O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

Considerada uma das mais severas doenças em citros, o Huanglongbing (HLB) foi descoberto no Brasil em 2004, e desde então tem causado sérios danos à citricultura do país. Anteriormente conhecida apenas na Ásia e África, atualmente está também presente em vários países do continente Americano. O HLB, no Brasil, é causado pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) e Ca. L. americanus (LAM), sendo a última encontrada apenas neste país. São bactérias gram-negativas, limitadas ao floema, pertencentes ao subgrupo alpha das -proteobacterias. A transmissão desta doença pode ocorrer por enxertia de materiais vegetais infectados, pela planta parasita Cuscuta spp. ou pelo psilídeo-asiático-dos-citros, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Para que o patógeno seja transmitido, há uma interação única que ocorre entre a bactéria e seu inseto vetor, cujo conhecimento auxiliaria no controle e prevenção da doença. Entretanto, vários aspectos da biologia da transmissão de Ca. Liberibacter spp. ainda são desconhecidos. Este trabalho teve por objetivo elucidar alguns aspectos relacionados à aquisição e interação de LAS e LAM com o inseto vetor, D. citri. Um primeiro estudo foi montado para avaliação de qual(s) estágio(s) apresentaria(m) maior eficiência de aquisição. Em seguida, avaliou-se o crescimento e concentração de ambas as bactérias no organismo do inseto em períodos sucessivos após a aquisição. Por fim, investigou-se a possibilidade de aquisição de ambas as bactérias concomitantemente pelo vetor, em períodos de acesso à aquisição iguais e seqüenciais em plantas-fonte de cada umas delas. Observou-se uma maior taxa de aquisição do patógenos por ninfas de 4° e 5° instares, contrastando com uma menor eficiência de aquisição por adultos. Por meio de análises de regressão, verificou-se um crescimento da população bacteriana com o passar do tempo, em insetos que se alimentaram em plantas infectivas ainda nas formas jovens (ninfas), sendo que o mesmo não foi observado para adultos. As bactérias foram detectadas no inseto por sonda específicas de PCR quantitativo apenas 7 dias após o início do período de acesso à aquisição (PAA) e foram detectadas até 40 dias após o PAA. O fato de as bactérias serem detectadas até 6 semanas após sua aquisição e em concentrações crescentes no vetor, caracterizam o tipo de transmissão como persistente propagativa. Este conhecimento é importante para melhor compreensão da epidemiologia e aprimorar o manejo do HLB. / Known as one of the most severe citrus diseases, Huanglongbing (HLB) was first described in Brazil in 2004. Ever since, it has caused serious damages to Brazilian citriculture. Previously known only in Asia and Africa, HLB is now present in several countries in the Americas. In Brazil, HLB is associated with two bacterial species, Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) and Ca. L. americanus (LAM); the latter one was found only in this country. These are gram-negative, phloem-limited bacteria, belonging to the alpha subdivision of the Proteobacteria group. Transmission of these bacteria may occur by grafting with infected plant material, by parasitic plants (Cuscuta spp.), or by the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). The vector transmission process probably involves complex psyllid-pathogen interactions, which should be understood in order to improve management strategies to control HLB. The goal of this research was to study some aspects related to acquisition of LAS and LAM by the insect vector, D. citri. A first study was carried out to determine bacterial acquisition efficiency in relation to vector developmental stages. A second study was set up to investigate if bacterial concentration increases over time in the vector after acquisition by D. citri nymphs and adults. Finally, the possibility of acquisition of both LAS and LAM by a single insect was investigated by submitting D. citri nymphs and adults to sequential and similar acquisition access periods on citrus plants singly-infected with each one of these bacterial species. D. citri nymphs acquired Ca. L. asiaticus and Ca. L. americanus more efficiently than adults. No single insect acquired both bacterial species. Concentration of Ca. L. asiaticus reached higher levels in D. citri when acquired by 4th and 5th instar nymphs. Regression analyses showed an increase in the concentration of Ca. L. asiaticus in D. citri over time after acquisition for insects that acquired the pathogen yet as nymphs, which was not observed when bacterial acquisition occurred only in the adult stage. Both bacterial species were detected in D. citri by quantitative PCR from 7 to 40 days after onset of the acquisition access period. The observation of increasing concentrations of Ca. L. asiaticus in D. citri for several weeks after acquisition indicates that the bacterium is persistent and propagative in the vector. This information allows a better understanding of the transmission process with implications on HLB epidemiology and management.

