Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-04-29T12:50:20Z No. of bitstreams: 1 2014_ThuanydeMouraCordeiro.pdf: 3960809 bytes, checksum: 4b394c3182d7b2be77db6f48e1225c6d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-23T12:40:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThuanydeMouraCordeiro.pdf: 3960809 bytes, checksum: 4b394c3182d7b2be77db6f48e1225c6d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T12:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThuanydeMouraCordeiro.pdf: 3960809 bytes, checksum: 4b394c3182d7b2be77db6f48e1225c6d (MD5) / A malária é uma doença infecciosa causada por protozoários Plasmodium spp. O P. falciparum é considerado o mais severo por ser o responsável pela maioria dos casos de morte causados pela doença. Devido ao rápido surgimento de cepas de P. falciparum resistentes às drogas antimalariais dá-se a importância de realizar um screening de compostos da biodiversidade, além de elucidar os mecanismos de ação de substâncias com comprovada ação antiplasmodial, como por exemplo, a rottlerin, um inibidor da proteína quinase C. As proteínas quinases desempenham um papel essencial em muitas funções celulares, o que as tornam alvos muito atraentes para o desenvolvimento de novas drogas. A metodologia considerada padrão ouro para avaliar a atividade antimalárica de drogas é o ensaio com incorporação de hipoxantina tritiada. No entanto, o alto custo, a adoção de medidas de segurança e a produção de lixo radioativo limitam a utilização desta técnica. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram à implementação do teste de atividade antiplasmodial baseado em fluorescência com SYBR Green I®, avaliação da atividade antimalárica das subfrações cromatográficas de sílica-gel do extrato de acetato de etila de Qualea grandiflora, uma planta típica do Cerrado brasileiro, e avaliação dos efeitos da rottlerin no ciclo intra-eritrocitário do P. falciparum por métodos bioquímicos e citofluorimétricos. Três subfrações de Q. grandiflora apresentaram atividade antiplasmodial moderada, sem atividade citotóxica e hemolítica aparentes. Foi demonstrado o efeito da rottlerin, um potencial efetor da autofagia, sobre o ciclo eritrocitário de P. falciparum por citometria de fluxo. De fato, a análise da população enriquecida de esquizonte de P. falciparum em cultura tratada por rottlerin comparada com a não tratada revelou que houve inibição da diferenciação dos merozoítos, acarretando na morte rápida do parasito. A fim de entender quais eram os alvos proteicos de ação desta molécula, foi realizada uma análise proteômica comparativa preliminar por eletroforese bidimensional. Três proteínas, Heat Shock Protein 90 (HSP90), 3-fosfoglicerato quinase (3-PGK) e lactato desidrogenase (LDH), superexpressas na população de esquizontes não tratada com a rottlerin foram identificadas. Estas proteínas pertencem à classe de proteínas quinases ou possuem um domínio de interação com quinase. A HSP90 está envolvida no processo de enovelamento proteico com um papel fundamental no crescimento e desenvolvimento do parasito e, consequentemente, estudada como potencial alvo de droga antiplasmodial. A LDH e a 3-PGK são enzimas do metabolismo da glicose, e assim, potenciais alvos bem conhecidos para compostos antimaláricos devido à dependência deste parasito à glicólise para produção de energia. O estudo da biodiversidade do Cerrado pode contribuir para a descoberta de compostos antimalariais e a conservação deste bioma ameaçado. A não detecção das proteínas identificadas na presença de rottlerin pode estar relacionada à indução da autofagia na esquizogonia eritrocitária e constituem potenciais alvos de drogas antimaláricas. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Malaria is an infectious disease caused by Plasmodium spp protozoa. The P. falciparum is considered the most severe, since it is responsible for the majority of deaths related to this disease. Due to the rapid emergence of resistant strains of P. falciparum against antimalarial drugs, a great importance can be given to the screening of biodiversity compounds in addition to elucidate the mechanisms of action of substances with demonstrated antiplasmodial action such as rottlerin, an inhibitor of protein kinase C. Protein kinases play a pivotal role in many cellular functions, which make them very attractive targets for the development of new drugs. The methodology considered the gold standard for assessing antimalarial drug activity is the [3H]hypoxanthine incorporation assay. However, the high cost, adoption of safety regulations and the production of radioactive waste limit the application of this technique. Therefore, the objectives of this study were to implement the antiplasmodial activity test based on SYBR® Green I fluorescence, assessment of antimalarial activity of silica gel chromatographic subfractions of Qualea grandiflora ethyl acetate extract, a typical plant of the Brazilian Cerrado, and assessment of the rottlerin‟s effects in erythrocytic cycle of P. falciparum by biochemical and cytofluorimetric methods. Three subfractions of Q.grandiflora showed moderate antiplasmodial activity without apparent cytotoxic and hemolytic activities. It was demonstrated the effect of rottlerin, a potencial autophagy effector, on P. falciparum erythrocytic cycle by flow cytometry. In fact, analysis of the schizont enriched population of P. falciparum in rottlerin-treated culture compared to untreated ones revealed that there was an inhibition of merozoites differentiation, resulting in the rapid death of the parasite. In order to elucidate which proteins were the targets of rottlerin action, a preliminary comparative proteomic analysis by two-dimensional electrophoresis was performed. Three proteins, heat shock protein 90 (HSP90), 3- phosphoglycerate kinase (PGK-3) and lactate dehydrogenase (LDH), upregulated in schizont population non treated with rottlerin were identified. These proteins belong to the class of protein kinases or possess domains that interact with them. The HSP90 is involved in the protein folding process with a critic role in parasite growth and development, thus being studied as a potential target for antiplasmodial drugs. The 3- PGK and LDH are enzymes of glucose metabolism, hence well known potential targets for antimalarial compounds due to parasite dependence on glycolysis to produce energy. The study of Cerrado biodiversity can contribute to the discovery of antimalarial compounds and to the conservation of this threatened biome. The not detection of these proteins identified in the presence of rottlerin may be related to autophagy induction in erythrocytic schizogony and constitute potential targets for antimalarial drugs.

