LIMA, Jaqueline Rabelo de. Controle da antracnose pós-colheita do mamão com leveduras killer. 2013. 135 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Renorbio, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-23T14:38:07Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_jrlima.pdf: 3900571 bytes, checksum: 4b74f4790b64e178ecb28e6fbdaeb326 (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-23T14:44:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_jrlima.pdf: 3900571 bytes, checksum: 4b74f4790b64e178ecb28e6fbdaeb326 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T14:44:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_jrlima.pdf: 3900571 bytes, checksum: 4b74f4790b64e178ecb28e6fbdaeb326 (MD5) Previous issue date: 2013 / This study aimed to isolate yeast able to produce and excrete the toxin from killer tropical fruits, to act in the biological control of plant pathogens in postharvest. A total of 580 yeasts strains, isolated from Ceara State of Brasil, were evaluated for their ability to produce killer toxin. Of these strains, 29 tested positive for the killer phenotype and were further evaluated for their ability to control Colletotrichum gloeosporioides germination in vitro. All yeast strains that expressed the killer phenotype were characterized by sequencing the D1/D2 regions of the large subunit of the rRNA gene. Five yeast strains provided a significant reduction in mycelial growth and conidial germination of C. gloeosporioides in vitro, especially Meyerozyma guilliermondii, which was able to reduce the fungal mycelial growth on solid medium (PDA) by 60% and block 100% of conidia germination in liquid media (PDB). Filtering and autoclaving the liquid cultures had no effect on the growth of the pathogen. These results indicate the potential use of antagonist yeasts isolated from tropical fruits in the control of anthracnose caused by C. gloeosporioides in papaya. Further elucidation of main mechanisms involved on anthracnose control by these yeasts could be helpful for the development of biocontrol techniques related to the management of this disease in tropical fruits. The efficiency of two killer yeast strains, with better results in vitro were tested in vivo against C. gloeosporioides, Wickerhamomyces anomalus (strain 422) and Meyerozyma guilliermondii (strain 443), as biocontrol agents against C. gloeosporioides, a postharvest anthracnose agent of papaya and other tropical fruits, was assessed. These strains were previously selected through in vitro assays, but in the present study, their in vivo action was assessed. In addition, the influence of phytopathogen inoculation time on the fruit in combination with the use of the biocontrol agent was also assessed. Through the use of scanning electron microscopy (SEM), we assessed mycoparasitism as an antagonistic mechanism of action. In addition, two hydrolytic enzymes, chitinase and β-1, 3 glucanase, were assayed. Our results indicated that W. anomalus (strain 422) and M. guilliermondii (strain 443) reduced the disease occurrence by 24.62% and 20.68%, respectively, for up to 6 days after inoculation, when applied 3 hours before the phytopathogen and incubated in a wet chamber (95% relative humidity) at 28°C. The time of yeast inoculation had a significant effect on its antagonistic action. Application of the yeasts 12 or 24 hours before the phytopathogen inoculation resulted in 13.75% and 30% of disease reductions for W. anomalus (strain 422) and 31.35% and 41.17% reductions for M. guilliermondii (strain 443), respectively. Electron micrographs confirmed mycoparasitism by clearly indicating the interaction of the yeasts with C. gloeosporioides hyphae, causing, in some cases, a loss of turgor and yeast penetration of walls with marked concavity formation on hypha cell walls. The efficiency of two killer yeasts, Wickerhamomyces anomalus (strain 422) and Meyerozyma guilliermondii (strain 443), which showed better results in tests in vtro and in vivo, associated with five different application vehicles was assessed for the protection of papayas postharvest. In this study, after 90 days of incubation at 4°C, W. anomalus (strain 422) and M. guilliermondii (strain 443) were viable with all application vehicles tested. Fruits treated with different formulations (yeasts + application vehicles) had a decreased incidence of disease (by at least 30%) compared with untreated fruits. The treatment of W. anomalus (strain 422) + 2% starch lowered disease occurrence by 48.3%. The most efficient treatments using M. guilliermondii (strain 443) were those with 2% gelatin or 2% liquid carnauba wax, both of which reduced anthracnose by 50% in postharvest papayas. Electron micrographs of the surface tissues of the treated fruits showed that all application vehicles provided excellent adhesion of yeast to the surface. The formulations based on starch (2%), gelatin (2%) and carnauba wax (2%) were the most efficient at controlling fungal diseases in postharvest papayas / Este trabalho objetivou isolar leveduras capazes de produzir e excretar a toxina killer a partir de frutos tropicais, para atuarem no controle biológico de fitopatogenos em pós-colheita. Inicialmente, foram isoladas 580 leveduras a partir de 87 amostras de frutos tropicais (mamão, caju, sapoti, murici, manga e acerola), dentre as quais 29 exibiram o fenótipo killer. Todas as cepas killer foram identificadas pelo sequenciamento da região D1/D2 do 28S rRNA, em que ficou demonstrada a presença de Candida aaseri, Wickerhamomyces anomalus, Pichia kluyveri, Meyerozyma guilliermondii, Kodamaea ohmeri. Cinco leveduras foram capazes de inibir em 100% a germinação de conídios em meio líquido e reduzir o crescimento micelial, em meio sólido de Colletotrichum gloeosporioides in vitro, com destaque para M. guilliermondii (cepa 443) que foi capaz de reduzir o crescimento micelial do fitopatogeno em 60% em meio sólido. As duas leveduras com melhores resultados in vitro foram testadas in vivo, contra C. gloeosporioides, agente da antracnose em pós-colheita de mamão e outros frutos tropicais, W. anomalus (cepa 422) e M. guilliermondii (cepa 443). Também foi investigada a ocorrência de micoparasitismo como mecanismo de ação do antagonista por meio de microscopia eletrônica de varredura – MEV e detecção das enzimas hidrolíticas, quitinase e β-1-3 glucanase. Os resultados demonstraram que, quando aplicada simultaneamente ao fitopatógeno e incubadas em câmara úmida (95% U.R.) a 28 °C, as leveduras W. anomalus (cepa 422) e M. guilliermondii (cepa 443) foram capazes de reduzir a ocorrência da doença em 24,62%, 7,0% e 20,68%, respectivamente, até 06 dias após a inoculação. Verificou-se que o tempo de inoculação da levedura teve significativa influência sobre sua ação antagonista; a aplicação dos agentes com 24 ou 12 horas de antecedência em relação ao fitopatógeno resultou em redução de 30% e 13,75% para W. anomalus (cepa 422), em 40% e 35% para W. anomalus (cepa 440) e em, 41,17 e 31,35% para M. guilliermondii (cepa 443) respectivamente. A ocorrência de micoparasitismo foi confirmada através de eletromicrografias que evidenciaram a união das leveduras às hifas do C. gloeosporioides, provocando, em alguns casos, perda de turgidez e até ruptura dessas; tudo isso associado à produção de β 1-3-glucanase. As leveduras killer, W. anomalus (cepa 422) e M. guilliermondii (cepa 443) que