Les microARN (miARN) sont des petits ARN non-codants pour des protéines qui permettent d’inhiber la traduction d’ARN messagers. Pour obtenir un miARN, un gène de miARN passe à travers une voie de maturation dans laquelle il sera coupé à deux reprises par les enzymes Drosha et Dicer. Pour interagir avec les enzymes, les gènes de miARN possèdent une structure générale en tige-boucle. Cependant, les détails de cette structure sont encore peu connus. L’objectif principal de ce projet était d’établir s’il y a une relation entre l’efficacité de maturation et la dynamique de la structure. Pour cela, l’efficacité de maturation de plusieurs variants de miARN a été évaluée par Northern Blot. La dynamique de la structure a été mesurée par un programme informatique à partir de l’information de la séquence. Une corrélation de 0,74 avec une valeur p de 0,02206 a été obtenue entre les dynamiques et les ratios d’efficacités de maturation de miARN. Cette corrélation est supérieure à celle obtenue basée sur l’énergie libre des structures prédites les plus stables qui n’atteignent pas 0,6. Les mutants de miR128-1 et miR188 ont été découverts comme diminuant la maturation. De plus, les mutants de miR125a, miR188 et miR330 affectent le site de clivage de Drosha. Une meilleure connaissance de la dynamique de l’ARN impliquée dans la maturation permettrait de définir l’impact des mutations dans les séquences de miARN ou encore de prédire les séquences pouvant générer des miARN. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs, which can inhibit target messenger RNAs translation. In order to obtain a miRNA, two enzymes, Drosha and Dicer cut the gene of miRNA. The RNA interacts with the proteins by its general hairpin structure. However, the details of the structure are still missing. The objective of this project is to establish if there is a relation between the efficiency of maturation and the RNA’s structural dynamics. In order to do this, the maturation efficiency of miRNA variants is measured by Northern Blot. The structural dynamics is measured by a program assessing the information of the sequence. The correlation between the dynamics and the maturation efficiency of the miRNA is 0.74 with a p-value of 0.02206. This correlation is superior to those based on free energy, which does not reach 0.6. The tested mutants of miR128-1 and miR188 have inhibited maturation; also, those of miR125a, miR188 and miR330 have modified the cleavage site of Drosha. A better knowledge of the dynamic structure involved in maturation would help define the impact of miRNA mutation or to predict sequences that are able to generate miRNAs.

L’étude de l’assemblage et de l’acheminement à la membrane plasmique des complexes de signalisation des RCPGs va jouer un rôle crucial dans le développement de nouveaux médicaments ayant moins d’effets secondaires. Des outils permettant l’étude de ces phénomènes existent déjà, mais un outil polyvalent qui permettrait d’étudier plusieurs aspects pourrait grandement faciliter et accélérer ces études. L’étiquette SNAP est un candidat intéressant puisqu’avec cette étiquette il est possible de marquer une seule construction avec une variété de différents substrats. Une construction encodant pour le récepteur β2AR avec une étiquette SNAP à son extrémité C-terminale a été ingénérée. Cette construction est apte à lier son ligand, à être acheminée à la membrane plasmique et à homodimériser. La protéine exprimée a été marquée avec le fluorophore BG-430. De la fluorescence non spécifique a été détectée dans la cellule (même en absence de l’étiquette SNAP sur le récepteur). Un essai BRET a été développé, utilisant la construction HA-β2AR-SNAP en tant qu’accepteur et est fonctionnel. L’étiquette SNAP, comme utilisée ici, ne présente pas un aussi bon candidat qu’attendu, puisque le substrat n’ayant pas réagi demeure coincé dans la cellule. Le facteur activateur de plaquette (PAF) et son récepteur (PAFR) jouent un rôle critique dans plusieurs réponses inflammatoires et le récepteur FP est impliqué dans l’accouchement prématuré. Une meilleure compréhension des complexes de signalisation associés à ces récepteurs pourrait être la première étape dans la compréhension de leur signalisation dans des situations normales ou de maladies. Des expériences de BRET étudiant des interactions de bases entre les récepteurs et leurs partenaires d’interactions connus ont été réalisées. Elles ont permis de déterminer que : les récepteurs PAF et FP homodimérisent, que les récepteurs PAF et FP hétérodimérisent, que les protéines Gβγ interagissent de manière constitutive avec ces récepteurs et qu’aucun signal de BRET n’a été détecté avec la protéine Gα et ce, en présence ou en absence de stimulation par un agoniste (suggérant qu’il est nécessaire d’optimiser le système présentement utilisé). / Studies of the assembly and plasma membrane trafficking of G protein-coupled receptor (GPCR) signalling complexes will play an important role in the development of new drugs with fewer side effects. Tools for this purpose have already been developed, but a more versatile tool which would allow assessment of multiple aspects of GPCR trafficking and protein/protein interaction could greatly facilitate and expedite these studies. The SNAP tag is without doubt an interesting candidate for this task. Using this tag, it is possible to label one receptor construct, with a variety of different substrates. A construct encoding the β2AR receptor was engineered with a C-terminal SNAP tag. This construct, when expressed in HEK 293 cells, was able to bind ligand, to traffic to the plasma membrane and to form homodimers. The expressed protein was then labelled with the BG-430 fluorophore. Non-specific fluorescence was detected in the cell, even in the absence of the SNAP tag. A BRET assay was developed using the HA-β2AR-SNAP as a BRET acceptor. The SNAP tag as used in this initial study was not as good as thought previously because uneacted substrate remains trapped in cells (i.e. the background was too high). Platelet-activating factor (PAF) and its receptor (PAF-R) play a critical role in many inflammatory responses and the receptor for prostaglandin F (FP) plays a role in pre-term labour. A better understanding of signalling complexes associated with these receptors might be the first step in a better understanding of their signalling in health and disease. As an initial step in this direction, we used BRET to study basic interactions between these receptors and known signalling partners. PAF-R and FP receptors homodimerize. A heterodimer between the FP and PAF receptors was also detected. Gβγ subunits interact with these receptors in a constitutive way. In the case of the Gα, no BRET signal was detected with or without agonist stimulation suggesting more work is required to optimize the system.

La susceptibilité ou la résistance aux cancers peuvent impliquer plusieurs mécanismes, incluant l’apoptose, la croissance cellulaire et la différenciation, la réplication et la réparation de l’ADN. Mon projet porte plus particulièrement sur l’apoptose. Une dérégulation dans les voies d’activation de l’apoptose entraîne une accumulation de cellules déréglées, créant ainsi un environnement propice à l’instabilité génétique et au développement du cancer. Comme l’apoptose est une voie biologique hautement régulée, nous proposons l’hypothèse que des polymorphismes « fonctionnels » dans les régions de régulations des gènes (rSNPs) perturberaient cette voie à cause de taux variables de transcrits et des protéines correspondantes dû à la modification des sites de reconnaissances des facteurs de transcription. Les principaux objectifs de mon projet sont : (i) identifier les SNPs présents dans la région promotrice des gènes d’apoptose; (ii) déterminer les haplotypes de promoteurs les plus fréquents présents dans la population générale; (rHaps) (iii) vérifier leurs impacts fonctionnels sur l’expression génique par des essais in vitro (gène rapporteur et retard sur gel). Cette étude permettra d’identifier des rSNPs et rHaps ayant un impact sur le niveau d’expression des gènes d’apoptose, au moins dans un contexte in vitro. Ces différences alléliques au niveau de l’expression de ces gènes d’apoptose pourraient contribuer à la susceptibilité interindividuelle de développer un cancer. / Cancer susceptibility can involve many different mechanisms, including apoptosis, cell growth, cell differentiation, DNA replication and DNA repair. My project focuses on the apoptosis pathway. Decreased apoptosis level can lead to the accumulation of dysregulated cells, creating a favourable environment for genetic instability and tumorigenesis. Since apoptosis is a highly regulated pathway, the hypothesis of this project is that functional polymorphisms (rSNPs) in the regulatory regions of apoptosis genes such as promoters could create or disrupt transcription factor binding sites and modify their transcription levels. The main objectives of my project are: (i) Identify rSNPs in promoter regions of apoptosis genes; (ii) Calculate the frequent promoter haplotypes (rHaps) in general population; (iii) Validate their functional impact on gene expression with in vitro assays (gene reporter and gel shift). This study will allow identification of rSNPs and rHaps that could influence apoptosis gene expression levels, at least in the in vitro context. These allelic differences of expression in apoptosis genes could contribute to interindividual cancer susceptibility.