Made available in DSpace on 2018-03-22T15:59:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11695_Tese Final St_fanie Cristina de Oliveira.pdf: 1556297 bytes, checksum: e9a76ba058e80aec74bb5fddd6159037 (MD5) Previous issue date: 2017-12-21 / Entre as espécies Coffea, existe um híbrido natural denominado "Híbrido de Timor" (HT), encontrado na Ilha de Timor em 1927. HT 'CIFC 4106', o qual representa a primeira planta, possui 2n = 3x = 33 cromossomos e valor 1C DNA igual a 1C = 2.10 pg. O número cromossômico, o conteúdo de DNA e evidências geográficas, suportam uma possível origem alotriploide a partir da fusão de uma célula reprodutiva reduzida de Coffea arabica (2n = 4x = 44) com outra célula, também reduzida, de Coffea canephora (2n = 2x = 22). C. arabica, outro alopoliploide pertencente ao gênero, acumula estudos que buscam desvendar seus progenitores. Dados moleculares e cariotípicos sugerem que este alotetraploide verdadeiro seja formado a partir de uma célula reprodutiva reduzida de C. canephora (CC) e C. eugenioides (EE), seguido por um evento de poliploidização. Neste sentido, acredita-se que o genoma de C. arabica seja representado como CaCaEaEa. Com base nas evidências mencionadas, formulamos a seguinte hipótese: o genoma de HT 'CIFC 4106' é CCaEa? O presente estudo caracterizou citogenicamente C. eugenioides, C. canephora, C. arabica e HT 'CIFC 4106'. A combinação de dados morfométricos, conteúdo de DNA nuclear e cromossômico e hibridização in situ fluorescente (FISH) com rDNA 5S, expandiu o conhecimento sobre a origem evolutiva e a estrutura do genoma de HT 'CIFC 4106'. O cariograma de HT 'CIFC 4106' evidenciou pares e grupos cromossômicos delimitados de acordo com o tamanho total, classes e conteúdos de DNA cromossômicos. Com base nessas características cariotípicas, foi possível inferir a presença de dois genomas idênticos em HT 'CIFC 4106', possivelmente de C. canephora (CC) e um genoma distinto (C. eugenioides, E). Os cromossomos de HT 'CIFC 4106' apresentaram classe, conteúdo de DNA idênticos aos cromossomos de C. eugenioides, C. canephora e C.arabica. Padrões de distribuição de sinais 5S em HT 'CIFC 4106' foram similares aos encontrados nos possíveis progenitores C. eugenioides e C. canephora. Os dados revelados neste estudo corroboram com a hipótese CCaEa do genoma de HT 'CIFC 4106'.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-03T18:45:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 521431 bytes, checksum: f1d795099ef7fc1ce72a69d0855ecd37 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-03T18:45:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 521431 bytes, checksum: f1d795099ef7fc1ce72a69d0855ecd37 (MD5) Previous issue date: 2018-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O primeiro trabalho de citometria de fluxo utilizando abelhas da tribo Meliponini, quantificou o genoma de três espécies, as quais apresentaram conteúdo de DNA de 0,43 pg em Scaptotrigona xantotricha, 0,93 pg em Melipona rufiventris e 0,95 pg em Melipona mondury. Posteriormente à determinação do seu conteúdo genômico, S. xantotricha passou a ser utilizada como padrão interno, em todos os estudos de citometria com meliponíneos. Atualmente, valores de apenas 63 espécies de abelhas estão disponíveis, mostrando uma escassez de dados nesse grupo. Uma das razões para esse desprovimento de dados, pode ser devido à dificuldade do acesso as larvas e pupas, que foram as únicas utilizadas, até o momento, nos estudos de quantificação do genoma de abelhas. Sendo assim, a busca pela utilização de material mais acessível, pode ser uma estratégia para que mais espécies sejam analisadas. Portanto, o presente estudo teve como objetivo testar diferentes tampões para a quantificação do conteúdo de DNA nuclear em abelhas adultas. Para a preparação das suspenções nucleares, a serem analisadas no citômetro de fluxo, foram utilizadas abelhas adultas da espécie S. xantotricha e o padrão interno Drosophila melanogaster, juntamente com os tampões LB01, Galbraith, MgSO 4 e TRIS. Os histogramas obtidos, apresentaram bons níveis de resolução e coeficiente de variação satisfatórios, com percentuais menores do que 5%, variando de 2,24% com o tampão Galbraith a 3,34% com o tampão LB01. O tamanho do genoma de adultos de S. xantotricha apresentou valores muito próximos ou idênticos aos dados disponíveis na literatura para as larvas e pupas dessa mesma espécie. Da mesma forma, a razão experimental não apresentou grandes variações em relação à teórica (2,39), sendo o tampão MgSO 4 com razão de 2,34 o mais distante. Em relação à porcentagem de debri celular, as amostras que utilizaram os tampões Galbraith, MgSO 4 e TRIS, mostraram-se mais limpas em relação as que utilizaram o tampão LB01. Por fim, os resultados dos parâmetros analisados, no mesmo dia da extração e 24 após extração, foram