apresentaram melhores resultados nos testes in vivo foram testadas associação com cinco diferentes veículos de aplicação na proteção em pós-colheita de mamão. Após 90 dias de incubação a 4 °C, essas leveduras mantiveram-se viáveis em todos os veículos de aplicação testados e durante todo o período de incubação, frutos tratados com formulações (leveduras + veículos de aplicação) apresentaram incidência de doença, pelo menos 30% menores, quando comparadas aos frutos não tratados. Para W. anomalus (cepa 422), o tratamento que utilizou amido (2%) reduziu em 48,3% a ocorrência de doenças, já para M. guilliermondii, (cepa 443), os tratamentos mais eficientes no controle da doença foram os que utilizaram gelatina e cera líquida de carnaúba (2%) como veículos de aplicação, ambos foram capazes de reduzir em 50% a ocorrência de doenças em pós-colheita de mamões. Eletromicrograficas revelaram que todos os veículos de aplicação foram eficientes em permitir a fixação das leveduras na superfície do fruto. Leveduras killer podem atuar no biocontrole em pós-colheita de mamão e estes microrganismos atuam através de uma variedade de mecanismos de ação, o que potencializa seu efeito protetor e amplia sua eficiência de ação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The massive use of chemicals to control plant diseases cause numerous negative impacts on agricultural production system on non-target organisms, consumers and farmers. Therefore, the use of biological control organisms such as Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis, able to act on the control of plant pathogens and / or induce resistance in plants is characterized as an important and with great potential yet to be explored tool. The objective of this study was to identify metabolites produced by these organisms grown in liquid medium and test the use of filtered culture and of living organisms, applied via seed or leaf in the control of anthracnose in beans. Biological control organisms T. harzianum and B. subtilis were grown in liquid culture medium for 96 h and 12 h photoperiod. After incubation, the media were filtered through Millipore membrane extraction of the bacterial cells and spores. Metabolites were extracted with four organic solvents, ethanol, methanol, ethyl acetate and hexane and subjected to gas chromatography and mass spectrometry and the chromatograms generated for each organism and solvent used. The evaluation of the induction of defense responses in plants was held in cultivating Minuano with susceptibility reaction to the pathogen Colletotrichm lindemuthianum. The bean plants were evaluated for disease index, area under the disease progress curve and changes in peroxidase activity, β-1,3-glucanase and IAA - oxidase, as well as certain fresh and dry weight of plants in two stages, before and after inoculation of the challenging pathogen. The chromatographic identification of compounds from culture filtrates showed that both test organisms produce fatty acids and oxylipins in liquid medium with antifungal action and inducing defense responses, respectively. In the assessments performed in bean plants, both T. harzianum as B. subtilis reduced the severity and progress of the disease, and produced significant increases in the activities of peroxidase isozymes and β-1,3-glucanase after inoculation of the pathogen, indicating the activation of induced resistance. The induction of responses did not affect the dry mass of the plants, which shows no energy expenditure that could affect plant growth. The best answers to T. harzianum are observed in foliar applications, either spore suspension or culture filtrate, as for B. subtilis, the best answers are observed in the foliar application of culture filtrate. For ease of production, culture filtrates of Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis can give bioproducts for agricultural use. / O uso massivo de produtos químicos para controle de doenças em plantas causa inúmeros impactos negativos no sistema de produção agrícola, sobre organismos não alvo, consumidores, agricultores e o ambiente. Diante disso, a utilização de organismos de controle biológico, como Trichoderma harzianum e Bacillus subtilis, capazes de agir no controle de fitopatógenos e/ou induzir resistência em plantas, se caracteriza como uma ferramenta importante e com muito potencial ainda a ser explorado. O objetivo deste trabalho foi identificar metabólitos produzidos por estes organismos cultivados em meio líquido e testar a utilização destes filtrados de cultura, bem como dos organismos vivos, aplicados via semente ou foliar, no controle da antracnose em feijoeiro. Os organismos de controle biológico T. harzianum e B. subtilis foram cultivados em meio de cultura líquido por 96h e fotoperíodo de 12h. Após a incubação, os meios foram filtrados em membrana milipore para extração dos esporos e das células bacterianas. Os metabólitos foram extraídos com quatro solventes orgânicos, etanol, metanol, acetato de etila e hexano e submetidos à cromatografia gasosa e espectrofotometria de massa e gerados cromatogramas para cada organismo e solvente utilizado. A avaliação da indução de respostas de defesa em plantas foi realizada na cultivar Minuano, com reação de suscetibilidade ao patógeno Colletotrichum lindemuthianum. As plantas de feijão foram avaliadas quanto ao índice de doença, área abaixo da curva de progresso da doença e às alterações nas atividades de peroxidase, β-1,3-glucanase e AIA oxidase, assim como determinada a massa fresca e seca das plantas em dois momentos, antes e após a inoculação do patógeno desafiante. A identificação cromatográfica dos compostos presentes nos filtrados de cultura demonstrou que ambos os organismos testados produzem ácidos graxos e oxilipinas em meio líquido, com ação antifúngica e indutoras de respostas de defesa, respectivamente. Nas avaliações realizadas em plantas de feijão, tanto T. harzianum quanto B. subtilis, reduziram a severidade e o progresso da doença, assim como produziram acréscimos significativos nas atividades das isoenzimas peroxidase e β-1,3-glucanase após a inoculação do patógeno, indicando a ativação da resistência induzida. As respostas de indução não comprometeram o acúmulo de massa seca das plantas, o que demonstra não haver gasto energético capaz de comprometer o crescimento das plantas. As melhores respostas para T. harzianum são observadas nas aplicações foliares, seja de suspensão de esporos ou filtrado de cultura, já para B. subtilis, as melhores respostas são observadas na aplicação foliar do filtrado de cultura. Pela facilidade de produção, filtrados de cultura de Trichoderma harzianum e Bacillus subtilis podem originar bioprodutos para uso agrícola.