavidade peritoneal de ratos. A resposta inflamatÃria induzida por FD foi dependente de tempo e dose e parece estar relacionada com a presenÃa de peptÃdeos detectados na fraÃÃo, jà que esta atividade foi diminuÃda quando a fraÃÃo foi tratada com pronase durante 24 horas antes de sua administraÃÃo nos ratos. A inflamaÃÃo induzida por FD foi inibida por Dexametasona, Talidomida e Meclizina sugerindo um processo inflamatÃrio induzido por vias de liberaÃÃo de histamina e TNF-α. A fraÃÃo PL, rica em proteÃnas, e a fraÃÃo borracha (B) nÃo foram prÃ-inflamatÃrias e apresentaram forte atividade antiinflamatÃria por via endovenosa. A atividade promovida por B parece estar relacionada à presenÃa de proteÃnas pertencentes à fraÃÃo PL, como observado em ensaio de detecÃÃo imunolÃgica. PL inibiu o processo inflamatÃrio induzido por FD. A atividade antiinflamatÃria promovida pela fraÃÃo PL parece ser um evento promovido pela aÃÃo de proteÃnas, visto que a atividade antiinflamatÃria da fraÃÃo foi perdida apÃs aquecimento ou tratamento com pronase, e permaneceu ativa apÃs precipitaÃÃo com acetona. TrÃs novas sub-fraÃÃes (PI, PII e PIII) foram obtidas apÃs aplicaÃÃo da fraÃÃo PL em coluna de troca iÃnica (CM-Sepharose Fast Flow) em pH 5,0. As sub-fraÃÃes, distintas entre si, como observado atravÃs de eletroforese em gel de poliacrilamida, foram igualmente capazes de reverter a inflamaÃÃo induzida por carragenina no modelo de peritonite em ratos, bem como reduzir as contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico, evidenciando o envolvimento de mÃltiplas proteÃnas na resposta antiinflamatÃria e antinociceptiva produzida pela fraÃÃo PL. Ensaio de microscopia intravital revelou que PI, PII e PIII inibem o rolamento e a adesÃo leucocitÃria no mesentÃrio de camundongos. Somente PI induziu intensa produÃÃo de Ãxido nÃtrico em ratos alÃm de ter sido a Ãnica sub-fraÃÃo capaz de reverter a resposta prÃ-inflamatÃria promovida pela fraÃÃo FD, evidenciando diferentes mecanismos antiinflamatÃrios promovidos por diferentes proteÃnas do lÃtex. A atividade antiinflamatÃria nÃo foi observada quando a fraÃÃo PL foi administrada por via oral nos animais. Este à o primeiro trabalho que confirma a presenÃa de duas atividades antagonistas no lÃtex de C. procera e que estas sÃo promovidas por molÃculas distintas passÃveis de serem separadas com base em seu tamanho molecular. O conjunto de resultados aqui apresentados mostra que a atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva do lÃtex foram promovidas por molÃculas protÃicas / Latex is a general term used to describe fluid exudates from plants after mechanical injury. Latex from Calotropis procera is well known for its medicinal properties mainly in Indian traditional medicine. Moreover, it has been experimentally shown that it exhibits interesting biological activities such as anti-inflammation. However its latex has been reported to induce proinflammatory responses. In the present work, (1) the latex was fractionated to segregate pro- and anti-inflammatory activities; (2) assays were carried out to characterize the mechanism of action of active fractions and (3) attempts were done to identify molecules involved in anti-inflammatory and antinociceptive activities. First, the latex was collected in distilled water (1:1; v/v) and submitted to centrifugation and dialysis steps to obtain three different fractions (FD, PL and B). These fractions were evaluated to pro- and anti-inflammatory activities using peritonitis model in rats. FD, constituted by compounds with molecular mass lower than 8,000 Da, did not exhibited anti-inflammatory activity, however induced intense neutrophil migration into peritoneal cavity of rats. The inflammation induced by FD was time and dose dependent. Moreover, it was seen that previous injection of Dexamethasone, Thalidomide and Meclizine in animals inhibited FD inflammatory responses suggesting that inflammation triggered by this fraction occurs through histamine and TNF-α release. Peptides, present in FD as shown in electrophoresis, should be involved in inflammation responses displayed by FD since such activity was diminished after 24 hour pronase treatment. Fractions PL, and B did not induce inflammatory response when injected into peritoneal cavity of animals, however intravenous injection displayed strong anti-inflammatory activity against inflammation induced by carrageenan. The anti-inflammatory activity promoted by B seems to be related to PL proteins present in B. PL fraction inhibited neutrophil migration trigged by FD. PL anti-inflammatory activity ought to be related to proteins since such activity was completely abolished after heat or pronase treatment and it still remained after acetone precipitation. Three protein sub-fractions (PI, PII and PIII) were recovered after PL chromatography on ion-exchange column (CM-Sepharose Fast flow) at pH 5.0. In spite of the fact that PI, PII e PIII were seen to be different by electrophoresis they were equally able to inhibit neutrophil migration induced by