L’endothéline-1 (ET-1) est un puissant agent vasoconstricteur dont la production est dérégulée dans plusieurs maladies inflammatoires où l’expression des cyclooxygénases-1/2 (COX-1/2) est augmentée. Puisqu’il est connu que la voie p38 MAPK est impliquée dans la régulation de l’ET-1 au niveau de l’ARNm, nous avons étudié le rôle de l’un de ses substrats, la kinase MK2 dans la régulation post-transcriptionnelle de l’ET-1 et des COX. Pour ce faire, nous avons utilisé des souris MK2-déficientes (MK2-/-) ainsi que des contrôles (MK2+/+) issus de la même portée. Des paramètres de la fonction cardiaque ont été mesurés sous anesthésie à l’aide d’un cathéter Millar et la réactivité vasculaire de l’artère fémorale a été mesurée par myographe. L’expression de ET-1, COX-1 et COX-2 a été quantifiée dans la cellule endothéliale aortique (CE) par qPCR. En réponse à l’ET-1 (100 nM), l’expression de la préproET-1 dans les CE augmente en fonction du temps (p<0.05) : cette variation est accentuée chez les souris MK2-/-. Bien que la pression artérielle soit similaire entre les souris MK2+/+ et MK2-/-, l’inhibition de COX (indométacine, 1 μM) augmente (p<0.05) la contraction à l’ET-1 des vaisseaux isolés provenant de souris MK2+/+ mais pas des MK2-/-. Ces données suggèrent un rôle de MK2 dans la réponse vasculaire à l’ET-1 et possiblement dans la signalisation post-récepteur de l’ET-1 en général. / Endothelin-1 (ET-1) is a potent vasoconstrictor whose production is deregulated in many inflammatory related diseases in which the cyclooxygenase-1/2 (COX-1/2) is up-regulated. Since it is known that the p38 MAPK pathway regulates ET-1 expression at the mRNA level, we studied the implication of the downstream kinase MK2 in the post-transcriptional regulation of ET-1 and COX. To accomplish this, MK2-deficient mice (MK2-/-) and their wild type littermate controls (MK2+/+) were used. Cardiac function parameters were measured using a Millar catheter under anesthesia and isometric reactivity of the isolated femoral artery was measured subsequently using a wire myograph. Aortic endothelial cell (EC) ET-1, COX-1 and COX-2 expression was quantified by qPCR. In response to ET-1 (100 nM), EC expression of preproET-1 increased in a time-dependant manner (p<0.05): this change in mRNA was greater in MK2-/- mice. Although arterial pressure was similar in MK2+/+ and MK2-/- mice, inhibition of COX (indomethacin, 1 μM) increased (p<0.05) the contraction of isolated vessels to ET-1 from MK2+/+ but not MK2-/- mice. These data suggest a role of MK2 in the vascular response to ET-1 and, possibly, ET-1 post-receptor signalling in general.

