A mitoxantrona (MXT) é um antineoplásico utilizado no tratamento de tumores como leucemias, linfoma não-Hodgkin e câncer de mama e próstata. Ela é classificada como uma antracenodiona, sendo um análogo estrutural das antraciclinas, como a doxorrubicina (DOX), cujo mecanismo de ação é baseado na inibição da enzima topoisomerase II (Topo II), através da formação dos complexos estabilizados Topo II-DNA. As antraciclinas e a MXT também são capazes de formar lesões do tipo adutos, pontes intercadeias de DNA (interstrand crosslink – ICL) e espécies reativas de oxigênio (ERO). Estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (Nucleotide Excision Repair – NER) está envolvido na remoção de lesões no DNA induzidas pela DOX. Considerando as similaridades estruturais e de mecanismo de ação entre a MXT e a DOX, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da via NER na citotoxicidade da MXT, a fim de elucidar possíveis mecanismos envolvidos na resistência tumoral a esta droga. Os resultados encontrados demonstraram que células deficientes na via NER (XPA, XPD, XPC e CSB) apresentam elevada sensibilidade a MXT comparadas a células proficientes em reparo (MRC5). Apesar disso, células CSB (deficientes na subvia associada à transcrição - Transcription coupled – TCR-NER) são mais sensíveis a MXT que células XPC (deficientes na subvia de reparo global do genoma – Global genome repair – GGR-NER) e também apresentam diferenças no perfil de ciclo celular, síntese de DNA e formação dos complexos Topo II-DNA após tratamento com MXT. Células XPC, da mesma forma que as células proficientes MRC5 apresentam parada de ciclo celular em G2/M, recuperação da síntese de DNA e sinal semelhante para formação dos complexos Topo II-DNA, enquanto células CSB apresentam acúmulo de células na fase S, diminuição na síntese de DNA e sinal mais intenso para formação dos complexos Topo II-DNA. Além disso, a complementação das células CSB com a proteína CSB recuperou a resistência das células a MXT e também diminuiu a intensidade do sinal dos complexos Topo II-DNA. Estes resultados indicaram que a via NER está envolvida na resistência das células ao tratamento com MXT e que a proteína CSB ou a subvia TCR-NER tem um papel chave no processamento dos complexos Topo II-DNA. / Mitoxantrone (MXT) is an antineoplastic drug used in treatment of tumors like leukemia, non-Hodgkin lymphoma and breast and prostate cancer. It is classified as an anthracenedione, being a structural analogue of anthracyclines, like doxorubicin (DOX), which action mechanism is based on topoisomerase II (Topo II) inhibition and formation of stabilized Topo II-DNA complexes. Anthracyclines and MXT also can form lesions like DNA adducts, interstrand crosslinks (ICL) and reactive oxygen species (ROS). Studies have shown that nucleotide excision repair (NER) pathway is involved in removal of lesions induced by DOX. Due to structural and action mechanism similarities between MXT and DOX, the aim of this work was to evaluate the influence of NER pathway in cytotoxicity of MXT, in order to elucidate possible mechanisms involved in tumor resistance to this drug. The results demonstrated that NER-deficient cells (XPA, XPD, XPC and CSB) show high sensitivity to MXT compared to repair proficient cells (MRC5). However, CSB cells (deficient in Transcription coupled repair – TCR) were more sensitive to MXT than XPC cells (deficient in Global genome repair – GGR) and also showed differences in cell cycle, DNA synthesis and Topo II-DNA complexes formation upon MXT treatment. XPC cells, in the same way as MRC5 proficient cells present G2/M cell cycle arrest, DNA synthesis recovery and similar signal for Topo II-DNA complexes formation, while CSB cells present accumulation of cells in S phase, reduced DNA synthesis and a more intense signal for Topo II-DNA complexes formation. Moreover, CSB cells complementation recovery MXT-resistance and also diminished Topo II-DNA complexes signal intensity. These results indicate that NER pathway is involved in cells resistance to MXT treatment and that CSB protein or TCR-NER sub pathway has a key role in processing of MXT induced Topo II-DNA complexes.

Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é um Erro Inato do Metabolismo dos peroxissomos, que se caracteriza pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em fluidos e tecidos corporais. É causada por mutações no gene ABCD1, o qual codifica uma proteína responsável por transportar VLCFA do citosol para dentro do peroxissomo, para serem oxidados. Apesar dos mecanismos relacionados ao dano tecidual ainda não estarem bem elucidados, estudos vêm mostrando que o acúmulo de metabólitos tóxicos e o estresse oxidativo podem estar relacionados com a fisiopatologia da doença. Considerando que ainda não foi reportado dano ao DNA em pacientes X-ALD, e que muitos estudos vêm investigando as propriedades antioxidantes de N-acetil-L-cisteína (NAC), rosuvastatina (RSV) e trolox (TRO), os objetivos deste trabalho foram avaliar o dano ao DNA em HTZ e pacientes sintomáticos portadores de X-ALD, verificar o efeito in vitro de NAC, TRO e RSV sobre o dano ao DNA nestes pacientes, estudar associações entre o dano ao DNA e a peroxidação lipídica e, por fim, investigar a capacidade da NAC em aumentar, in vitro, os níveis de glutationa (GSH) e sulfidrila nos pacientes X-ALD. Não foi verificada diferença significativa no dano ao DNA em mulheres HTZ, quando comparado a controles. Em contraste, pacientes sintomáticos apresentaram um maior índice de dano ao DNA comparado às HTZ e ao grupo controle. No ensaio in vitro, foi observado que os antioxidantes NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) e RSV (0,5; 2 e 5 μM) foram capazes de reduzir o dano ao DNA em pacientes sintomáticos a níveis de controle. Além disso, observamos uma correlação positiva entre o dano ao DNA e o nível de isoprostanos urinários (biomarcador de dano a lipídios), o que nos permite inferir que o dano ao DNA poderia estar sendo causado por processos oxidativos em pacientes sintomáticos. Verificou-se também que os conteúdos de glutationa eritrocitária e sulfidrila plasmática estavam diminuídos em pacientes X-ALD (independentemente do fenótipo) e que 5 mM de NAC, in vitro, foi capaz de aumentar estes parâmetros a níveis de controle saudáveis. O presente trabalho fornece evidências experimentais de que há dano ao DNA em pacientes X-ALD, os quais possuem níveis diminuídos de GSH e sulfidrila, e que a administração dos antioxidantes NAC, TRO e RSV poderia ser considerada uma terapia adjuvante no tratamento da X-ALD. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inborn error of peroxisome metabolism which is characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in tissue and body fluids. It is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes a protein responsible for transporting VLCFA from cytosol to peroxisomes to be oxidized. Although the mechanisms underlying tissue damage are still poor understood, studies have been shown that the accumulation of toxic metabolites and oxidative stress may be related to the pathophysiology of X-ALD. Considering that DNA damage was not reported in X-ALD patients yet, and that former studies have been investigated the antioxidant properties of N-acetyl-L-cistein (NAC), rosuvastatin (RSV) and trolox (TRO), the aims of this study were to evaluate DNA damage in HTZ and symptomatic X-ALD patients, to study the in vitro effect of NAC, TRO and RSV on DNA damage in these patients, to look for associations between DNA damage and lipid peroxidation and to verify the ability of NAC in increasing, in vitro, glutathione (GSH) and sulfhydryl levels on X-ALD patients. It was verified no significant difference on DNA damage in HTZ women when compared to controls. In contrast, symptomatic patients presented higher DNA damage levels, compared to HTZ and control group. In the vitro assay, it was observed that the antioxidants NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) and RSV (0,5; 2 e 5 μM) were able to reduce DNA damage in symptomatic patients until control levels. Likewise, our results showed positive correlation between DNA damage and urinary isoprostanes (biomarker of lipid damage), allowing us to hypothesize that DNA damage might be caused by oxidative processes in symptomatic patients. It was also verified that the plasmatic sulfhydryl content and erythrocyte glutathione levels were decreased in X-ALD patients (regardless of the phenotype) and that 5mM of NAC in vitro was able to increase these parameters until control levels. The present work yields experimental evidence that DNA damage occurs in X-ALD patients, which have GSH and sulfhydryl levels reduced and that the administration of the NAC, TRO and RSV antioxidants might be considered as an adjuvant therapy for X-ALD.

Introdução: A Esteato-Hepatite Não-Alcoólica (EHNA) é uma doença com alta incidência, difícil diagnóstico e tratamentos ainda não efetivos, o que impulsiona a utilização de modelos experimentais para indução da EHNA e o estudo das rotas de desenvolvimento desta doença, bem como tentativas de tratamento. Objetivo: Tem-se como objetivo desenvolver um modelo experimental de EHNA a partir do uso de uma dieta deficiente de metionina e colina (MCD) fabricada no Brasil, avaliar as alterações hepáticas, o estresse oxidativo, os danos ao DNA e os parâmetros moleculares de inflamação e fibrose decorrentes da doença, bem como avaliar a modulação resultante da suplementação do flavonóide antioxidante quercetina (Q). Métodos: Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6 com 8 semanas. No primeiro experimento, que visou estabelecer o modelo experimental de EHNA, os animais foram divididos em dois grupos (n=15), onde um grupo foi alimentado com dieta MCD e o outro com dieta controle no período de duas semanas. No segundo experimento, utilizaram-se quatro grupos (n = 16): (i) controle + veículo (ração controle com carboximetilcelulose sódica a 1%, usada como veículo, CO + V), (ii) ração controle mais Q 50 mg / kg administrada intragastricamente (CO + Q), (iii) dieta MCD mais veículo (EHNA + V), e (iv) dieta MCD mais Q (EHNA + Q). As dietas foram administradas por 4 semanas e avaliou-se as alterações bioquímicas hepáticas, a repercussão histopatológica e imuno-histoquímica, a lipoperoxidação e as enzimas antioxidantes, os danos causado ao DNA por ensaio cometa, bem como, os parâmetros moleculares de inflamação e fibrose através da avaliação de mRNA de TNF-α, HMGB-1, COX-2, CTGF, TGF-β, MMP-9 e AREG por RT-PCR, e a expressão proteíca de TLR-4, JNK e pJNK por Western blotting, avaliando-se o efeito da suplementação do flavonóide antioxidante Q. Resultados: Os camundongos que receberam a dieta MCD apresentaram perda de peso e aumento significativo das enzimas de integridade hepática e diminuição dos níveis bioquímicos sistêmicos de glicemia, triglicerídeos, colesterol total, HDL e VLDL. Todos os animais EHNA mostraram, pelo menos, algum grau de esteatose macrovesicular. O diagnóstico de EHNA foi realizado em 100% dos camundongos que receberam a dieta MCD e nenhum dos animais que recebeu dieta controle apresentou alterações histológicas. Os animais EHNA apresentaram aumento de lipoperoxidação e do antioxidante glutationa (GSH). O ensaio cometa revelou um aumento significativo nos danos de DNA no fígado do grupo EHNA + V em comparação com CO + V. O grupo EHNA + Q mostrou danos ao DNA significativamente menores do que EHNA + V e uma significativa diminuição do processo inflamatório através da avaliação da expressão de: TNF-α, HMGB1, TLR-4, a COX-2 e JNK e na fibrose pela expressão de CTGF, TGF-β, MMP-9 e AREG no fígado. Conclusão: A dieta deficiente de metionina e colina induziu no fígado de camundongos C57BL/6 características histopatológicas semelhantes à esteatose e à esteato-hepatite de humanos. A suplementação com o flavonoide antioxidante quercetina (50 mg / kg) reduziu os níveis de lipoperoxidação, os danos ao DNA no fígado, os níveis enzimáticos hepáticos, bem como os níveis dos parâmetros moleculares inflamatórios e de fibrose estudados, sugerindo proteção hepática neste modelo. / Introduction: Non-alcoholic steatohepatitis is a disease with a high incidence, difficult diagnosis, and yet no effective treatment. This reasons lead to the use of experimental models for induction of NASH, and the study of routes developing this disease, as well as attempts to a effective therapy. Aims: This study was designed to develop an experimental model of non-alcoholic steatohepatitis based on a methionine- and choline-deficient diet which is manufactured in Brazil. Furthermore, evaluate the liver alterations, oxidative stress parameters, lipoperoxidation, DNA damage, and the molecular parameters of inflammatory and fibrosis, as well as the response to the antioxidant flavonoid quercetin (Q). Methods: Male C57BL/6 mice were used with 8 weeks of age. In the first experiment, which aimed to establish an experimental model of NASH, the animals were divided into two groups (n = 15), the experimental group fed with a methionine- and choline-deficient diet manufactured by Brazilian company PragSoluções®, and the control group fed with a normal diet, for a period of 2 weeks. In the second experiment, we used four groups (n = 16): (i) Control plus Vehicle (control ration plus carboxymethylcellulose 1% used as vehicle, CO + V); (ii) Control ration plus Q 50 mg/kg (CO + Q); (iii) MCD diet plus vehicle (NASH + V); and (iv) MCD diet plus Q (NASH + Q). Diets were administered for 4 weeks, which aimed to evaluate