Introdução: A terapia antirretroviral (ART) mudou o curso da Aids, porém está associada a alterações metabólicas e aumento do risco de doenças cardiovasculares. Objetivo: Avaliar o efeito da suplementação com ácidos graxos ômega-3 de origem marinha no perfil lipídico, na homeostase da glicose, na distribuição de gordura corporal e nos marcadores inflamatórios de adultos com HIV em ART. Métodos: Artigo 1. Trata-se de uma revisão sistemática da literatura com metanálise. Realizou-se busca por ensaios clínicos na base de dados PubMed; 33 artigos foram localizados, seis cumpriram os critérios de inclusão e quatro apresentavam qualidade metodológica adequada. Foi realizada metanálise com efeitos fixos e descrição das diferenças de médias sumárias (DMS (IC95 por cento )). Artigos 2 e 3. Trata-se de um ensaio clínico aleatorizado e controlado. Foram recrutados 120 adultos com idade entre 19 e 64 anos, de ambos os sexos. Os indivíduos alocados no grupo intervenção foram suplementados por 24 semanas com 3g de óleo de peixe/dia (900mg de ácidos graxos ômega-3) e indivíduos alocados no grupo controle receberam placebo (óleo de soja). Resultados: Artigo 1. Após 8-16 semanas de intervenção com 900-3360mg de ácidos graxos ômega-3/dia, observou-se redução de -80,34mg/dL (IC 95 por cento : -129,08 a -31,60) nas concentrações de triglicérides. A análise agregada de estudos com média de concentração de triglicérides > 300mg/dL no baseline e intervenção com 1800-2900mg de ácidos graxos ômega-3/dia resultou em redução de -129,72mg/dL (IC95 por cento : -206,54 a -52,91). Artigos 2 e 3. Foram considerados nas análises dados de 83 sujeitos. Os modelos multinível não revelaram relação estatisticamente significante entre a suplementação com óleo de peixe e as mudanças longitudinais nas concentrações de triglicérides (p=0,335), LDL-C (p= 0,078), HDL-C (p=0,383), colesterol total (p=0,072), apo B (p=0,522), apo A1 (p=0,420), razão LDL-C/apo B (p=0,107), índice homa-2 IR (p=0,387), IMC (p=0,068), circunferência da cintura (p=0,128), relação cintura/quadril (p=0,359), PCR ultra sensível (p=0,918), fibrinogênio (p=0,148), e fator VIII (p=0,073). Conclusões: Artigo 1. Diferentes doses de ácidos graxos ômega-3 reduziram modo significativo as concentrações de triglicérides, confirmando a potencial aplicabilidade desse nutriente no tratamento da hipertrigliceridemia em pessoas que vivem com HIV em ART. Artigos 2 e 3. Uma dose relativamente baixa de óleo de peixe para pessoas que vivem com HIV em ART não alterou o perfil lipídico, a homeostase da glicose, a distribuição de gordura corporal e a concentração de marcadores inflamatórios. Recomenda-se, em estudos subseqüentes, a avaliação do efeito de doses mais elevadas, bem como a determinação de marcadores inflamatórios mais sensíveis / Background: Although the antiretroviral therapy (ART) revolutionized the care of HIV-infected subjects, it has been associated with metabolic abnormalities and increased risk of cardiovascular diseases. Aims: To review the effects of marine omega-3 fatty acids on lipid profile, insulin resistance and inflammatory markers in subjects living with HIV on ART. Methods: Paper 1. Thirty three articles were found in a PubMed search; six met the inclusion criteria; and four of them were considered of adequate quality and included. Meta-analysis with fixed effects was performed and weighted mean differences (WMD (95 per cent CI)) were described. Paper 2 and 3. The study was conducted in an HIV/Aids care centre affiliated to the Medical School, University of Sao Paulo. This was a randomized controlled trial that assessed the effects of 3g fish oil/day (900mg of omega-3 fatty acids) or 3g soy oil/day (placebo). A hundred and twenty subjects aged between 19 and 64 years were recruited. The statistical analyses were performed in Stata 9. Results: Paper 1. Data from 83 subjects were included in the analyses. The overall reduction on triglyceride concentrations after 8-16 weeks of treatment with 900-3360mg of omega-3/day was WMD=-80.34mg/dL (95 per cent CI: -129.08 to -31.60). The pooled result of studies with mean triglyceride > 300 mg/dL at baseline and 1800-2900mg omega-3/day was WMD=-129.72mg (95 per cent CI: -206.54 to -52.91). Paper 2 and 3. Multilevel analyses revealed no statistically significant relationships between fish oil supplementation and the longitudinal changes in triglyceride (p= 0.335), LDL-C (p= 0.078), HDL-C (p= 0.383), total cholesterol (p=0.072), apo B (p= 0.522), apo A1 (p=0.420), LDL-C/apo B ratio (p=0.107), homa-2 IR index (p=0.387), BMI (p=0.068), waist circumference (p=0.128), waist/hip ratio (p=0.359), hs-CRP (p=0.918), fibrinogen (p=0.148), and VIII factor (p=0.073). Conclusions: Paper 1. Different doses of omega-3 fatty acids reduced significantly triglyceride concentrations confirming the potential applicability of this nutrient on the management of hypertriglyceridemia in HIV-infected subjects on ART. Paper 2 and 3. A relatively low dose of fish oil for HIV subjects on ART did not change lipid profile, insulin resistance, body fat distribution, and inflammatory markers. Further investigations should considerer the assessment of higher doses and more sensitivity inflammatory markers

O HDL-c é um fator de risco cardiovascular negativo e sua concentração plasmática apresenta relação inversa com a incidência de eventos cardiovasculares. Entretanto, as evidências relativas ao grupo de indivíduos com níveis de HDL-c acima do percentil 95 da população geral ainda são escassas e o impacto da hiperalfalipoproteinemia (HALP) sobre o risco cardiovascular continua representando motivo de controvérsia na literatura médica. Alguns estudos em populações específicas associam a HALP a aumento do risco cardiovascular. Ao mesmo tempo, outros estudos identificaram populações de indivíduos hipoalfalipoproteinêmicos com marcada longevidade. Assim, demonstrou-se aparente dissociação entre níveis de HDL-c e risco cardiovascular em determinadas populações, reconduzível a aspectos disfuncionais da HDL. O objetivo do presente estudo foi verificar o papel da HALP na determinação do risco cardiovascular; comparar a prevalência de doença cardiovascular subclínica, avaliada por meio da quantificação ultrassonográfica da Espessura Íntimo-Medial Carotídea (EIMC), entre portadores de HDL-c >= 90mg/dL (grupo HALP) e portadores de concentrações de HDL-c atualmente consideradas normais (entre 40 e 50mg/dL para os homens e entre 50 e 60mg/dL para as mulheres); e avaliar características e função da HDL em portadores de HALP por meio do estudo de sua composição, de sua capacidade de efluxo de