muito semelhantes. Mediante o exposto, podemos concluir que a utilização de abelhas adultas para a determinação do conteúdo de DNA é tão eficaz quanto ao uso de larvas e pupas, visto que seus resultados não apresentaram diferenças estatisticamente significantes quando comparados com os dados da literatura. / The first work of flow cytometry using bees from Meliponini tribe quantified the genome of three species, to which they presented DNA content of 0.43 pg in Scaptotrigona xantotricha, 0.93 pg in Melipona rufiventris and 0.95 pg in Melipona mondury. After the determination of its genomic content, S. xantotricha became to be was used as the internal standard in all the studies of meliponine cytometry. Currently, values of just 63 species of bees are available, showing a scarcity of data in this group. One of the reasons for this data shortage may be due to the difficulty of access the larvae and pupae, which were the only ones used, until the moment, in the studies of quantifying the genome of bees. Thus, the search for the use of more accessible material may be a strategy for more species to be analyzed. Therefore, the present study aimed to test different buffers for the quantification of nuclear DNA content in adult bees. For the preparation of the nuclear suspensions, to be analyzed in the flow cytometer, adult bees of the species S. xantotricha and the internal standard Drosophila melanogaster, along with LB01, Galbraith, MgSO4 and TRIS buffers. The histograms obtained had good resolution levels and coefficient of variation of satisfactory, with percentages lower than 5%, ranging from 2.24% with Galbraith buffer to 3.34% with LBO1 buffer. The size of the genome obtained with the use of adults of S. xantotricha values very close or identical to the available data in the literature for the larvae and pupae of the same species. Similarly, the experimental coefficient did not show great variations in relation to the theoretical one (2.39), and the MgSO4 buffer with a ratio of 2.34 was the most distant. In relation to the percentage of debri cell, the samples using the Galbraith, MgSO4 and TRIS buffers were cleaner compared to those using the LB01 buffer. Finally, the results of analyzed parameter in the same day of extraction and 24 hours after extraction were very similar. In front of this fact, we can conclude that the utilization of adult bee for the determination of DNA content is so effective as to use of larvae and pupae, since its result not showed significant statistical differences when compared with the literature data.

Orientador: Irene Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:42:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira-Cunha_FernandaGoncalves_M.pdf: 18014184 bytes, checksum: 6e22ea867f4a1fb74e5f242860b5e339 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A Leucemia aguda se caracteriza pela proliferação clonal da célula tronco hematopoética substituindo o tecido normal da medula óssea. A recente classificação da OMS incorpora características cito genéticas e imunofenotípicas que apresentam impacto prognóstico. Nós examinamos a distribuição e impacto na sobrevida de vários antígenos de linhagem e maturação usados na rotina de imunofenotipagem dos pacientes com leucemia aguda ao diagnóstico.Os casos foram diagnosticados pelo hemograma, citologia da medula óssea, citoquímica, citogenética e imunofenotipagem através de um painel de triagem de 3 cores (CD45, CD3, CD7, CDI9, CD13, CD33 e HLA-DR) e painéis secundários para LLA de linhagem B (CDI0, CD20, k e À de citoplasma e superfície) e LMA (CD2, CDI4, CDI5, CD34, CD56 e MPO). A expressão dos antígenos foi medida pela intensidade média de fluorescência (CMF) por citometria de fluxo usando o programa Paint-a-gate. Nós analisamos 5 pacientes com LLA de linhagem T. Mediana de idade: 29 anos (14-51).80% dos casos foram diagnosticadosapenas com o painel de triagem.O CD13 foi o marcador de linhagem cruzada mais expresso (80%). Analisamos 31 pacientes com LLA de linhagem B. Mediana de idade: 27 anos (7-67). O painel de triagem definiu a linhagem de 61% dos casos e com o secundário diagnosticamos todos os outros. Os antígenos de linhagem cruzada mais expressos foram os CD13 (35%) e CD33 (38%). Na análise multivariada de Cox a idade e o CMF do CD45 foram fatores preditivos de pior sobrevida.Analisamos 35 pacientes com LMA.Mediana de idade: 51 anos (11-79). O painel de triagem definiu todos os casos. Os subtipos FAB predominantes foram M2 e M4. Nós detectamos 2 sub populações de blastos com fenótipos diferentes em 5 casos e 3 em 1 caso. O marcador de imaturidade CD7 foi expresso em 20% dos casos, os marcadores de linhagem cruzada, CD2 e CD19 em 11% e observamos assincronismode maturação em 20% com CD34/CD15 e 22% com CD34/CD56positivos.Na análise multivariadade Cox o CMF do CD45 e