carrageenan in rats as well as abdominal writhes stimulated by acetic acid in mice. Intravital microscopy assay revealed that, PI, PII and PIII inhibit both leucocyte rolling and adhesion in mice mesenteric tissues. In addition, PI was able to induce nitric oxid production and inflammation induced by FD. These results show that multiples proteins in PL display anti-inflammatory activity and they act at different pathway of inflammation. Several experiments were performed aiming to detect the anti-inflammatory activity of PL when it was administered by oral route however, we did not obtain success. This is the first report which confirms the presence of pro- and anti-inflammatory activities and it shows that such activities are displayed by compounds suitable to be fractionated on the basis of their molecular size. In addition, these results show that anti-inflammatory and antinociceptive activities are displayed by proteins present in the latex

OLIVEIRA, Raquel Sombra Basílio de. Caracterização bioquímica e mecanismo de ação do efeito protetor in vivo de proteínas do látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. sobre infecção letal induzida por Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium. 2010. 109 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-04T13:28:34Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_rsboliveira.pdf: 10124085 bytes, checksum: 7913896b3ed24d365503af04dded020c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:47:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_rsboliveira.pdf: 10124085 bytes, checksum: 7913896b3ed24d365503af04dded020c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_rsboliveira.pdf: 10124085 bytes, checksum: 7913896b3ed24d365503af04dded020c (MD5) Previous issue date: 2010 / Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection. / O látex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui moléculas com diferentes atividades farmacológicas, dentre estas, pró- e antiinflamatória. Neste trabalho, o efeito imunomodulatório da fração de proteínas solúveis do látex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculação de S. Typhimurium. Aspectos bioquímicos das proteínas do látex foram investigados e parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivência de até 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e não tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da indução da sepse. PL não apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de ação indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A população microbiana no fígado, baço e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas após inoculação bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactérias viáveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteínas do látex. O efeito protetor de PL foi revisto através de suas três sub-frações protéicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas através de fracionamento por cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As três sub-frações protéicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento térmico de PL (100 °C, 30 min.) ou inibição de suas proteases endógenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O óxido nítrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram níveis similares ao controle após 24 horas da infecção. Este resultado corroborou com a observação de que animais com sepse letal apresentaram falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de células para a cavidade peritoneal. Além disto, nestes animais, o nível de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provável atividade dos neutrófilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, após 4 e 24 horas de infecção, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas não em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migração de neutrófilos, enquanto que a linfopenia é parte da imunossupressão estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias após a infecção, sugerindo um estímulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no início da sepse (24 h), só ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutâmico oxalacética estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutâmico pirúvica não teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. Análises histopatológicas do fígado e baço mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado após sete dias. A análise integrada de todos os resultados sugere que as proteínas do látex modulam a resposta imunoinflamatória por mecanismo indireto, revertendo à falência da migração de neutrófilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunológica ainda não esclarecida, que permite a sobrevivência dos animais, mesmo sob infecção. Os resultados sugerem que a modulação de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacológicas de PL previamente descritas em modelos clássicos de inflamação são agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatória sistêmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido.