colesterol, e de sua atividade anti-inflamatória e antioxidante, correlacionando estas características com a presença de doença cardiovascular subclínica avaliada por meio da determinação da EIMC, da Velocidade de Onda de Pulso (VOP) e da presença de Calcificação Arterial Coronariana (CAC) avaliada pela TCMD. Para responder estas perguntas, o presente estudo foi articulado em dois braços: Braço 1: Análise da coorte do estudo ELSA com o objetivo de determinar a prevalência de HALP em uma população geral; definir o perfil demográfico, antropométrico e metabólico dos portadores de HALP; e comparar a prevalência de doença vascular subclínica deste grupo com controles da mesma coorte com níveis normais de HDL-colesterol. Braço 2: Recrutamento de 80 voluntários hígidos e portadores de HALP para avaliação da correlação entre presença de doença vascular subclínica, e aspectos estruturais e funcionais da HDL. Em seus dois braços, o estudo levou a quatro conclusões principais: 1) Níveis marcadamente elevados de HDL-c estão associados a menor espessura íntimo-medial carotídea quando comparados a níveis de HDL-c considerados normais pelas diretrizes vigentes. Embora portadores do fenótipo HALP apresentem, como grupo, um perfil metabólico mais favorável que o encontrado em indivíduos com HDL-c normal, a associação entre EIMC e HALP foi independente dos fatores de risco tradicionais, indicando que a menor prevalência destes últimos em portadores de HDL-c marcadamente elevado justifica apenas parcialmente a menor prevalência de doença vascular subclínica neste grupo; 2) Embora a HALP se apresente como um fenótipo ateroprotetor, há indivíduos com níveis marcadamente elevados de HDL-c que evoluem com doença cardiovascular, clínica ou subclínica. Neste contexto, nossos resultados indicam correlação entre os três métodos avaliados para estudar doença vascular subclínica em portadores de HALP: EIMC, VOP e CAC; 3) Os fatores de risco tradicionais continuam exercendo seu peso na determinação do risco cardiovascular em portadores de HALP. Idade, tabagismo, hipertensão arterial, hipertrigliceridemia e altos níveis de LDL-c apresentaram associação estatisticamente significativa com a presença de doença vascular subclínica no grupo estudado; 4) A avaliação da composição e da função da HDL em portadores de HALP pode permitir identificar indivíduos especificamente mais suscetíveis à aterosclerose. Nossos resultados indicam que, em particular, a atividade anti-inflamatória da HDL, avaliada pela capacidade de inibição da produção de IL-6; o efluxo de colesterol e a capacidade de transferência de triglicérides apresentaram associação independente com menor espessura íntimo-medial carotídea em portadores de HALP, enquanto níveis mais altos de Apo A-IV se associaram a maior grau de doença cardiovascular subclínica / HDL-c is a negative cardiovascular risk factor and its plasma concentration is inversely related to the incidence of cardiovascular events. However, evidence of benefit among subjects with HDL-c levels above the 95th percentile of the general population is still scarce and the impact of hyperalphalipoproteinemia (HALP) on cardiovascular risk continues to represent matter of debate in the medical literature. Some studies with specific populations indicated an increased cardiovascular risk associated with HALP. In addition, other reports identified groups of patients with marked hypoalphalipoproteinemia and longevity. Hence, there could be a dissociation between HDL-c levels and cardiovascular risk in certain populations, possibly due to dysfunctional HDL particles. The aim of this study was to investigate the role of HALP phenotype in determining cardiovascular risk; to compare the prevalence of subclinical cardiovascular disease, assessed by ultrasound measurement of Carotid Intima-Media Thickness (CIMT) among patients with HDL-c >= 90mg/dL (HALP group) and patients with HDL-c currently considered normal (40-50mg/dL for men and 50-60mg/dL for women); and to evaluate HDL functionality in patients with HALP through the study of its composition, its cholesterol efflux capacity, and its anti-inflammatory and antioxidant activity; correlating those characteristics with the presence of subclinical cardiovascular disease assessed by CIMT, Pulse Wave Velocity (PWV) and Coronary Artery Calcification (CAC). To answer these questions, the present study was articulated into two arms: Arm 1: ELSA-Brasil study cohort analysis in order to assess HALP prevalence in a general population, defining demographic, anthropometric and metabolic profile of HALP individuals; and comparing the prevalence of subclinical vascular disease among HALP subjects with controls with normal HDL-c. Arm 2: Recruitment of 80 healthy volunteers with HALP to study the correlation between subclinical vascular disease and HDL functionality in this group. Our study led to four main conclusions: 1) markedly elevated HDL-c is associated with lower CIMT compared to the control group with normal HDL-c levels. Although individuals with HALP display a more favorable metabolic profile than subjects with normal HDL-c, the association between CIMT and HALP was independent of traditional risk factors, indicating that the lower prevalence of subclinical vascular disease in this group is only partially justified by the lower prevalence of cardiovascular risk factors; 2) Although HALP can be regarded as an atheroprotective phenotype, there are individuals with markedly elevated levels of HDL-c who develop cardiovascular disease. Our results indicate good correlation of the three methods here adopted to study subclinical vascular disease among HALP patients: CIMT, VOP and CAC; 3) Traditional risk factors continue to exert their weight in determining cardiovascular risk in patients with HALP. Age, smoking, hypertension, hypertriglyceridemia and high levels of LDL-c were significantly associated with the presence of subclinical vascular disease among HALP individuals; 4) the assessment of the HDL composition and functionality in patients with HALP may allow to identify individuals specifically more susceptible to atherosclerosis. Our results indicate that, in particular, cholesterol efflux capacity, the anti-inflammatory activity of HDL, and triglyceride transfer capacity were independently associated with lower CIMT in HALP individuals, while higher levels of Apo A-IV were associated with a greater burden of subclinical cardiovascular disease