MPO, a idade, cariótipo e número de leucócitos foram fatores preditivos de pior sobrevida. Pela medida da intensidade média de fluorescência dos antígenos nós pudemos detectar parâmetros prognósticos bem como sub populações de blastos fenotipicamente diferentes, que não tiveram influência na sobrevida, mas podem dificultar o estudo de doença residual mínima por citometria de fluxo, visto que a quimioterapiapode selecionar uma das populações / Abstract: Acute leukemia is characterized by a c1onal proliferation of haematopoietic stem cell substituting the normal bone marrow. The recent WHO c1assification for acute leukemia separates entities by recurrent cytogenetic abnormalities and immunophenotypic features presenting prognostic impact. We have examined the distribution and impact on survival of the expression of severallineage and maturation linked antigens used in routine immunophenotyping of patients with de novo acute leukemía. Cases were diagnosed by peripheral blood counts,bone marrow cytology, cytochemistry, cytogenetics and immunophenotyping using a first screening panel with 3 colors (CD45, CD3, CD7, CDI9, CD13, CD33 e HLA-DR) and secondary panel for precursor B ALL (CDI0, CD20, k e À) and AML (CD2, CDI4, CD15, CD34, CD56 e MPO). Antigen expression was measured by mean fluorescence intensity (MFI) by flow cytometry using the Paint-a-gate software. We analysed 5 cases of T-ALL. Median age: 29 years (14-51). In 80% of the cases were defined by primary panel. CD13 was the most expressed cross-lineage marker (80%). We analysed 31 cases ofB-ALL. Median age: 27 years (7-67). In 61% of the cases were defined by screening panel and the remaining, by secondary panel defined others. CD13 (35%) and CD33 (38%) were the cross-lineage markers most expressed. In Cox multivariate analysis, MFI of CD45 and age were significant for worse prognosis. We analysed 35 cases of AML. Median age: 51 years (11-79). The screening panel defined all cases. Predomínant FAB types were M2 and M4. In 5 cases we could detect 2 phenotypically different blast subpopulations and in 1 case we detected 3 subpopulations. The immaturity marker CD7 was expressed in 20% ofthe cases, the cross-lineage CD2 and CD19 were expressed in 11% of the cases and we could observe asynchronous in 20% with co-expression of CD34/CD15 and 22% with co-expression of CD34/CD56. In Cox multivariate analysis, MFI of CD45 and MPO, age, WBC and karyotype were significant for worse survival. By measuring the fluorescence intensity of the antigens, we could detect prognostic parameters as well as phenotypically different blast subsets. These did not influence survival, but may represent a pitfall in studies of mínimal residual diseaseby flow cytometry, as chemotherapy may select one of these subsets / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Irene Lorand-Metze / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T06:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_Elisangela_D.pdf: 5950588 bytes, checksum: d00f171d21ca1cf1430070e17e34ace6 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) são desordens clonais da célula precursora hematopoética pluripotencial caracterizadas por alterações na proliferação e maturação celulares e presença de apoptose medular excessiva. Alterações cariotípicas na mielodisplasia são comuns. Apesar dos critérios de diagnóstico estarem bem estabelecidos, o uso da citometia de fluxo (CF) no estudo desta doença tem sido muito explorado, pois desordens não-clonais (DNCs), que também apresentam citopenias periféricas, podem dificultar o diagnóstico. Populações eritroblástica, granulocítica, monocítica, linfóide e blástica em medula óssea (MO) de pacientes com SMD foram estudadas e comparadas à MO normal (doadores para transplante de MO) e às DNCs. Foram incluídos no estudo 32 casos de SMD (20 AR, 05 ARSA, 07 AREB), 11 controles normais e 10 pacientes com DNCs confirmadas. Selecionamos as populações celulares pelo dot plot CD45/side scatter (SSC). A análise quantitativa dos marcadores eritroblásticos CD71 e Glicoforina A (GlyA); granulocíticos e monocíticos CDllb, CD13, CDI6, CDI0 e CD64; linfóide CDI9, CD3, CD4, CD8 e CDI6; além do precursor CD34 e o pan leucocitário CD45, foi obtida através da intensidade média de fluorescência (IMF). A granularidade citoplasmática das células granulocíticas foi observada pela baixa IMF do SSC. Mielopoiese, presença de aberrações fenotípicas e o padrão maturacional também foram avaliados nestas células. Todos os pacientes com SMD tiveram algum tipo de alteração nas populações avaliadas pela CF. Os eritroblastos apresentaram perfil maturacional alterado em 20 casos (64,4%) e os monócitos em 22 (68,7%). Os granulócitos em 7 casos tiveram 1 anormalidade imunofenotípica, em 9 pacientes houve 2, em 9 casos 3 e em 2 pacientes 4 expressões anormais foram