Quelques enzymes sont connus pour déglyquer les kétoamines résultants de la réaction de Maillard entre des sucres et des amines primaires. Il a été démontré qu’Escherichia coli possède un opéron afin de métaboliser la fructoselysine. La fructoselysine 6-kinase, de la famille des PfkB, initie le processus de déglycation permettant l’utilisation ultérieure du glucose-6-P par la bactérie. La résolution de la structure de la FL6K par cristallographie et diffraction des rayons X a permis d’identifier son site actif en présence d’ATP, d’ADP et d’AMP-PNP. La modélisation de la fructoselysine au site actif de la kinase a permis d’identifier des résidus pouvant être importants pour sa liaison et son mécanisme enzymatique. De plus, les résultats de cinétique suggèrent que le mécanisme utilisé par la FL6K semble passer par un état ternaire de type SN2. Des modifications structurales à la FL6K pourraient permettre d’augmenter la taille des substrats afin de permettre ultimement la déglycation de protéines. / Some enzymes have been found to deglycate the products of the Maillard reaction between sugars and primary amines: ketoamines. An operon is found in Escherichia coli that allows the growth on fructoselysine media. The deglycation process is done by a kinase and a “deglycase”. The fructoselysine 6-kinase, a member of the PfkB family, phosphorylates its substrate on the sixth carbon to initiate the metabolism of fructoselysine. Here are presented x-ray crystallography structures obtained for the fructoselysine 6-kinase in its native form and bound with ATP, ADP and AMP-PNP. The active site of the kinase has been determined, and modelisation of fructoselysine allowed identification of some residues that might be important for the specific binding of the substrate and the enzymatic mechanism. Kinetic results tend to suggest a SN2 mechanism for the phosphorylation catalyzed by the enzyme. Structural modifications of the FL6K could help to increase the size of the substrates recognized by the enzyme until it binds glycated proteins.

De récents travaux ont mis en évidence une production accrue de Perlecan au stade terminal de l’arthrose ou ostéoarthrite (OA). L’équipe du Dr Moreau a mis en évidence qu’il y a une perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans l’arthrose et que ce dernier pourrait agir comme un régulateur négatif du gène HSPG2 codant pour le Perlecan. Afin d’étudier la régulation transcriptionnelle de ce gène, des fragments du promoteur proximal ont été clonés en amont du gène rapporteur luciférase et testés en transfections transitoires. Des co-transfections avec des quantités variables de pSI-mPitx1 et avec des constructions comportant des fragments de différentes régions du promoteur mHSPG2 (jusqu’à 3926 pbs en amont de l’ATG) ont démontrées une activité transcriptionnelle et une stimulation de cette activité en présence de Pitx1, avec des résultats variables selon les types cellulaires. Parallèlement, des expériences en qPCR effectuées sur des ostéoblastes dérivés de souris transgéniques surexprimant Pitx1 ont aussi démontré qu’une surexpression de Pitx1 corrèle avec une augmentation de l’expression de p53, une cible connue de Pitx1, et de Perlecan. Le lien qui existe entre Pitx1 et Perlecan est encore très méconnu et la cascade régulatrice impliquant ces deux acteurs n’est pas encore établie. Une meilleure connaissance des mécanismes qui régulent la transcription normale et pathologique du gène HSPG2 permettrait sans aucun doute une avancée dans la compréhension du développement et du rôle possible de Perlecan dans la progression de l’ostéoarthrite. / Recent work has shown an increase of Perlecan production associated with the terminal stage of osteoarthritis (OA). Dr Moreau’s team demonstrated a loss of expression of the transcription factor Pitx1 in osteoarthritis suggesting its putative role as a negative regulator of the HSPG2 gene coding for Perlecan. To study the transcriptional regulation of this gene, promoter fragments were cloned upstream of a luciferase reporter gene and tested in transient transfection assays. Co-transfections with variable quantities of pSI-mPitx1 and with constructs made with fragments of different lengths of the mHSPG2 promoter demonstrated a transcriptional activity and enhancement of this activity in presence of Pitx1, with variable results depending on cell types. In addition, expression analysis by qPCR on transgenic mice osteoblasts that overexpress Pitx1 showed that the overexpression of Pitx1 correlates with an augmentation of p53, a known Pitx1 target and Perlecan expression. The link between Pitx1 and Perlecan is still poorly understood and a clear pathway involving those two players is not yet established. A better understanding of mechanisms regulating normal and pathological transcription of the HSPG2 gene encoding for Perlecan would allow a better comprehension of osteoarthritis development and the putative role of Perlecan in its progression.

