Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:37:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao completa - Lenilton Silveira.pdf: 2646876 bytes, checksum: fbad76d9c78a2517359d01fc6fc96b45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:37:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao completa - Lenilton Silveira.pdf: 2646876 bytes, checksum: fbad76d9c78a2517359d01fc6fc96b45 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste estudo nós realizamos um monitoramento cinético, ex vivo, da resposta imune do hospedeiro, induzida durante infecção murina por L. (L.) amazonensis. Fêmeas de camundongos BALB/c foram inoculadas subcutaneamente no coxim plantar esquerdo com 106 promastigotas de fase estacionária e o progresso da infecção foi monitorado por medição da área de lesão. Os linfócitos dos linfonodos poplíteos drenantes da lesão (LNs) foram analisados por citometria de fluxo (FACS - fluorescence-activated cell sorting) e por ressonância plasmônica de superfície (SPR - surface plasmon resonance). Os resultados de FACS indicaram que o perfil de linfócitos é definido na primeira semana de infecção e caracterizado por elevados níveis de linfócitos B e por uma diminuição de linfócitos T. O percentual de linfócitos B foi três vezes maior quando comparado com o dos camundongos não infectados e os linfócitos T eram 1,5 vezes mais baixo. Estes valores permaneceram constantes ao longo da infecção até o ultimo ponto analisado. Foi observado um discreto aumento (0.3 a 0.5) na relação CD8+/CD4+ nos animais infectados, enquanto nos não infectados esta relação permaneceu em torno de 0.35, até o último dia do estudo. Adicionalmente, nós realizamos ensaios de detecção de linfócitos T CD8+ dos LNs, em tempo real, por SPR, utilizando moléculas H-2 Ld:Ig ligadas à peptídeos da região COOH-terminal de cisteína-proteinase B de L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). Os peptídeos testados indicaram valores de constante de associação (0.16x107 – 22.0x107) e dissociação (0.047-0.123) favoráveis a formar complexos com os dímeros H-2 Ld em pH neutro, com valores de energia livre de Gibbs < 0. De forma geral, a ligação das células ao complexo H-2 Ld:Ig/peptídeo, mostrou uma resposta (RU - Response unit) de dissociação maior em células de animais infectados (113 RU – 465 RU) que nas dos animais não infectados (71 RU – 304 RU). A resposta aos complexos H-2 Ld:Ig/peptídeo revelou diferenças de reconhecimento nas semanas avaliadas, como alta resposta ao P1.10 (227 RU) na 3ª semana e ausência de resposta ao P1.7 na 16ª semana. Em uma mesma semana de análise, vimos que o nível de reconhecimento dos peptídeos difere entre eles, uns apresentando alto valor de RU e outros um valor mais baixo: 3ª (P1.10>P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4ª (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6ª (P6.4>P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12ª (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18ª semana (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Embora, apenas, dois peptídeos tenham sido testados na 1ª semana, a maior resposta foi relacionada ao P1.7 (161 RU), seguido do P1.9 (115 RU). Os dados gerados indicaram uma flutuação na população dos linfócitos T e B, assim como o envolvimento de linfócitos T CD8+ direcionados a peptídeos da região COOH-terminal da CPB, ao longo da infecção / In this study, we performed a kinetic ex vivo monitoring of host immune responses during murine infection with Leishmania (Leishmania) amazonensis. Female BALB/c mice were injected subcutaneously in the left hind footpad with 106 promastigotes in stationary growth phase and the progression of infection was monitored by measuring lesion area expansion. Lymphocytes from lesion draining popliteal lymph nodes (LNs) were analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and surface plasmon resonance (SPR). FACS results indicated that the lymphocytes profile is defined in the first week post infection and was characterized by high levels of B cells and by a decrease in T cell numbers. The percentage of B lymphocytes was three times higher when compared to the non-infected mice and T lymphocytes were up to 1.5 times lower. These values remained constant throughout infection until the last point analyzed. It was observed a slight increase (0.3 to 0.5) in the CD8+/CD4+ ratio in the infected mice, whereas in the not infected group this ratio remained around 0.35, until the last assessed infection day. Additionally, we have performed an assay to detect CD8+ T lymphocytes from LNs in real time, by SPR, utilizing H-2 Ld:Ig molecules bound to peptides derived from the COOH-terminal region of cysteine-proteinase B from L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). The peptides tested presented values of association (0.16x107 – 22.0x107) and dissociation constant (0.047-0.123) favorable to form complexes with H-2 Ld at neutral pH, with values of Gibbs free energy < 0. In general, the binding of cells to the H-2 Ld:Ig/peptide complexes showed a response unit (RU) of dissociation higher in cell preparations from infected mice (113 RU - 465 RU) than the cells from uninfected mice (71 RU – 304 RU). The recognition response to the complex H-2 Ld:Ig/peptide were assessed at different weeks as high response to P1.10 (227 RU) at 3th week and absence of response to P1.7 at 16th week. In the same week of analysis, we found that the level of recognition of peptides differs among them, some presenting a high value of RU and others a lower value: 3th (P1.10 >P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4th (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6th (P6.4> P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12th (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18th week (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Although only two peptides were tested at 1th week, the highest response was related to P1.7 (165 RU), followed by P1.9 (115 RU). Generated data indicated a fluctuation in the population of T and B lymphocytes, as well as the involvement of CD8+ T cells directed to peptides of the COOH-terminal region of the CPB, throughout the infection