O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

The aim of this study was to address the shortfall in current, in-depth knowledge of Western Australian rickettsiae investigating in particular, the role of native and feral animals as reservoir hosts. Two novel species of rickettsiae were detected in ticks collected from native and feral animals and humans, these were characterised using molecular methods. A preliminary investigation into the pathogenic potential of one of the isolates was also undertaken. To facilitate investigation, ectoparasites (principally ticks) were opportunistically collected from across the State, with an emphasis on native and feral animals and people. All ectoparasites were screened for rickettsial infection using a polymerase chain reaction incorporating Rickettsia-specific citrate synthase gene (gltA) primers. Preliminary sequencing was performed on representative PCR-positive samples from each geographical location, vertebrate host and ectoparasite in order to identify and characterize the infecting rickettsia. Isolation in cell culture and further genotypic characterization was then performed. Finally, a serosurvey and questionnaire were implemented in one of the study areas to determine whether people were being infected with a Rickettsia spp. and whether infection was associated with clinical signs. Ectoparasite collection produced three genera of ticks (Ixodes, Amblyomma and Haemaphysalis) from native animals, feral pigs and people, primarily from the southwest of Western Australia and Barrow Island in the Pilbara region. Ticks from a number of sources were shown to be infected with rickettsiae by the PCR, including feral pigs, people, bobtail lizards, kangaroos, bandicoots, burrowing bettongs, common brushtail possums and yellow-footed antechinus. Genotypic characterization of positive amplicons from ticks revealed the presence of two novel spotted fever group rickettsiae. Rickettsia gravesii sp. nov., named in honour of Dr Stephen Graves, was identified extensively throughout the southwest of the State and on Barrow Island in Ixodes, Amblyomma and Haemaphysalis spp. ticks from multiple hosts. Candidatus “Rickettsia antechini” was detected in Ixodes spp. only from yellow-footed antechinus in Dwellingup. In addition, a novel Bartonella spp. (Bartonella sp. strain Mu1) was also detected from Acanthopsylla jordani fleas collected from yellow-footed antechinus in Dwellingup. Rickettsia gravesii sp. nov. is most closely related to the Rickettsia massiliae subgroup of the spotted fever group and to R. rhipicephali in particular. Sequence similarities between this novel species and the subgroup were 99.7%, 98.4%, 95.8% and 97.4% based on its 16S rRNA, gltA, ompA and ompB genes respectively. Candidatus “Rickettsia antechini” also demonstrated a close relationship to the R. massiliae subgroup (99.4%, 94.8% and 97.1% sequence similarity based on its gltA, ompA and ompB genes respectively). The two novel Western Australian species demonstrated 98.4%, 96.3% and 96.7% sequence similarity to each other based on gltA, ompA and ompB genes respectively indicating separate species. The novel Bartonella spp. (Bartonella sp. strain Mu1) detected in fleas collected from yellow-footed antechinus in Dwellingup demonstrated greatest gltA gene sequence similarity to Bartonella strain 40 at 86.1%. Results from the serosurvey and questionnaire-based investigation into the zoonotic importance of R. gravesii sp. nov. on Barrow Island supported the results of the tick study and suggested that a tick-borne rickettsia(e) was infecting people on the island. However, a significant association between seroconversion and a history of symptoms consistent with a rickettsiosis was not found, and it is possible therefore, that R. gravesii sp. nov. produces only asymptomatic infections. Future work on rickettsiae in Western Australia will involve phenotypic characterization of the novel species, further investigation of their epidemiology and pathogenicity and an ongoing search for additional undiscovered species.