the hepatic biochemical changes, the histopathological impact and immunohistochemical analysis, lipid peroxidation and antioxidant enzymes, the damage caused to DNA, and the molecular parameters of inflammation and fibrosis by assessment of mRNA of TNF-α, HMGB-1, COX-2, CTGF, TGF-β, MMP-9 and AREG by RT-PCR Protein expression and TLR-4, pJNK and JNK by Western blotting to assess the effects of supplementation of the antioxidant flavonoid Q. Results: The mice that received the methionine- and choline-deficient diet showed weight loss and significant increase in hepatic damage enzymes, as well as a decrease on systemic levels of glycemia, triglycerides, total cholesterol, HDL and VLDL. The diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis was performed in 100% of the mice that were fed the methionine- and choline-deficient diet. All non-alcoholic steatohepatitis animals showed some degree of macrovesicular steatosis, ballooning, and inflammatory process. None of the animals which were fed with the control diet presented histological alterations. All non-alcoholic steatohepatitis animals showed significantly increased lipoperoxidation and antioxidant GSH activity. The comet assay revealed a significant increase in DNA damage in the NASH + V group, in comparison to CO + V. The NASH + Q group showed significantly lower DNA damage than NASH + V. The NASH+Q group showed a significant reduction of inflammation based on the expression of TNF-α, HMGB1, TLR-4, COX-2 and JNK and a reduction in fibrosis based on the expression of CTGF, TGF-β, MMP-9 and AREG in the liver. Conclusion: The low cost and easily accessible methionine- and choline-deficient diet explored in this study is highly effective in inducing steatosis and steatohepatitis in animal model, leading to alterations that are similar to those observed in human livers. The results demonstrate that an antioxidant supplementation of Q 50 mg / kg reduced the levels of lipid peroxidation, DNA damage, liver enzymes, as well as the levels of inflammation and fibrosis in the liver, suggesting protective effects of the liver in this model.

Benzo[a]pireno (BaP) é um contaminante ambiental formado durante a combustão incompleta ou pirólise de material orgânico. O papel do BaP como um potente agente mutagênico e carcinogênico está bem definido, no entanto, poucos estudos foram publicados relacionados aos efeitos neurotóxicos provocados por este composto. Devido a presença de BaP como contaminante de alimentos e água, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da administração subcrônica oral de BaP, nas concentrações de 1 mg/kg e 2 mg/kg, em ratos machos e fêmeas sobre parâmetros comportamentais (atividade locomotora e memória de reconhecimento de objetos), dano ao DNA através do ensaio cometa, medida do conteúdo e secreção da proteína S100B, medida de GFAP e alterações na via das MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 and p38MAPK). As duas doses utilizadas neste estudo são equivalentes aos níveis de contaminação em fumantes, consumidores de grandes quantidades de produtos como carne defumada, grelhados e peixes, ou mesmo em indivíduos com alta exposição ocupacional. Como resultados, encontramos, que a atividade locomotora aumentou nos animais tratados com BaP, tanto os machos como as fêmeas. No teste de reconhecimento de objetos, os machos apresentaram um déficit na memória de curta duração, memória esta não testada no grupo das fêmeas. O dano ao DNA foi significativamente maior nos animais tratados com BaP, onde foi observado danos de classe três e quatro, os mais graves. No imunoconteúdo de GFAP os animais tratados com BaP apresentaram uma tendência de aumento de astrogliose hipocampal, que provavelmente poderá ser confirmada se aumentarmos o tempo de administração. A secreção de S100B apresentou-se alterada tanto no líquor quanto no soro, a qual pode atuar tanto na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, quanto em diversas doenças neurodegenerativas. Foi observado também alteração na via das MAPKs, onde o tratamento com BaP diminuiu a fosforilação da ERK2 hipocampal, não alterando as demais testadas. O BaP foi capaz de induzir danos ao DNA, alterar a atividade locomotora, prejudicar a memória e alterar parâmetros neuroquímicos dos animais, mesmo em uma concentração encontrada como contaminante de alimentos e água, apontando para a necessidade de uma legislação mais eficiente para este composto, visto que pode acarretar sérios problemas à saúde. / Benzo[a]pyrene (BaP) is an environmental contaminant formed during incomplete combustion or pyrolysis of organic material. The role of the BaP as a potent mutagenic and carcinogenic agent is well defined; however, few studies have been published related to the neurotoxic effects of BaP. Due to the presence of BaP as a contaminant of food and water, the objective of this study was to investigate the effects of subchronic oral administration of BaP, concentrations of 1mg/kg and 2mg/kg, in male and female rats on behavioral parameters (locomotor activity and object recognition memory), DNA damage through comet assay, as the content and secretion of S100B, measure of GFAP and changes in the pathway of MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 and p38MAPK). The two doses used in this study are equivalent to the contamination levels in smokers, consumers of large quantities of products such as smoked meat, grilled meats and fish, or even in individuals with high occupational exposure. As a result, there was an increased locomotor activity in both males and females treated with BaP. In the object recognition test, males showed a deficit in short-term memory. This parameter was not tested in the group of females. The DNA damage index, evaluated by the nucleus fragment migration (DNA grade 1-4) was significantly increased in animals treated with BaP, due to the nigher presence of grade 3-4 of DNA tail lengh. In immunocontent GFAP, animals treated with BaP showed a trend of increased astrogliosis hippocampal, which can probably be confirmed if we increase the time of administration. The secretion of S100B showed changed both in serum and cerebrospinal fluid, which can act in neuron-astrocyte signaling in physiological or pathological conditions, and in various neurodegenerative diseases. It was also observed changes in the MAPK pathway, whereas treatment with BaP decreased the phosphorylation of ERK2 hippocampal, without altering the others tested. BaP was able to induce DNA damage, alteration of locomotor activity, impair memory, and changes neurochemical parameters of the animals, even at a concentration found as a contaminant of food and water, pointing to the need for legislation more efficient for this compound, since it can cause serious health problems.