encontradas. O SSC esteve alterado em 7 casos (23%), os perfis do CDI6/CDl1b e CDI6/CD13 em 18 (56,2%) e 20 casos (66%), respectivamente, , o CD13 em 22 (73%), o CDllb em 17 (56%), , o CD16 em 11 (36%), o CD45 em 17 (56%), e por fim a deficiência do CDlO encontrada em 3 casos (10,3%). Assincronismo maturacional na população granulocítica foi encontrado enquanto nasDNCs a maturação granulocítica foi mantida. Os monócitos tiveram número aumentado tanto nos pacientes com SMD quanto nos com DNCs. A expressão do SSC, CD13 e CDl1b foram similares nos 3 grupos. CD64 esteve aumentado nos 2 grupos de pacientes enquanto o CD16 apenas na SMD. O CD45 esteve diminuído somente no grupo das DNCs. Os linfócitos B nos pacientes AREB tiveram uma diminuição intensa em relação aos outros subtipos FAR A maturação B está comprometida na SMD tanto numericamente quanto na expressão antigênica dos grupos de baixo e alto risco. Uma aberração fenotípica CD19+/cCD79a-foi encontrada nas células B na SMD mas não nos controles. As células T não tiveram alterações consideráveis. Os mieloblastos foram analisados nos dot plots CD16/CD11b e CD16/CD13 e CD34. Houve uma correlação entre a porcentagem de blastos visualizados pela morfologia (mielograma) com os do dot plot CD16/CD13 e número de células CD34 positivas, mas não com aqueles quantificados pelo dot plot CD16/CDllb. A técnica da CF pôde demonstrar presença de assincronismo maturacional, aberrações fenotípicas, granulopoiese alterada e utilidade na detecção de anormalidades imunofenotípicas na SMD. Além disso, possibilita monitorar a evolução da doença, observada pelo aumento de blastos na MO, e é capaz de diferenciar a SMD das citopenias periféricas não-clonais / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDSs) are characterized by abnormalities in proliferation, apoptosis and maturation of the hemopoietic cell lines. MDS is known by bone marrow (BM) celIs abnormalities identified by morphology. Although MDS diagnostic criteria are well established, flow cytometry (FCM) technique has been explored. Even so, non-clonal disorders that present periphera1 cytopenias such as MDS can difficult the diagnostic, mainly in MDS cases with normal karyotype. lnitially, we analyzed the erythroid, granulocytic and monocytic lineages maturation patterns, and the blastic population in BM from patients with MDS and compared them with normal BM (BM transplantation donors) and patients with pancytopenia due to non-clonal diseases (NCD). MDS are considered as hematopoietic myeloid stem celIs clonal disorders. However, accumulating evidence support that more immature stem celI, which has ability to differentiate into both myeloid and lymphoid celIs, could origin the disease. BM cell populations were separated in CD45/side scatter (SSC) plot. Staining intensity quantitative pattems assessment for CD45, CDI6, CD13, CDllb, CDIO, CD34 and CD64 were performed in 32 MDS BM cases and compared with 10 non-clonal diseases and 11 contrals. Granulocytic and monocyticabnormalities were identified per case and with 2 or more detected alterations. Antigenic expression pattems were determined during maturation. CDI6/CDI3, CD16/CDllb and CDIO/CD64plots were used for monitoring of granulocyte maturation and monocytic celIs, CD711GlyA for erythroblastic population and CD34+/SSC for blasts cells. Mostly MDS patients presented some kind of expression abnonnalities: 7 (23%) low SSC, 18 (56.2%) CD16/CDllb and 20 (66%) CDI6/CD13 abnonnal pattems, 1I (36%) CD16, 22 (73%) CD13, 17 (56%) CDllb, 17 (56%) CD45, 3 (10.3%) CDIO deficiency. Monocytes were increased in both MDS and NCD, but increase in expression of CDI6 occurred exclusively in MDS. The monocytes had similar expression in SSC, CD13 and CDllb among 3 groups. CD64 had increased in both patients groups but the CD45 was decreased more pronounciated in NCD. Asynchronous maturation was found in MDS patients, but was maintained in .NCD. Several abnormalities in CD71/Gly A expression were found in erythroblasts in MDS, but they were normal in NCD. Neither GlyA nor CD71 deficiency were observed in NCD. Myeloblastic celIs were analyzed in the CD16/CDllb and CDI6/CDI3 dot plots and CD34 expression. There was positive correlation between blasts percentage with CDI6/CD13 dot plot and absolut number of CD34 positive celIs, but not with those quantified by CDI6/CDllb dot plot. Ongoing the study, specific enumeration and characterization of CD34+/CDI9+ and CD34-/CDI9+ B-cell precursors and mature B-Iymphocytes was performed in all MDS cases by multiparameter FCM. Both quantitative and qualitative immunophenotypic abnormalities involving BM B-cells were shown in B population. CDI9+/cCD79a- phenotype asynchronous antigen expression was detected on CD34+ B-cell precursors but only when detectable levels of those precursos were shown in the MDS BM. There