BANDEIRA, G. P. Caracterização bioquímica parcial do látex de Calotropis procera (Ait.) R.Br. e efeito sobre a eclosão de ovos e desenvolvimento larval do mosquito transmissor da dengue. 2006. 97 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-03-12T12:38:19Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_gpbandeira.pdf: 1851136 bytes, checksum: cc04228fd4a99ccfedf56c89cdd0d3b3 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-29T21:18:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_gpbandeira.pdf: 1851136 bytes, checksum: cc04228fd4a99ccfedf56c89cdd0d3b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-29T21:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_gpbandeira.pdf: 1851136 bytes, checksum: cc04228fd4a99ccfedf56c89cdd0d3b3 (MD5) Previous issue date: 2006 / Calotropis procera (Ait.) R.Br. (Asclepiadaceae) is a well-known medicinal plant with leaves, roots and bark being exploited by popular medicine to fight many human and animal diseases. Despite, the lack of information about its biochemical content has stimulated the present study. Healthy plants of C. procera growing in the field around the beaches of Fortaleza were used as the source of fresh latex. The latex was collected in distilled water to give a dilution rate of 1:2 (v:v). The mixture was gently agitated during collection to overcome the natural coagulation effect of the material. Later in the laboratory the samples were centrifuged at 5.000 x g during 10 min at room temperature. The rubber-rich precipitate was separated and the supernatant was exhaustively dialyzed against distilled water at room temperature and recentrifuged using the conditions described above. Three distinct fractions were obtained: LP (rich in proteins); DL (rich in low molecular weight molecules) and RL (rich in poly-isoprene rubber). LP fraction constitutes 10.03 % of the dry matter of the latex while DL > 1% and RL 84.97 %. The latex possesses relevant amounts of HCO-3, Mg+2, Cl-, lower quantities of SO4-2 , NO3- , NO2-, NH4+ and P-3, while Ca+2 and Fe+2 were not detected. Proteins in LP showed molecular mass varying between 8,000 - 97,000 Da further confirmed by mass spectrometry. They are essentially basic proteins. RL and LP exhibited similar protein profile and peptides were detected in DL. LP could be fractionated in three newly fractions by ion exchange chromatography and able to bind chitin. Enzymatic activity of chitinases, superoxide dismutase and ascorbate peroxidases were detected. Glicoproteínas bearing oligomanosídic and N-acetylgalactosamine seems to be present in LP. The whole latex was shown to cause 100 % mortality of 3rd instars within five minutes. Both LP and DL fractions were partially effective to prevent egg hatching and most of individuals growing under experimental conditions died before reaching 2nd instars or stayed in 1st instars. Besides, the fractions were very toxic to 3rd instars causing 100 % mortality within 24 hs. When both fractions were submitted to heat-treatment the toxic effects of LP were strongly diminished while that of DL diminished slowly suggesting low thermostability of the toxic compounds in LP. According to the results, the latex of C. procera exhibits strong insecticide action upon St. aegypti and it is expected that proteins are at least in part involved in that an activity. / Título - Caracterização Bioquímica Parcial do Látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. e Efeito Sobre a Eclosão de ovos e Desenvolvimento do mosquito transmissor da Dengue. Autor – Glaís de Paiva Bandeira. Introdução - O arbusto Calotropis procera (Ait.) R.Br. é um membro da família Asclepiadaceae. É vastamente encontrado no Estado do Ceará e tem como característica a produção de látex. Ao látex são atribuídas propriedades tóxicas e farmacológicas. Neste trabalho, uma caracterização bioquímica parcial do látex foi estabelecida e seu efeito sobre a eclosão de ovos e desenvolvimento larval do Mosquito transmissor da Dengue (Stegomyia aegypti) foi avaliado. Métodos - O látex foi coletado de plantas não cultivadas e após etapas de diálise e centrifugação deu origem a três frações: LP (rica em proteínas), DL (compostos de pequeno tamanho molecular e solúveis em água) e RL (fração rica em isopreno, insolúvel em água). Uma análise físico-química de elementos inorgânicos foi realizada. As frações foram analisadas através de eletroforese em uma e 2 dimensões, espectrometria de massas, técnicas cromatográficas