Introdução: A Esteato-Hepatite Não-Alcoólica (EHNA) é uma doença com alta incidência, difícil diagnóstico e tratamentos ainda não efetivos, o que impulsiona a utilização de modelos experimentais para indução da EHNA e o estudo das rotas de desenvolvimento desta doença, bem como tentativas de tratamento. Objetivo: Tem-se como objetivo desenvolver um modelo experimental de EHNA a partir do uso de uma dieta deficiente de metionina e colina (MCD) fabricada no Brasil, avaliar as alterações hepáticas, o estresse oxidativo, os danos ao DNA e os parâmetros moleculares de inflamação e fibrose decorrentes da doença, bem como avaliar a modulação resultante da suplementação do flavonóide antioxidante quercetina (Q). Métodos: Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6 com 8 semanas. No primeiro experimento, que visou estabelecer o modelo experimental de EHNA, os animais foram divididos em dois grupos (n=15), onde um grupo foi alimentado com dieta MCD e o outro com dieta controle no período de duas semanas. No segundo experimento, utilizaram-se quatro grupos (n = 16): (i) controle + veículo (ração controle com carboximetilcelulose sódica a 1%, usada como veículo, CO + V), (ii) ração controle mais Q 50 mg / kg administrada intragastricamente (CO + Q), (iii) dieta MCD mais veículo (EHNA + V), e (iv) dieta MCD mais Q (EHNA + Q). As dietas foram administradas por 4 semanas e avaliou-se as alterações bioquímicas hepáticas, a repercussão histopatológica e imuno-histoquímica, a lipoperoxidação e as enzimas antioxidantes, os danos causado ao DNA por ensaio cometa, bem como, os parâmetros moleculares de inflamação e fibrose através da avaliação de mRNA de TNF-α, HMGB-1, COX-2, CTGF, TGF-β, MMP-9 e AREG por RT-PCR, e a expressão proteíca de TLR-4, JNK e pJNK por Western blotting, avaliando-se o efeito da suplementação do flavonóide antioxidante Q. Resultados: Os camundongos que receberam a dieta MCD apresentaram perda de peso e aumento significativo das enzimas de integridade hepática e diminuição dos níveis bioquímicos sistêmicos de glicemia, triglicerídeos, colesterol total, HDL e VLDL. Todos os animais EHNA mostraram, pelo menos, algum grau de esteatose macrovesicular. O diagnóstico de EHNA foi realizado em 100% dos camundongos que receberam a dieta MCD e nenhum dos animais que recebeu dieta controle apresentou alterações histológicas. Os animais EHNA apresentaram aumento de lipoperoxidação e do antioxidante glutationa (GSH). O ensaio cometa revelou um aumento significativo nos danos de DNA no fígado do grupo EHNA + V em comparação com CO + V. O grupo EHNA + Q mostrou danos ao DNA significativamente menores do que EHNA + V e uma significativa diminuição do processo inflamatório através da avaliação da expressão de: TNF-α, HMGB1, TLR-4, a COX-2 e JNK e na fibrose pela expressão de CTGF, TGF-β, MMP-9 e AREG no fígado. Conclusão: A dieta deficiente de metionina e colina induziu no fígado de camundongos C57BL/6 características histopatológicas semelhantes à esteatose e à esteato-hepatite de humanos. A suplementação com o flavonoide antioxidante quercetina (50 mg / kg) reduziu os níveis de lipoperoxidação, os danos ao DNA no fígado, os níveis enzimáticos hepáticos, bem como os níveis dos parâmetros moleculares inflamatórios e de fibrose estudados, sugerindo proteção hepática neste modelo. / Introduction: Non-alcoholic steatohepatitis is a disease with a high incidence, difficult diagnosis, and yet no effective treatment. This reasons lead to the use of experimental models for induction of NASH, and the study of routes developing this disease, as well as attempts to a effective therapy. Aims: This study was designed to develop an experimental model of non-alcoholic steatohepatitis based on a methionine- and choline-deficient diet which is manufactured in Brazil. Furthermore, evaluate the liver alterations, oxidative stress parameters, lipoperoxidation, DNA damage, and the molecular parameters of inflammatory and fibrosis, as well as the response to the antioxidant flavonoid quercetin (Q). Methods: Male C57BL/6 mice were used with 8 weeks of age. In the first experiment, which aimed to establish an experimental model of NASH, the animals were divided into two groups (n = 15), the experimental group fed with a methionine- and choline-deficient diet manufactured by Brazilian company PragSoluções®, and the control group fed with a normal diet, for a period of 2 weeks. In the second experiment, we used four groups (n = 16): (i) Control plus Vehicle (control ration plus carboxymethylcellulose 1% used as vehicle, CO + V); (ii) Control ration plus Q 50 mg/kg (CO + Q); (iii) MCD diet plus vehicle (NASH + V); and (iv) MCD diet plus Q (NASH + Q). Diets were administered for 4 weeks, which aimed to evaluate the hepatic biochemical changes, the histopathological impact and immunohistochemical analysis, lipid peroxidation and antioxidant enzymes, the damage caused to DNA, and the molecular parameters of inflammation and fibrosis by assessment of mRNA of TNF-α, HMGB-1, COX-2, CTGF, TGF-β, MMP-9 and AREG by RT-PCR Protein expression and TLR-4, pJNK and JNK by Western blotting to assess the effects of supplementation of the antioxidant flavonoid Q. Results: The mice that received the methionine- and choline-deficient diet showed weight loss and significant increase in hepatic damage enzymes, as well as a decrease on systemic levels of glycemia, triglycerides, total cholesterol, HDL and VLDL. The diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis was performed in 100% of the mice that were fed the methionine- and choline-deficient diet. All non-alcoholic steatohepatitis animals showed some degree of macrovesicular steatosis, ballooning, and inflammatory process. None of the animals which were fed with the control