Introdução: A terapia antirretroviral (ART) mudou o curso da Aids, porém está associada a alterações metabólicas e aumento do risco de doenças cardiovasculares. Objetivo: Avaliar o efeito da suplementação com ácidos graxos ômega-3 de origem marinha no perfil lipídico, na homeostase da glicose, na distribuição de gordura corporal e nos marcadores inflamatórios de adultos com HIV em ART. Métodos: Artigo 1. Trata-se de uma revisão sistemática da literatura com metanálise. Realizou-se busca por ensaios clínicos na base de dados PubMed; 33 artigos foram localizados, seis cumpriram os critérios de inclusão e quatro apresentavam qualidade metodológica adequada. Foi realizada metanálise com efeitos fixos e descrição das diferenças de médias sumárias (DMS (IC95 por cento )). Artigos 2 e 3. Trata-se de um ensaio clínico aleatorizado e controlado. Foram recrutados 120 adultos com idade entre 19 e 64 anos, de ambos os sexos. Os indivíduos alocados no grupo intervenção foram suplementados por 24 semanas com 3g de óleo de peixe/dia (900mg de ácidos graxos ômega-3) e indivíduos alocados no grupo controle receberam placebo (óleo de soja). Resultados: Artigo 1. Após 8-16 semanas de intervenção com 900-3360mg de ácidos graxos ômega-3/dia, observou-se redução de -80,34mg/dL (IC 95 por cento : -129,08 a -31,60) nas concentrações de triglicérides. A análise agregada de estudos com média de concentração de triglicérides > 300mg/dL no baseline e intervenção com 1800-2900mg de ácidos graxos ômega-3/dia resultou em redução de -129,72mg/dL (IC95 por cento : -206,54 a -52,91). Artigos 2 e 3. Foram considerados nas análises dados de 83 sujeitos. Os modelos multinível não revelaram relação estatisticamente significante entre a suplementação com óleo de peixe e as mudanças longitudinais nas concentrações de triglicérides (p=0,335), LDL-C (p= 0,078), HDL-C (p=0,383), colesterol total (p=0,072), apo B (p=0,522), apo A1 (p=0,420), razão LDL-C/apo B (p=0,107), índice homa-2 IR (p=0,387), IMC (p=0,068), circunferência da cintura (p=0,128), relação cintura/quadril (p=0,359), PCR ultra sensível (p=0,918), fibrinogênio (p=0,148), e fator VIII (p=0,073). Conclusões: Artigo 1. Diferentes doses de ácidos graxos ômega-3 reduziram modo significativo as concentrações de triglicérides, confirmando a potencial aplicabilidade desse nutriente no tratamento da hipertrigliceridemia em pessoas que vivem com HIV em ART. Artigos 2 e 3. Uma dose relativamente baixa de óleo de peixe para pessoas que vivem com HIV em ART não alterou o perfil lipídico, a homeostase da glicose, a distribuição de gordura corporal e a concentração de marcadores inflamatórios. Recomenda-se, em estudos subseqüentes, a avaliação do efeito de doses mais elevadas, bem como a determinação de marcadores inflamatórios mais sensíveis / Background: Although the antiretroviral therapy (ART) revolutionized the care of HIV-infected subjects, it has been associated with metabolic abnormalities and increased risk of cardiovascular diseases. Aims: To review the effects of marine omega-3 fatty acids on lipid profile, insulin resistance and inflammatory markers in subjects living with HIV on ART. Methods: Paper 1. Thirty three articles were found in a PubMed search; six met the inclusion criteria; and four of them were considered of adequate quality and included. Meta-analysis with fixed effects was performed and weighted mean differences (WMD (95 per cent CI)) were described. Paper 2 and 3. The study was conducted in an HIV/Aids care centre affiliated to the Medical School, University of Sao Paulo. This was a randomized controlled trial that assessed the effects of 3g fish oil/day (900mg of omega-3 fatty acids) or 3g soy oil/day (placebo). A hundred and twenty subjects aged between 19 and 64 years were recruited. The statistical analyses were performed in Stata 9. Results: Paper 1. Data from 83 subjects were included in the analyses. The overall reduction on triglyceride concentrations after 8-16 weeks of treatment with 900-3360mg of omega-3/day was WMD=-80.34mg/dL (95 per cent CI: -129.08 to -31.60). The pooled result of studies with mean triglyceride > 300 mg/dL at baseline and 1800-2900mg omega-3/day was WMD=-129.72mg (95 per cent CI: -206.54 to -52.91). Paper 2 and 3. Multilevel analyses revealed no statistically significant relationships between fish oil supplementation and the longitudinal changes in triglyceride (p= 0.335), LDL-C (p= 0.078), HDL-C (p= 0.383), total cholesterol (p=0.072), apo B (p= 0.522), apo A1 (p=0.420), LDL-C/apo B ratio (p=0.107), homa-2 IR index (p=0.387), BMI (p=0.068), waist circumference (p=0.128), waist/hip ratio (p=0.359), hs-CRP (p=0.918), fibrinogen (p=0.148), and VIII factor (p=0.073). Conclusions: Paper 1. Different doses of omega-3 fatty acids reduced significantly triglyceride concentrations confirming the potential applicability of this nutrient on the management of hypertriglyceridemia in HIV-infected subjects on ART. Paper 2 and 3. A relatively low dose of fish oil for HIV subjects on ART did not change lipid profile, insulin resistance, body fat distribution, and inflammatory markers. Further investigations should considerer the assessment of higher doses and more sensitivity inflammatory markers

O HDL-c é um fator de risco cardiovascular negativo e sua concentração plasmática apresenta relação inversa com a incidência de eventos cardiovasculares. Entretanto, as evidências relativas ao grupo de indivíduos com níveis de HDL-c acima do percentil 95 da população geral ainda são escassas e o impacto da hiperalfalipoproteinemia (HALP) sobre o risco cardiovascular continua representando motivo de controvérsia na literatura médica. Alguns estudos em populações específicas associam a HALP a aumento do risco cardiovascular. Ao mesmo tempo, outros estudos identificaram populações de indivíduos hipoalfalipoproteinêmicos com marcada longevidade. Assim, demonstrou-se aparente dissociação entre níveis de HDL-c e risco cardiovascular em determinadas populações, reconduzível a aspectos disfuncionais da HDL. O objetivo do presente estudo foi verificar o papel da HALP na determinação do risco cardiovascular; comparar a prevalência de doença cardiovascular subclínica, avaliada por meio da quantificação ultrassonográfica da Espessura Íntimo-Medial Carotídea (EIMC), entre portadores de HDL-c >= 90mg/dL (grupo HALP) e portadores de concentrações de HDL-c atualmente consideradas normais (entre 40 e 50mg/dL para os homens e entre 50 e 60mg/dL para as mulheres); e avaliar características e função da HDL em portadores de HALP por meio do estudo de sua composição, de sua capacidade de efluxo de colesterol, e de sua atividade anti-inflamatória e antioxidante, correlacionando estas características com a presença de doença cardiovascular subclínica avaliada