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6. / The autotrophic lifestyle of plants relies entirely on the integrity of chloroplasts and particularly on their biogenesis. Chloroplast gene transcription, performed by a Plastid-Encoded Polymerase (PEP) and two Nuclear-Encoded Polymerases (NEPs), is one of the key steps during the development of photosynthetic chloroplast. There are 3 classes of genes, one transcribed by PEP alone (class I), one by both PEP and NEPs (class II), and the third by NEPs alone (class III). To carry out transcription, PEP associates with plastid sigma factors including the general sigma factor SIG6. sig6 mutants have a pale cotyledon phenotype, a severe decrease in class I gene transcription and a reduction in the level of class I proteins. In our laboratory, we study the role of the two plastid WIHRLY proteins (WHY1 and WHY3) in maintaining plastid genome stability. However, little is known about any role these proteins may play in transcription or chloroplast biogenesis. It seems likely they are involved in plastid gene transcription since they are found in the Plastid Transcriptionally Active Chromosome (PTAC). Moreover, they have been implicated in chloroplast biogenesis in maize. In this study, we verified the implication of these proteins in plastid biogenesis using a genetic approach in which we crossed a sig6 mutant with a why1why3 mutant. We isolated sig6why1 and sig6why3 double mutants and a sig6why1why3 triple mutant. Using a phenotypic characterisation and quantification of some plastid proteins, we show that loss of one of the two Why genes complements the sig6 pale cotyledon phenotype and allows a more normal pattern of expression of plastid proteins that are under-expressed in the sig6 mutant. However, we also show that loss of the two Why genes does not alleviate the sig6 phenotype. Moreover, the triple mutant shows a second pale phenotype on true leaves, and the plastid protein expression pattern is abnormal compared to either sig6 or wild type plants. Those results cannot be explained by the role of WHIRLY proteins in plastid genome stability since the triple mutant shows fewer plastid genome rearrangements than the why1why3 mutant. Finally, we show that inhibition of the PEP polymerase using rifampicin elicits the same complementation of the sig6 phenotype as the loss of one of the two WHIRLY. Together, these results show the implication of WHIRLY proteins in plastid biogenesis in association with SIG6. We propose a model in which WHIRLY act as activators of PEP activity, particularly during the chloroplast biogenesis. Therefore, the absence of one of the WHIRLY would cause a weak inhibition of PEP, facilitating the set-up of a rescue mechanism by NEPs and, consequently, allowing the complementation of plastid biogenesis in the sig6 mutant. However, the absence of the two WHIRLY proteins would cause a strong inhibition of PEP, and the inability of the rescue mechanism by NEPs to compensate for this strong inhibition, resulting in a more severe phenotype in the sig6 mutant.

