Molibdênio é um elemento traço envolvido na fixação de nitrogênio, enxofre e carbono. Oligopeptídeos estão envolvidos na nutrição bacteriana e diversos outros processos de sinalização intercelular. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel funcional das proteínas ligadoras dos sistemas de captação de molibdato (ModA) e oligopeptídeo (OppA) em Xanthomonas axonopodis pv. citri em condições in vitro e in vivo. O mutante ModA mostrou uma produção diminuída de goma xantana, alteração do biofilme e adesão prejudicada em condições in vitro. In vivo a interação do mutante modA mostrou alterações nas lesões causadas em folhas de grapefruit possivelmente resultado da baixa expressão do gene gumB. O mutante na proteína OppA apresentou células mais co-agregadas alterando a estrutura do biofilme e consequentemente diminuindo sua capacidade de adesão. In vivo, a linhagem mutante não alterou o fenótipo de patogenicidade, mas a sua capacidade de crescimento foi afetada no início da fase estacionária sugerindo que o sistema Opp desempenha um papel nutricional. / Molybdenum is a trace element involved in nitrogen fixation, sulfur and carbon. Oligopeptides are involved in bacterial nutrition and several other intercellular signaling processes. The aim of this study was to investigate the functional role of binding proteins of molybdate (ModA) and oligopeptide (OppA) uptake systems of Xanthomonas campestris pv. citri in in vitro and in vivo conditions. ModA mutant showed a decreased production of xanthan gum, altered biofilm and adhesion impaired in vitro conditions. In vivo ModA mutant interaction showed changes in injuries on leaves of grapefruit possibly due to low expression of the gumB gene. The OppA mutant showed more cells co-aggregated by changing the structure of the biofilm and consequently reducing their capacity to adhere. In vivo, the mutant strain did not modify the phenotype of pathogenicity, but its ability for growth was affected at the early stationary phase suggesting that the Opp system plays a nutritional role.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação planta-microrganismo é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados, principalmente, para a diversidade e características benéficas induzidas, como o controle biológico de doenças. As doenças com sintomas de murcha e cancro são consideradas emergentes no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de Eucalyptus e a expansão do setor, juntamente com o cultivo clonal, tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos e do rizoplano têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação da comunidade bacteriana associada a Eucalyptus sp. com fungos causadores de murcha e cancro. Foi também estudada a diversidade e colonização desses endófitos em sementes e o efeito da germinação nessa interação. Adicionalmente, foi realizada uma busca por bactérias associadas a Eucalypus sp. com capacidade de controlar fungos causadores de murcha e cancro. Foi observado que a densidade bacteriana endofítica não difere entre as espécies de Eucalyptus citriodora, E. urophylla e E. globulus x E. grandis avaliadas e que esta comunidade cultivada é composta por bactérias pertencentes às classes Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. Com uso de diferentes ferramentas de estudo foi observado que a quantidade de bactérias endofíticas nas sementes aumenta proporcionalmente ao tempo de germinação. Foi observado também que os sintomas de murcha e cancro causados, principalmente, por Ceratocystis fimbriata podem ser causados por outros fungos patogênicos. Foram identificados 41 isolados bacterianos endofíticos e do rizoplano com capacidade de controlar fungos patogênicos causadores de murcha e cancro em Eucalyptus sp. Adicionalmente ao potencial para uso no controle biológico do cancro e da murcha de Eucalyptus, as bactérias de sementes aqui relatadas, podem ter papel importante de proteção das plantas no campo. Futuros estudos devem ser direcionados para identificação de genes associados a essa inibição, bem com análise dos fatores responsáveis por este controle biológico no campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction plant-microorganism is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out for several plant hosts, which are focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. Brazil is one of the largest world