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1393738 bytes, checksum: a972ec00e49dcfa2c5d44a8c6f9480a0 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The plants produce antifungous proteins and specialized antibiotics (phytoanticipins and phytoalexins) in order to defend from phytopathogenic fungus. Only the pathogens able to avoid those defensive plant responses at the initial stages of the infection are able to cause disease. The fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara is the etiological agent of the anthracnose in the common bean plant (Phaseolus vulgaris L.), that is an important disease contributing to reduce the productivity of the bean plant crop in Brazil. The genes abcCl1 and cypCl1 were isolated from this phytopathogen and their deduced aminoacid sequences have high similarity with ABC transporters and cytochromes P450, respectively. Those genes are found in unique copy and clustered in genome of the fungus, as revealed by either the sequencing of one DNA 8,4 kb fragment from the genomic library of C. lindemuthianum and the hybridization profile. Those genes also show an increased expression in response to different toxic compounds, mainly when the fungus is grown at the presence of eugenol, hygromycin and pisatin phytoalexin. Therefore, besides their genes to be physically linked, the proteins ABCCl1 and CYPCl1 can also be involved in the same functional process: the fungus resistance to the toxic compounds produced by plants or antagonistic microorganisms. In the functional analysis of the gene abcCl1, the mutants abcCl1− showed reduction in their virulence to the leaf of the common bean plant, compared with the wild line of C. lindemuthianum. Those results indicate the gene abcCl1 to codify an ABC transporter that is necessary to pathogenicity of C. lindemuthianum, probably because providing the fungus with the ability to overcome the defense mechanism of the plant. The cytochrome P450, that is codified by the gene cypCl1, can represent a complementary detoxification mechanism used by this fungus during the establishment of the disease. / Para se defenderem de fungos fitopatogênicos, as plantas produzem proteínas antifúngicas e antibióticos especializados (fitoanticipinas e fitoalexinas). Somente patógenos que conseguem evitar estas respostas defensivas da planta nos estágios iniciais da infecção são capazes de causar doença. O fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara é o agente etiológico da antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), uma importante doença que contribui para redução da produtividade da cultura do feijoeiro no Brasil. Neste fitopatógeno foram isolados dois genes, abcCl1 e cypCl1, cujas sequências de aminoácidos deduzidas possuem alta similaridade com transportadores ABC e citocromos P450, respectivamente. Estes genes estão presentes em cópia única e agrupados no genoma do fungo, conforme revelado no sequenciamento de um fragmento de DNA de 8,4 kb da biblioteca genômica de C. lindemuthianum, bem como no perfil de hibridização. Estes genes também apresentam aumento de expressão em resposta a diferentes compostos tóxicos, principalmente quando o fungo é crescido na presença de eugenol, higromicina ou fitoalexina pisatina. Assim, além de seus genes estarem ligados fisicamente, as proteínas ABCCl1 e CYPCl1 podem, também, estarem envolvidas em um mesmo processo funcional: a resistência do fungo a compostos tóxicos produzidos por plantas ou microrganismos antagonistas. Na análise funcional do gene abcCl1, foi observado que mutantes abcCl1− apresentam redução na virulência a folhas de feijoeiro comum, em comparação com a linhagem selvagem de C. lindemuthianum. Estes resultados indicam que o gene abcCl1 codifica um transportador ABC, que é necessário para a patogenicidade de C. lindemuthianum, provavelmente por conferir ao fungo a capacidade de superar algum mecanismo de defesa da planta. O citocromo P450, codificado pelo gene cypCl1, pode representar um mecanismo complementar de destoxificação empregado por este fungo durante o estabelecimento da doença.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1830082 bytes, checksum: ec907521bfa48f79975e5fe22c20d972 (MD5) Previous issue date: 2009-10-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The filamentous fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., causal agent of anthracnose, is an important pathogen of common bean (Phaseolus vulgaris L.). This fungus is an excellent model organism for understanding the infection process of pathogenic fungi. A C. lindemuthianum non-pathogenic mutant (LVSa1) with partial deficiency in the production of melanin was obtained through plasmid insertional mutagenesis. The aim of this study was to isolate and characterize the interrupted gene in theLVSa1 mutant and demonstrate its importance in the plant infection process. The mutated gene was isolated from a C. lindemuthianum genomic bank and named slnCl1. The sequence analysis revealed that slnCl1 encodes a histidine kinase. The sequence presents an ORF of 3555 base pairs, interrupted by three putative introns, containing 51, 87 and 89 bp. The multiple alignment of the deduced sequence of the protein, including sequences of all histidine kinases classes available in the databases, grouped SlnCl1 in class VI; possessing highly conserved regions characteristic of histidine kinase, and related to its function. A mutant with partial deficiency for the production of melanin was obtained through site-directed insertional mutagenesis using a gene fragment. This mutant showed a significant reduction in the ability to infect bean leaves, demonstrating that SlnCl1 is important to the pathogenicity process of this fungus. As many histidines kinases already described in fungi, SlnCl1 is involved in osmoregulation and adaptation to different osmotic concentrations in C. lindemuthianum. Furthermore, through this sensor protein, the fungus can distinguish the osmotic stress caused by high concentrations of sugars and salts. The mutant was sensitive to fungicides that target a MAPK signaling pathway, probably regulated by slnCl1. The results suggest that C. lindemuthianum must have other histidines kinases involved in the osmoregulation process. The study of the signaling cascade regulated by slnCl1 may represent a major advance in understanding the pathogenicity and developing new methods to combat this disease. / O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose, é um importante patógeno do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Esse fungo é um excelente modelo de estudo para o entendimento do processo de infecção de fungos fitopatogênicos. Por meio de mutagênese por inserção de plasmídeo foi obtido um mutante (LVSa1) não patogênico de C. lindemuthianum com deficiência parcial na produção de melanina. O objetivo desse trabalho foi isolar e caracterizar o gene interrompido no mutante LVSa1 e comprovar a sua importância no processo de infecção da planta. O gene mutado foi isolado de um banco genômico de C. lindemuthianum e denominado slnCl1. A análise da sequência revelou que slnCl1 codifica uma histidina quinase. A sequência apresenta uma ORF de 3555 pares de bases, interrompida por três íntrons putativos, contendo 51, 87 e 89 pb. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com sequências de todas as classes de histidinas quinases disponíveis nos bancos de dados agrupou SlnCl1 na classe VI, possuindo regiões extremamente conservadas características de histidina quinases e relacionadas a sua função. Por meio de mutagênese insercional sítio dirigida utilizando um fragmento do gene, foi obtido um mutante que apresentou deficiência parcial na produção de melanina. Esse mutante apresentou uma redução significativa na capacidade de infectar folhas de feijoeiro, demonstrando que SlnCl1 é importante no processo de patogenicidade desse fungo. Como muitas histidinas quinases já descritas em fungos, SlnCl1 apresenta envolvimento no processo de osmorregulação e adaptação a diferentes concentrações osmóticas em C. lindemuthianum. Além disso, por meio dessa proteína sensora, o fungo pode distinguir o estresse osmótico causado por altas concentrações de açúcares e de sais. O mutante mostrou-se sensível a fungicidas que tem como alvo uma via de sinalização MAPK, provavelmente regulada por slnCl1. Os resultados obtidos sugerem que C. lindemuthianum deve possuir outras histidinas quinases envolvidas no processo de osmorregulação. O estudo da cascata de sinalização regulada por slnCl1 pode representar um grande avanço no entendimento do processo de patogenicidade e na elaboração de novos métodos de combate a doença.