were not any considerable abnormalities for T lymphocytes. Abnormal B-cell maturation in MDS patients were shown by imunophenotypic evidences, and further investigations shall be used to undertand its nature. Concluding, FCM is an useful toei for differential diagnosis between donal and non-clonal disorders / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-07-27T19:37:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Katianne B.A.Sousa.pdf: 1701891 bytes, checksum: 5aeafe40b9a9abf7a64c229073d28651 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-07-27T19:47:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Katianne B.A.Sousa.pdf: 1701891 bytes, checksum: 5aeafe40b9a9abf7a64c229073d28651 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-07-27T19:48:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Katianne B.A.Sousa.pdf: 1701891 bytes, checksum: 5aeafe40b9a9abf7a64c229073d28651 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-27T19:48:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Katianne B.A.Sousa.pdf: 1701891 bytes, checksum: 5aeafe40b9a9abf7a64c229073d28651 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The arbovirus are virus group with a complex life cycle, once vertebrate hosts as well as arthropod vectors are involved. The Phlebovirus are arboviruses of the Bunyaviridae family transmitted mainly by Lutzomyia insects in the new world and Phlebotomus in the old world. These insects are important vectors of tropical diseases, such as leishamaniasis, causing outbreaks of febrile syndromes worldwide. A large fauna of phlebotomus is observed in the Amazon region and a few studies aimed to detect virus at those vectors. The present study aimed to the detection of arboviruses in phlebotomus collected in the Reserva Florestal Adolpho Ducke, Manaus and at the Ramal Nova Esperança, Manacapuru, Amazonas. The phlebotomus were collected using adapted CDC light traps, including parallel collections with manual aspirators. Speciemens were grouped in pools by sex and trap, and subsequently macerated. The macerated samples were inoculated into VERO cells, following by indirect immunofluorescence. The positives samples by flow cytometry were submitted to molecular assays, in order to amplify segments S and L of the Bunyavirus. Among the collected pools, 17 out of 243 were positive by flow cytometry, those samples presented displacement of positive cells within a range 1.19 – 71.6%. Also, molecular methods were applied for detection of Bunyavirus, following capillary and next generation sequencing. However, no virus was identified with this techniques. The samples are stored for futures studies, in order elucidate questions related to the presence of medical important arbovirus infecting phlebotomus at the Brazilian Western Amazon. / Arbovírus são um grupo de vírus que apresenta um ciclo biológico bastante complexo, que envolve hospedeiros vertebrados suscetíveis e um ou mais vetor artrópode. Os Phlebovirus são arbovírus da família Bunyaviridae transmitidos por insetos do gênero Lutzomyia no novo mundo e Phlebotomus no velho mundo. Estes insetos são importantes vetores de doenças tropicais, como a leishmaniose e vem causando surtos de síndromes febris pelo mundo. Mesmo com uma vasta fauna de flebotomíneos na região Amazônica poucos estudos tiveram como objetivo principal detectar vírus nestes vetores. Em função do descrito anteriormente o presente trabalho teve como objetivo a detecção de Bunyavirus em flebotomíneos coletados na Reserva Florestal Adolpho Ducke, Manaus e no Ramal Nova Esperança, Manacapuru, Amazonas. Os flebotomíneos foram coletados em armadilhas de luz do tipo CDC adaptadas, além de coletas paralelas com aspiradores manuais. Os espécimes foram agrupados em pools, por sexo e armadilha, sendo posteriormente macerados. O material macerado foi inoculado em culturas de células VERO, seguido por técnicas de imunofluorescência indireta para família Bunyaviridae. As amostras positivas pela citometria de fluxo foram submetidas a ensaios moleculares, na tentativa de amplificação dos segmentos S e L de Bunyavirus. Dos 243 pools coletados foi identificada a presença de vírus da família Bunyaviridae em 17 pools através dos resultados obtidos pela citometria de fluxo, com base no deslocamento de células positivas que variaram entre 1,19 - 71,6%. Nesse projeto foi utilizado pela primeira vez um protocolo para Citometria de fluxo para Bunyavirus. Foram aplicadas também metodologias moleculares para detecção de Bunyavirus, seguidos de sequenciamento capilar e de Nova Geração. Entretanto, não foi possível a identificação viral por técnicas moleculares. As amostras estão armazenadas para experimentos futuros, na tentativa de elucidar questões como: a circulação de arbovírus de importância médica em flebotomíneos na Amazônia Ocidental Brasileira.