La sclérose latérale amyothrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative charactérisée par la perte des neurones moteurs menant à la paralysie et à la mort. Environ 20% des cas familiaux de la SLA sont causés par des mutations de la superoxyde dismutase 1 (SOD1), conduisant vers un mauvais repliement de la protéine SOD1, ce qui a comme conséquence un gain de fonction toxique. Plusieurs anticorps spécifiques pour la forme mal repliée de la protéine ont été générés et utilisés comme agent thérapeutique dans des modèles précliniques. Comment le mauvais repliement de SOD1 provoque la perte sélective des neurones moteurs demeure non résolu. La morphologie, le bilan énergétique et le transport mitochondrial sont tous documentés dans les modèles de la SLA basés sur SOD1, la détérioration des mitochondries joue un rôle clé dans la dégénération des neurones moteurs. De plus, la protéine SOD1 mal repliée s’associe sélectivement sur la surface des mitochondries de la moelle épinière chez les modèles de rongeurs de la SLA. Notre hypothèse est que l’accumulation de la protéine SOD1 mal repliée sur les mitochondries pourrait nuire aux fonctions mitochondriales. À cette fin, nous avons développé un nouvel essai par cytométrie de flux afin d’isoler les mitochondries immunomarquées avec des anticorps spécifiques à la forme malrepliée de SOD1 tout en évaluant des aspects de la fonction mitochondriale. Cette méthode permettra de comparer les mitochondries portant la protéine SOD1 mal repliée à celles qui ne la portent pas. Nous avons utilisé un anticorps à conformation spécifique de SOD1, B8H10, pour démontrer que la protéine mal repliée SOD1 s’associe avec les mitochondries de la moelle épinière des rat SOD1G93A d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries avec la protéine mal repliée SOD1 B8H10 associée à leur surface (B8H10+) ont un volume et une production excessive de superoxyde significativement plus grand, mais possèdent un potentiel transmembranaire comparable aux mitochondries B8H10-. En outre, la présence de la protéine mal repliée SOD1 reconnue par B8H10 coïncide avec des niveaux plus élevés de la forme pro-apoptotique de Bcl-2. L’immunofluorescence de sections de moelle épinière du niveau lombaire avec l’anticorps spécifique à la conformation B8H10 et AMF7-63, un autre anticorps conformationnel spécifique de SOD1, démontre des motifs de localisations distincts. B8H10 a été trouvé principalement dans les neurones moteurs et dans plusieurs points lacrymaux dans tout le neuropile. Inversement, AMF7-63 a marqué les neurones moteurs ainsi qu’un réseau fibrillaire distinctif concentré dans la corne antérieure. Au niveau subcellulaire, SOD1 possèdant la conformation reconnu par AMF7-63 est aussi localisée sur la surface des mitochondries de la moelle épinière d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries AMF7-63+ ont une augmentation du volume comparé aux mitochondries B8H10+ et à la sous-population non marquée. Cependant, elles produisent une quantité similaire de superoxyde. Ensemble, ces données suggèrent qu’il y a plusieurs types de protéines SOD1 mal repliées qui convergent vers les mitochondries et causent des dommages. De plus, différentes conformations de SOD1 apportent une toxicité variable vers les mitochondries. Les protéines SOD1 mal repliées réagissant à B8H10 et AMF7-63 sont présentes en agrégats dans les fractions mitochondriales, nous ne pouvons donc pas prendre en compte leurs différents effets sur le volume mitochondrial. Les anticorps conformationnels sont des outils précieux pour identifier et caractériser le continuum du mauvais repliement de SOD1 en ce qui concerne les caractéristiques biochimiques et la toxicité. Les informations présentes dans cette thèse seront utilisées pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces anticorps. / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder characterized by the loss of motor neurons resulting in paralysis and death. Approximately 20% of familial ALS cases are caused by mutations in superoxide dismutase (SOD1), which leads to misfolding of the SOD1 protein, resulting in a toxic gain of function. Several antibodies have been generated that are specific for the misfolded form of the protein, and have been used as therapeutics in pre-clinical models. How misfolded SOD1 provokes a selective loss of motor neurons remains unresolved. Mitochondrial morphology, bioenergetics and transport are all documented is SOD1-mediated ALS models, thus mitochondrial impairment plays a key role in motor neuron degeneration. Moreover, misfolded SOD1 selectively associates with the surface of spinal cord mitochondria in ALS rodent models. We hypothesize that the accumulation of misfolded SOD1 on mitochondria could