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4267302 bytes, checksum: e9b9d7cbe9f5e7cfd714ca533302e571 (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean antracnose. This fungus, like other phytopatogens, is constantly exposed to several toxic compounds from many sources, what makes indispensable the development of protection strategies against these products. One of these strategies is related to membrane transporters proteins like the Major Facilitator Superfamily (MFS), that could provide protection against toxic compounds or minimizing its action, being essential for the fungal cellular viability maintenance. In this context, this work aimed to inactivate the mfs1 gene encoding a MFS membrane transporter and investigate the phenotypic alterations entailed in an isolate C. lindemuthianum mutant LV49 (race 89) for this gene. To obtain the mutant, it was necessary to confirm if mfs1 gene was organized as a single copy in the C. lindemuthianum genome. The mfs1 gene can be organized in a cluster in view that a second open reading frame, which corresponds to a transcription factor superfamily containing a Zn2-Cys6 domain, identified as clft1, was observed in 3` downstream region of this gene. The mfs1 promoter analysis revealed a putative mfs1 element that is recognized by proteins of this family, what suggests that this protein could be related to the mfs1 expression regulation. The Split-Marker technique proved to be efficient in C. lindemuthianum mfs1 gene inactivation enabling the study of mfs1 function in a mutant by specific integrations without ectopic integrations. The Δmfs1 mutant showed no differences in drug sensibility profile when commonly drugs employed in antracnose control was used and in relation to pathogenicity, the mutant symptoms started earlier on susceptible bean leaves, showing a stress situation due to the genic product absence. It was also observed that mfs1 presents a primordial role in C. lindemuthianum cellular viability maintenance, what was confirmed by the altered conidiation observed, confirming that this gene encodes for a specific hexose membrane transporter, specifically carbon sources like glucose, mannose and fructose. The protein Mfs1 phylogenetic analysis allow us to conclude that this transporter is a SP family member and the MFS proteins are strongly related with the transported substance. Studies conducted with MFS transporters are important to broaden the knowledge of these proteins and to understand the cell viability in C. lindemuthianum. / O fungo Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Este fungo, assim como outros fungos fitopatógenos estão constantemente expostos a uma grande variedade de compostos tóxicos provenientes de várias fontes, o que torna imprescindível para estes o desenvolvimento de mecanismos de proteção contra estes produtos. Uma dessas estratégias está relacionada com a presença de proteínas transportadoras de membrana, como as pertencentes à Principal Superfamília Facilitadora (MFS), que podem fornecer aos fungos proteção contra compostos tóxicos evitando ou minimizando a ação destes, sendo em sua maioria essenciais para a manutenção da viabilidade celular. Este trabalho teve como objetivo inativar o gene mfs1 que codifica para um transportador de membrana da família MFS e investigar as alterações fenotípicas ocasionadas em um mutante C. lindemuthianum isolado LV49 (raça 89) para este gene. Para a obtenção do mutante foi necessário confirmar que o gene mfs1 encontrava-se presente em cópia única no genoma de C. lindemuthianum. O gene mfs1 pode estar organizado em um conjunto de genes com funções relacionadas, uma vez que downstream à região 3’ deste foi identificada uma segunda janela aberta de leitura correspondente a uma proteína da superfamília de fatores de transcrição contendo o domínio Zn2-Cys6, identificado como clft1. A análise do promotor do gene mfs1 revelou um putativo cis elemento de reconhecimento por proteínas desta família, o que sugere que esta proteína possa estar relacionada à regulação da expressão de mfs1. A técnica de Split- Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene mfs1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene mfs1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. O mutante Δmfs1 não mostrou diferenças no perfil de sensibilidade a drogas comumente empregadas no controle da antracnose e em relação à patogenicidade, o mutante induziu mais precocemente os sintomas em folhas de feijoeiro susceptível, evidenciando uma situação de estresse decorrente da ausência do produto gênico. Foi observado também que o gene mfs1 exerce um papel primordial na manutenção da viabilidade celular de C. lindemuthianum, fato este confirmado pela conidiação alterada e pela confirmação de que este gene codifica para um transportador de membrana específico no transporte de hexoses, especificamente glicose, manose e frutose, uma vez que o mutante Δmfs1 mostrou crescimento reduzido quando cultivado em meios contendo apenas glicose, manose e frutose como fontes de carbono. A análise filogenética da proteína Mfs1 associada aos outros resultados obtidos nos sugere que este transportador é um membro da família SP, e que as proteínas MFS estão fortemente relacionadas com o tipo de substância que é transportada. Estudos de natureza básica sobre transportadores MFS são importantes para ampliar os conhecimentos sobre estas proteínas e a viabilidade celular em C. lindemuthianum.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477917 bytes, checksum: 4ab8f5cc2dd481acd067b02bd7abf32d (MD5) Previous issue date: 2012-01-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Colletotrichum is one of the most important genera of plant-pathogenic fungi in the world. The pathogenic species of this genus have hemibiotrophic lifestyle and cause diseases in several economically significant crops. Besides the economic importance, Colletotrichum has great significance as a model system for studying the molecular and cellular bases of fungal pathogenicity. The species C. graminicola, causal agent of corn anthracnose (Zea mays), has rare sexual stage and was the first species of the genus to have its genome completely sequenced. The transposable elements are ubiquitous and constitute a source of new mutations, being an important source of genetic variability. These elements are divided into two classes according to the presence or absence of an RNA intermediate in transposition. Elements of class I transpose via RNA intermediate, while class II elements transpose directly as DNA. The transposable elements can be applied as mutagenic agents aimed at the identification and labeling of genes and in phylogenetic and population studies. Given the importance of transposable elements in the generation of genetic