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-10-20T16:10:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Gabriele Costa Rodrigues.pdf: 669924 bytes, checksum: 39da9a8e9734a6d7491ddbfaf0f55cd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-20T16:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Gabriele Costa Rodrigues.pdf: 669924 bytes, checksum: 39da9a8e9734a6d7491ddbfaf0f55cd4 (MD5) / A linfadenite caseosa é uma doença infecciosa crônica que afeta ovinos e caprinos, causada por uma bactéria intracelular facultativa, Corynebacterium pseudotuberculosis. Pouco se conhece sobre a imunorreatividade induzida por diferentes linhagens deste microrganismo, bem como sobre o efeito no hospedeiro de seus antígenos secretados. O objetivo deste trabalho foi avaliar o reconhecimento antigênico e a ativação de células esplênicas de camundongos Balb/c infectados com duas linhagens de C. pseudotuberculosis, utilizando para tanto dois preparados antigênicos obtidos a partir da linhagem atenuada T1, denominados SeT1 e Q5, ao longo dos primeiros 35 dias após a inoculação. Os camundongos foram infectados com 102 CFU da linhagem VD57 ou da linhagem T1 e sacrificados nos dias 0, 15 e 35. A resposta humoral e celular foram avaliadas pela identificação de IgG total e subclasses, específicas contra estes antígenos secretados, bem como pela quantificação de citocinas produzidas “in vitro”, contra estas mencionadas biomoléculas. O grupo infectado com a linhagem selvagem VD57 apresentou diversas lesões granulomatosas, ao contrário dos camundongos infectados com a linhagem atenuada T1 que não desenvolveram lesões. A linhagem VD57 induziu expressiva produção de TNF-alfa, IFN-gama e IL-10, enquanto que a produção de IL-4 foi semelhante nos dois grupos, apesar de ter apresentado valores significativos com a estimulação pela fração Q5. Através do “Western Blotting” foi possível identificar quatro bandas na fração antigênica Q5, reativas com soros de camundongos infectados com a linhagem T1. Utilizando-se o ensaio imunoenzimático ELISA observou-se uma baixa resposta pelo grupo infectado com a linhagem T1 e uma resposta expressiva dos animais infectados com a linhagem VD57 apenas no dia 35. Neste último grupo, notou-se resposta predominante de IgG1 e IgG2a quando se utilizou como antígeno, respectivamente os preparados Q5 e SeT1. Os dados mostram que os dois preparados antigênicos foram capazes de estimular a imunidade humoral e celular, entretanto, ativando diferentemente os padrões de resposta Th1 e Th2.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02Bitstream added on 2014-06-13T20:56:42Z : No. of bitstreams: 1 missima_f_me_botfmvz.pdf: 271973 bytes, checksum: f18bf71130620b89a3924afe3c6eecb2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A relação entre estresse e imunidade tem sido amplamente investigada, envolvendo o sistema neuroendócrino e vários outros órgãos. A natureza fisiológica do estresse, a grande diversidade de condições estressantes e sua complexa relação com o sistema imune e doenças têm recebido especial atenção. A própolis tem sido motivo de intensa investigação científica e sua ação imunomoduladora vem sendo mencionada. O objetivo deste projeto foi avaliar a ação imunomoduladora da própolis em camundongos BALB/c submetidos a estresse por imobilização, através da análise morfológica do timo, baço, medula óssea e adrenal, avaliação do estado de ativação de macrófagos e indicadores de estresse (glicose e corticosterona). Animais estressados apresentaram produção mais elevada de peróxido de hidrogênio (H2O2) e, quando tratados com própolis, apresentaram potencialização na geração de H2O2 e inibição na liberação de óxido nítrico (NO). A análise histológica revelou aumento no número de centros germinativos no baço de animais estressados. Não foram observadas alterações no timo, medula óssea e adrenal dos animais estressados ou tratados com própolis. O tratamento com própolis impediu o aparecimento de alterações encontradas no baço de animais submetidos a estresse. Futuras investigações fornecerão maiores contribuições quanto à possibilidade de utilização da própolis durante o estresse. / Stress is a generic term that summarizes the effects of psychosocial and environmental factors on physical and mental well-being. The interaction between stress and immunity has been widely investigated, involving the neuroendocrine system and several organs. Assays using natural products in stress models deserve further investigation. Propolis immunomodulatory action has been mentioned and it has been the reason of scientific investigation in our laboratory. The aim of this study was to evaluate propolis effect on macrophage activation in BALB/c mice submitted to immobilization stress, as well as the histopathological analysis of the thymus, bone marrow, spleen and adrenal glands. Stressed mice showed a higher hydrogen peroxide (H2O2) generation, and propolis treatment potentiated H2O2 generation and inhibited nitric oxide (NO) production. Histopathological analysis showed no alterations in the thymus, bone marrow and adrenal glands, but increased germinative centers in the spleen. Propolis treatment counteracted the alterations found in the spleen of stressed mice. Further investigation will provide a better comprehension of propolis immunomodulatory action during stress.