diet presented histological alterations. All non-alcoholic steatohepatitis animals showed significantly increased lipoperoxidation and antioxidant GSH activity. The comet assay revealed a significant increase in DNA damage in the NASH + V group, in comparison to CO + V. The NASH + Q group showed significantly lower DNA damage than NASH + V. The NASH+Q group showed a significant reduction of inflammation based on the expression of TNF-α, HMGB1, TLR-4, COX-2 and JNK and a reduction in fibrosis based on the expression of CTGF, TGF-β, MMP-9 and AREG in the liver. Conclusion: The low cost and easily accessible methionine- and choline-deficient diet explored in this study is highly effective in inducing steatosis and steatohepatitis in animal model, leading to alterations that are similar to those observed in human livers. The results demonstrate that an antioxidant supplementation of Q 50 mg / kg reduced the levels of lipid peroxidation, DNA damage, liver enzymes, as well as the levels of inflammation and fibrosis in the liver, suggesting protective effects of the liver in this model.

Benzo[a]pireno (BaP) é um contaminante ambiental formado durante a combustão incompleta ou pirólise de material orgânico. O papel do BaP como um potente agente mutagênico e carcinogênico está bem definido, no entanto, poucos estudos foram publicados relacionados aos efeitos neurotóxicos provocados por este composto. Devido a presença de BaP como contaminante de alimentos e água, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da administração subcrônica oral de BaP, nas concentrações de 1 mg/kg e 2 mg/kg, em ratos machos e fêmeas sobre parâmetros comportamentais (atividade locomotora e memória de reconhecimento de objetos), dano ao DNA através do ensaio cometa, medida do conteúdo e secreção da proteína S100B, medida de GFAP e alterações na via das MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 and p38MAPK). As duas doses utilizadas neste estudo são equivalentes aos níveis de contaminação em fumantes, consumidores de grandes quantidades de produtos como carne defumada, grelhados e peixes, ou mesmo em indivíduos com alta exposição ocupacional. Como resultados, encontramos, que a atividade locomotora aumentou nos animais tratados com BaP, tanto os machos como as fêmeas. No teste de reconhecimento de objetos, os machos apresentaram um déficit na memória de curta duração, memória esta não testada no grupo das fêmeas. O dano ao DNA foi significativamente maior nos animais tratados com BaP, onde foi observado danos de classe três e quatro, os mais graves. No imunoconteúdo de GFAP os animais tratados com BaP apresentaram uma tendência de aumento de astrogliose hipocampal, que provavelmente poderá ser confirmada se aumentarmos o tempo de administração. A secreção de S100B apresentou-se alterada tanto no líquor quanto no soro, a qual pode atuar tanto na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, quanto em diversas doenças neurodegenerativas. Foi observado também alteração na via das MAPKs, onde o tratamento com BaP diminuiu a fosforilação da ERK2 hipocampal, não alterando as demais testadas. O BaP foi capaz de induzir danos ao DNA, alterar a atividade locomotora, prejudicar a memória e alterar parâmetros neuroquímicos dos animais, mesmo em uma concentração encontrada como contaminante de alimentos e água, apontando para a necessidade de uma legislação mais eficiente para este composto, visto que pode acarretar sérios problemas à saúde. / Benzo[a]pyrene (BaP) is an environmental contaminant formed during incomplete combustion or pyrolysis of organic material. The role of the BaP as a potent mutagenic and carcinogenic agent is well defined; however, few studies have been published related to the neurotoxic effects of BaP. Due to the presence of BaP as a contaminant of food and water, the objective of this study was to investigate the effects of subchronic oral administration of BaP, concentrations of 1mg/kg and 2mg/kg, in male and female rats on behavioral parameters (locomotor activity and object recognition memory), DNA damage through comet assay, as the content and secretion of S100B, measure of GFAP and changes in the pathway of MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 and p38MAPK). The two doses used in this study are equivalent to the contamination levels in smokers, consumers of large quantities of products such as smoked meat, grilled meats and fish, or even in individuals with high occupational exposure. As a result, there was an increased locomotor activity in both males and females treated with BaP. In the object recognition test, males showed a deficit in short-term memory. This parameter was not tested in the group of females. The DNA damage index, evaluated by the nucleus fragment migration (DNA grade 1-4) was significantly increased in animals treated with BaP, due to the nigher presence of grade 3-4 of DNA tail lengh. In immunocontent GFAP, animals treated with BaP showed a trend of increased astrogliosis hippocampal, which can probably be confirmed if we increase the time of administration. The secretion of S100B showed changed both in serum and cerebrospinal fluid, which can act in neuron-astrocyte signaling in physiological or pathological conditions, and in various neurodegenerative diseases. It was also observed changes in the MAPK pathway, whereas treatment with BaP decreased the phosphorylation of ERK2 hippocampal, without altering the others tested. BaP was able to induce DNA damage, alteration of locomotor activity, impair memory, and changes neurochemical parameters of the animals, even at a concentration found as a contaminant of food and water, pointing to the need for legislation more efficient for this compound, since it can cause serious health problems.