por meio da determinação da EIMC, da Velocidade de Onda de Pulso (VOP) e da presença de Calcificação Arterial Coronariana (CAC) avaliada pela TCMD. Para responder estas perguntas, o presente estudo foi articulado em dois braços: Braço 1: Análise da coorte do estudo ELSA com o objetivo de determinar a prevalência de HALP em uma população geral; definir o perfil demográfico, antropométrico e metabólico dos portadores de HALP; e comparar a prevalência de doença vascular subclínica deste grupo com controles da mesma coorte com níveis normais de HDL-colesterol. Braço 2: Recrutamento de 80 voluntários hígidos e portadores de HALP para avaliação da correlação entre presença de doença vascular subclínica, e aspectos estruturais e funcionais da HDL. Em seus dois braços, o estudo levou a quatro conclusões principais: 1) Níveis marcadamente elevados de HDL-c estão associados a menor espessura íntimo-medial carotídea quando comparados a níveis de HDL-c considerados normais pelas diretrizes vigentes. Embora portadores do fenótipo HALP apresentem, como grupo, um perfil metabólico mais favorável que o encontrado em indivíduos com HDL-c normal, a associação entre EIMC e HALP foi independente dos fatores de risco tradicionais, indicando que a menor prevalência destes últimos em portadores de HDL-c marcadamente elevado justifica apenas parcialmente a menor prevalência de doença vascular subclínica neste grupo; 2) Embora a HALP se apresente como um fenótipo ateroprotetor, há indivíduos com níveis marcadamente elevados de HDL-c que evoluem com doença cardiovascular, clínica ou subclínica. Neste contexto, nossos resultados indicam correlação entre os três métodos avaliados para estudar doença vascular subclínica em portadores de HALP: EIMC, VOP e CAC; 3) Os fatores de risco tradicionais continuam exercendo seu peso na determinação do risco cardiovascular em portadores de HALP. Idade, tabagismo, hipertensão arterial, hipertrigliceridemia e altos níveis de LDL-c apresentaram associação estatisticamente significativa com a presença de doença vascular subclínica no grupo estudado; 4) A avaliação da composição e da função da HDL em portadores de HALP pode permitir identificar indivíduos especificamente mais suscetíveis à aterosclerose. Nossos resultados indicam que, em particular, a atividade anti-inflamatória da HDL, avaliada pela capacidade de inibição da produção de IL-6; o efluxo de colesterol e a capacidade de transferência de triglicérides apresentaram associação independente com menor espessura íntimo-medial carotídea em portadores de HALP, enquanto níveis mais altos de Apo A-IV se associaram a maior grau de doença cardiovascular subclínica / HDL-c is a negative cardiovascular risk factor and its plasma concentration is inversely related to the incidence of cardiovascular events. However, evidence of benefit among subjects with HDL-c levels above the 95th percentile of the general population is still scarce and the impact of hyperalphalipoproteinemia (HALP) on cardiovascular risk continues to represent matter of debate in the medical literature. Some studies with specific populations indicated an increased cardiovascular risk associated with HALP. In addition, other reports identified groups of patients with marked hypoalphalipoproteinemia and longevity. Hence, there could be a dissociation between HDL-c levels and cardiovascular risk in certain populations, possibly due to dysfunctional HDL particles. The aim of this study was to investigate the role of HALP phenotype in determining cardiovascular risk; to compare the prevalence of subclinical cardiovascular disease, assessed by ultrasound measurement of Carotid Intima-Media Thickness (CIMT) among patients with HDL-c >= 90mg/dL (HALP group) and patients with HDL-c currently considered normal (40-50mg/dL for men and 50-60mg/dL for women); and to evaluate HDL functionality in patients with HALP through the study of its composition, its cholesterol efflux capacity, and its anti-inflammatory and antioxidant activity; correlating those characteristics with the presence of subclinical cardiovascular disease assessed by CIMT, Pulse Wave Velocity (PWV) and Coronary Artery Calcification (CAC). To answer these questions, the present study was articulated into two arms: Arm 1: ELSA-Brasil study cohort analysis in order to assess HALP prevalence in a general population, defining demographic, anthropometric and metabolic profile of HALP individuals; and comparing the prevalence of subclinical vascular disease among HALP subjects with controls with normal HDL-c. Arm 2: Recruitment of 80 healthy volunteers with HALP to study the correlation between subclinical vascular disease and HDL functionality in this group. Our study led to four main conclusions: 1) markedly elevated HDL-c is associated with lower CIMT compared to the control group with normal HDL-c levels. Although individuals with HALP display a more favorable metabolic profile than subjects with normal HDL-c, the association between CIMT and HALP was independent of traditional risk factors, indicating that the lower prevalence of subclinical vascular disease in this group is only partially justified by the lower prevalence of cardiovascular risk factors; 2) Although HALP can be regarded as an atheroprotective phenotype, there are individuals with markedly elevated levels of HDL-c who develop cardiovascular disease. Our results indicate good correlation of the three methods here adopted to study subclinical vascular disease among HALP patients: CIMT, VOP and CAC; 3) Traditional risk factors continue to exert their weight in determining cardiovascular risk in patients with HALP. Age, smoking, hypertension, hypertriglyceridemia and high levels of LDL-c were significantly associated with the presence of subclinical vascular disease among HALP individuals; 4) the assessment of the HDL composition and functionality in patients with HALP may allow to identify individuals specifically more susceptible to atherosclerosis. Our results indicate that, in particular, cholesterol efflux capacity, the anti-inflammatory activity of HDL, and triglyceride transfer capacity were independently associated with lower CIMT in HALP individuals, while higher levels of Apo A-IV were associated with a greater burden of subclinical cardiovascular disease