variability and its applications in research, the aim of this study was to identify and characterize the class II transposable elements in the genome of C. graminicola. For this purpose, we used a bioinformatic approach combined with experimental activities. We identified 132 complete sequences of transposable elements in the sequenced genome of C. graminicola, which represent a significant proportion of the genome (0.47%). The elements were classified into six families according to similarity, all elements have characteristics of Tc1-mariner superfamily. Although some of these elements possess putative transposases with conserved DDE domain, all are interrupted by multiple stop codons. None of the elements identified has all the necessary features to be considered an active element. In silico analysis revealed evidence that these sequences are mutated by RIP (repeat point induced mutation) mechanism. TCg1 element was amplified by PCR from a Brazilian isolate and has imperfect terminal inverted repeats and the putative transposase sequence has three conserved domains characteristic of transposases: DDE, CENPB and HTH. However, this sequence is interrupted by stop codons and lacks the initiation codon and termination codon, therefore, is probably inactive. The genomic DNA from 49 different isolates were analyzed by hybridization with a probe derived from the inner region of TCg1 and different profiles were identified. The strategy allowed the efficient identification of a variety of Tc1-Mariner transposable elements degenerated by mutations characteristics of RIP in C. graminicola. It is unlikely that any of the identified elements is autonomous, however, these elements must have an important role in the genetic variability of this fungus. The TCg1 element is present in the genomes of different isolates of C. graminicola and has the potential to be used as a molecular marker in population analyzes. / Colletotrichum é um dos gêneros mais importantes de fungos fitopatogênicos em todo o mundo. As espécies fitopatogênicas desse gênero apresentam ciclo de vida hemibiotrófico e causam doenças em diversas culturas economicamente importantes. Além da importância econômica, Colletotrichum possui grande relevância como um sistema modelo para o estudo das bases celulares e moleculares da patogenicidade fúngica. A espécie Colletotrichum graminicola, agente causal da antracnose do milho (Zea mays), possui ciclo sexual raro e foi a primeira espécie do gênero a ter o seu genoma completamente sequenciado. Os elementos transponíveis são ubíquos e constituem uma fonte de novas mutações, sendo, portanto, uma importante fonte de variabilidade genética. Esses elementos são divididos em duas classes de acordo com a presença ou ausência de um intermediário de RNA na transposição. Os elementos da classe I se transpõem via intermediário de RNA, enquanto os elementos da classe II se transpõem diretamente como DNA. Os elementos transponíveis podem ser utilizados como agentes mutagênicos visando à identificação e etiquetagem de genes e em estudos filogenéticos e populacionais. Tendo em vista a importância dos elementos transponíveis na geração de variabilidade genética e as suas aplicações na pesquisa, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar elementos transponíveis da classe II no genoma de C. graminicola. Para tanto, foi utilizada uma abordagem de bioinformática (análises in silico) aliada às atividades experimentais. Foram identificadas 133 sequências completas de elementos transponíveis no genoma sequenciado de C. graminicola, que representam uma proporção relevante do genoma (0,47%). Os elementos foram classificados em 6 famílias de acordo com a identidade e apresentam características da superfamília Tc1-Mariner. Apesar de algumas transposases putativas codificadas por esses elementos possuírem domínio DDE conservado, todas estão interrompidas por vários códons de parada. Nenhum elemento identificado possui todas as características necessárias para um elemento autônomo. A análise in silico revelou evidências de mutações geradas pelo mecanismo de RIP (Mutação de ponto induzida por repetição). O elemento TCg1, amplificado por PCR a partir de um isolado brasileiro de C. graminicola, possui extremidades repetidas invertidas imperfeitas e a sequência putativa da transposase apresenta os três domínios característicos conservados: DDE, HTH e CENPB. Entretanto, essa sequência está interrompida por códons de parada e não foram localizados os códons de iniciação e de terminação, sendo, portanto, provavelmente inativa. O DNA genômico de 49 diferentes isolados foi analisado por hibridização com uma sequência derivada da região interna de TCg1 e apresentaram diferentes perfis. A estratégia utilizada permitiu uma identificação eficiente de uma variedade de elementos transponíveis Tc1-Mariner degenerados por mutações características de RIP em C. graminicola. É improvável que algum dos elementos identificados seja autônomo, entretanto, esses elementos devem possuir um importante papel na variabilidade genética desse fungo. O elemento TCg1 está presente no genoma de diferentes isolados de C. graminicola e possui potencial para ser utilizado como marcador molecular em análises populacionais.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 952076 bytes, checksum: 7fbcb43414ecacd3439620826b6172cd (MD5) Previous issue date: 2012-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean anthracnose. Genes that encode cell wall-degrading enzymes are essential for the development of this disease. The pectinases are characterized as the most important group of cell wall- degrading enzymes produced by phytopathogen fungi. The gene coding for pectate lyase, pecCl1, was previously identified in a suppressive subtractive library of bean infected with C. lindemuthianum. Isolation of the gene pecCl1 made it possible to obtain mutants and to analyze the regulation of this gene during development of anthracnose, determining whether the pectate lyase is a pathogenic factor. Thus, the aim of our study was structurally and functionally characterize the gene encoding pectate lyase in C. lindemuthianum. Initially, was performed the structural analysis of the gene pecCl1. The complete nucleotide sequence of the gene pecCl1 was deposited in Genbank with accession number JX270683. The analysis of the promoter region revealed some putative cis-elements and potential binding motifs of transcription factors involved in the regulation of pectate lyase gene expression. The deduced amino acid sequence of pecCl1 showed sequence identity with the pectate lyase F of Colletotrichum higginsianum and the pectate lyase C of Glomerella graminicola M1.001. Furthermore, it was found putative conserved domain pfam03211 of the pectate lyases superfamily. The gene pecCl1 is represented by a single copy in the C. lindemuthianum genome. However, into the genome of Colletotrichum graminicola, three sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, and into the genome of C. higginsianum seven sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, indicating that the C. lindemuthianum genome can possess other genes encoding pectate lyase. Phylogenetic analysis of pectate lyase amino acid sequences of filamentous fungi exhibited the formation of two distinct groups which are grouped on the basis of members of the pectate lyases multigene family. The