A dieta de restrição calórica (RC) tem apresentado efeitos que diminuem a progressão, ou previnem completamente, uma variedade de doenças associadas com o envelhecimento, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neurodegenerativas. O prejuízo da função celular astroglial, incluindo captação de glutamato, atividade da glutamina sintetase (GS) e secreção de S100B, além de parâmetros de estresse oxidativo alterados podem contribuir para a progressão de doenças neurológicas. Este estudo objetivou avaliar alterações astrocíticas hipocampais em resposta à RC, medindo parâmetros astrogliais, tais como: captação de glutamato, atividade da GS e imunoconteúdo de GFAP e S100B. Nós investigamos também, os efeitos da RC nos parâmetros hipocampais (Hc) e corticais cerebrais (Cx) de estresse oxidativo e de comportamento em ratos Wistar machos. Parâmetros bioquímicos sanguíneos também foram avaliados. Os ratos (60 dias de idade) foram alimentados com dieta ad libitum ou com RC por 12 semanas. Os animais do grupo RC apresentaram um ganho de peso menor, de aproximadamente 16% em relação ganho de peso do grupo controle. A RC induziu um aumento significativo (23%) na captação de glutamato e na atividade da GS (26%). Não houve diferença significativa no imunoconteúdo de S100B ou GFAP. Os parâmetros bioquímicos avaliados não diferiram entre os grupos, indicando bom estado de saúde. Além disso, a RC não alterou parâmetros de ansiedade, mas aumentou significativamente a atividade locomotora, elevou os níveis de GSH e diminuiu a atividade de GPx, diminuiu a produção de ERO. Além disso, não alterou a peroxidação lipídica, conteúdo de óxido nítrico e a atividade da catalase. A RC também diminuiu o nível basal de dano oxidativo ao DNA, medido pelo ensaio cometa. Em resumo, este estudo indica que a RC modula as funções astrocíticas, através do aumento da captação de glutamato e da atividade da GS, sugerindo que a dieta pode exercer seus efeitos neuroprotetores contra patologias do SNC através da modulação destas funções. A RC também pode induzir a modulação hipocampal e cortical cerebral, resultando em alterações metabólicas, que por sua vez, melhoram as condições basais de importantes parâmetros de defesa celular, como por exemplo, o aumento dos níveis de GSH e diminuição do dano oxidativo ao DNA. / The dietary caloric restriction (CR) has been shown to slow the progression of, or even prevent entirely, a range of age-dependent pathologies, including cardiovascular disease, diabetes and neurodegenerative diseases. The impairment of astroglial cell function, including glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and S100B secretion, besides oxidative stress parameters altered, may contribute to the progression of neurological disorders. The present study aimed to evaluate hippocampal astrocytic changes in response to CR diet, measuring astroglial parameters, such as glutamate uptake, GS activity and the immunocontent of GFAP and S100B. We investigated also the effects of CR on hippocampal (Hc) and cerebral cortical (Cx) oxidative stress and behavioral parameters in male Wistar rats. Blood biochemical parameters were also analyzed. Rats (60-day old) were fed ad libitum or on CR diets for 12 weeks. CR-fed rats showed approximately 16% less body weight gain than control rats. The CR diet was able to induce a significant increase in glutamate uptake (23%) and in GS activity (26%). There were no statistically significant differences in the immunocontent of either GFAP or S100B. No differences were observed in the biochemistry parameters evaluated, indicating normal healthy. CR did not alter anxiety parameters but increased locomotion performance; increased glutathione content; decreased glutathione peroxidase activity; decreased reactive oxygen species production and did not altered lipid peroxidation, nitric oxide content and catalase activity. Also, CR diet decreased basal DNA damage index, measured by comet assay. In summary, the present study indicates that CR modulates astrocyte functions by increasing glutamate uptake and GS activity, suggesting that CR might exert its neuroprotective effects against brain illness by modulation of astrocytic functions. The CR diet also induced hippocampal and cerebral cortical modulation, resulting in metabolic changes which in turn improve the basal status of important parameters of cellular defenses, such as the increased glutathione content and decreased DNA damage.

O dano ao ADN pode estar associado com o diabetes mellitus tipo II (T2DM) e suas complicações, incluindo estresse oxidativo. Os parâmetros bioquímicos relacionados com o metabolismo glicídico (glicose, insulina, TTG e TSI) e parâmetros corporais (peso corporal, tecido adiposo) foram avaliados após 12 meses de tratamento com dieta hiperlipídica e dieta hiperlipídica aquecida. Após o período experimental, os ratos tratados com dietas hiperlipídicas obtiveram aumento de peso corporal e aumento de glicemia e insulinemia quando comparado ao grupo controle normolipídico. A dieta hiperlipídica (HFD) e a dieta hiperlipídica aquecida (HFTD) também levaram a uma redução na sensibilidade à insulina e na tolerância à glicose, independentemente dos tempos estudados. Interessantemente, somente os animais submetidos à dieta aquecida demonstraram redução na oxidação de glicose pelo tecido adiposo epididimal. Mostramos que ambas as dietas hiperlipídicas tem a capacidade de reduzir a síntese de glicogênio pelas vias, direta e indireta. A dieta aquecida acarretou um aumento significativo na peroxidação lipídica no fígado em relação aos demais grupos. Utilizando o ensaio cometa, verificamos um aumento significativo de dano ao ADN em sangue e hipocampo dos ratos submetidos às dietas hiperlipídicas, tendo o grupo HFTD aumento maior em relação ao HFD. Estes resultados sugerem que uma correlação positiva entre dieta hiperlipídica, alteração no metabolismo glicídico, estresse oxidativo e dano ao ADN. Contudo, o aquecimento da dieta parece agravar tais resultados. / Many studies have demonstrated that DNA damage may be associated with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and its complications. The goal of this study was to evaluate the effects of the potential relationship between fat (thermolyzed) intake, glucose dyshomeostasis and DNA injury in rats. Biochemical parameters related to glucose metabolism (i.e., blood glucose levels, insulin tolerance tests, glucose tolerance tests and fat cell glucose oxidation) and general health parameters (i.e., body weight, retroperitoneal and epididymal adipose tissue) were evaluated in rats after a 12-month treatment with either a high fat or a high thermolyzed fat diet. The high fat diet (HFD) and high fat thermolyzed diet (HFTD) showed increased body weight and impaired insulin sensitivity at the studied time-points in insulin tolerance test (ITT) and glucose tolerance test (GTT). Interestingly, only animals subjected to the HFTD diet showed decreased epididymal fat cell glucose oxidation. We show which high fat diets have the capacity to reduce glycogen synthesis by direct and indirect pathways. HFTD promoted an increase in lipid peroxidation in the liver, demonstrating significant damage in lipids in relation to other groups. Blood and hippocampus DNA damage was significantly higher in animals subjected to HFDs, and the highest damage was observed in animals from the HFTD group. Striatum DNA damage was significantly higher in animals subjected to HFDs, compared with the control group. These results show a positive correlation between high fat diet, glucose dyshomeostasis, oxidative stress and DNA damage.