A subject of the diploma thesis was the optimization of a procedure of detecting a phytoplasma Candidatus Phytoplasma mali using woody indicator Golden Delicious in greenhouse conditions as an alternative method to the phytoplasma presence testing by biological indexing in field conditions. To control the presence of phytoplasma in the experimental plants, molecular method of real-time PCR was used. The experiment was set up on the demonstration area of the Department of Breeding and Propagation of Horticultural Plants in the grounds of Mendel University in Brno. Three different ways of transferring of the phytoplasma infection were compared: method of parallel grafting of the tested variety and of the indicator on the seedling in the period of dormancy (method number 1), method of summer budding of the tested variety on indicator grafted on the seedling in the period of dormancy (method number 2), and method of double summer budding of the indicator and of the tested variety on the seedling (method number 3). On a woody indicator Golden Delicious, varieties Virgin Czech, Canadian rennet, Gascoigne, Ribston and Boskoop were tested, 10 plants of each variety. The experiment lasted 10 months. A total of 150 tested plants were assessed by a visual inspection of the symptoms presence. During the monitoring period, none of the tested plants showed typical symptoms of the apple proliferation. Presence of the Candidatus Phytoplasma mali was verified using real-time PCR method in 60 tested (indicator) plants. The infection was confirmed in 12 of the indicator plants. The detected quantities of the phytoplasma in the tissues however reached very low values. The highest number of the infected plants was found in tests of the Gascoigne variety, established by the method of double summer budding of the indicator and of the tested variety on the seedling (method number 3). This method provided the most successful inoculation of the indicator by the phytoplasma. Based on the results obtained during the presented study, it can be declared that biological testing of the phytoplasma presence using short-term greenhouse tests is not reliable. When using testing with the indicator ´Golden Delicious´, it is recommended to realize the experiments for at least two growing seasons, as it is in the field tests. Due to the fact that during the time-limited realization period of the experiment in this study it was found that the phytoplasma was not sufficiently propagated, the final results of the comparison of the indicator plants inoculation methods will be available at the end of autumn of 2017.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-15T15:39:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1246444 bytes, checksum: 4901c76fe1d76e482dba8c70875663f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T15:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1246444 bytes, checksum: 4901c76fe1d76e482dba8c70875663f3 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / O Brasil é o maior produtor mundial de frutos cítricos e maior exportador de suco de laranja. A maior produção está em São Paulo, seguida por Bahia, Paraná e Minas Gerais. Entre as pragas que atacam as plantas cítricas, a que vem se destacando pela rápida disseminação, difícil controle e por ser altamente destrutiva é o Huanglongbing. Tem como agente etiológico a bactéria Candidatus liberibacter sp. e é transmitida através do inseto vetor Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). No Brasil, é regulamentada como praga quarentenária presente, e a Instrução Normativa No 53, publicada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento em 16 de outubro de 2008, aprova os critérios e procedimentos para que os órgãos estaduais de defesa sanitária vegetal realizem os levantamentos de ocorrência do HLB e adotem medidas de prevenção e erradicação. Este trabalho buscou avaliar a evolução do HLB no estado de Minas Gerais, no período do segundo semestre de 2010 ao primeiro semestre de 2015, assim como as ações no levantamento e controle da praga. Para isso, foram analisados os dados dos Relatórios de Vistoria de Plantas Cítricas entregues pelos produtores ao Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) e dos relatórios de levantamento fitossanitário realizado nos pomares comerciais pelos fiscais do IMA, com os objetivos de detectar plantas cítricas com sintomas de HLB e coletar amostras dessas plantas para análise laboratorial e confirmação oficial da presença da praga. Houve aumento no número de plantas cítricas com sintomas de HLB erradicadas, sendo o município de Três Pontas e a coordenadoria de Varginha os que mais eliminaram plantas nesse período. Propriedades com área menor do que 15 hectares apresentaram taxas de erradicação maiores do que propriedades com área maior do que 100 hectares. Os resultados dos relatórios de