Eucalyptus producers and the increasing of the Eucalyptus production associated to clonally reproduction has allowed an increasing incidence of some pathogens. These new disease demands on studies related to causal agent and biotic and abiotic factors associated to the diseases. The canker of Eucalyptus is considered an emerging disease by several reforestation companies. In that way, the rhizoplane and endophytic microorganisms has been described as potential diseases biological control agents. In this context, the aims of the present work were to assess the bacterial community associated to Eucalyptus sp. plants and seeds, besides the interaction with the wilt and canker pathogenic fungi. We also assessed the diversity and colonization effect of seed germination on bacterial community. Additionally, was carried out a screening of the Eucalypus sp. associated bacteria against pathogenic fungi that cause wilt and canker. We observed that endophytic bacterial density doesn\'t differ among the species of Eucalyptus citriodora, E. urophylla and E. globulus x E. grandis and that this cultivated community is composed by follow bacterial classes Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Using different study approaches was observed that the amount of endophytic bacteria in the seeds increases proportionally at the germination time. We also observed that the symptoms of wilt and canker caused, mainly, by Ceratocystis fimbriata may be caused by other pathogenic fungi too. Additionally, were identified 41 endophytic and rhizoplane bacterial isolates able to control pathogenic fungi that cause Eucalyptus wilt and canker. Besides to the wilt and canker biological control potential of that bacteria, the seed endophyte identified in the present work can have important function on plant protection in the field. New studies should be addressed for identification of genes related to antagonism, besides of factors responsible for biological control occurrence in the field.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-20T14:28:26Z No. of bitstreams: 1 Adriano Marcio Freire da Silva.pdf: 233973 bytes, checksum: 8365664074820b5955fb940c37b47616 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-20T14:28:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriano Marcio Freire da Silva.pdf: 233973 bytes, checksum: 8365664074820b5955fb940c37b47616 (MD5) Previous issue date: 2009-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Bacterial canker (Xanthomonas campestris pv. viticola) (Xcv) caused great damage to the grapevine cultivation in the Vale do Submédio São Francisco. In the first paper techniques of in vitro tissue culture in modified Galzy medium (MGM) were studied in order to eliminate Xcv from ‘Red Globe’ grapevine plants. The first experiment aimed to select the ideal length of apex and axillary’s buds for cultivation in MGM; the second to verify the effect of the thermotherapy (38ºC/four weeks) associated to the MGM cultivation; and the third intended to test antibiotics to eliminate Xcv from explants taken from infected grapevines. All plants obtained without contamination in vitro and culture media contaminated were indexed by using the semi-selective culture media nutrient agar-dextrose-yeast extract-ampicilin (NYDAM) followed by a pathogenicity test. The cultivation of 3 mm explants permitted to obtain plants free of bacteria with regeneration 14.3 times higher than 1 mm explants. The thermotherapy of infected plants associated to the in vitro culture did not eliminate the pathogen. The cultivationof 10 mm explants for 40 days in MGM+cefotaxime (300 mg L-1) eliminated Xcv from grapevine plants. The indexation in NYDAM permitted the visualization of specific Xcv growing. The indexation of in vitro regenerated grapevine plants for Xcv infection by using NYDAM medium is an economic and efficient alternative for production of selected plants. It is known that pruning residues of infected plants abandoned in the grapevine plantations are important source of disease primary inoculum and that burning is recommended as control measure. Thus the second paper investigated the survival of Xcv in infected tissues and the use of composting to eradicate Xcv associated with crop residues. Plants of grapevine “Festival’ were inoculated with a mutant resistant to rifampicin Xcv2Rif and at the time they presented high disease severity, fragmented