Muitas evidências indicam que exposições a eventos adversos no início da vida, como abuso e negligência, aumentam a vulnerabilidade a psicopatologias na vida adulta. Além disso, psiquiatras infantis têm sugerido que o ambiente da relação mãe-filho nas fases iniciais da vida pode mais tarde afetar fortemente o desenvolvimento mental e influenciar a taxa de prevalência de vários transtornos psiquiátricos, incluindo o Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT). Periódicas separações maternas no período neonatal têm sido usadas por vários estudiosos como um modelo animal de eventos adversos no início da vida, avaliando-se seus efeitos sobre aspectos comportamentais e fisiológicos observados na vida adulta. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se repetidas ações de separação materna podem tornar os animais mais susceptíveis aos efeitos de um estresse agudo na vida adulta como o modelo de TEPT, alterando diferentes aspectos como os comportamentais e neuroquímicos. Ratos Wistar foram sujeitos a repetidas separações maternas nos dia 1 ao 10 do período neonatal. Quando adultos esses animais foram submetidos ao modelo de TEPT, consistindo da exposição a um choque inescapável nas patas seguido pelos recordatórios situacionais. Na primeira parte do trabalho foram usados ratos machos e fêmeas. Foram observados efeitos duradouros em ambas as intervenções. A exposição ao choque aumentou o medo condicionado. Também houve um aumento do comportamento do tipo ansioso, mas a atividade exploratória foi diminuída por ambos os tratamentos e esses efeitos foram mais robustos em machos. Adicionalmente, o nível basal de corticosterona plasmática estava diminuído, paralelamente aos níveis observados em pacientes com TEPT. Os níveis da proteína S100B plasmática e central também foram avaliados. Os níveis plasmáticos foram correlacionados com os efeitos observados no comportamento do tipo ansioso, aumentado nos ratos machos expostos ao choque e não apresentando efeito nas fêmeas. No líquido cefalorraquidiano, os níveis da proteína S100B estavam aumentados nas fêmeas submetidas à separação materna no período neonatal. Esses resultados sugerem que, em ratos, experiências estressantes no início da vida como a separação materna podem agravar alguns efeitos da exposição a um estressor na idade adulta e que esses efeitos são sexo-específicos. Na segunda parte desse trabalho somente foram usados ratos machos. Os animais foram expostos a uma tarefa para avaliar a memória e uma semana depois da análise comportamental os animais foram sacrificados e avaliou-se o índice de dano ao ADN hipocampal e a atividade de enzimas antioxidantes. Na análise da memória espacial através da tarefa do Labirinto Aquático de Morris os animais somente submetidos ao choque (modelo de TEPT) e os animais que foram separados no período neonatal e também submetidos ao choque na idade adulta apresentaram prejuízo nessa tarefa permanecendo mais tempo no quadrante oposto no dia do teste. Na análise do dano ao ADN através da técnica do Ensaio Cometa, os animais que foram submetidos à separação materna ou ao choque apresentaram maiores índices de dano ao ADN hipocampal. Não houve diferença significativa entre os grupos quanto às atividades das enzimas antioxidantes Superóxido Dismutase, Glutationa Peroxidade e Catalase. A separação maternal aumentou a susceptibilidade ao estresse na idade adulta (modelo de TEPT) quanto ao parâmetro cognitivo avaliado. Tanto a separação materna quanto a aplicação do choque na idade adulta foram suficientes para causar aumentos no dano ao ADN hipocampal, mas a separação não causou um aumento adicional no dano ao ADN. Possivelmente alterações neuroendocrinológicas relacionadas com a resposta a esses estresses esteja mediando tais mudanças no hipocampo e conseqüentemente alterando o desempenho na tarefa que avaliou a memória. Concluindo, a separação materna no início da vida tornou os animais mais susceptíveis a um estressor considerando os parâmetros ansiedade e memória espacial e esses efeitos parecem ser dependentes do gênero. / A large body of evidences indicates that exposure to early adverse life events in the form of childhood neglect and abuse can increase vulnerability to psychopathology in adult life. In addition, child psychiatrists have reported that the mother-child relationship and fostering environment in early childhood strongly affect later mental development and influence the prevalence rate of various psychiatric disorders including Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD). Periodic neonatal maternal separation in the rat has been used by several investigators as a rodent model of the effects of early adverse life events on adult physiology and behavior. Therefore, the purpose of the present study was to verify if repeated long-term maternal separation would affect performance in different parameters including behavior and neurochemistry. Wistar rats were subjected to repeated maternal separation during post-natal days 1-10. When adults, rats were submitted to a PTSD model consisting of exposure to inescapable footshock, followed by situational reminders. In the first part of this work rats of both sexes were used. We observed long-lasting effects of both interventions. Exposure to shock increased fear conditioning. Anxiety-like behavior was increased and exploratory activity decreased by both treatments, and these effects were more robust in males. Additionally, basal corticosterone in plasma was decreased, paralleling effects observed in PTSD patients. Levels of S100B protein in serum and cerebrospinal fluid (CSF) were measured. Levels in serum were correlated with the effects observed in anxiety-like behavior, increasing in males exposed to shock, and presenting no effect in females. S100B in CSF was increased in females submitted to maternal separation during the neonatal period. These results suggest that, in rats, an early stress experience such as maternal separation may aggravate some effects of exposure to a stressor during adult age, and that this effect is sex-specific. In the second part of this work the animals were exposed to a task to evaluate spatial memory and one week after the behavioral task animals were sacrificed and DNA damage and antioxidant enzymes activities in hippocampus were measured. Only male rats were used in the second part of this work. We observed that both treatments, maternal separation during the first 10 days of life and exposure to a stressful event in adult life, presented important effects on memory and DNA damage in hippocampus. No differences were found in oxidative parameters. In this work rats exposed to shock and maternal separation plus shock presented long-lasting effects on spatial memory associated with impairments in learning and memory (they spent more time in the opposite quadrant in water maze task). Rats subjected to shock or maternal separation exhibited a higher score of DNA damage in hippocampus. Concluding, our findings showed that early adverse life events alter the susceptibility to the effects of a stressor applied in adulthood in anxiety and cognitive parameters such as spatial memory. These effects were probably sex-specific. Besides, both treatments were able to induce increased index of DNA damage.

Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é um Erro Inato do Metabolismo dos peroxissomos, que se caracteriza pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em fluidos e tecidos corporais. É causada por mutações no gene ABCD1, o qual codifica uma proteína responsável por transportar VLCFA do citosol para dentro do peroxissomo, para serem oxidados. Apesar dos mecanismos relacionados ao dano tecidual ainda não estarem bem elucidados, estudos vêm mostrando que o acúmulo de metabólitos tóxicos e o estresse oxidativo podem estar relacionados com a fisiopatologia da doença. Considerando que ainda não foi reportado dano ao DNA em pacientes X-ALD, e que muitos estudos vêm investigando as propriedades antioxidantes de N-acetil-L-cisteína (NAC), rosuvastatina (RSV) e trolox (TRO), os objetivos deste trabalho foram avaliar o dano ao DNA em HTZ e pacientes sintomáticos portadores de X-ALD, verificar o efeito in vitro de NAC, TRO e RSV sobre o dano ao DNA nestes pacientes, estudar associações entre o dano ao DNA e a peroxidação lipídica e, por fim, investigar a capacidade da NAC em aumentar, in vitro, os níveis de glutationa (GSH) e sulfidrila nos pacientes X-ALD. Não foi verificada diferença significativa no dano ao DNA em mulheres HTZ, quando comparado a controles. Em contraste, pacientes sintomáticos apresentaram um maior índice de dano ao DNA comparado às HTZ e ao grupo controle. No ensaio in vitro, foi observado que os antioxidantes NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) e RSV (0,5; 2 e 5 μM) foram capazes de reduzir o dano ao DNA em pacientes sintomáticos a níveis de controle. Além disso, observamos uma correlação positiva entre o dano ao DNA e o nível de isoprostanos urinários (biomarcador de dano a lipídios), o que nos permite inferir que o dano ao DNA poderia estar sendo causado por processos oxidativos em pacientes sintomáticos. Verificou-se também que os conteúdos de glutationa eritrocitária e sulfidrila plasmática estavam diminuídos em pacientes X-ALD (independentemente do fenótipo) e que 5 mM de NAC, in vitro, foi capaz de aumentar estes parâmetros a níveis de controle saudáveis. O presente trabalho fornece evidências experimentais de que há dano ao DNA em pacientes X-ALD, os quais possuem níveis diminuídos de GSH e sulfidrila, e que a administração dos antioxidantes NAC, TRO e RSV poderia ser considerada uma terapia adjuvante no tratamento da X-ALD. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inborn error of peroxisome metabolism which is characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in tissue and body fluids. It is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes a protein responsible for transporting VLCFA from cytosol to peroxisomes to be oxidized. Although the mechanisms underlying tissue damage are still poor understood, studies have been shown that the accumulation of toxic metabolites and oxidative stress may be related to the pathophysiology of X-ALD. Considering that DNA damage was not reported in X-ALD patients yet, and that former studies have been investigated the antioxidant properties of N-acetyl-L-cistein (NAC), rosuvastatin (RSV) and trolox (TRO), the aims of this study were to evaluate DNA damage in HTZ and symptomatic X-ALD patients, to study the in vitro effect of NAC, TRO and RSV on DNA damage in these patients, to look for associations between DNA damage and lipid peroxidation and to verify the ability of NAC in increasing, in vitro, glutathione (GSH) and sulfhydryl levels on X-ALD patients. It was verified no significant difference on DNA damage in HTZ women when compared to controls. In contrast, symptomatic patients presented higher DNA damage levels, compared to HTZ and control group. In the vitro assay, it was observed that the antioxidants NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) and RSV (0,5; 2 e 5 μM) were able to reduce DNA damage in symptomatic patients until control levels. Likewise, our results showed positive correlation between DNA damage and urinary isoprostanes (biomarker of lipid damage), allowing us to hypothesize that DNA damage might be caused by oxidative processes in symptomatic patients. It was also verified that the plasmatic sulfhydryl content and erythrocyte glutathione levels were decreased in X-ALD patients (regardless of the phenotype) and that 5mM of NAC in vitro was able to increase these parameters until control levels. The present work yields experimental evidence that DNA damage occurs in X-ALD patients, which have GSH and sulfhydryl levels reduced and that the administration of the NAC, TRO and RSV antioxidants might be considered as an adjuvant therapy for X-ALD.