Aldeídos de colesterol (Secosterol A e Secosterol B) têm sido detectados em amostras de cérebro humano e investigados em modelos de doenças neurodegenerativas como possíveis marcadores e intermediários do processo patológico. Estes oxisteróis constituem uma classe de eletrófilos derivados de lipídeos que podem modificar e induzir agregação de proteínas. A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é um distúrbio neurodegenerativo associado ao acúmulo de agregados imunorreativos de superóxido dismutase (Cu, Zn-SOD, SOD1). O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de aldeídos de colesterol em ratos modelo ELA e sua capacidade de induzir a formação de agregados de SOD1 in vitro. Aldeídos de colesterol foram analisados no plasma, medula espinhal e córtex motor de ratos ELA. Uma quantidade elevada de Secosterol B foi detectada no córtex motor desses ratos em comparação com animais controle. Adicionalmente, os experimentos in vitro mostraram que Secosterol B e Secosterol A induziram a agregação da SOD1 em uma forma amiloidogênica que se liga à tioflavina T. Esta agregação não foi observada com o colesterol e os seus hidroperóxidos. Usando aldeídos de colesterol marcados com grupo alquinil e um ensaio de click chemistry, foi observado que os agregados de SOD1 estão ligados covalentemente aos aldeídos. A modificação covalente da proteína foi confirmada por análise de MALDI-TOF, que mostrou a adição de até cinco moléculas de aldeídos de colesterol à proteína por base de Schiff. Curiosamente, a análise comparativa com outros eletrófilos derivados de lipídeos (e.g. HHE e HNE) demonstrou que a agregação de SOD1 aumentou proporcionalmente à hidrofobicidade dos aldeídos, observando-se a maioragregação com aldeídos de colesterol. Os sítios de modificação da SOD1 foram caracterizados por nanoLC-MS/MS após digestão da proteína com tripsina, onde foram identificadas lisinas como o principal aminoácido modificado. Em geral, nossos dados mostram que a oxidação do colesterol que leva à produção de aldeídos de colesterol é aumentada no cérebro de ratos ELA e que os aldeídos altamente hidrofóbicos derivados de colesterol podem promover eficientemente modificação e agregação de SOD1. / Secosterol aldehydes (Secosterol B and Secosterol A) have been detected in human brain samples and investigated in models of neurodegenerative diseases as possible markers and intermediates of the pathological process. These oxysterols constitute a class of lipid-derived electrophiles that can modify and induce aggregation of proteins. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder associated with the accumulation of immunoreactive aggregates of superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD, SOD1). The objective of this work is to evaluate the presence of secosterol aldehydes in ALS rats and their ability to induce formation of SOD1 aggregates in vitro. Secosterol aldehydes were analyzed in plasma, spinal cord and motor cortex of ALS rats. A higher amount of Secosterol B was detected in the motor cortex of these rats compared to control animals. In addition, in vitro experiments have shown that Secosterol B and Secosterol A induce aggregation of SOD1 into an amyloidogenic form that binds to thioflavin T. This aggregation was not apparent in incubations with cholesterol and its hydroperoxides. Using alkynyl-labeled secosterol aldehydes and a click chemistry assay, it was found that the SOD1 aggregates are covalently linked to the aldehydes. Covalent modification of the protein was confirmed by MALDI-TOF analysis, which showed the addition of up to five molecules of secosterol aldehydes to the protein by Schiff base formation. Interestingly, the comparative analysis with other lipid-derived electrophiles (e.g. HHE and HNE) demonstrated that the aggregation of SOD1 increased according to the hydrophobicity of the aldehydes. Compared to the other electrophiles, a higher SOD1 aggregation was observed with secosterol aldehydes. SOD1 modification sites were characterized by nanoLC-MS/MS afterprotein digestion with trypsin, revealing lysine as the major amino acid modified in these experiments. Collectively, our data show that cholesterol oxidation leads to the production of secosterol aldehydes, which are increased in the brain of ALS rats, and that these highly hydrophobic aldehydes can efficiently promote the modification and aggregation of SOD1.

Os esteróides anabólicos androgênicos (EAA) aumentam a massa muscular e o desempenho físico. O uso abusivo de EAA leva a uma grande diminuição da concentração de HDL-C, podendo ocorrer um aumento nas concentrações de LDL-C e triglicérides. Os efeitos dos EAA na cinética plasmática das lipoproteínas que transportam os lípides da dieta, na circulação sanguínea, os quilomícrons e seus produtos de lipólise, os quilomícrons remanescentes, não foram avaliados e podem estar relacionados com o processo aterosclerótico. No presente estudo, foram estudados 12 indivíduos que realizam exercício de força localizada e admitem fazer uso de EAA (grupo Musculação+EAA), 16 indivíduos que também realizam exercício de força localizada, porém não fazem uso de EAA (grupo Musculação) e 18 indivíduos sedentários e normolipidêmicos (grupo Sedentário). A emulsão de quilomícrons artificiais, marcada com triglicérides radioativos (TG-3H) e éster de colesterol radioativo (EC-14C), foi injetada endovenosamente e amostras de sangue foram colhidas durante intervalos de tempo préestabelecidos. As curvas de decaimento plasmático dos lípides radioativos da emulsão foram traçadas e as taxas fracionais de remoção (TFR) foram calculadas por meio de análise compartimental. A TFR-EC do grupo Musculação+EAA apresentou-se diminuída comparando-se aos grupos Sedentário e Musculação (0,0073± 0,0079 min -1, 0,0155± 0,0100 min -1, 0,0149± 0,0160 min -1, respectivamente; p< 0,05), enquanto que as TFR-TG foram similares. As concentrações plasmáticas de LDL-C foram maiores no grupo Musculação+EAA comparando-se com os grupos Sedentário e Musculação (143±54,101±31, 111±52 mg/dL, respectivamente; p=0,047). As concentrações plasmáticas de HDL-C e de apolipoproteína A1 foram menores no grupo Musculação+EAA quando comparados aos grupos Sedentário e Musculação (HDL-C= 22±13; 41±7; 38±13 mg/dL, respectivamente; p<0,001 e apo A1= 88±50; 156±35; 140±24 mg/dL, respectivamente; p<0,001). As curvas de geração de ácidos graxos livres originados pela hidrólise de triglicérides radioativos dos quilomícrons artificiais na circulação sanguínea foram similares entre os grupos estudados. A atividade da lipase hepática foi maior no grupo Musculação+EAA, comparando-se aos grupos Sedentário e Musculação (7243±1822; 3898±1232; 2058±749, respectivamente; p<0,001), enquanto que a atividade da lipase lipoprotéica não diferiu. O diâmetro da HDL e concentração de triglicérides presentes na HDL também foram similares nos três grupos estudados. / Anabolic androgenic steroids (AAS) increase muscle mass and physical performance. Abusive use of AAS has led to a significant reduction of HDL-C concentration in the plasma, which in turn can cause lead to an increase in LDL-C and trigliceride concentrations. The effects of steroids on lipoprotein plasmatic kinetics which transport diet lipids in the blood, the chilomicrons and its lypolisis products, chilomicron reminiscents have not yet been studied and can be contributing factors to the ateroclesrosis process. In this study 12 local weight lifters and admitted steroid users (AAS group), 16 local weight lifters but nonsteroids use (non-user group) and 18 sedentary and normolipidemic individuals (control group) were studied. The artificial chilomicron emulsion, marked with radioactive triglyceride (3H-TG) and radioactive oleate cholesterol (14C-OC) were injected interveneously and blood samples collected during pre-established time intervals. The plasmatic decay curve of the radioactive lipids of the emulsion was traced and fractional clearance rate was calculated (FCR) through compartamental analysis. The FCR-OC of the AAS group when compared to the control and nonuser groups was reduced (0,0073±0,0079 min -1,0,0155±0,0100 min -1, 0,0149± 0,0160 min -1, respectivelly; p< 0,05), while FCR-TG were similar. The LDL-C plasmatic concentration were higher in the AAS group when compared to control and non-user groups (143±54,101±31, 111±52 mg/dL, respectivelly; p=0,047). The HDL-C plasmatic concentration and the apolipoprotein A1 were lower in the AAS group when compared control and non-user groups (HDL-C: 22±13; 41±7; 38±13 mg/dL, respectivelly; p<0,001 e apo A1: 88±50; 156±35; 140±24 mg/dL,respectivelly; p<0,001). No difference was observed of the area under the fatty acid generated curve. Hepatic lipase activity was greater in the AAS group when compared to control and the non-user groups (7243±1822; 3898±1232; 2058±749, respectivelly; p<0,001). However, no difference was observed for lipoproteic lipase activity. The analisys of HDL size and triglyceride concentration in HDL were similar for all three groups.

Quitosana é um polissacarídeo usado em diversas aplicações biológicas, por exemplo, em liberação controlada de drogas, transfecção, aceleração da cicatrização de feridas e como agente bactericida, entre outras. Em todas essas aplicações, o polímero interage com tecidos e células. Entretanto, embora sua ação seja comprovada, os mecanismos de ação e a interação do polímero com células e biomembranas no nível molecular ainda não são conhecidos. Nesta tese de doutorado, filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB) de lipídios foram usados como modelos de membrana celular para estudar em nanoescala a interação e os efeitos causados pela quitosana. Primeiramente, observou-se que a quitosana, um polieletrólito solúvel em pH ácidos, possui atividade superficial induzida na presença de um filme interfacial de lipídio, demonstrando que o polímero possui interação favorável com membranas. Após adsorver sobre as monocamadas, a quitosana expande as mesmas, o que ocorre apenas até uma determinada concentração de polímero, denominada concentração de saturação. A magnitude dessa expansão é menor para filmes compactos, o que sugere que a quitosana é parcialmente expulsa da interface, localizando-se na subsuperfície. Isso foi comprovado com o uso de filmes LB, que mostraram que filmes mistos com quitosana têm rugosidade cerca de 10 vezes a de filmes puros de ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA). Foi possível confirmar que a quitosana penetra na monocamada, formando agregados com até 150 nm de altura. Além disso, a maior orientação das moléculas de fosfolipídios, sugerida por isotermas de potencial de superfície (V-A) para filmes de Langmuir, também foi comprovada para os filmes LB por medidas de espectroscopia de geração de soma de freqüências (SFG). Filmes mistos de DMPA e colesterol também foram estudados, sendo que o colesterol provoca condensação nos filmes de DMPA a baixas pressões, mas expande as monocamadas em altos estágios de compactação. Quando a quitosana interage com os filmes mistos, ela provoca a mesma expansão para todas as monocamadas independentemente da proporção de colesterol na mistura. Embora esse comportamento possa sugerir um papel inerte do colesterol, ele é explicado pela modulação da penetração da quitosana nos filmes pelo colesterol. Isso ocorre porque há um número fixo de pontos de interações eletrostáticas entre os grupos NH3+ da quitosana e PO2- do DMPA, o que foi comprovado por medidas de espectroscopia de reflexão-absorção na região do infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Com esta técnica para filmes de Langmuir, e espectroscopia SFG para filmes LB, pôde ser traçado um panorama dos efeitos da inserção de colesterol na membrana de DMPA, seguido da interação da quitosana com a membrana mista. A adição do colesterol ao filme de fosfolipídio acarreta em diminuição da ordem das cadeias de DMPA, detectado por variações nas bandas de s(CH2) e ass(PO2-) do fosfolipídio no espectro de PM-IRRAS, e pela razão s(CH3)/s(CH2) nos espectros de SFG. Por outro lado, a interação da quitosana com esse filme misto causa recuperação da orientação das caudas polares do fosfolipídio, verificada pela análise das mesmas bandas de PM-IRRAS e pela razão s(CH3)/s(CH2), que diminui de 6,62 para 4,58 com a adição de colesterol, mas volta a 5,97 após a interação com o polímero. De forma geral, a ação da quitosana sobre biomembranas é governada principalmente por interações eletrostáticas com lipídios carregados negativamente, na superfície externa das mesmas. Dentre os principais efeitos causados pelo polímero, destaca-se a diminuição da elasticidade da membrana e o aumento da orientação das moléculas de lipídio, que podem ter importantes implicações biológicas. A observação de uma concentração de saturação dos efeitos, na maioria dos casos, sugere que a dosagem e a estrutura química da quitosana devem ser bem controladas para alcançar o efeito biológico desejado. / Chitosan is a polyssaccharide with many biological applications, as in drug delivery, transfection, wound healing and as bactericidal agent, for instance. In all these applications the polymer interacts with tissues and cells. The efficacy of chitosan has been proven, but the mechanisms of action and the interactions with cells and biomembranes are still unknown. In this thesis, Langmuir and Langmuir-Blodgett (LB) films made of lipids were employed as cell membrane models, in order to investigate the interactions and modulations caused by chitosan at