shoots and entire leaves were placed in mesh bags. These bagswere placed on the surface of microplots in experimental area (experiment 1) and inside compost piles of grapevine pruning residues (experiment 2). The survival of Xcv2Rif in grapevine infected tissue was monitored in the culture medium NYDAM + rifampicin (0,1g L-1) + azoxystrobim (0,16 g L-1), at 8 and 10 days intervals from 1 and 2 experiment setting, respectively. In the experiment 1 tissue decomposition was also evaluated and in the experiment 2, pile temperature curves, phenolyc content, and fungi and bacteria antagonistic to Xcv2Rif were analyzed. The pathogen survived in high densities (104 a 106 CFU g-1) for at least 80 days in grapevine-infected tissues on soil surface. Then grapevine-pruning residues are important inoculum source for other plants in the vineyard. The composting process eliminated Xcv2Rif from crop residues in 10 days due to high temperatures in piles, liberation of phenolyc compounds during the process and microbial antagonism. Therefore the composting is a viable and safemethod to manage pruning residues in grapevine plantations without problems of Xcv survival and without losing of an important source of organic matter for the culture. / O cancro-bacteriano causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) é responsável por grandes prejuízos ao cultivo de videira no Vale do Submédio São Francisco. No primeiro trabalho, técnicas de cultura de tecidos em meio de Galzy modificado (MGM) foram estudadas visando eliminar Xcv de mudas de videira ‘Red Globe’. O primeiro experimento visou selecionar o tamanho ideal de ápices e gemas axilares para o cultivo em MGM; o segundo, verificar o efeito da termoterapia de mudas (38ºC/quatro semanas) associada ao cultivo em MGM; e o terceiro, testar antibióticos para eliminação de Xcv em explantes oriundos de videiras infectadas. Todas as plantas obtidas sem contaminação in vitro e meios de cultivo contaminados foram indexados utilizando o meio ágar nutritivo-dextrose-extrato de leveduraampicilina (NYDAM) seguindo-se teste de patogenicidade. O cultivo de explantes com 3 mm possibilitou a obtenção de plantas livres da bactéria, com regeneração 14,3 vezes maior que explantes de 1 mm de comprimento. A termoterapia de mudas infectadas associada ao cultivo in vitro não eliminou o patógeno. O cultivo de explantes com 10 mm durante 40 dias em MGM+cefotaxima (300 mg L-1) proporcionou limpeza clonal das mudas. A indexação em NYDAM permitiu a visualização do crescimento de Xcv. A indexação de plantas de videira regeneradas in vitro quanto à infecção por Xcv utilizando NYDAM é uma alternativa econômica e eficiente para produção de plantas selecionadas. Sabe-se que restos de poda de plantas infectadas deixados no parreiral são importante fonte de inóculo primário da doença, recomendando-se a queima como medida de controle. No segundo trabalho, investigou-se a sobrevivência de Xcv em tecidos de videira infectados e o uso da compostagem para erradicação de Xcv em associação com restos culturais. Mudas de videira ‘Festival’ foram inoculadas com omutante resistente a rifampicina Xcv2Rif e quando apresentavam alta severidade da doença, ramos fragmentados e folhas inteiras foram acondicionados em bolsas de malha plástica. Estas foram alocadas na superfície de microparcelas em área experimental (experimento 1) e no interior de pilhas de compostagem de restos de poda de videira (experimento 2). A sobrevivência de Xcv2Rif em tecidos infectados de videira foi monitorada em meio NYDAM + rifampicina (0,1g L-1) + azoxystrobim (0,16 g L-1), a intervalos de 8 e 10 dias a partir do início do experimento, respectivamente nos experimentos 1 e 2. No experimento 1, foi também avaliada a decomposição de tecidos e no experimento 2, as curvas de temperatura das pilhas, conteúdo de fenóis, e presença de microbiota fúngica e bacteriana antagonista a Xcv2Rif. O patógeno sobreviveu em altas densidades (104 a 106 UFC g-1) por pelo menos 80 dias em tecidos infectados de videira na superfície do solo. Portanto, restos de poda de videira constituem importante fonte de inóculo primário para infecção de outras plantas no parreiral. O processo de compostagem eliminou Xcv2Rif de restos culturais em 10 dias, devido às altas temperaturas alcançadas pelas pilhas, liberação de compostos fenólicos durante o processo e antagonismo microbiano. Desta forma, a compostagem constitui uma maneira viável e segura de manejar os restos de poda em parreirais, sem perigo de sobrevivência de Xcv e sem que haja a perda de uma importante fonte de matéria orgânica para a cultura.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