e atividades enzimáticas. A presença de glicoproteínas foi investigada através de coloração em gel e análise por Ressonância Plasmônica de Superfície. Bioensaios para atividade ovicida e larvicida foram realizados com as frações LP e DL, além do látex íntegro. Resultados – A fração LP representou 10,03 % da massa seca do látex enquanto que DL representou menos que 1 % e RL 84,97 %. O látex possui quantidades apreciáveis de HCO-3, Mg+2, Cl-, quantidades menores de SO4-, NO3- , NO-2, NH4+ e P-3, enquanto que Ca+2 e Fe+2 não foram detectados. A fração PL apresentou proteínas com massa molecular relativa entre 8.000 - 97.000 Da e isto foi confirmado por Espectrometria de massa. Foi verificado que as frações RL e LP eram similares e peptídeos foram detectados na fração DL. A fração LP mostrou-se heterogênea em gel de eletroforese 2-D e as proteínas exibiram caráter essencialmente básico. Três picos protéicos foram recuperados por troca iônica. A fração LP foi capaz de se ligar à matriz de quitina e foi detectada atividade quitinásica. Atividades para, superóxido dismutase e ascorbato peroxidase foram detectadas, mas não para catalase. Glicoproteínas do tipo oligomanosídicas e N-acetillactosamina parecem estar presentes na fração LP. O látex total causou 100 % de mortalidade para larvas do terceiro estágio de St. aegypti. As frações também foram tóxicas causando 100 % mortalidade em 24 hs. Quando as frações LP e DL foram aquecidas a 100 °C a ação larvicida da fração LP diminuiu e a da fração DL foi pouco afetada sugerindo pouca termoestabilidade dos componentes ativos em LP. As frações LP e DL foram parcialmente efetivas em prevenir a eclosão dos ovos do mosquito e muitos dos indivíduos não atingiram o primeiro ou segundo estágio. É esperado que os efeitos tóxicos observados sobre a eclosão dos ovos e desenvolvimento das larvas poderiam ser, em parte, devido ao conteúdo protéico de LP.

OLIVEIRA, Jefferson Soares de. Múltiplas proteínas estão envolvidas nas atividades antiinflamatória e antinociceptiva do látex da planta medicinal Calotropis procera (AIT.) R. Br. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-25T13:19:57Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_jsoliveira.pdf: 2272072 bytes, checksum: 0182fc53b1ceb0d4a37902cd816bcd13 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T20:11:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_jsoliveira.pdf: 2272072 bytes, checksum: 0182fc53b1ceb0d4a37902cd816bcd13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T20:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_jsoliveira.pdf: 2272072 bytes, checksum: 0182fc53b1ceb0d4a37902cd816bcd13 (MD5) Previous issue date: 2009 / Latex is a general term used to describe fluid exudates from plants after mechanical injury. Latex from Calotropis procera is well known for its medicinal properties mainly in Indian traditional medicine. Moreover, it has been experimentally shown that it exhibits interesting biological activities such as anti-inflammation. However its latex has been reported to induce proinflammatory responses. In the present work, (1) the latex was fractionated to segregate pro- and anti-inflammatory activities; (2) assays were carried out to characterize the mechanism of action of active fractions and (3) attempts were done to identify molecules involved in anti-inflammatory and antinociceptive activities. First, the latex was collected in distilled water (1:1; v/v) and submitted to centrifugation and dialysis steps to obtain three different fractions (FD, PL and B). These fractions were evaluated to pro- and anti-inflammatory activities using peritonitis model in rats. FD, constituted by compounds with molecular mass lower than 8,000 Da, did not exhibited anti-inflammatory activity, however induced intense neutrophil migration into peritoneal cavity of rats. The inflammation induced by FD was time and dose dependent. Moreover, it was seen that previous injection of Dexamethasone, Thalidomide and Meclizine in animals inhibited FD inflammatory responses suggesting that inflammation triggered by this fraction occurs through histamine and TNF-α release. Peptides, present in FD as shown in electrophoresis, should be involved in inflammation responses displayed by FD since such activity was diminished after 24 hour pronase treatment. Fractions PL, and B did not induce inflammatory response when injected into peritoneal cavity of animals, however intravenous injection displayed strong