levantamento fitossanitário indicaram que desde 2013 não são confirmados novos focos da praga em municípios produtores de citros em Minas Gerais, que se restringem a 20 municipalidades. As ações para levantamento e controle da praga requerem disponibilidade de recursos humanos e financeiros, e os esforços para que ela não se dissemine devem ser mantidos e intensificados. / Brazil is currently in the first position worldwide in citros production and orange juice exportation. The main producing states are São Paulo, Paraná, Bahia and Minas Gerais. From all the diseases that attack citrus plants, the one that has been highlighted by the rapid spread, difficult to control and to be highly destructive is the HLB (ex-greening). It is caused by the bacterium Candidatus liberibacter sp. and transmitted by Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). In Brazil is regulated as present quarantine pest and the Normative Instruction No. 53 issued by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply on October 16, 2008 approves the criteria and procedures for state agencies of plant health protection conduct the surveys on occurrence of HLB and adopt prevention and eradication measures. This study aimed to evaluate the evolution of HLB in the state of Minas Gerais in the second half of 2010 to the first half of 2015, and the evaluation of actions in the survey and control of the disease. To do this, data from Citrus Plant Inspection Reports delivered by producers to the Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) and phytosanitary survey reports conducted in commercial orchards by IMA’s supervisors in order to detect citrus plants with symptoms of HLB were analyzed and to collect samples of these plants for laboratory analysis and official confirmation of the presence of the disease. It was noted that the second half of 2010 to the first half of 2015 there was an increase in the number of citrus plants with symptoms of HLB eradicated, and the city of Três Pontas and the coordinating office of Varginha eliminated more plants in this period. Properties with an area less than 15 hectares showed higher eradication rates than properties with an area greater than 100 hectares. The results of phytosanitary survey reports showed that since 2013 is not confirmed new outbreaks of the disease in citrus producing municipalities in Minas Gerais, which is restricted in 20 municipalities. The actions for the survey and control of the disease require the availability of human and financial resources and efforts so that it can not be established must be maintained and intensified.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6344.pdf: 28928980 bytes, checksum: e00be5b82af995a60fd2dc884613b411 (MD5) Previous issue date: 2014-03-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / This paper describes the variation of the chemical profile study of citros after inoculation of the bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus", responsible for Huanglongbing (ex greening), one of the most serious diseases causing several losses in the Brazilian citrus industry. The bacterium "Ca. Liberibacter " was inoculated in seedlings of the" Valencia "(Citrus sinensis (L.) Osbeck) grafted on "Swingle" (Poncirus trifoliata x Citrus paradisi) and was evaluated the change of secondary metabolites by the development of analytical methods such as HPLC-UV, LC-MS/MS, LC-UVSPE- NMR and chemometric tools. The chemometric methods PCA and S-PLOT applied to data obtained in the studies by LC-MSE allowed to discriminate infected plants from healthy plants, and also allowed the characterization of the compounds that most contribute to this differentiation. By analyzing the change in the chemical profile of citrus studied by HPLC-UV-SPE-NMR, it was able to detect the change of some coumarins in the roots and stem from rootstock, and glycosides flavonoid in leaves, indicating that these compounds may be involved in defense mechanism of the plant, and may be acting as a Phytoanticipins. Aiming to better interpret this change observed, also performed a quantitative variation of some secondary metabolites, as coumarin identified in the roots, and flavonoids identified in leaves. This technique showed an increase of coumarins in infected plants, while there was a decrease in all the flavonoids in the leaves in infected treatment, indicating that the plant defense is in the roots. Finally, a phytochemical study of citrus was performed aiming obtain patterns compounds, and this study resulted in the isolation of 13 substances, from several classes of secondary metabolites. / O presente trabalho descreve o estudo da variação do perfil químico de citros após a inoculação da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus , responsável pelo Huanglongbing (ex-greening) que é uma das doenças mais sérias causadoras de prejuízos