Orientadores : Irene Lorand-Metze, Carmen Silvia Passos Lima / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T16:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_Elisangela_M.pdf: 23459196 bytes, checksum: e3c3f69e1b6470bb9cfa7570a9a84ff0 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças clonais caracterizadas por citopenias periféricas persistentes de uma ou mais linhagens e com possibilidade para transformação leucêmica. Níveis aumentados de apoptose nas células precursoras hematopoéticas (células CD34l foram observados em pacientes com SMD de baixo risco (AR e ARSA), sugerindo esse mecanismo como o responsável pela hematopoes e ineficaz nessa doença. A Amifostina (AMF) é considerada um agente citoprotetor, com ação antioxidante, potente estimulador da hematopoese normal e supressor apoptótico nos precursores mielodisplásicos. Analisamos a expressão dos marcadores da apoptose, (Fas e FasL) nas células CD34+ em pacientes com SMD de baixo risco, submetidos ao tratamento com a AMF. Foram estudados 17 pacientes, sendo 11AR e 6 ARSA. A resposta terapêutica em relação ao nível da hemoglobina, ao número de neutrófilos e às plaquetas, aos critérios de inclusão e às respostas foi definida pelo protocolo de tratamento da AMF. Dos 17 pacientes tratados, 10 apresentaram critérios de resposta em pelo menos uma série do hemograma após 2 ciclos de AMF, os quais receberam mais 4 ciclos adicionais. Quatro pacientes (3 não respondedores e um respondedor) apresentaram evolução da SMD (aumento de blastos medulares) durante ou após o tratamento. As atipias celulares na medula óssea (MO) e o número de células CD34+ diminuíram nos pacientes respondedores após o ciclo 2. No grupo dos não respondedores não houve alterações significativas em nenhum desses parâmetros. Os pacientes que responderam à amifostina tinham, antes do tratamento, uma percentagem menor de expressão de Fas e FasL nas células CD34+ e de linfócitos na medula óssea em relação aos que não responderam. A percentagem de linfócitos aumentou ainda mais após o tratamento neste último grupo. Esse resultado sugere que, no grupo que não respondeu à amifostina o sistema imune pode estar impedindo a resposta ao tratamento. Esses resultados favorecem a hipótese de que a resposta à AMF é influenciada pela expressão dos marcadores apoptóticos e/ou pela percentagem de linfócitos na MO. A resposta à AMF não depende apenas da supressão apoptótica. Um seguimento maior de pacientes é necessário para observar a durabilidadede resposta / Abstract: Not informed. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2653_1.pdf: 3219087 bytes, checksum: e49263700ce90bf224851971f1039607 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A radiossensibilidade celular está diretamente relacionada às falhas no mecanismo de reparo dos danos causados ao DNA. Nesse mecanismo, a molécula considerada como chave é a proteína p53. Neste contexto, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a correlação entre os níveis de expressão da proteína p53 com a radiossensibilidade individual. Para tanto, amostras de sangue periférico de 23 indivíduos sadios foram divididas em alíquotas e, separadamente, irradiadas com doses de 0,5; 1; 2 e 4 Gy. Em seguida, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidas e cultivadas durante 72 horas, tanto na presença quanto na ausência de mitógenos (Fitohemaglutinina PHA e Pokeweed PKW). Em paralelo, a viabilidade celular foi determinada utilizando o corante azul de trypan (0,4%). Os resultados obtidos demonstraram que a expressão da proteína p53 em PBMCs aumenta com a dose absorvida sendo inversamente proporcional à viabilidade celular. O maior índice da expressão de p53 foi observado em culturas estimuladas com PHA durante 72 horas. O aumento na expressão da p53, em resposta à radiação, foi significativamente diferente entre os indivíduos estudados, o que pode ser relacionado a variabilidade na radiossensibilidade individual. Os resultados desse trabalho sugerem estudos adicionais no sentido de correlacionar os níveis de expressão de p53 com efeitos adversos graves em pacientes submetidos à radioterapia

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2680_1.pdf: 1987756 bytes, checksum: fdd0f79604394508bc5200c1a773e36e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A radiossensibilidade individual é reconhecida como um importante fator biológico que contribui de maneira significativa na resposta aos danos radioinduzidos em tecidos e células do organismo. Entretanto, os eventos moleculares associados à radiossensibilidade individual ainda são pouco conhecidos. Dessa maneira, o estabelecimento de uma correlação entre as expressões moleculares e a radiossensibilidade individual poderão contribuir para o aprimoramento de pesquisas cujo objetivo seja a definição de diferentes graus de sensibilidade humana à irradiação. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi analisar parâmetros moleculares que caracterizam a apoptose em linfócitos humanos irradiados in vitro, avaliando seu potencial para estimação de radiossensibilidade individual. Para tal, amostras de sangue periférico de 12 voluntários foram coletadas e alíquotas foram irradiadas (fonte 60Co) individualmente com diferentes doses. Células mononucleares foram isoladas, processadas e mantidas com ou sem cultivo celular (com ou sem estímulo mitótico pela fitohemaglutinina-PHA). Com auxílio da citometria de fluxo, quantificou-se nos linfócitos a expressão da fosfatidilserina na membrana plasmática, bem como a expressão das proteínas caspase-3 ativa e p53. Verificou-se que os linfócitos irradiados com diferentes doses e cultivados por diferentes tempos apresentam uma resposta apoptótica do tipo dosedependente, com aumento dos níveis de apoptose nas células estimuladas com PHA. Para os linfócitos não estimulados com PHA, verificou-se que o fenômeno de apoptose em sua fase tardia é predominante. Correlações positivas foram observadas entre a apoptose radioinduzida e os níveis de expressão dos marcadores protéicos investigados. Os maiores níveis de caspase- 3 ativa e p53 foram encontrados nos linfócitos irradiados; dos quais os linfócitos estimulados com PHA apresentaram maiores níveis de expressão protéica. Adicionalmente, contatou-se que dentre as amostras irradiadas, a p53 é expressa tanto em linfócitos quiescentes quanto em linfócitos proliferantes. Os resultados deste estudo indicaram a existência de uma forte correlação entre a quantificação das moléculas que caracterizam a apoptose e a radiossensibilidade de linfócitos

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T18:05:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 889327 bytes, checksum: 2e422435078bdf3008be0c06d51d330e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T18:05:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 889327 bytes, checksum: 2e422435078bdf3008be0c06d51d330e (MD5) Previous issue date: 2004-08-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor desse grão. Parte do aumento da produção tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citogenéticos e citométricos, os quais procuram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entre os diversos níveis de contribuição, essa linha de pesquisa tem forte potencial como ferramenta de prospecção e monitoramento de genomas, considerando-se que a caracterização dos cariótipos e a quantificação do conteúdo genômico geram dados que se estendem da cultura de tecidos a processos de hibridação. Levando em conta a necessidade de aprimoramento de estratégias de pesquisas citogenética e citométrica, desenvolveram-se quatro ferramentas de estudo em Coffea. Citogeneticamente, procurou-se obter cromossomos com morfologia adequada para caracterização de C. congensis, com aplicação de metodologias que aumentam o índice metafásico e fornecem cromossomos com morfologia mais adequada para caracterização e montagem de cariogramas. O complemento de C. congensis corresponde a 2x=22 cromossomos, sendo quatro metacêntricos (4, 6, 8 e 9) e sete submetacêntricos (1, 2, 3, 5, 7, 10 e 11). A constrição secundária foi identificada na porção distal do braço curto do cromossomo 7. A citometria de imagem foi utilizada para estimar o conteúdo de DNA em picogramas (pg) de cada cromossomo de C. canephora cv. Apoatã. Neste estudo foi possível mensurar, a partir da densidade óptica, o conteúdo de DNA, com 2C=1,43 pg, dos 11 cromossomos. Os valores encontrados variaram entre 0,18 pg (cromossomo 1) e 0,10 pg (cromossomos 10 e 11). Amostras de calos e agregados celulares de C. canephora cv. Apoatã foram coletadas para verificar se há relação entre os núcleos interfásicos com diferente número e o tempo de manutenção das culturas nas condições in vitro. A partir dos valores percentuais de células com um, dois, três ou quatro nucléolos, foi aplicada a análise de regressão, que indicou que o tempo das culturas in vitro altera o número de nucléolos por núcleo, o que pode ser utilizado como ferramenta no monitoramento de ocorrências de variações somaclonais. Em termos de citometria de fluxo, analisaram-se suspensões nucleares extraídas de agregados celulares fixados de C. arabica cv. Catuaí Vermelho e corados com DAPI. Os histogramas gerados evidenciaram a ocorrência de variação somaclonal (aneuploidias e euploidias) ao longo dos subcultivos das suspensões de agregados celulares com células em diferentes fases do ciclo celular. Com este estudo, espera-se que os resultados descritos representem um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro. / Brazil leads the world coffee market in production and exportation, and is the second biggest worldwide consumer of the grain. Part of the production increase has been ascribed to the investments on breeding programs and to the innovations brought by the biotechnological processes. Species from the genus Coffea have been investigation to cytogenetical and cytometrical studies, which search for data with cytological and genetical basis, so as to contribute with breeding programs. Among the many contribution levels, this research line has strong potential as a research and genome monitoring tool, considering that karyotype characterization and genomic content quantification generate data that range from tissue culture to hybridization processes. Considering the necessity of improving cytogenetical and cytometrical research strategies, four studying tools have been developed in Coffea. Cytogenetically, it was seeked to obtain chromosomes with adequate morphology for the characterization of C. congensis was seeked, with use of methodologies that increase the metaphasic index and provide chromosomes with adequate morphology for karyogram characterization and assembly. The complement of C. congensis corresponds to 2x=22 chromosomes, being four metacentric chromosomes (4, 6, 8 and 9) and seven submetacentric ones (1, 2, 3, 5, 7 10 and 11). The secondary constriction was identified on the distal portion of the short arm of chromosome 7. Image cytometry was used to estimate the DNA content in picograms (pg) in each chromosome of C. canephora cv. Apoatã. In the present study it was possible to measure, based on optical density, the DNA content, with 2C=1,43 pg, for the eleven chromosomes. The values found varied between 0,18 pg (chromosome 1) and 0,10 pg (chromosomes 10 and 11). Samples of calli and cell aggregates of C. canephora cv. Apoatã were collected for verification of the existence of a relationship between the interphasic nuclei with different number of nucleoli and time maintenance of the cultures an in vitro condition. Based on the percentage values of cells with one, two, three or four nucleoli, regression analysis was applied, and it suggested that the in vitro culture time alters the number of nucleoli per nucleus, which can be used as a tool for monitoring the occurrence of somaclonal variations. In terms of flow cytometry were analyzed nuclei suspensions of C. arabica cv. Catuaí Vermelho, extracted from fixed cell aggregates and stained with DAPI. The generated histograms evidenced the occurrence of somaclonal variations (aneuploidies and euploidies) throughout the passages of the cell aggregate suspensions with cells in different phases of the cell cycle. With this study, it is expected that the described results represent an advance on the research of the coffee tree genome.