anti-inflammatory activity against inflammation induced by carrageenan. The anti-inflammatory activity promoted by B seems to be related to PL proteins present in B. PL fraction inhibited neutrophil migration trigged by FD. PL anti-inflammatory activity ought to be related to proteins since such activity was completely abolished after heat or pronase treatment and it still remained after acetone precipitation. Three protein sub-fractions (PI, PII and PIII) were recovered after PL chromatography on ion-exchange column (CM-Sepharose Fast flow) at pH 5.0. In spite of the fact that PI, PII e PIII were seen to be different by electrophoresis they were equally able to inhibit neutrophil migration induced by carrageenan in rats as well as abdominal writhes stimulated by acetic acid in mice. Intravital microscopy assay revealed that, PI, PII and PIII inhibit both leucocyte rolling and adhesion in mice mesenteric tissues. In addition, PI was able to induce nitric oxid production and inflammation induced by FD. These results show that multiples proteins in PL display anti-inflammatory activity and they act at different pathway of inflammation. Several experiments were performed aiming to detect the anti-inflammatory activity of PL when it was administered by oral route however, we did not obtain success. This is the first report which confirms the presence of pro- and anti-inflammatory activities and it shows that such activities are displayed by compounds suitable to be fractionated on the basis of their molecular size. In addition, these results show that anti-inflammatory and antinociceptive activities are displayed by proteins present in the latex / A planta Calotropis procera, pertencente à família Apocinaceae, tem como uma de suas principais características a produção constitutiva de látex. Este fluido é amplamente utilizado na medicina popular, principalmente da Índia, por apresentar diversas propriedades curativas. Na literatura, o produto da extração do látex íntegro com solvente aquoso e/ou orgânico desta planta é citado por apresentar atividade antinociceptiva e antiinflamatória. Por outro lado, a mesma preparação do látex também é relatada por induzir processos inflamatórios. O presente trabalho teve como objetivo fracionar o látex da planta Calotropis procera para separar as atividades pró- e antiinflamatória; caracterizar estes mecanismos e avançar na identificação das moléculas envolvidas na atividade antiinflamatória e antinociceptiva. O látex coletado em água destilada (1:1; v/v) foi submetido às etapas de centrifugação e diálise e três frações foram obtidas (FD, PL e B) e inicialmente avaliadas quanto à presença de atividade pró- e antiinflamatória, utilizando o modelo de peritonite em ratos. A fração FD, rica em compostos de massa molecular inferior a 8.000 Da, não se mostrou antiinflamatória quando administrada por via endovenosa nos animais. Por outro lado, uma forte atividade pró-inflamatória foi observada quando esta foi injetada na cavidade peritoneal de ratos. A resposta inflamatória induzida por FD foi dependente de tempo e dose e parece estar relacionada com a presença de peptídeos detectados na fração, já que esta atividade foi diminuída quando a fração foi tratada com pronase durante 24 horas antes de sua administração nos ratos. A inflamação induzida por FD foi inibida por Dexametasona, Talidomida e Meclizina sugerindo um processo inflamatório induzido por vias de liberação de histamina e TNF-α. A fração PL, rica em proteínas, e a fração borracha (B) não foram pró-inflamatórias e apresentaram forte atividade antiinflamatória por via endovenosa. A atividade promovida por B parece estar relacionada à presença de proteínas pertencentes à fração PL, como observado em ensaio de detecção imunológica. PL inibiu o processo inflamatório induzido por FD. A atividade antiinflamatória promovida pela fração PL parece ser um evento promovido pela ação de proteínas, visto que a atividade antiinflamatória da fração foi perdida após aquecimento ou tratamento com pronase, e permaneceu ativa após precipitação com acetona. Três novas sub-frações (PI, PII e PIII) foram obtidas após aplicação da fração PL em coluna de troca iônica (CM-Sepharose Fast Flow) em pH 5,0. As sub-frações, distintas entre si, como observado através de eletroforese em gel de poliacrilamida, foram igualmente capazes de reverter a inflamação induzida por carragenina no modelo de peritonite em ratos, bem como reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido acético, evidenciando o envolvimento de múltiplas proteínas na resposta antiinflamatória e antinociceptiva produzida pela fração PL. Ensaio de microscopia intravital revelou que PI, PII e PIII inibem o rolamento e a adesão leucocitária no mesentério de camundongos. Somente PI induziu intensa produção de óxido nítrico em ratos além de ter sido a única sub-fração capaz de reverter a resposta pró-inflamatória promovida pela fração FD, evidenciando diferentes mecanismos antiinflamatórios promovidos por diferentes proteínas do látex. A atividade antiinflamatória não foi observada quando a fração PL foi administrada por via oral nos animais. Este é o primeiro trabalho que confirma a presença de duas atividades antagonistas no látex de C. procera e que estas são promovidas por moléculas distintas passíveis de serem separadas com base em seu tamanho molecular. O conjunto de resultados aqui apresentados mostra que a atividade antiinflamatória e antinociceptiva do látex foram promovidas por moléculas protéicas

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O lÃtex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui molÃculas com diferentes atividades farmacolÃgicas, dentre estas, prÃ- e antiinflamatÃria. Neste trabalho, o efeito imunomodulatÃrio da fraÃÃo de proteÃnas solÃveis do lÃtex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculaÃÃo de S. Typhimurium. Aspectos bioquÃmicos das proteÃnas do lÃtex foram investigados e parÃmetros bioquÃmicos, hematolÃgicos e histopatolÃgicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivÃncia de atà 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e nÃo tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da induÃÃo da sepse. PL nÃo apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de aÃÃo indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A populaÃÃo microbiana no fÃgado, baÃo e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas apÃs inoculaÃÃo bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactÃrias viÃveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteÃnas do lÃtex. O efeito protetor de PL foi revisto atravÃs de suas trÃs sub-fraÃÃes protÃicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas atravÃs de fracionamento por cromatografia de troca iÃnica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As trÃs sub-fraÃÃes protÃicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento tÃrmico de PL (100 ÂC, 30 min.) ou inibiÃÃo de suas proteases endÃgenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O Ãxido nÃtrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram nÃveis similares ao controle apÃs 24 horas da infecÃÃo. Este resultado corroborou com a observaÃÃo de que animais com sepse letal apresentaram falÃncia na migraÃÃo de neutrÃfilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de cÃlulas para a cavidade peritoneal. AlÃm disto, nestes animais, o nÃvel de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provÃvel atividade dos neutrÃfilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, apÃs 4 e 24 horas de infecÃÃo, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas nÃo em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migraÃÃo de neutrÃfilos, enquanto que a linfopenia à parte da imunossupressÃo estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias apÃs a infecÃÃo, sugerindo um estÃmulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no inÃcio da sepse (24 h), sà ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutÃmico oxalacÃtica estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutÃmico pirÃvica nÃo teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. AnÃlises histopatolÃgicas do fÃgado e baÃo mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado apÃs sete dias. A anÃlise integrada de todos os resultados sugere que as proteÃnas do lÃtex modulam a resposta imunoinflamatÃria por mecanismo indireto, revertendo à falÃncia da migraÃÃo de neutrÃfilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunolÃgica ainda nÃo esclarecida, que permite a sobrevivÃncia dos animais, mesmo sob infecÃÃo. Os resultados sugerem que a modulaÃÃo de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacolÃgicas de PL previamente descritas em modelos clÃssicos de inflamaÃÃo sÃo agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatÃria sistÃmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido. / Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection.