A prevalência mundial de asma na infância é alta. Alterações estruturais das vias aéreas são observadas na asma, e podem ocorrer precocemente na infância. Este estudo tem como objetivo comparar os resultados de um modelo de sensibilização alérgica, em camundongos de diferentes idades. Para tanto foram utilizados camundongos Balb/C pré-desmamados, jovens e adultos. O grupo de animais pré desmamados foram divididos em outros dois grupos (18D 18D1), sendo que ambos foram sensibilizados com duas injeções intraperitoneal (i.p.) de 10 g ovalbumina (OVA) no 5º e 7º dia de vida. Após, o primeiro grupo de camundongos pré desmamados foram submetidos a 01 (um) desafio, este consistente em receberem inalações por 3 dias consecutivos, a 3% de OVA, por 10 minutos, nos dias 14, 15 e 16. O segundo grupo de camundongos pré desmamados foram submetidos 02 (dois) desafios, estes nos dias 09, 10 e 11; e 14, 15 e 16 dias de vida. O grupo de camundongos jovens (40D) receberam as mesmas inalações nos dias 22 a 24 e depois nos dias 36 a 38. Um quarto grupo de camundongos, denominados adultos (100D), foram sensibilizados com 10 g OVA i.p. nos dias 60 e 62 de vida; e também recebendo inalações por 3 dias consecutivos a 3% de OVA, por 10 minutos, nos dias 77 a 79 de vida, repetindo o procedimento nos dias 96, 97 e 98, sendo que os animais em todos os xiii grupos foram sacrificados 48hs após a última inalação. Todos os grupos possuíam um grupo controle respectivo, mesmo protocolo, mas ao invés de OVA, recebiam apenas solução salina. Observamos que os animais sensibilizados, quando comparados entre si, não apresentavam diferença quanto à densidade de células de eosinófilos (p = 0,052). A densidade de células TCD3+ foi maior nos camundongos adultos e no grupo de animais pré desmamados com dois desafios (p<0,001), não havendo diferença nos demais grupos (p=1,000). Foi possível observar também uma maior expressão de IL-5 nas vias aéreas quando comparados os grupos OVA de 18 dias de vida (18D e 18D1) com os seus controles (p=0,017). Todavia não houve esta diferença de IL-5 nos grupos jovens e adultos. Entre os grupos controles, a expressão de IL-5 foi menor nos grupos de 18 dias de vida (18D e 18D1) em relação aos animais dos grupos de 40 e 100 dias de vida (40D e 100D - p<0,001). Verificamos ainda que o grupo de animais pré desmamados com um desafio (p = 0,003) e os camundongos adultos (p = 0,006) apresentaram aumento da expressão de TGF- nas vias aéreas, quando comparados aos seus respectivos controles; e que os camundongos do grupo pré desmamado com um ou dois desafios apresentaram maior expressão de PAS no epitélio bronquiolar, quando comparado aos camundongos jovens e adultos (18D e 18D1 - p=0,007 e 40D e 100D - p=0,073). Entre os camundongos sensibilizados, o grupo pré desmamado com um único desafio, apresentou menor fração de área de colágeno comparado ao grupo de camundongos pré desmamados que receberam dois desafios (p<0,001), não havendo outras diferenças entre os grupos. xiv Camundongos jovens e adultos apresentaram um aumento de espessura do músculo liso da via aérea (MLB) quando comparados a seus respectivos controles (p = 0,048). Desta forma, foi possível demonstrar que os camundongos pré desmamados podem desenvolver alterações inflamatórias e estruturais nas vias aéreas, porém apresentam características diferentes das alterações observadas em animais com maior idade. Por fim, conclui-se que o presente estudo proporciona resultado e forma a ser utilizado como base para um estudo experimental, seja para verificar o resultado de medicamentos, seja para um estudo comparativo em crianças, jovens e adultos com asma, a fim de se verificar as diferenças apresentadas; e assim, auxiliar na adequada conduta clínica para prevenção ou combate dessa doença / The prevalence of childhood asthma is high worldwide. Recent data indicate that asthma structural changes occur early in childhood, and that structure alterations occur early in life. In this study we have aimed to compare a model of allergic sensitization in infantile, juvenile and adult mice. BALB/c mice at different ages were sensitized with two intraperitoneal injections (i.p.) of 10 g ovalbumin (OVA) at day 05 and 07 and received 3 daily inhalations of 3% OVA for 10 min on days 14 to 16 and 09 to 11 - 14 to 16 the infantile groups (18d - 18d1).The juvenile mice (40d) at days 22 to 24 - 36 to 38 and adult mice (100d) were sensitized with 3% OVA i.p. at day 60 and 62 and received 2x 3 daily inhalations at days 77-79 and at day 96-98, being euthanized 48h later. Control groups received saline using the same protocols. The OVA treated animals were compared among each other there were no differences regarding eosinophil cell density (p= 0.052). The density of T CD3+ cells was higher in the adult mice and in the infantile group with two challenges in relation to 18D e 40D (p=0.000), but without differences between the former groups (p= 1.000). When OVA groups were compared to the respective controls, infantile groups presented increased IL-5 expression in the airways (p=0.017), no differences were observed in the juvenile and adult mice. Among controls, IL-5 expression was lower in the infantile groups in relation to the juvenile and adult mice (p<0.001). The infantile group (p=0.003) with one challenge and the adult mice (p=0.006) presented increased TGF- expression in the airways when compared to their respective controls. Infantile mice with one or two challenges presented more PAS positivity in the bronchiolar epithelium than the juvenile and adult mice (p=0.007 and p=0.073). Among the OVA mice, infantile mice with one xvi challenge presented lower collagen area fraction than the group of infantile mice that received two challenges (p=0.000), without further differences among groups. Juvenile and adult mice had increased ASM thickness when compared to their age related controls (p=0.48). In summary, we have shown that infantile mice develop inflammatory and structural alterations in the airways, but that are partially different from those developed in older animals. Understanding the phenotypic differences in children vs adult asthma is very important to treat disease adequately and to manage prevention of severity