na citricultura brasileira. Para isso, inoculou-se a Ca. Liberibacter em mudas de a Valência (Citrus sinensis (L.) Osbeck) enxertadas em Swingle (Citrus paradisi X Poncirus trifoliata) e avaliou-se a variação dos metabólitos secundários através do desenvolvimento de métodos analíticos como HPLC-UV, LC-MS/MS, LC-UV-SPE-NMR e de ferramentas quimiométricas. As ferramentas quimiométricas (PCA e S-PLOT) aplicadas aos dados obtidos nos estudos de LC-MS/MS permitiram discriminar as plantas infectadas daquelas sadias, e também permitiram a caracterização dos compostos que mais contribuem para essa diferenciação. Ao analisar a variação do perfil químico dos citros doentes e sadios através da HPLC-UV-SPE-NMR foi possível detectar a variação principalmente de algumas cumarinas nas raízes e caule do porta enxerto, e flavonoides glicosilados nas folhas, indicando que estes compostos podem estar envolvidos no mecanismo de defesa da planta, e podem estar atuando como uma fitoantecipina. Para melhor interpretar essa variação observada, realizou-se também a variação quantitativa de alguns metabólitos secundários, como cumarinas identificadas nas raízes, e flavonóides identificados nas folhas. A partir dessa técnica foi possível verificar o aumento das cumarinas nas plantas infectadas com a bactéria, enquanto nas folhas observou-se a diminuição de todos os flavonóides no tratamento infectado, indicando que a defesa da planta parece estar nas raízes. Por fim, foi realizado um estudo fitoquímico de citros com o objetivo de obter substâncias padrões, que resultou no isolamento de 13 metabólitos secundários de diversas classes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-22Bitstream added on 2014-06-13T19:23:51Z : No. of bitstreams: 1 leal_rm_dr_jabo.pdf: 4872255 bytes, checksum: 46bfab51f00e499d72157c3c120d648c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do trabalho foi verificar a distribuição espacial de ninfas e adultos de D. citri e sua relação com a expansão do greening em duas áreas cultivadas com laranjeiras, uma de quatro e outra de 12 anos de idade, de uma propriedade agrícola localizada no município de Matão-SP, utilizando geoestatística. Para determinar o número de psilídeos adultos, de ninfas e de plantas com greening foram realizadas avaliações periódicas no período de dezembro/2005 a novembro/2007. Realizou-se uma análise descritiva dos dados e, para verificar a distribuição espacial de adultos e ninfas de D. citri e das plantas com greening, utilizou-se a metodologia geoestatística, ajustando semivariogramas e criando mapas através de interpolação por krigagem. A maior incidência de adultos e ninfas de D. citri ocorreu no período de primavera e verão. A área com plantas de quatro anos de idade apresentou maior incidência de adultos e ninfas de D. citri quando comparada com a área com plantas de 12 anos de idade. A distribuição espacial de adultos e ninfas de D. citri e das plantas com greening foi agregada, com raio de agregação que variou de 55 a100 metros. Por meio da geoestatística observou-se a expansão do greening nas duas áreas de laranjeira Valência. Na área de 4 anos, houve maior incidência de psilídeos e uma maior expansão da doença, com um aumento de 1700% no número de plantas com greening, enquanto que na área de 12 anos, houve menor incidência do psilídeo, e o aumento no número de plantas com greening foi de 277,78%. / The aim of this study was to use geostatistics to verify the spatial distribution of adults and nymphs of D. citri and its relation with expansion greening in two areas sweet orange, at four years old and other the twelve years old, in a Farm located in the Matão, municipality - São Paulo, State. To determine the number of adults psyllid, nymphs and plants with greening symptoms, periodic assessments were done December 2005 until November 2007. A descriptive data analysis was undertaken, and geostatistics were used to verify the spatial distribution of adults and nymphs of D. citri and plants of greening symptoms through the adjustment of semivariograms and interpolation of data by kriging. The higher incidence of adults and nymphs of D. citri occurred in the Spring and Summer periods when there was not high precipitation. The area with plants the four years old showed higher incidence of adults and nymphs of D. citri when compeered with area the plants the twelve years old. The spatial distribution the adults and nymphs of D. citri and the plants with greening were aggregate forming a beam of aggregation of 55 to 100 m. Through geostatistics verified the greening expansion in two areas with ‘Valência’ sweet orange. In the area with plants the four years old, with higher incidence of adults and nymphs of D. citri there was increase of 1700% in the number of plants with greening, while in the area with plants the twelve years old, this increase was of 277,78%.