the molecular level. Firstly, the soluble polyelectrolyte chitosan was found to induce surface activity when a lipid monolayer is at the air/water interface, demonstrating that the interaction of chitosan with membranes is favorable. Upon chitosan adsorption, the monolayers were increasingly expanded with increasing chitosan concentration in the subphase up to a saturation concentration. The extension of this expansion was lower for highly packed films, suggesting that chitosan was partially expelled from the interface after the compression, being located at the sub-monolayer region. This was confirmed by the 10-fold increase in film roughness observed for the areas without aggregates in LB films. Also, we could observe aggregates as high as 150 nm on the film surface, thus confirming chitosan penetration in the dimyristoyl phosphatidic acid (DMPA) monolayer. Mixed DMPA-cholesterol Langmuir monolayers were also produced, with cholesterol inducing condensation of the DMPA films at low pressures, and film expansion at high pressures. Regardless of the cholesterol proportion in the film, chitosan always induced the same degree of expansion on the DMPA mixed monolayers as for a neat DMPA monolayer. Although this behaviour may suggest an inert role for cholesterol, it can only be explained if the sterol is assumed to regulate the extension of chitosan penetration into the monolayer. This occurs because there is a fixed number of sites for electrostatic interactions between NH3+ groups from chitosan and PO2- from DMPA, probed by infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) measurements. Indeed, with PM-IRRAS measurements for Langmuir monolayers and sum-frequency generation spectroscopy (SFG) measurements for LB films, we could establish an overview of the effects from cholesterol on DMPA films upon interaction with chitosan. The addition of cholesterol to the DMPA monolayer caused a decrease in the chain order, which was detected by changes in the s(CH2) and ass(PO2-) bands from the phospholipid in the PM-IRRAS spectrum, and by the s(CH3)/s(CH2) intensity ratio in SFG measurements. On the other hand, the interaction of chitosan with these mixed monolayers restored chain order, as observed from the analysis of PM-IRRAS bands and the s(CH3)/s(CH2) in SFG. The latter dropped from 6.62 to 4.58 with cholesterol addition, but further increased to 5.97 with the chitosan interaction. Overall, the chitosan action on biomembranes is mainly governed by electrostatic interactions with negatively charged lipids at the external leaflet of the membrane. The main effects from chitosan to the membrane models are the decrease in membrane elasticity and the increase in molecular ordering, which can lead to important biological implications. Moreover, the existence of the so-called concentration of saturation for most systems suggests that the dosage and chemical structure of chitosan must be well controlled to obtain the desired biological effect.

Concentração de apolipoproteína A-1 (1.5±0.3; 1.5±0.2g/l). O tamanho da HDL também foi igual entre os dois grupos (8.8±0.8; 9.0±0.5 nm, respectivamente). A menopausa também não afetou a transferência de lípides da LDE para a HDL (em % total de radioatividade/10mg HDL/h), CE (0.5±0.3; 0.5±0.2, respectivamente), CL (0.9±0.2; 0.9±0.2), TG (0.6±0.2;0.6±0.2) e PL (3.0±0.7; 3.3±1.0). Conclusão: A menopausa não Introdução: A concentração plasmática da HDL é um fator de risco importante e independente para a prevenção da doença aterosclerótica, principalmente na mulher. Seu metabolismo e suas características estruturais e funcionais também têm sido estudados como fatores de risco. Neste estudo, foram comparadas mulheres de mesma faixa etária na pré e na pós-menopausa, para determinar a influência da menopausa sobre o tamanho da HDL e sobre a habilidade desta lipoproteína em receber lipídios de lipoproteínas doadoras, um processo que depende de proteínas de transferência e da composição e estrutura da HDL. Métodos: Vinte e duas mulheres saudáveis, normolipidêmicas na pré e dezoito na pós-menopausa, de idades entre 40-50 anos foram estudadas. Os grupos não diferiam em IMC, glicemia, colesterol total, LDL, triglicérides, apo A1 e apo B. Uma nanoemulsão artificial foi usada como modelo de LDL (LDE) para doar lípides para a HDL. LDE marcada radioativamente com 3 H-triglicérides (TG) e 14 C-colesterol livre (CL) ou 3 H- ésteres colesterol (CE) e 14 C-fosfolipídios (PL) foram incubados com as amostras de plasma por 1 hora. Após a precipitação química do sobrenadante contendo HDL, foi contada a radioatividade. O tamanho da HDL foi medido por espalhamento da luz laser. Resultados: A concentração da HDL nos dois grupos não diferiu, demonstrada pela concentração de HDL colesterol (61±12; 61±14 mg/dl respectivamente) e influenciou o tamanho das partículas HDL e um importante parâmetro funcional que é a habilidade da HDL de receber lipídios. / Objective: HDL levels are important for atherosclerosis prevention especially in the female gender, but functional aspects of the lipoprotein are also important. In this study, post-menopausal were compared to pre-menopausal women in the same age range to determine the influence of menopause upon the HDL size and ability of the lipoprotein to receive lipids from donor lipoproteins, a process that depends on transfer proteins and on HDL composition and structure. Methods: Twenty-two pre and eighteen postmenopausal, healthy and normolipidemic women, aged 40-50 yr. Both groups did not differ in BMI and plasma glucose, total and HDL cholesterol, triglycerides and apo B concentration. An artificial nanoemulsion (LDE) was used as a model of LDL to donate lipids to HDL. LDE labeled with 3 H-triglicerides (TG) and 14 C-free cholesterol (FC) or 3 H-cholesteryl esters (CE) and 14 C-phospholipids (PL) incubated with plasma samples for 1h. After chemical precipitation, the supernatant containing HDL was counted for radioactivity. HDL size was measured by laser-light-scattering. Results: HDL concentration of pre and post menopausal women did not differ as estimated by HDL cholesterol (61±12; 61±14 mg/dl respectively) and apo A1 concentration (1.5±0.3; 1.5±0.2g/l). HDL size also did not differ (8.8±0.8; 9.0±0.5 nm, respectively). Menopause also did not affect the transfer of lipids from LDE to HDL (in % of total radioactivity/10mg HDL/h), namely CE (0.5±0.3; 0.5±0.2, respectively), FC (0.9±0.2; 0.9±0.2), TG (0.6±0.2;0.6±0.2) and PL (3.0±0.7; 3.3±1.0). Conclusion: The menopause does not affect the size and an important functional parameter that is the ability of HDL to receive lipids.