SILVA, Rayanne Farias da. Análise histológica de tecidos cultivados in vitro de plantas laticíferas, perfil de proteínas solúveis e ação contra fitopatógenos. 2015. 121 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T21:33:34Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:01:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:01:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_rfsilva.pdf: 3566752 bytes, checksum: 60c280c36514d085ed22317cb38b6cb5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticíferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasn’t any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation. / Plantas laticíferas têm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteínas relacionadas à defesa vegetal em seu látex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteínas e atividades descritas para o látex de duas espécies laticíferas. Tecidos de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos através de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à análise histológica para caracterização de laticíferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas análises. Não foi detectada qualquer estrutura laticífera em calos ou raízes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticíferos se formam nas raízes. Proteínas solúveis foram extraídas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimáticos, técnicas bioquímicas, imunológicas e espectrometria de massas. A presença de atividade contra fungos fitopatogênicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os látex das espécies estudadas. Proteínas dos calos e raízes de C. procera, apresentaram atividade antifúngica sobre fungos fitopatogênicos. Os percentuais de inibição do crescimento vegetativo de hifas na presença de proteínas de calos e raízes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, não demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteínas de calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram qualquer efeito inibitório sobre o crescimento de hifas ou germinação de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescência, foi possível demonstrar que as proteínas extraídas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteúdo citoplasmático, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de ação contra fungos esteja relacionado à alteração na permeabilidade da membrana plasmática. Também foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteínas de calos e raízes de C. procera através da produção de peróxido de hidrogênio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raízes de C. procera, porém, osmotinas e proteases não foram observadas em calos e raízes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticíferas de C. grandiflora foram demonstradas exercer ação contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausência de atividade antifúngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausência de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteínas antifúngicas. Em calos e raízes de C. procera, além de proteases, outras proteínas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifúngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que não diferenciam laticíferos é um interessante modelo para estudar atividades associadas às proteínas encontradas no látex. Proteases antifúngicas presentes no látex de C. grandiflora não foram encontradas nos tecidos sem formação laticífera.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-17T13:22:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Tatianne Leite Nascimento.pdf: 1005313 bytes, checksum: 9919a36f2460b9b63effcddf792fb8bd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-17T13:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Tatianne Leite Nascimento.pdf: 1005313 bytes, checksum: 9919a36f2460b9b63effcddf792fb8bd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2010-02-11 / CAPES e FINEP / Fungos endofíticos são micro-organismos que colonizam assintomaticamente, intra e/ou intercelularmente, tecidos sadios de plantas em algum período do seu ciclo de vida. Estes despertaram grande interesse biotecnológico em virtude da aplicabilidade de seus metabólitos secundários na medicina, indústria e agricultura. Calotropis procera (Ait.) R. Br. (Apocynaceae) é uma planta medicinal muito utilizada nas regiões de origem (Ásia e África) com comprovado potencial farmacológico, sendo de ocorrência subespontânea no Nordeste do Brasil. Com o objetivo geral de analisar alguns aspectos ecológicos e o potencial antimicrobiano dos fungos endofíticos de C. procera, no presente estudo, foram realizadas duas coletas de material vegetal: uma no canteiro experimental do Centro de Ciências Biológicas, UFPE (Área 1), para avaliar a influência da idade foliar na comunidade de fungos endofíticos; e nas margens da BR-232, no início da Serra das Russas-PE (Área 2), para estudar a influência do tipo de tecido vegetal na comunidade de fungos endofíticos associados a