A prevalência mundial de asma na infância é alta. Alterações estruturais das vias aéreas são observadas na asma, e podem ocorrer precocemente na infância. Este estudo tem como objetivo comparar os resultados de um modelo de sensibilização alérgica, em camundongos de diferentes idades. Para tanto foram utilizados camundongos Balb/C pré-desmamados, jovens e adultos. O grupo de animais pré desmamados foram divididos em outros dois grupos (18D 18D1), sendo que ambos foram sensibilizados com duas injeções intraperitoneal (i.p.) de 10 g ovalbumina (OVA) no 5º e 7º dia de vida. Após, o primeiro grupo de camundongos pré desmamados foram submetidos a 01 (um) desafio, este consistente em receberem inalações por 3 dias consecutivos, a 3% de OVA, por 10 minutos, nos dias 14, 15 e 16. O segundo grupo de camundongos pré desmamados foram submetidos 02 (dois) desafios, estes nos dias 09, 10 e 11; e 14, 15 e 16 dias de vida. O grupo de camundongos jovens (40D) receberam as mesmas inalações nos dias 22 a 24 e depois nos dias 36 a 38. Um quarto grupo de camundongos, denominados adultos (100D), foram sensibilizados com 10 g OVA i.p. nos dias 60 e 62 de vida; e também recebendo inalações por 3 dias consecutivos a 3% de OVA, por 10 minutos, nos dias 77 a 79 de vida, repetindo o procedimento nos dias 96, 97 e 98, sendo que os animais em todos os xiii grupos foram sacrificados 48hs após a última inalação. Todos os grupos possuíam um grupo controle respectivo, mesmo protocolo, mas ao invés de OVA, recebiam apenas solução salina. Observamos que os animais sensibilizados, quando comparados entre si, não apresentavam diferença quanto à densidade de células de eosinófilos (p = 0,052). A densidade de células TCD3+ foi maior nos camundongos adultos e no grupo de animais pré desmamados com dois desafios (p<0,001), não havendo diferença nos demais grupos (p=1,000). Foi possível observar também uma maior expressão de IL-5 nas vias aéreas quando comparados os grupos OVA de 18 dias de vida (18D e 18D1) com os seus controles (p=0,017). Todavia não houve esta diferença de IL-5 nos grupos jovens e adultos. Entre os grupos controles, a expressão de IL-5 foi menor nos grupos de 18 dias de vida (18D e 18D1) em relação aos animais dos grupos de 40 e 100 dias de vida (40D e 100D - p<0,001). Verificamos ainda que o grupo de animais pré desmamados com um desafio (p = 0,003) e os camundongos adultos (p = 0,006) apresentaram aumento da expressão de TGF- nas vias aéreas, quando comparados aos seus respectivos controles; e que os camundongos do grupo pré desmamado com um ou dois desafios apresentaram maior expressão de PAS no epitélio bronquiolar, quando comparado aos camundongos jovens e adultos (18D e 18D1 - p=0,007 e 40D e 100D - p=0,073). Entre os camundongos sensibilizados, o grupo pré desmamado com um único desafio, apresentou menor fração de área de colágeno comparado ao grupo de camundongos pré desmamados que receberam dois desafios (p<0,001), não havendo outras diferenças entre os grupos. xiv Camundongos jovens e adultos apresentaram um aumento de espessura do músculo liso da via aérea (MLB) quando comparados a seus respectivos controles (p = 0,048). Desta forma, foi possível demonstrar que os camundongos pré desmamados podem desenvolver alterações inflamatórias e estruturais nas vias aéreas, porém apresentam características diferentes das alterações observadas em animais com maior idade. Por fim, conclui-se que o presente estudo proporciona resultado e forma a ser utilizado como base para um estudo experimental, seja para verificar o resultado de medicamentos, seja para um estudo comparativo em crianças, jovens e adultos com asma, a fim de se verificar as diferenças apresentadas; e assim, auxiliar na adequada conduta clínica para prevenção ou combate dessa doença / The prevalence of childhood asthma is high worldwide. Recent data indicate that asthma structural changes occur early in childhood, and that structure alterations occur early in life. In this study we have aimed to compare a model of allergic sensitization in infantile, juvenile and adult mice. BALB/c mice at different ages were sensitized with two intraperitoneal injections (i.p.) of 10 g ovalbumin (OVA) at day 05 and 07 and received 3 daily inhalations of 3% OVA for 10 min on days 14 to 16 and 09 to 11 - 14 to 16 the infantile groups (18d - 18d1).The juvenile mice (40d) at days 22 to 24 - 36 to 38 and adult mice (100d) were sensitized with 3% OVA i.p. at day 60 and 62 and received 2x 3 daily inhalations at days 77-79 and at day 96-98, being euthanized 48h later. Control groups received saline using the same protocols. The OVA treated animals were compared among each other there were no differences regarding eosinophil cell density (p= 0.052). The density of T CD3+ cells was higher in the adult mice and in the infantile group with two challenges in relation to 18D e 40D (p=0.000), but without differences between the former groups (p= 1.000). When OVA groups were compared to the respective controls, infantile groups presented increased IL-5 expression in the airways (p=0.017), no differences were observed in the juvenile and adult mice. Among controls, IL-5 expression was lower in the infantile groups in relation to the juvenile and adult mice (p<0.001). The infantile group (p=0.003) with one challenge and the adult mice (p=0.006) presented increased TGF- expression in the airways when compared to their respective controls. Infantile mice with one or two challenges presented more PAS positivity in the bronchiolar epithelium than the juvenile and adult mice (p=0.007 and p=0.073). Among the OVA mice, infantile mice with one xvi challenge presented lower collagen area fraction than the group of infantile mice that received two challenges (p=0.000), without further differences among groups. Juvenile and adult mice had increased ASM thickness when compared to their age related controls (p=0.48). In summary, we have shown that infantile mice develop inflammatory and structural alterations in the airways, but that are partially different from those developed in older animals. Understanding the phenotypic differences in children vs adult asthma is very important to treat disease adequately and to manage prevention of severity

A mutagênese química utilizando o agente mutagênico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) seguida da observação do fenótipo deu origem a um mutante Anêmico. O tipo de herança é autossômica dominante, com morte intra útero dos mutantes homozigotos. O mapeamento genético foi feito utilizando-se marcadores microssatélites, sendo selecionados marcadores polimórficos entre as linhagens BALB/c e C57BL/6 envolvidas no mapeamento. Estabeleceu-se um painel de microssatélites distribuídos por todo o genoma do camundongo, que permitisse a localização do cromossomo portador da mutação. O gene mutante foi localizado no cromossomo 7 entre os marcadores D7Mit301 e D7Mit131 delimitando um intervalo entre 46,5cM e 51cM de 4,5cM. Através das análises fenotípicas do mutante Anêmico e estudo dos genes candidatos neste intervalo, foi selecionado o gene Hbb responsável pela síntese das globinas b-major e b-minor , sendo o gene que mais se identifica com as características do mutante, localizado a 50cM. A deficiência deste gene leva a uma das mais severas anemias humana, a b-Talassemia major. / Chemical mutagenesis, using the mutagenic agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), and followed by observation of the phenotype, originated in an Anaemic mutant. The inheritance-type is dominant auto-somic, with intra-uterus death of the homozygotic mutants. Genetic mapping was undertaken by means of micro-satellite markers, polymorphic markers being selected from among the BALB/c and C57BL/6 lineages involved in the mapping itself. A panel was established of the micro-satellites distributed throughout the whole mouse genome, thereby permitting localization of the mutation bearing chromosome. The mutant gene was located in chromosome 7 between markers D7Mit301 and D7Mit131, these delimiting an interval between 46,5cM and 51cM of 4,5cM. Selection of the Hbb gene responsible for synthesis of the b-major and b-minor globins came about through phenotypic analysis of the Anaemic mutant and a study of candidate genes within this interval, the selected gene being that which was most identified with the mutants characteristics and located at 50cM. A deficiency in this gene leads to one of the most severe forms of human anaemia, b-Talhassemia major.

Estudamos o efeito do tratamento com salbutamol em dois regimes: diário (DS) e administrado a intervalos de 96 horas (IS) em camundongos balb/c sensibilizados com injeções intraperitoneais de uma solução de ovoalbumina (OVA) adsorvida em hidróxido de alumínio, e desafiada com inalações de ovoalbumina a 1%. O grupo controle SAL recebeu injeções i.p. de salina e desafios inalatórios de sallina. A partir do 34o dia, os animais OVA foram tratados com salbutamol via inalatória 10 mg/ml durante 15 minutos nos dois regimes descritos. Os animais foram sacrificados no 60o dia, que corresponde a 48 horas após o último desafio antigênico. Após os camundongos serem anestesiados com pentobarbital sódico via i.p., eles foram traqueostomizados e entubados e sacrificados com secção da Aorta abdominal. Então, procedeu-se com a coleta do lavado broncoalveolar para a quantificação de leucócitos. Coletamos os tecidos pulmonares para a avaliação do processo inflamatório por quantificação de células linfomononucleares (LMN) e eosinófilos EPO+, essa última com marcação citoquímica. Além disso, estudamos a influência do tratamento adrenérgico sobre o IgE anafilático. O modelo de inflamação (grupo OVA) produziu significativo aumento do número de células totais, de eosinófilos e de neutrófilos observados na avaliação de lavado broncoalveolar. Além disso, houve nesse grupo processo inflamatório na parede de vias aéreas, caracterizada por um infiltrado linfomononuclear e com presença de eosinófilos. O nosso processo de indução de inflamação também recrutou eosinófilos para o septo alveolar. O tratamento com salbutamol diário produziu uma queda significativa do processo inflamatório no BAL, principalmente de neutrófilos e eosinófilos, enquanto que o tratamento intermitente produziu redução significativa apenas de neutrófilos. O tratamento com salbutamol a cada 96 horas (IS) promoveu uma queda significativa de células LMN quantificadas no septo alveolar, mas não atingindo valores do grupo salina (NS). Ambos os tratamentos com salbutamol produziu redução significativa de células EPO+ no parênquima pulmonar (P < 0,05). Apesar das alterações no processo celular, o salbutamol não influenciou na expressão de anticorpos IgE anafiláticos a OVA. Assim, podemos concluir que o salbutamol apresenta atividade imunomoduladora, observada por redução de eosinófilos no BAL e no parênquima pulmonar, apesar de não atingir valores semelhantes aos animais do grupo salina / We studied the effects of salbutamol treatment in two regimen: diary (DS) and at interval of 96 hours (IS) in ovalbumin sensitized (OVA) balb/c mice. The control group (NS) received i.p. injections and aerosol challenge with normal saline. Starting at day 34 the OVA animals were treated with 10mg/ml salbutamol by inhalation during 15 minutes per day in both regimen: DS and IS. The mice were sacrificed at day 60 that corresponded the fourthly eight hours after last OVA and/or salbutamol exposure. At experimental day, mice were anesthetized with i.p. injection of sodium pentobarbital, tracheostomized, entubed and the abdominal aorta sectioned. We followed with collecting of bronchoalveolar lavage (BAL) and lungs to histopathology studies. In the BAL, total cells and differential leukocytes were quantified, while in the lung sections, the EPO+ and LMN in airways wall and parenchyma septa were evaluated. Also, we sampled the blood to evaluate the effects of salbutamol on anaphylactic IgE antibodies expression. The inflammatory model (OVA animals) produced a significant increase of BAL total cells, BAL eosinophils and neutrophils, and LMN cells and EPO+ eosinophils in the airways and in the parenchyma. Diary salbutamol treatment decrease significantly BAL eosinophils and neutrophils, while the IS group showed a diminution of BAL neutrophils and LMN cells in the alveolar septum. Both salbutamol treatments produced significant decline of EPO+ cells in the lung parenchyma. Despite the changes in the cellular patterns, the salbutamol did not affect the IgE antibodies expression. So, we can concluded that salbutamol present an immunomodulatory activity observed by reduction of eosinophils in the BAL and lung parenchyma, but did not achieve the values of saline control group

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Debora_G_Melo.pdf: 804977 bytes, checksum: 2854d8486722eba4b2703a8a3bd9eab0 (MD5) Previous issue date: 2008-08-14 / The objective of this work was to obtain new isolates of N. caninum and characterize the same pathogenically. In Nerópolis (Goiás, Brazil), two Holstein-Friesian male calves, aged four months, positive for indirect immunoflourescence for Neospora with a titre of 1:400 and 1:800 were utilized for the isolation. Two new isolates, NC- Goiás 1 and NC-Goiás 2, were obtained. NC-Goiás 2 was discarded, however, due to fungal contamination. In addition to characterization of isolate NC-Goiás 1, pathogenic characterizations were done for six Spanish isolates in female mice of the lineage Balb/c. Symptomatology and mortality caused by the isolates, parasitaemia, detection of parasite DNA in the brain and lungs were verified, as well as parasite load in the brain throughout the experiment. Further, the development of humoral immune response of the animals was verified. Statistical analysis was carried analysing the effect of isolate and the infection phase. Differences between percentages encountered through nested-PCR were analysed using the Chi-square test. When significant differences were observed (P<0,05), the groups were compared two by two. The difference between parasite loads, optical density values for IgG1, IgG2a and the relation IgG1/IgG2a between the isolates were analysed by the Kruskal-Wallis test. When statistically significant differences were observed (P<0,05), the groups were compared two by two using the Mann-Whitney U test. In blood and lungs, the parasite was detected mainly in the acute phase (P<0,05). The DNA of N. caninum was also detected in the brain mainly in the chronic phase (P<0,05). On comparing parasite loads between isolates, statistically significant differences were observed between them in the chronic phase (P< 0,05). Antibodies of class IgG1 and IgG2a were detected starting from day 16 P.I. and 4 P.I. respectively, increasing gradually and remaining high until day 64 P.I. An analysis of the relation IgG1/IgG2a demonstrated predominance of IgG2a on day 8 e 16 P.I. and highest levels of IgG1 were detected on day 32 and 64 P.I. The isolate NC-Goiás 1 is the first isolate obtained in Goiás and the first obtained from an infected calf, though clinically healthy, reported from South América. These results are the first of a study of the diversity of the protozoon, N. caninum, and indicate that these isolates are of low pathogenicity in mice as compared with other known isolates / A neosporose bovina foi reconhecida inicialmente em 1989 e a partir de seu reconhecimento e descrição da nova espécie Neospora caninum, a neosporose emergiu como uma séria enfermidade de bovinos e cães. Este trabalho teve como objetivo obter novos isolados de N. caninum e realizar a caracterização patogênica dos mesmos. Em Nerópolis (Goiás, Brasil) dois bezerros machos de quatro meses de idade, da raça Holandês, positivos por Imunofluorescência indireta para Neospora com título de 1:400 e 1:800, foram utilizados para isolamento. Dois novos isolados denominados NC-Goiás 1 e NC-Goiás 2 foram obtidos porém, o isolado NC-Goiás 2 foi perdido devido a contaminação por fungos. Além da caracterização do isolado NC-Goiás 1 