Alimentos submetidos a processos tecnológicos que requerem altas temperaturas apresentam um grande potencial para a produção de óxidos de colesterol (OsC). Inúmeras evidências indicaram que os óxidos de colesterol são potencialmente citotóxicos, aterogênicos, mutagênicos e carcinogênicos. Em pescados, a oxidação do colesterol está favorecida pela presença de ácidos graxos poliinsaturados e altos níveis de colesterol. O camarão salgado-seco é particularmente suscetível à formação de óxidos de colesterol devido a sua composição lipídica, ao seu processamento e as condições de estocagem. O objetivo deste trabalho foi determinar a ocorrência de produtos da oxidação do colesterol e analisar o perfil lipídico em camarão salgado-seco. Analisou-se cinqüenta amostras de camarão salgado-seco por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), através da qual foram determinados os teores de óxidos de colesterol. O colesterol e os óxidos de colesterol (7ß-OH, 7?-OH, 7-Ceto e 25-OH) foram analisados simultaneamente. O perfil de ácidos graxos foi determinado por cromatografia gasosa e para a avaliação da oxidação lipídica foi empregado o teste de TBARS. Os resultados indicaram que as amostras examinadas continham: 7ß-OH (34,63-72,56 µg/g), 7?-OH (5,02-12,12 µg/g), 7-Ceto (7,44-32,68 µg/g) e 25-OH (2,37-22,88 µg/g), sendo o 7ß-OH o óxido predominante. A quantidade de (OsC) nas amostras analisadas variou consideravelmente (4,52 a 77,30 µg/g). Quanto ao teor de colesterol total e a concentração média de TBARS, os resultados variaram de 73,88 a 247,69 mg/100g e 0,023 a 1,30 mgMA/Kg respectivamente. O perfil de ácidos graxos encontrado foi de 27,48 % saturados, 43,90% monoiinsaturados e 28,61% poliinsaturados. Este estudo indicou que as amostras estavam oxidadas, tanto pela presença de produtos da oxidação do colesterol como pelos valores de TBARS. Tal oxidação foi, provavelmente, iniciada no processamento e em condições inadequadas de armazenamento. Os resultados reforçaram a importância da reavaliação dos procedimentos que envolvem o manuseio de pescados, particularmente do camarão salgado-seco, desde a captura até a determinação do tempo de prateleira, no sentido de minimizar as reações oxidativas. / Foods submitted to technological processes that require high temperature present a great potential for production of cholesterol oxides (COPs). Several evidences have indicated that COPs are potentially cytotoxic, atherogenic, mutagenic, and carcinogenic. In sea food, the cholesterol oxidation is favored by the presence of unsaturated fatty acids and high cholesterol levels. The salted-dried shrimp is particularly susceptible to the formation of COPs due to its lipidic composition, the processing and storage conditions. The objective of this work was to determine the occurrence of cholesterol oxidation products and to analyze the lipidic profile in salted-dried shrimp. Fifty samples of salted-dried shrimp were evaluated, and the cholesterol oxides were quantified by high-performance liquid chromatography (HPLC). Cholesterol and COPs (7ß-hydroxycholesterol, 7?- hydroxycholesterol, 7-Ketocholesterol and 25- hydroxycholesterol) were simultaneously analyzed. The fatty acids profile was determined by gas chromatography, and for the evaluation of lipidic oxidation the TBARS method was used. The results indicated that the samples contained: 7ß-OH (34.63-72,56 µg/g), 7?-OH (5.02-12.12µg/g), 7-Keto (7.44-32.68 µg/g) and 25-OH (2.37-22.88 µg/g). These data indicated that 7?-OH was the predominant product. The amount of COPs in the samples varied considerably, ranging from 4.52 to 77.30 µg/g. Regarding to the total cholesterol content and the average concentration of TBARS, the results varied from 73.88 to 247.69 mg/100g, and 0.023 to 1.30 mgMA/Kg, respectively. The fatty acids profile was: 27.48% saturated, 43.90% monounsaturated and 28.61% polyunsaturated. This study indicated that the samples were oxidized, by the presence of COPs and the values of TBARS as well. Such oxidation was probably initiated under inadequate conditions of processing and storage. These results reinforced the need of revaluation of the fishing handling procedures, particularly the salted-dried shrimp, including all the stages - from the capture to the de shelf-life determination, in order to minimize the oxidative reactions.

Orientador: Débora Cristina Damasceno / Abstract: Maternal exposure to the high-fat diet (HFD) during gestation or lactation can be harmful to both mother and offspring. The objective of this systematic review was to synthesize the available data on the effects of maternal HFD on the reproductive parameter and biochemical profile in rodents. The electronic search was performed in the PUBMED (Public/Publisher MEDLINE), EMBASE (Ovid) and Web of Science databases. Data from 76 studies showed that change in biochemical and reproductive parameters is dependent on the experimental design. Furthermore, the heterogeneity found in the studies makes it impossible to comparisons. In addition, studies often omit or neglect important information, such as a description of the diet or methodological details. These factors make it difficult to affirm the true effect of maternal HFD consumption for both mother and offspring. / Resumo: A exposição materna à dieta hiperlipídica (DHL) durante a gestação ou lactação pode ser prejudicial tanto para a mãe quanto para seus descendentes. O objetivo desta revisão sistemática foi sintetizar os dados da literatura referente aos efeitos do consumo materno de DHL sobre os parâmetros reprodutivos e perfil bioquímico em roedores. A busca eletrônica foi realizada nos bancos de dados PUBMED (Public / Publisher MEDLINE), EMBASE (Ovid) e Web of Science. Dados de 76 estudos mostraram que a mudança nos parâmetros bioquímicos e reprodutivos é dependente do design experimental. A heterogeneidade encontrada nos estudos impossibilita as comparações. Além disso, os estudos frequentemente omitem ou negligenciam informações importantes, como a descrição da dieta ou detalhes metodológicos. Esses fatores dificultam a afirmação do verdadeiro efeito do consumo materno de DHL para a mãe e a prole. / Doutor