Resumo: O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Abstract: Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system's secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system's proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system's pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris / Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo / Banca: Leandro Márcio Moreira / Mestre

Resumo: Dentro da comercialização de frutas, a citricultura é a mais importante. Representa para muitos países, dentre eles, os EUA e o Brasil, uma importante atividade econômica. Porém, esta atividade, vem sofrendo com inúmeras doenças e/ou pragas como a doença do Cancro Cítrico Asiático causada pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Deste modo, com o objetivo do estudo do genoma funcional da X. citri, um banco de mutantes deste microorganismo foi obtido por meio de inserção aleatória do transposon Tn5, nas quais foram selecionados 53 mutantes que apresentaram, de forma superficial, alterações fenotípica em relação à X. citri selvagem. Para uma avaliação mais precisa, eles passaram por uma nova confirmação de suas alterações fenotípicas, onde foram inoculados em folhas de Citrus sinensis (Laranjeira pêra-Rio) e Citrus limonia (limoeiro cravo) e monitorados durante 16 dias, e aqueles que apresentaram as maiores alterações em relação à selvagem, tiveram confeccionadas para si curvas de crescimento in vivo. Conseguiu-se, desta forma, avaliar quantitativamente o processo patogênico, relacionar seus sintomas com dados numéricos e ainda descobrir detalhes até então não conhecidos. O mapeamento, dos respectivos loci mutados, foi realizado por seqüenciamento de DNA a partir do transposon, demonstrando que a metodologia empregada para a obtenção dos mutantes foi eficiente, conseguiu também revelar diversas proteína ainda hipotéticas, e outras, até então, não considerados como implicados no processo patogênico, como, uma Integrase, Fe-S oxidoredutase, Helicase IV, Receptor Dependente de Ton-B, entre outros / Abstract: Concerning the commercialization of fruits, the citrus production is the most important. It represents for many countries, amongst them, U.S.A. and Brazil, an important economic activity. However, this activity has been suffering with many illnesses and/or plagues as the illness from the Asiatic citrus canker caused by the Xanthomonas citri subsp. citri bacterium (X. citri). In this way, from a bank of mutants of X. citri, gotten by means of random insertion of commercial one derived from transposon Tn5, had been selected 53 mutants that had presented, of superficial form, some type of phenotype alteration in relation to the wild X. citri. To a more necessary evaluation, each one of them passed for a new confirmation of its phenotype alterations, where they had been inoculated in leafs of Citrus sinensis ('Pera' sweet orange) and Citrus limonia ('Rangpur' lime) and monitored during 16 days, and those that had presented the biggest alterations in relation to the savage, had confectioned for itself in planta growth curves. We obtain, in such a way, to evaluate quantitatively the pathogenic process, to relate its symptoms with numerical data and still to discover not known details until then. The mapping of respective locus mutated was carried through by sequencing of DNA from transposon, demonstrating that the methodology used for the attainment of the mutants was efficient and still to disclose diverse genes still hypothetical, and others, until then, not considered as implied in the pathogenic process, as, Integrase, Fe-S oxidoredutase, Helicase IV, TonB-dependent receptor, among others / Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Mariana Carina Frigieri / Mestre