folhas e pedúnculos florais. Os endofíticos foram caracterizados quanto à produção de substâncias antimicrobianas contra micro-organismos testes, patogênicos ao homem e vegetais, através de seleção em meio sólido e líquido. Na Área 1, um total de 156 isolados fúngicos distribuídos em 19 táxons, foram obtidos a partir dos 468 fragmentos foliares analisados. Verificou-se que o aumento da idade foliar exerceu uma forte influência no aumento da taxa de colonização e da riqueza de táxons dos fungos endofíticos isolados. Ocorreu pouca variação entre os índices de diversidade de Shannon calculados para as diferentes categorias etárias. A espécie dominante foi Phaeoramularia calotropidis, seguida por Guignardia bidwellii. Seis fungos endofíticos mostraram atividade contra pelo menos um micro-organismo teste. A capacidade antagônica foi verificada apenas contra bactérias Gram-positivas e os fungos patogênicos Epidermophyton floccosum e Colletotrichum dematium. Na Área 2, dos 400 fragmentos vegetais analisados foram isolados 214 fungos endofíticos distribuídos em 30 táxons, incluindo 11 morfoespécies. A taxa de colonização dos fungos endofíticos foi bem superior nos fragmentos de pedúnculos florais (61%) que nos foliares (22,5 %). Nos pedúnculos florais as leveduras predominaram, enquanto que nas folhas os fungos filamentosos foram o grupo prevalente. Dentre as espécies de fungos filamentosos isolados de pedúnculo floral, destaca-se a espécie Monodisma fragilis de primeira ocorrência na América Latina. Dos 51 fungos endofíticos submetidos a seleção primária em meio sólido, 47% mostraram atividade contra pelo menos um micro-organismo teste, principalmente contra bactérias Gram-positivas. Dos fungos selecionados em ensaio em meio sólido, apenas quatro apresentaram resultados positivos nas condições de cultivo aplicadas no ensaio em meio líquido, com destaque para o isolado do pedúnculo floral Xylaria sp., com atividade contra Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Salmonella typhi.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticÃferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasnât any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation. / Plantas laticÃferas tÃm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteÃnas relacionadas à defesa vegetal em seu lÃtex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteÃnas e atividades descritas para o lÃtex de duas espÃcies laticÃferas. Tecidos de calos e raÃzes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos atravÃs de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à anÃlise histolÃgica para caracterizaÃÃo de laticÃferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas anÃlises. NÃo foi detectada qualquer estrutura laticÃfera em calos ou raÃzes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticÃferos se formam nas raÃzes. ProteÃnas solÃveis foram extraÃdas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimÃticos, tÃcnicas bioquÃmicas, imunolÃgicas e espectrometria de massas. A presenÃa de atividade contra fungos fitopatogÃnicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os lÃtex das espÃcies estudadas. ProteÃnas dos calos e raÃzes de C. procera, apresentaram atividade antifÃngica sobre fungos fitopatogÃnicos. Os percentuais de inibiÃÃo do crescimento vegetativo de hifas na presenÃa de proteÃnas de calos e raÃzes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, nÃo demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteÃnas de calos e raÃzes de C. grandiflora nÃo apresentaram qualquer efeito inibitÃrio sobre o crescimento de hifas ou germinaÃÃo de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescÃncia, foi possÃvel demonstrar que as proteÃnas extraÃdas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteÃdo citoplasmÃtico, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de aÃÃo contra fungos esteja relacionado à alteraÃÃo na permeabilidade da membrana plasmÃtica. TambÃm foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteÃnas de calos e raÃzes de C. procera atravÃs da produÃÃo de perÃxido de hidrogÃnio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raÃzes de C. procera, porÃm, osmotinas e proteases nÃo foram observadas em calos e raÃzes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticÃferas de C. grandiflora foram demonstradas exercer aÃÃo contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausÃncia de atividade antifÃngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausÃncia de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteÃnas antifÃngicas. Em calos e raÃzes de C. procera, alÃm de proteases, outras proteÃnas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifÃngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que nÃo diferenciam laticÃferos à um interessante modelo para estudar atividades associadas Ãs proteÃnas encontradas no lÃtex. Proteases antifÃngicas presentes no lÃtex de C. grandiflora nÃo foram encontradas nos tecidos sem formaÃÃo laticÃfera.