Split-Marker technique was effective in C. lindemuthianum pecCl1 gene inactivation, allowing the study of pecCl1 function in a mutant by specific integrations and without ectopic integrations. The pecCl1 gene inactivation did not lead to complete loss of the pectate lyase activity, and consequently only decreased anthracnose symptoms in its host, which is consistent with the presence of other genes coding pectate lyase, allowing greater flexibility in pathogen aggressiveness. The analysis of differential expression of gene pecCl1 by qPCR was performed at different stages of bean infection and were observed expression levels of pecCl1 at all stages of development of the fungus in the plant, but a significant increase was observed five days after infection, in the onset of necrotrophic stage. At this stage, secondary hyphae cause extensive degradation of plant cell wall through the secretion of wide range of depolymerases, among these, the pectate lyase. Thus, the pectate lyase encoded by the gene pecCl1 is important to aggressiveness of C. lindemuthianum. The analysis of pectate lyases in C. lindemuthianum can not only assist in understanding the disease, but may also lead to discovery of one more target for disease control. / Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Genes que codificam enzimas que degradam a parede celular são essenciais para o desenvolvimento dessa doença. As pectinases são caracterizadas como o grupo de enzimas que hidrolisam a parede celular mais importante produzidas por fungos fitopatogênicos. O gene pecCl1, que codifica pectato liase, foi previamente identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum. O isolamento do gene tornou possível a obtenção de mutantes e análise da regulação deste gene durante o desenvolvimento da antracnose, visando determinar se a pectato liase é um fator de patogenicidade. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente o gene que codifica pectato liase em C. lindemuthianum. Inicialmente, foi realizada a análise estrutural do gene pecCl1. A sequência completa de nucleotídeos do gene pecCl1 foi deposita no Genbank com número de acesso JX270683. A análise da região promotora revelou alguns possíveis cis-elementos e sítios de ligação a fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica da pectato liase. A sequência de aminoácidos deduzida de pecCl1 apresentou identidade de sequências com a pectato liase F de Colletotrichum higginsianum e a pectato liase C de Glomerella graminicola M1.001. Além disso, detectou-se um possível domínio conservado pfam03211 da superfamília de pectato liases. O gene pecCl1 encontra-se representado por uma cópia única no genoma de C. lindemuthianum. No entanto, no genoma de Colletotrichum graminicola, três sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, e no genoma de C. higginsianum sete sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, indicando que o genoma de C. lindemuthianum pode possuir além do gene pecCl1 outros genes que codificam pectato liase. A análise filogenética de sequências de aminoácidos de pectato liases de fungos filamentosos mostrou a formação de dois grupos distintos, que se agruparam com base nos membros da família multigênica de pectato liases. A técnica de Split-Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene pecCl1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene pecCl1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. A inativação do gene pecCl1 não levou a perda completa da atividade de pectato liase, e consequentemente, somente diminuiu os sintomas de antracnose em seu hospedeiro, o que é consistente com a presença de outros genes que codificam pectato liase no fungo, permitindo ao patógeno uma maior flexibilidade em sua agressividade. Foi realizada a análise da expressão diferencial do gene pecCl1 por qPCR nos diferentes estágios de infecção no feijoeiro e foram observados transcritos de pecCl1 em todas as fases de desenvolvimento do fungo na planta, mas houve um aumento significativo destes transcritos cinco dias após a infecção, no início da fase necrotrófica do fungo. Nesta fase, as hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de despolimerases, dentre estas, a pectato liase. Portanto, a pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de C. lindemuthianum. A análise de pectato liases poderá não somente auxiliar na compreensão da antracnose em feijoeiro comum, mas também poderá levar a descoberta de mais um alvo para o controle dessa doença.

Submitted by RAFAELLY CALSAVARA MARTINS (rcalsavara@yahoo.com.br) on 2018-04-18T14:26:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rafaelly.pdf: 1006900 bytes, checksum: 5de75f90d394fb494260f60a66a10061 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-04-18T16:29:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martins_rc_me_botfca.pdf: 944570 bytes, checksum: 61c4c333ef49f44b64f726f81acdfe56 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-18T16:29:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martins_rc_me_botfca.pdf: 944570 bytes, checksum: 61c4c333ef49f44b64f726f81acdfe56 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A bananeira é a segunda fruta com maior volume comercializado no mundo. Pelo fato de ser uma fruta muito apreciada pelo consumidor brasileiro, nos últimos anos surgiram diversas tecnologias que auxiliam no cultivo da bananeira, principalmente relacionadas à qualidade dos frutos. Nesse contexto, o trabalho teve como objetivo avaliar a influência da coloração dos sacos plásticos empregados no ensacamento de cachos de bananeira ‘BRS Conquista’. Os tratamentos consistiram no uso de sacos de polietileno comerciais, nas cores branco, preto, vermelho e azul, além da testemunha (sem ensacamento). O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com cinco tratamentos, quatro repetições e quatro plantas por parcela, totalizando 80 plantas. Avaliou-se a qualidade fitossanitária dos frutos, sendo o número de pontuações de danos causados por tripes da erupção e a porcentagem de área lesionada causada por antracnose, além das características físicas dos frutos, como massa do cacho, massa da ráquis, massa dos frutos, número de frutos por cacho, número de pencas por cacho, massa das pencas, número, comprimento e diâmetro de frutos da segunda penca, e as características físico-químicas dos frutos, como sólidos solúveis, acidez titulável, relação polpa/casca, índice de maturação e período de maturação. Verificou-se que os cachos que foram ensacados com sacos de coloração branca e preto apresentaram menor número de pontuações provocadas por tripes. Enquanto que para antracnose, os cachos que receberam sacos de coloração branca, vermelha e azul, apresentaram as menores porcentagens de área lesionada. O ensacamento dos cachos com sacos plásticos de diferentes colorações não interferiu nas variáveis produtivas. Contudo, nos cachos que não receberam ensacamento observaram-se maiores teores de sólidos solúveis que naquelas ensacadas. / Banana is the second most commercialized fruit crop in the world. Since it is very appreciated by the Brazilian consumer, in the last years, several technologies have come out to help in the development of the crop, mainly related to the quality of fruits. In this context, the objective of this work was to use banana bagging techniques for improvements in the banana cultivation process. Polyethylene