foram feitas caracterizações biológicas de seis isolados espanhóis em camundongos fêmeas, da linhagem BALB/c. Foi verificada a sintomatologia e mortalidade provocada pelos isolados, a parasitemia, detecção de DNA do parasito no cérebro e pulmão e determinada a carga parasitária no cérebro ao longo do experimento. Além disso, também se verificou o desenvolvimento da resposta imune humoral dos animais. A análise estatística foi realizada para verificar a influência do isolado e a fase da infecção. As diferenças entre as porcentagens encontradas pela nested-PCR foram analisadas aplicando o teste de Qui-quadrado. Quando observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05), os grupos foram comparados dois a dois. A diferença entre as cargas parasitárias, valores de densidade óptica para IgG1, IgG2a e a razão IgG1/IgG2a entre os isolados foram analisadas pela prova de Kruskal-Wallis. Quando observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05), os grupos foram comparados dois a dois pelo teste de U de Mann-Whitney. No sangue e pulmão o parasito foi detectado principalmente na fase aguda (P<0,05). Quanto ao cérebro, foi detectado DNA de N. caninum principalmente na fase crônica (P<0,05). Ao comparar as cargas parasitárias entre os isolados, foram observadas diferenças estatisticamente significativas na fase crônica (P< 0,005). Anticorpos da classe IgG1 e IgG2a foram detectados a partir do dia 16 P.I. e 4 P.I. respectivamente, aumentando gradualmente e se mantendo elevados até o dia 64 P.I. A análise da relação de IgG1/IgG2a mostrou predominância de IgG2a nos dias 8 e 16 P.I. e os níveis de IgG1 mais elevados foram detectados nos dias 32 e 64 P.I. O isolado NC-Goiás 1 é o primeiro isolado de N. caninum obtido em Goiás e o primeiro isolado obtido de um bezerro infectado porém clinicamente saudável relatado na América do Sul. Esses resultados são o início do estudo da diversidade do protozoário N. caninum e indicam que esses isolados são de baixa patogenicidade em camundongos quando comparados com outros isolados conhecidos

Estudamos o efeito do tratamento com salbutamol em dois regimes: diário (DS) e administrado a intervalos de 96 horas (IS) em camundongos balb/c sensibilizados com injeções intraperitoneais de uma solução de ovoalbumina (OVA) adsorvida em hidróxido de alumínio, e desafiada com inalações de ovoalbumina a 1%. O grupo controle SAL recebeu injeções i.p. de salina e desafios inalatórios de sallina. A partir do 34o dia, os animais OVA foram tratados com salbutamol via inalatória 10 mg/ml durante 15 minutos nos dois regimes descritos. Os animais foram sacrificados no 60o dia, que corresponde a 48 horas após o último desafio antigênico. Após os camundongos serem anestesiados com pentobarbital sódico via i.p., eles foram traqueostomizados e entubados e sacrificados com secção da Aorta abdominal. Então, procedeu-se com a coleta do lavado broncoalveolar para a quantificação de leucócitos. Coletamos os tecidos pulmonares para a avaliação do processo inflamatório por quantificação de células linfomononucleares (LMN) e eosinófilos EPO+, essa última com marcação citoquímica. Além disso, estudamos a influência do tratamento adrenérgico sobre o IgE anafilático. O modelo de inflamação (grupo OVA) produziu significativo aumento do número de células totais, de eosinófilos e de neutrófilos observados na avaliação de lavado broncoalveolar. Além disso, houve nesse grupo processo inflamatório na parede de vias aéreas, caracterizada por um infiltrado linfomononuclear e com presença de eosinófilos. O nosso processo de indução de inflamação também recrutou eosinófilos para o septo alveolar. O tratamento com salbutamol diário produziu uma queda significativa do processo inflamatório no BAL, principalmente de neutrófilos e eosinófilos, enquanto que o tratamento intermitente produziu redução significativa apenas de neutrófilos. O tratamento com salbutamol a cada 96 horas (IS) promoveu uma queda significativa de células LMN quantificadas no septo alveolar, mas não atingindo valores do grupo salina (NS). Ambos os tratamentos com salbutamol produziu redução significativa de células EPO+ no parênquima pulmonar (P < 0,05). Apesar das alterações no processo celular, o salbutamol não influenciou na expressão de anticorpos IgE anafiláticos a OVA. Assim, podemos concluir que o salbutamol apresenta atividade imunomoduladora, observada por redução de eosinófilos no BAL e no parênquima pulmonar, apesar de não atingir valores semelhantes aos animais do grupo salina / We studied the effects of salbutamol treatment in two regimen: diary (DS) and at interval of 96 hours (IS) in ovalbumin sensitized (OVA) balb/c mice. The control group (NS) received i.p. injections and aerosol challenge with normal saline. Starting at day 34 the OVA animals were treated with 10mg/ml salbutamol by inhalation during 15 minutes per day in both regimen: DS and IS. The mice were sacrificed at day 60 that corresponded the fourthly eight hours after last OVA and/or salbutamol exposure. At experimental day, mice were anesthetized with i.p. injection of sodium pentobarbital, tracheostomized, entubed and the abdominal aorta sectioned. We followed with collecting of bronchoalveolar lavage (BAL) and lungs to histopathology studies. In the BAL, total cells and differential leukocytes were quantified, while in the lung sections, the EPO+ and LMN in airways wall and parenchyma septa were evaluated. Also, we sampled the blood to evaluate the effects of salbutamol on anaphylactic IgE antibodies expression. The inflammatory model (OVA animals) produced a significant increase of BAL total cells, BAL eosinophils and neutrophils, and LMN cells and EPO+ eosinophils in the airways and in the parenchyma. Diary salbutamol treatment decrease significantly BAL eosinophils and neutrophils, while the IS group showed a diminution of BAL neutrophils and LMN cells in the alveolar septum. Both salbutamol treatments produced significant decline of EPO+ cells in the lung parenchyma. Despite the changes in the cellular patterns, the salbutamol did not affect the IgE antibodies expression. So, we can concluded that salbutamol present an immunomodulatory activity observed by reduction of eosinophils in the BAL and lung parenchyma, but did not achieve the values of saline control group