impair mitochondrial function. To this end, we developed a novel flow cytometric assay to immunolabel isolated mitochondria with misfolded SOD1 antibodies while also evaluating aspects of mitochondrial function. This method will allow for a comparison of mitochondria bearing misfolded SOD1 to those without. We utilized the B8H10 conformation specific SOD1 antibody to demonstrate that misfolded SOD1 associates with SOD1G93A rat spinal cord mitochondria in a in a time dependent manner. Mitochondria with B8H10-reactive misfolded SOD1 associated with their surface (B8H10+) have a significantly larger volume and produce excessive amounts of superoxide, but have a similar transmembrane potential compared to B8H10- mitochondria. In addition, the presence of B8H10-reactive misfolded SOD1 coincides with higher levels of the pro-apoptotic form of Bcl-2. Staining of lumbar spinal cord sections with both B8H10 and another conformation specific SOD1 antibody, AMF7-63, yielded distinct localization patterns. B8H10 was found predominantly in motor neurons and numerous puncta throughout the neuropil. Conversely, AMF7-63 marked motor neurons as well as a distinctive fibrillar network that was concentrated in the anterior horn. At the subcellular level, AMF7-63-reactive misfolded SOD1 also localized to the mitochondrial surface of spinal cord mitochondria in a time-dependent manner. AMF7-63+ mitochondria have an increased volume compared to B8H10+ mitochondria and the unlabelled subpopulation. However, they produce similar amounts of superoxide. Together, these data suggest that there are multiple species of misfolded SOD1 that converge at the mitochondria to cause damage. Moreover, different SOD1 conformations may ellicit varying toxicities towards mitochondria. Both B8H10 and AMF7-63-reactive misfolded SOD1 are present in aggregates in mitochondrial fractions and can therefore not account for any different effects produced in terms of mitochondrial volume. Conformational antibodies are invaluable tools to identify and characterize the continuum of misfolded SOD1 species with regards to biochemical characteristics and toxicity. The information presented in this thesis will be used in determining the future therapeutic potential of these antibodies.

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains. / Clinical and in vitro studies suggest that subchondral bone sclerosis due to abnormal osteoblasts (Ob) is involved in the progression and/or onset of osteoarthritis (OA). Human Ob isolated from sclerotic subchondral OA bone tissue show an altered phenotype, a decreased canonical Wnt/ß-catenin signaling pathway (cWnt), and a reduced mineralization in vitro. Besides the cWnt pathway, at least two non-canonical signaling pathways, the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathway have been described. These pathways are activated when a non-canonical Wnt ligand like Wnt-5a binds to a Wnt receptor coupled with non-canonical co-receptors. This activates, respectively for Wnt/PKC-Ca2+ and Wnt/PCP, the phosphorylation of PKC (pPKC) and the phosphorylation of JNK (pJNK) and their effect on downstream targets. However, there are no reports of either pathway in OA Ob. Here, we studied if alterations of the non-canonical pathways could be observed in OA Ob. We prepared primary human subchondral Ob using the tibial plateaus of OA patients undergoing total knee arthroplasty, or from tibial plateaus of normal individuals at autopsy. The expression of genes involved in Wnt/PKC and Wnt/PCP was evaluated by RT-qPCR and their protein production by Western blot analysis, in addition to p-PKC and p-PCP and NFAT and AP-1 activity with luciferase. Alkaline phosphatase activity and osteocalcin levels were evaluated respectively by substrate hydrolysis and ELISA respectively, and mineralization levels were evaluated with Alizarin red staining. OA Ob showed an increased alkaline phosphatase activity and osteocalcin release. The expression of Wnt5a was increased in OA Ob compared to normal. The expression of LGR5 was significantly increased in these cells. Moreover, the expression and production of LGR5 is directly modulated via the stimulation or inhibition of Wnt5a. However, Wnt5a did not stimulate the expression of LGR4. Wnt5a increased the phosphorylation of PKC and JNK as well as NFAT and AP-1 activity. Mineralization levels as well as alkaline phosphatase activity and osteocalcin secretion levels were also linked with changes in Wnt-5a levels. These data indicate that Wnt5a, which is increased in OA Ob, can directly stimulate the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathways and this can affect the phenotype and mineralization observed in human OA Ob.

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