bags of white, black, red, blue colors and the control (no bagging) were used in this technique. A randomized complete block design with five treatments, four replications, two plants per plot, totaling 80 plants was used. The evaluated characteristics in the post-harvest were the bunch mass, fruit mass, number of fruits per bunch, bunch number, second bunch mass, number of fruits of second batch, length, diameter, pH, soluble solids, titratable acidity, pulp/peel ratio, maturation index and maturation days. The phytosanitary quality of the fruits was evaluated, and the symptoms of thrips and anthracnose were assessed. In addition, the physical characteristics of the fruit, which is represented by the mass of the bunch, mass of the rachis, mass of the fruit, number of fruit per bunch, number of penca by bunch, productivity, mass of the second bunch, number of fruit in the second bunch, length and diameter of the fruit in the second bunch and physical chemical characteristics of the fruit, soluble solids, acidity, relation pulp/peel, index of maturation and period of maturation were evaluated. It was verified that for the variable mass of the second bunch, the white and black bags presented better results, whereas for pH variable the blue staining was the one which showed better results, and for the soluble solids it was the control group. This work showed that the efficiency of bagging is associated with the type and color of the bag which is used, since the coverings assign a thermal role inside the bunches / 130371/2016-5

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:31:45Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Samara Rayane Pereira de Morais - 2018.pdf: 1662554 bytes, checksum: a507cd1d13ea851ee565f7b6064db936 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:34:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Samara Rayane Pereira de Morais - 2018.pdf: 1662554 bytes, checksum: a507cd1d13ea851ee565f7b6064db936 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-26T13:34:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Samara Rayane Pereira de Morais - 2018.pdf: 1662554 bytes, checksum: a507cd1d13ea851ee565f7b6064db936 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-04-17 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The common bean anthracnose caused by the fungus Colletotrichum lindemuthianum is one of the main diseases that impacts negatively on crop yield. The use of resistant cultivars is an efficient tool to control this disease. However, the wide variability of C. lindemuthianum is a challenge for breeding programs. The pyramiding of different resistance alleles is a recommended strategy aiming to effective and durable resistance. Fourteen resistance loci to common bean anthracnose have been identified and described so far: Co-1, Co-2, Co-3, Co-4, Co-5, Co-6, co-8, Co-11, Co- 12, Co-13, Co-14, Co-15, Co16, and Co-17. This work has aimed to: (1) evaluate common bean resistance source based on their reaction to anthracnose in controlled environment and on the molecular analysis with molecular markers previously identified as linked to resistance loci; (2) test the allelic relationship among the anthracnose resistance loci present in the carioca seeded cultivars BRS Horizonte and BRS Cometa; and (3) study the genetic inheritance and mapping the anthracnose resistance in BRS Cometa. The phenotypic screening of the population F2 BRS Horizonte × BRS Cometa and F2 and F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa were carried out using the C. lindemuthianum pathotypes 89 and 91, respectively. The phenotypic and molecular characterization of 26 common bean lines were performed using two pathotypes (races 73 and 81) and seven SCAR and one STS markers. The evaluation of the reaction to disease was carried out using a 1-to-9 scale (resistant = 1 to 3, and susceptible = 4 to 9). The genotyping of the 104 F2 plants from the Rosinha G2 × BRS Cometa cross with SNP markers was carried out using the BARBean6K_3 Illumina Bead Chip on the Illumina Infinium HD Assay Ultra® genotyping platform. The genomic regions flanking the SNP markers were aligned against the reference genome of Phaseolus vulgaris, Andean variety (G19833) and Mesoamerican variety (BAT 93), using the BLASTN tool. As result from the phenotypic characterization, BRS Cometa and other thirteen common bean lines have been considered resistant to the races 73 and 81. The molecular characterization result has indicated that the resistance to anthracnose in BRS Cometa can be controlled by the Co-3 or other resistance locus in the chromosome Pv04, since BRS Cometa has showed amplification only for markers linked to the Co-3. Results from the phenotyping of the F2BRS Horizonte × BRS Cometa population indicated that the segregation ratio for the resistance to anthracnose has fit to the expected ratio of 15R_:1rr ( 2 = 1.24% and P = 26.41%). The segregation ratios in the F2 and F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa population has fit to expected ratio of 3R_:1rr ( 2 = 0.40% and P = 50.50%) and 1RR:2Rr:1rr ( 2 = 0.0% and P = 100%), respectively, indicating that the resistance to anthracnose in BRS Cometa is monogenic and dominant. The anthracnose resistance locus in BRS Cometa (Co-Cometa) was mapped on Pv04. Based on the genetic and physical distances observed between Co-Cometa and other resistance loci already described in Pv04 (Co-3, Co-15 and Co-16), the evidences indicate that Co-Cometa is a different locus. / A antracnose do feijoeiro, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum, é uma das principais doenças que impacta negativamente a produtividade da cultura. Para o manejo dessa doença, a utilização de cultivares resistentes é uma ferramenta eficiente. Porém, a ampla variabilidade de C. lindemuthianum representa um desafio para os programas de melhoramento genético. Deste modo, a piramidação de distintos alelos de resistência é uma estratégia recomendada. Atualmente, 14 locos de resistência à antracnose já foramcaracterizados e descritos: Co-1, Co-2, Co-3, Co-4, Co-5, Co-6, co-8, Co-11, Co-12, Co13, Co-14, Co-15, Co-16 e Co-17. O presente trabalho teve como objetivos: 1) avaliar linhagens fontes de resistência com base na reação à antracnose em ambiente controlado e análise molecular com marcadores moleculares identificados como ligados a locos de resistência; 2) testar a relação alélica entre os locos de resistência à antracnose presentes nas cultivares de feijão carioca BRS Horizonte e BRS Cometa; e 3) estudar a herança e mapear a resistência à antracnose na cultivar BRS Cometa. Foi realizada a fenotipagem das populações F2 BRS Horizonte × BRS Cometa e F2 e F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa, utilizando as raças 89 e 91, respectivamente. A caracterização fenotípica e molecular de 26 linhagens fontes de resistência foi realizada utilizando dois patótipos (raça 73 e 81) e sete marcadores SCAR e um STS. A avaliação da reação à doença foi realizada utilizando uma escala de notas contendo nove graus de reação (resistentes = 1 a 3 e suscetíveis = 4 a 9). Foi realizada a genotipagem de 104 plantas F2 Rosinha G2 × BRS Cometa com marcadores SNP, utilizando o BARBean6K_3 Illumina Bead Chip na plataforma de genotipagem Illumina Infinium HD Assay Ultra®. As regiões genômicas flanqueando os marcadores SNP foram alinhadas contra