Submitted by Michele Fernanda Souza Dutra (michele.084@terra.com.br) on 2018-09-25T14:24:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Mestrado_Michele_FSD_Versão_Final_25.09.18.pdf: 2825020 bytes, checksum: e2a62db2a8d1b14c59646518fe58e8e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-09-26T12:15:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dutra_mfs_me_araiq_int.pdf: 2808516 bytes, checksum: dbe9ed3db32fc012b5508b3b44d69e43 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-26T12:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dutra_mfs_me_araiq_int.pdf: 2808516 bytes, checksum: dbe9ed3db32fc012b5508b3b44d69e43 (MD5) Previous issue date: 2018-08-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O Huanglongbing (HLB) é a doença mais devastadora dos citros. No Brasil, o HLB está associado a presença de "Candidatus" Liberibacter asiaticus (Las) e Ca. L. americanus (Lam), ambas transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. O sequenciamento e anotação dos profagos SC1 e SC2 no genoma de Las, identificou uma possível bacteriocina do tipo colicina Ia em SC1, e uma possível proteína de imunidade a colicina em SC2. Lam apresenta profagos similares no seu genoma, porém SP2 é degenerado, sem proteína de imunidade. Como houve uma inversão notável na ocorrência de Las em relação à Lam no Brasil, com o predomínio atual de Las, a presença de ambos os profagos pode conferir uma vantagem adaptativa a Las pela atividade da bacteriocina. Adicionalmente, Las tem lisozimas cromossômicas e de profago, que também podem estar envolvidas em competição bacteriana. A incapacidade de cultivo axênico de Las e Lam requer o uso de sistemas heterólogos para estudos funcionais. Genes com potencial envolvimento na biologia do profago e na competição bacteriana, como as colicinas e lisozimas foram avaliados. As lisozimas CLIBASIA_04790 e ED07_RS0204515, obtidas dos isolados de Las 3PA e Las 4PA, e as colicinas SC1_gp060 e lam_678 obtidas de isolados de Las 2PA, Las Poona e Lam São Paulo foram clonadas em vetor de expressão pET28a e superexpressas em E. coli BL21 (DE3). O crescimento destas bactérias, mensurado pelas médias dos valores de absorbância (OD600), mostraram efeito tóxico das construções com lisozimas, sendo que clones de E. coli BL21 (DE3) expressando CLIBASIA_04790 (pMD15) e ED07_RS0204515 (pMD17) cresceram cerca de 60 e 70% menos, respectivamente, quando comparados aos controles. Ensaios de SDS-PAGE e Western Blot com anticorpo anti-His6X, evidenciaram a presença de ambas as proteínas na fração insolúvel, de 20 kDa (pMD15) e 12 kDa (pMD17), confirmando a expressão das lisozimas. Para as colicinas, somente o clone expressando SC1_gp060 proveniente do isolado Poona (pMD16) mostrou efeito em E. coli BL21 (DE3), com redução de 70% no crescimento quando comparado aos controles. Estes resultados auxiliam a desvendar a relação entre genes com potencial vantagem adaptativa e seu envolvimento na biologia das Liberibactérias e podem justificar seu uso biotecnológico em plantas geneticamente modificadas contra o HLB. / Huanglongbing (HLB) is the most devastating disease of citrus. In Brazil, HLB is associated with the presence of "Candidatus" Liberibacter asiaticus (Las) and Ca. L. americanus (Lam), both transmitted by psyllid Diaphorina citri. Sequencing and annotation of prophages SC1 and SC2 in the genome of Las, reveals the presence of a putative bacteriocin, colicin Ia in SC1, while in SC2 a possible colicin immunity-protein was found. Lam has similar prophages in the genome, though SP2 is degenerated, without immunity gene. As there was a striking inversion in the prevalence of Las in detriment of Lam, the presence of both prophages may confer an adaptative advantage to Las, due to the activity of the bacteriocin. Additionally, Las encodes both a chromosomal and phage lysozyme that may also be involved