Submitted by ALINE CRISTINA LOPES null (line.cl@hotmail.com) on 2016-05-02T12:42:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Aline_Cristina_Lopes.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T14:14:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lopes_ac_me_jabo.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T14:14:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lopes_ac_me_jabo.pdf: 1995885 bytes, checksum: 09268565881925cc85d0cdbe17aa6d6c (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A citricultura é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro. Entretanto, inúmeras pragas e doenças atacam os citros, causando grandes prejuízos econômicos. O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é um grave problema para o setor, não havendo ainda um método eficaz para o seu controle. Neste estudo, utilizando RNASeq, foram analisados os perfis transcricionais de Xac inoculada em duas espécies de citros contrastantes à doença: laranja doce ‘Pêra Rio’ (Citrus sinensis L. Osbeck), menos suscetível e lima ácida ‘Galego’ (Citrus aurantifolia Swingle), altamente suscetível, às 48 e 72 horas após a infecção (hai), com o objetivo de identificar genes de Xac envolvidos no processo de infecção. Foram identificados 80 genes de Xac diferencialmente expressos (GDEs) no hospedeiro laranja doce ‘Pêra Rio’, sendo 41 e 39 nos tempos de 48 e 72 hai, respectivamente. Em lima ácida ‘Galego’ foram identificados 82 GDEs, sendo 40 no tempo de 48 hai e 42 em 72 hai. Alguns destes genes diferencialmente expressos foram avaliados pela técnica de PCR quantitativa em tempo real, sendo estes hpa1, hrpE, hrpW, virK, ahpC, katE, katG, cydA e cydB, os quais estão envolvidos na patogenicidade e virulência, na defesa ao estresse oxidativo e na fosforilação oxidativa. Os genes de patogenicidade e virulência foram induzidos em Xac em ambos os hospedeiros, enquanto que os genes relacionados à cadeia respiratória foram inibidos em ambos os hospedeiros, com maior inibição em lima ácida ‘Galego’. No entanto, os genes relacionados ao estresse oxidativo apresentaram um perfil de expressão maior em Xac na interação com laranja doce ‘Pêra Rio’ do que em lima ácida ‘Galego’, principalmente ahpC e katG. A determinação da concentração de H2O2 nas folhas revelou que laranja doce ‘Pêra Rio’, espécie menos suscetível ao cancro cítrico, possui maior quantidade de H2O2 do que lima ácida ‘Galego’, espécie altamente suscetível. Isso sugere que a menor susceptibilidade ao cancro cítrico da laranja ‘Pêra Rio’ pode estar relacionada com a maior quantidade de H2O2 presente nesta espécie, o que leva a bactéria a ativar seu arsenal de enzimas para combater o estresse oxidativo do meio, retardando a infecção. / The citrus industry is one of the main activities of Brazilian agribusiness. However, many pests and diseases attack citrus, causing great economic losses. The citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a major problem for the sector, there is not yet an effective method for its control. In this study, the transcriptional profiles of Xac inoculated in two species of contrasting citrus disease were analyzed using RNA-Seq : sweet orange 'Pêra Rio' (Citrus sinensis L. Osbeck), moderately tolerant and Mexican Lime 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle) highly susceptible at 48 and 72 hours after infection (hai) aiming to identify Xac genes involved in the infection process. We identified 80 Xac differentially expressed genes (DGE) in sweet orange 'Pera Rio', 41 and 39 at 48 and 72 hai, respectively. In Mexican Lime 'Galego' 82 DGE were identified, 40 at 48 and 42 at 72 hai. Some of these differentially expressed genes were evaluated by real time quantitative PCR : hpa1, hrpE, hrpW, Virk, ahpC, KatE, katG, cyda and cydB, which are involved in pathogenicity and virulence, oxidative stress defense and oxidative phosphorylation. The pathogenicity and virulence genes were induced in Xac in both hosts, whereas the respiratory chain-related genes were inhibited in both hosts with greater inhibition in Mexican lime 'Galego'. However, genes related to oxidative stress showed a higher expression profile in Xac interaction with sweet orange 'Pera Rio' than with Mexican lime 'Galego', mainly ahpC and katG. The determination of H2O2 concentration in leaves revealed a higher amount of H2O2 in sweet orange 'Pêra Rio' moderately tolerant to citrus canker, than in Mexican Lime 'Galego' highly susceptible to citrus canker. The results suggests that the lower susceptibility to citrus canker orange 'Pera Rio' may be related to the greater amount of H2O2 present in this specie, which leads the bacteria to activate their arsenal of enzymes to fight oxidative stress environment, slowing the infection.