o genoma de referência de Phaseolus vulgaris, variedades Andina (G19833) e Mesoamericana (BAT 93), usando a ferramenta BLASTN. Como resultado da caracterização fenotípica, BRS Cometa e 13 linhagens foram consideradas resistentes às raças 73 e 81. A caracterização molecular indicou que a resistência à antracnose presente em BRS Cometa pode ser governada pelo loco Co-3 ou outro loco de resistência presente no cromossomo Pv04, uma vez que BRS Cometa apresentou amplificação apenas para marcadores ligados ao loco Co-3. Os resultados da fenotipagem da população F2 BRS Horizonte × BRS Cometa indicaram que a razão de segregação para resistência à antracnose se ajustou à proporção esperada de 15R_: 1rr ( 2 = 1,24 e P = 26,41%). As razões de segregação nas populações F2 e F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa se ajustaram à proporção esperada de 3R_:1rr ( 2 = 0,40 e P = 50,50%) e 1RR:2Rr:1rr ( 2 = 0,0 e P = 100%), respectivamente, evidenciando que a resistência em BRS Cometa é monogênica dominante. O loco de resistência à antracnose presente em BRS Cometa (CoCometa) foi mapeado no cromossomo Pv04. Com base nas distâncias genéticas e físicas observadas entre Co-Cometa e outros locos de resistência já descritos em Pv04 (Co-3, Co15 e Co-16), as evidencias são que Co-Cometa trata-se de um loco distinto.

Na literatura encontram-se referências de estudos envolvendo micro-organismos endofíticos, e mais recentemente estudos que avaliam a interação entre micro-organismos o que resulta na modificação, no tipo ou quantidade dos compostos que são produzidos. Neste trabalho foram realizados cultivos simples e mistos do fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 e da actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7, endófiticos isolados de Lychnophora ericoides que pertencem à coleção do Laboratório de Química de Microorganismos (LQMo) da FCFRP-USP, com o objetivo de aumentar suas capacidades de produção de novos compostos com atividade biológica. O cultivo misto, ou co-cultivo, é uma estratégia que tem sido usada para o acesso aos produtos naturais de origem microbiana. Existem poucos relatos de compostos com atividade biológica isolados a partir de S. albospinus e não há relatos de metabólitos secundários obtidos a partir de C. boninense. Nenhum desses micro-organismos tem sido descrito como endofítico na literatura e não existem relatos sobre co-cultivos envolvendo qualquer um deles na busca de compostos bioativos. Juntando as informações geradas através das diferentes técnicas de detecção utilizadas, como TLC, HPLC-DAD, GC-MS, ESI-MS, RMN e depois da análise correspondente, foi possível identificar e atribuir as estruturas de algumas substâncias conhecidas de origem microbiana como a mevalonolactona, o tirosol, a fisostigmina, a desferrioxamina E. ESI-MS foi utilizada para análises dos extratos brutos originados dos cultivos em meio arroz parbolizado permitindo visualizar compostos produzidos em baixas quantidades pelos micro-organismos na cultura simples quanto na co-cultura. Além disso, foram obtidos os perfis metabólicos desses micro-organismos a partir de cultivos em placa de Petri, possibilitando a detecção dos metabólitos em regiões específicas da interação microbiana, o que conduziu à identificação da fisostigmina e o seu análogo N-etilcarbamato produzidos pela actinobactéria, na interação com o fungo. Análises posteriores de MS sequencial permitiram obter perfis de fragmentação, os quais, juntamente com os dados dos íons detectados nos extratos, foram comparados com a informação disponível em bases de dados como DNP, METLIN e MassBank. Tais informações geradas a partir dessas análises permitiram sugerir possíveis compostos envolvidos na interação dos micro-organismos endofíticos mencionados. Foi sugerido que a fisostigmina, substância produzida pela actinobactéria S. albospinus RLe 7 e isolada nesse trabalho, poderia ter algum papel na inibição do crescimento do fungo C. boninense FLe 8.1 já que a inibição só foi observada quando cultivados ambos os micro-organismos na mesma placa de Petri. Porém, bioensaios com fisostigmina pura demonstraram que essa substância não possui atividade antifúngica per se, mas é possível que exista uma sinergia com outras substancias produzidas pela actinobactéria. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstram a importância do uso de técnicas de detecção muito sensíveis, como a ESI-MS, na identificação de substâncias envolvidas na troca metabólica e permitiram gerar informações que serão utilizadas em estudos futuros utilizando esses micro-organismos endofíticos. / There are several studies involving endophytic microorganisms, and more recently some studies evaluate microbial interaction resulting in metabolic profiles modifications. In this study, simple and mixed cultures of the fungus Colletotrichum boninense FLe 8.1 and the actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7 were carried out. These endophytic microorganisms, isolated from Lychnophora ericoides, belong to the collection of the Laboratory of Microbial Chemistry (LQMo) of the FCFRP-USP. The main goal of this work was to increase the bioactive compounds production capacities. Co-culture, or mixed culture, is a recent strategy for accessing microbial natural products. There are few reports of bioactive metabolites from S. albospinus RLe 7 and there are no one about secondary metabolites obtained from C. boninense FLe 8.1. Neither the actinobacteria nor the fungus have been described as endophytic microorganisms and there are no co-culture studies involving these microorganisms in order to obtain natural products. Joining and analyzing all together the generated information from several detection techniques, such as TLC, HPLCDAD, GC-MS, ESI-MS, NMR, it was possible to identify and attribute the chemical structures of some known natural, such as mevalonolactone, tyrosol, physostigmine and deferrioxamine E. ESI-MS was used for extracts analysis from cultures in parboiled rice medium, allowing visualization of compounds produced in very low yields. Besides that, it was possible to obtain metabolic profiles from cultures in Petri dishes, leading to the detection of metabolites in specific regions of the microbial interaction. Physostigmine and its N-ethylcarbamate analogue were identified as actinobacteria metabolites in the interaction against the fungus. Posterior analysis by MS/MS allowed to obtain fragmentation profiles, which together with the ions detected from the extracts analysis, were compared by searching in databases, such as DNP, METLIN and MassBank. Such information allowed to suggest possible candidates for the compounds involved in the microbial metabolic exchange. It was hypothesized that physostigmine, isolated from the actinobacteria in this work, had a role in the fungal growth inhibition observed when both microorganisms were co-cultured. However, this substance did not show considerable antifungal activity when tested against C. boninense FLe 8.1, but it is possible that other compounds produced by this actinobacteria are acting in a synergistic way. The results showed here demonstrated the importance of very sensitive techniques, as ESI-MS, in the identification of molecules involved in the microbial metabolic exchange and will help in the generation of information for future studies involving those endophytic microorganisms.