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-05T17:26:06Z No. of bitstreams: 1 akinoricardozonagato.pdf: 3623412 bytes, checksum: 052499ef93e153d7b083782377a73cd1 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-07T15:40:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 akinoricardozonagato.pdf: 3623412 bytes, checksum: 052499ef93e153d7b083782377a73cd1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T15:40:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 akinoricardozonagato.pdf: 3623412 bytes, checksum: 052499ef93e153d7b083782377a73cd1 (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Estudos prévios têm demonstrado que o dano e estresse oxidativo induzido pela hiperóxia levam ao aumento de interleucina-6 (IL6), fator de necrose tumoral-alfa (TNFα) e fator de crescimento transformador beta (TGFβ) em pulmões de camundongos. Juntos, a IL6 e TGFβ têm sido conhecidos por direcionar a diferenciação do fenótipo para as células T-helper 17 (Th17). No estudo corrente nós testamos a hipótese que a hiperóxia promove a polarização de células T para o fenótipo Th17 na resposta inflamatória aguda das vias aéreas induzida por ovalbumina (OVA). A inflamação das vias aéreas foi induzida em camundongos BALB/c, fêmeas, através da sensibilização intraperitonial e instilação intranasal de OVA, acompanhado de metacolina (MetCo). Depois do ataque com MetCo, os animais foram expostos a condições de hiperóxia em uma câmara de inalação durante 24h. Os animais do grupo controle permaneceram em normóxia ou receberam hidróxido de alumínio em salina tamponada. Depois de 24h de hiperóxia, o número de macrófagos (Mᶲ) e linfócitos diminuiu nos animais com inflamação induzida por OVA, enquanto o número de neutrófilos (PMN) aumentou. Os resultados mostraram que a expressão de Fator de transcrição nuclear derivado de eritróide 2 (Nrf2), óxido nítrico sintase induzida (iNOS), Fator de transcrição Tbet (Tbet) e interleucina-17 (IL17) aumentou depois de 24h de hiperóxia tanto em Mᶲ alveolares quanto em células epiteliais pulmonares, comparados com os animais que permaneceram em ar ambiente e com inflamação induzido por OVA. A hiperóxia, isoladamente, levou ao aumento dos níveis de Fator de necrose tumoral (TNFα) e Quimiocina ligante CC5 (CCL5), enquanto a hiperóxia depois da inflamação por OVA levou a diminuição dos níveis de CCL2. O extravasamento de células inflamatórias peribronquiolar e perivascular foi observado após a inflamação pulmonar e hiperóxia. A hiperóxia promoveu a polarização da resposta imune em direção ao fenótipo Th17, resultando em estresse oxidativo e dano tecidual, e migração de PMN e Mᶲ para os pulmões e vias aéreas. Esses achados sugerem que controlar o estresse oxidativo induzido pela hiperóxia pode contribuir importantemente no controle da inflamação aguda das vias aéreas induzida por OVA. / Previous studies have demonstrated that hyperoxia-induced stress and oxidative damage to the lungs of mice lead to an increase in IL6, TNFα and TGFβ expression. Together, IL6 and TGFβ have been known to direct T cell differentiation towards the TH17 phenotype.In the current study, we tested the hypothesis that hyperoxia promotes the polarization of T cells to the TH17 cell phenotype in response to ovalbumin-induced acute airway inflammation. Airway inflammation was induced in female BALB/c mice by intraperitoneal sensitization and intranasal introduction of ovalbumin, followed by challenge methacholine. After the methacholine challenge, animals were exposed to hyperoxic conditions in an inhalation chamber for 24 h. The controls were subjected to normoxia or aluminum hydroxide dissolved in phosphate buffered saline. After 24 h of hyperoxia, the number of macrophages and lymphocytes decreased in animals with ovalbumin-induced airway inflammation, whereas the number of neutrophils increased after ovalbumin-induced airway inflammation. The results showed that expression of Nrf2, iNOS, Tbet and IL17 increased after 24 of hyperoxia in both alveolar macrophages and in lung epithelial cells, compared with both animals that remained in room air, and animals with ovalbumin-induced airway inflammation. Hyperoxia alone without the induction of airway inflammation lead to increased levels of TNFα and CCL5, whereas hyperoxia after inflammation lead to decreased CCL2 levels. Histological evidence of extravasation of inflammatory cells into the perivascular and peribronchial regions of the lungs was observed after pulmonary inflammation and hyperoxia. Hyperoxia promotes polarization of the immune response towards the TH17 phenotype, resulting in tissue damage associated with oxidative stress, and the migration of neutrophils to the lung and airways. Elucidating the effect of hyperoxia-induced oxidative stress is relevant to preventing or treating ovalbumin-induced acute airway inflammation.