in bacterial competition. The inability of axenic cultivation of Las and Lam requires the use of heterologous systems for functional studies. Genes with potential involvement in prophage biology and bacterial competition, such as colicins and lysozymes, were evaluated. The lysozymes ORFs CLIBASIA_04790 and ED07_RS0204515, from Las isolates 3PA and Las 4PA, and the colicins SC1_gp060 and lam_678 obtained from isolates Las 2PA, Las Poona and Lam São Paulo were cloned into expression vector pET28a and superexpressed in E. coli BL21 (DE3) cells. The growth rate of these bacteria, measured by means of absorbance values (OD600), showed toxic effect of transformants expressing lysozymes, whereas E. coli BL21 (DE3) clones expressing CLIBASIA_04790 (pMD15) and ED07_RS0204515 (pMD17) grew about 60 and 70% when compared to controls. SDS-PAGE and Western Blot assays were performed with anti-His6X antibody, showing the presence of both proteins in the insoluble fraction, with 20 kDa (pMD15) and 12 kDa (pMD17), confirming lysozyme expression. In the case of the colicin, only the clone expressing SC1_gp060 from Las Poona strain (pMD16) showed toxic effect, showing reduction of 70% in growth rates when compared to the controls. These results help to unravel the relationship between genes with potential adaptive advantage and their involvement in the biology of Liberibacteria and may justify their biotechnological use in genetically modified plants against HLB. / CNPq: 830857/1999-0 -

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Raquel Luciana Boscariol-Camargo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_ThiagoSena_M.pdf: 6491430 bytes, checksum: 1dd8f0cde7283c457f3dfd61e7ff367d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Huanglongbing (HLB), também conhecido como greening é uma das mais importantes doenças dos citros no mundo e é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp. Esta doença é originária da China e da África, onde estão presentes as variantes Ca. L. asiaticus e Ca. L. africanus, respectivamente. Em 2004, a doença foi encontrada no Brasil onde foi identificada a forma asiática e também uma nova variante denominada Ca. L. americanus. A bactéria Ca.Liberibacter vive e se desenvolve no floema da planta hospedeira, causando amarelecimento do ramo infectado, deformação e queda do fruto. Até o momento não foi possível o cultivo em meio de cultura de Ca. Liberibacter e muito pouco é conhecido sobre sua biologia. Outra doença importante para a cultura, o cancro cítrico, também é originária do continente asiático, e causa grandes perdas de produção devido à desfolha da planta e a queda precoce de frutos. Seu agente causal, a bactériaXanthomonas axonopodis pv. citri provoca lesões necróticas em folhas, ramos e frutos. Não existem variedades resistentes ao HLB ou ao cancro cítrico, o que torna necessários estudos buscando fontes alternativas de resistência às doenças. Uma das possibilidades para se obter resistência é o uso de plantas geneticamente modificadas com genes que expressam peptídeos antimicrobianos ou que atuem no mecanismo de ativação da resposta das plantas às doenças. Os genes atacinaA e Xa21 já foram empregados em construções genéticas para variedades de laranjas doces, sendo que ambos apresentaram resistência a patógenos bacterianos em outras culturas, e diminuição no número de lesões causadas pelo patógeno X axonopodis em: I plantas transgênicas de laranja doce. Outro gene interessante, o Nprl, é um regulador que atua 0(1, indução de respostas de defesa da planta contra patógenos. Em outras culturas, a superexpressão de Npr 1 culturas promoveu aumento da resistência a fungos e bactérias. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta de plantas de laranjas geneticamente modificadas com estes três genes, quando infectadas com Ca. Liberibacter, e a resposta das plantas contendo o gene AtNpr 1 quando inoculadas com X axonopodis. O monitoramento da resposta à inoculação com Ca. Liberibacter foi realizado através da avaliação da presença de sintomas de HLB, e pela quantificação da bactéria nos tecidos do floema por meio de qPCR, utilizando-se a região ribossomal 16S bacteriana, previamente caracterizada. Já as plantas inoculadas com a bactéria causadora do cancro cítrico foram analisadas através da expressão de PR-proteínas, da quantificação do desenvolvimento da população bacteriana por meio de curva de crescimento, e pela análise visual de sintomas. A bactéria Ca. Liberibacter foi capaz de se multiplicar em todos os eventos de transformação analisados, porém quatro deles (transformados com o gene AtNprl) não manifestaram sintoma da doença. Duas plantas desta construção também apresentaram redução no número e tamanho das lesões causadas por X axonopodis, indicando uma possível tolerância desta planta à bactéria. / Abstract: Huanglongbing (HLB), also known as greening, is the world most important citrus disease and it is caused by the bacterium Candidatus Liberibacter spp. This disease was originated from China and Africa, where were discovered the variants Ca. L. asiaticus and Ca. L. africanus, respectively. In 2004, the disease was detected in Brazil, where the variants asiaticus and a new one called americanus were identified. The Ca. Liberibacter bacteria inhabit phloem vessels of host plants, causing yellowing of infected branches, and fruits abscission. At the moment, it was not possible to cultivate Ca. Liberibacter, and very little is known about its biology. Another important disease of citrus, the citrus canker, is also originated from Asian continent and causes huge damages to citrus production because of leaf drop and prematurely falI of fruits. Its causal agent, the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri, causes necrotic lesions in leaves, branches and fruits. There is no varietal resistance to HLB ar citrus canker, and it is necessary to develop studies in order to achieve altemative resistance sources to these diseases. One possibility to obtain resistance is the use of genetically modified plants expressing antimicrobial peptides genes, or expressing genes that act in theplant defense response machinery. The genes attacinA and Xa21 were used in genetic constructions for sweet orange varieties, and both showed resistarice to bacterial pathogens in other crops, with small number of lesions caused by X axonopodis in transgenic sweet orange plants. Another interesting gene, the Nprl, is a regulator that acts in the induction of plant defense response against pathogens. 1n other crops, the Npr 1 super-expression caused high leveI of resistance to bacterial and fungal pathogens. The goal ofthe present study was to evaluate the response of genetically modified sweet orange plants with these three genes, after infection of Ca. Liberibacter, and the response of plants containing the AtNprl gene, after X axonopodis inoculation. The response to Ca. Liberibacter infection was analyzed by the evaluation of HLB symptoms and by the quantification of phloem-associated bacteria by qPCR based on a previously characterized Ca. Liberibacter 168 ribosomal region. PIants inoculated with the causal agent of citrus canker were analyzed by RT-PCR to detect the expression of PR-proteins. The quantification of bacterial population was deveIoped using a growth curve and by visual analysis of symptoms. The bacterium Ca. Liberibacter grown in alI the transformation events analyzed, however four of them (transformed with the AtNprl gene) did not develop disease symptoms. Also, two. plants of this construction showed reduction in the number and size of lesions caused by X axonopodis, indicating a possible induction of plant tolerance to citrus canker. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular