A polpa dentária pode responder a uma agressão pela produção de dentina reacional e reparativa. Osteopontina (OPN), proteína abundante no osso, e proteína da matriz dentinária 1 (DMP1) podem estar presentes nessas dentinas. O objetivo do trabalho foi examinar a ultra-estrutura e a presença da OPN e DMP1 na dentina induzida pela extrusão de incisivos. Os incisivos de ratos foram extruídos e depois reposicionados. Após períodos de tempo determinados, as maxilas foram processadas para MET, MEV e imunocitoquímica. Após extrusão, houve formação de dentina reacional e reparativa, as quais variaram em aspecto, espessura e células secretoras. A OPN foi observada apenas na dentina reparativa num padrão semelhante ao encontrado no osso. A DMP1 foi detectada na matriz em mineralização de todas as dentinas estudadas, mas praticamente não foi observada nas suas pré-dentinas, o que confirmou o seu papel na mineralização. Tais achados mostraram que a dentina reparativa e o osso primário, além de semelhantes morfologicamente, são também similares com relação às suas composições / Reactionary dentine (Rc) and (Rp) reparative dentine are two strategies used by the dentine?pulp complex to respond to injury. Osteopontin (OPN) and dentine matrix protein 1 (DMP1) may be present in the matrix secreted after tissue injury. The aim of the present study was to examine the ultrastructure, as well as the presence of OPN and DMP1 in Rc and Rp by provoking extrusion of the rat incisor. The right upper incisors of rats were extruded and then repositioned. After certain periods of time, the maxillae were processed for scanning and transmission electron microscopy and for immunocytochemistry. After extrusive trauma, there was formation of Rc and Rp, which varied in aspect and thickness. OPN was only detected in the Rp in a pattern similar to bone. DMP1 was immunodetected in all the dentine types, but rare colloidal gold particles were observed in predentin, that confirmed its role in mineralization. The present findings showed that Rp shares some compositional characteristics with primary bone, especially in relation to its OPN content

Esta tese teve como objetivo verificar a resposta celular de fibroblastos pulpares após a variação nos parâmetros de fotobiomodulação. Fibroblastos pulpares de dentes decíduos humanos em 4a passagem foram plaqueados, deixados a aderir, submetidos a privação nutricional, e em seguida irradiados com laser de baixa intensidade a 660 nm. Os grupos em estudo foram baseados na variação da potência e tempo, resultando em dosimetrias diferentes, variando entre 2,5 a 6,2 J/cm2. No artigo 1, o efeito dos diferentes parâmetros da fotobiomodulação foram verificados por meio da expressão gênica do COL1 por RT-PCR, nos períodos de 6, 12 e 24 horas. No artigo 2, avaliou-se a síntese proteica de fatores angiogênicos (VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2, FGF-2, PDGF, PLGF, PECAM-1, e BMP-9) por ELISA Multiplex, nos períodos de 6, 12 e 24 horas após fotobiomodulação, no sobrenadante e lisado celular. Os dados foram analisados por ANOVA a dois critérios seguido pelo teste de Tukey (p<0.05) nos dois artigos. No artigo 1, a comparação intragrupo da expressão gênica do COL1 mostrou que a variação da fotobiomodulação com mais tempo (50 s) e menor potência (5 mW) em uma densidade de energia de 6,2 J/cm2 mudou o padrão de expressão gênica do COL1 pelos fibroblastos pulpares de 12 h para 6 h. A comparação intergrupo da expressão genica COL1 não mostrou diferenças estatisticamente significativas. No artigo 2, fibroblastos pulpares secretaram e produziram todas as proteínas testadas antes e após a fotobiomodulação, exceto PDGF no lisado. A comparação intragrupo, no artigo 2, mostrou padrões similares da síntese proteica dos fatores angiogênicos para todos os grupos: a secreção de VEGF-A, VEGF-C, VEGFR1 e BMP-9 aumentou significativamente no sobrenadante enquanto que FGF-2 e VEGF-A aumentou significativamente no lisado. A comparação intergrupo da sintese de proteínas revelou que a dosimetria 2,5 J/cm2 aumentou a secreção de VEGF-D (p=0.4779), VEGFR1 (p=0.8570) e BMP-9 (p=0.0042) no sobrenadante e VEGFR1 (p=0.0128) e VEGF-D (p=0.0036) no lisado; e diminuiu VEGF-A (p=0.0176), VEGF-C (p=0.0328), PDGF (p=0.0077), PLGF (p=0.0004) no sobrenadante e PLGF (p=0.0094) e BMP-9 (p= 0.5645) no lisado. A dosimetria de 3.7 J/cm2 aumentou VEGF-A p=0.8410), FGF-2 (p=0.4778), BMP-9 (p=0.0042) e VEGFR1 (p=0.8570) no sobrenadante e VEGF-A (p=0.8412), VEGF-C (p=0.5908) e VEGFR1 (p=0.0128) no lisado; e diminuiu VEGF-A (p=0.0176), PDGF (p=0.0077) e PLGF (p=0.0004) no sobrenadante e PLGF (p=0.0094) e BMP-9 (p=0.0276) no lisado. Concluiu-se que as dosimetrias de 2,5 a 6,2 J/cm2 biomodularam a expressão gênica de COL1, e as dosimetrias de 2,5 J/cm2 e 3.7 J/cm2 biomodularam a síntese proteica de vários fatores angiogênicos. Na dosimetria de 6,2 J/cm2, o maior tempo e a menor potência mudaram o padrão da expressão gênica de COL1 pelos fibroblastos pulpares. A dosimetria de 3.7 J/cm2 foi a mais efetiva na produção e secreção de fatores angiogênicos. / This thesis aimed to verify the cellular response of pulp fibroblasts after the variation in photobiomodulation parameters. Pulp fibroblasts at 4th passage were plated, led to adhere, subjected to serum starvation, and subsequently irradiated with 660 nm lowlevel laser. The study groups were based on the variation of the power and time, resulting in different dosimetries ranging from 2.5 to 6.2 J/cm2. In article #1, the effect of different photobiomodulation parameters were verified through the COL1 gene expression by RT-PCR, at 6, 12, and 24 hours. In article #2, the protein synthesis of angiogenic factors (VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2, FGF-2, PDGF, PLGF, PECAM-1, and BMP-9) was measured by ELISA Multiplex assay, at 6, 12, and 24 hours, in the supernatant and lysate. Data were analyzed by two-way ANOVA followed by Tukey test (p<0.05) in both articles #1 and #2. In article #1, the intragroup comparison of the COL1 gene expression showed that the variation of PBM application with longer time (50 s) and smaller power (5 mW) at the energy density of 6.2 J/cm2 changed the COL1 mRNA expression pattern by pulp fibroblasts from 12 h to 6 h. The intergroup comparison of COL1 gene expression revealed no statistically significant differences. In article #2, pulp fibroblasts secreted and produced all the tested proteins before and after PBM, except for PDGF in the lysate. The intragroup comparison, in article #2, showed similar patterns of angiogenic factors synthesis for all groups: the secretion of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR1, and BMP-9 increased significantly in the supernatant, while FGF-2 and VEGF-A increased significantly in the lysate. The intergroup comparison of the protein synthesis revealed that the dosimetry of 2.5 J/cm2 exhibited upregulation of VEGF-D (p=0.4779), VEGFR1 (p=0.8570), and BMP-9 (p=0.0042) in supernatant and VEGFR1 (p=0.0128) and VEGF-D (p=0.0036) in lysate; and downregulation of VEGF-A (p=0.0176), VEGF-C (p=0.0328), PDGF (p=0.0077), and PLGF (p=0.0004) in supernatant and PLGF (p=0.0094) and BMP-9 (p= 0.5645) in lysate. The dosimetry of 3.7 J/cm2 upregulated VEGF-A (p=0.8410), FGF-2 (p=0.4778), BMP-9 (p=0.0042), and VEGFR1 (p=0.8570) in supernatant and VEGF-A (p=0.8412), VEGF-C (p=0.5908), and VEGFR1 (p=0.0128) in lysate; and downregulated VEGF-A (p=0.0176), PDGF (p=0.0077), PLGF (p=0.0004) in supernatant and PLGF (p=0.0094) and BMP-9 (p=0.0276) in lysate. We concluded that the energy densities from 2.5 to 6.2 J/cm2 biomodulated the COL1 gene expression, but red laser at 2.5 J/cm2 and 3.7 J/cm2 biomodulated the synthesis of several angiogenic proteins. At the energy density of 6.2 J/cm2, longer application time and smaller power changed the pattern of COL1 gene expression by pulp fibroblasts. However, the dosimetry of 3.7 J/cm2 was the most effective for the production and secretion of angiogenic factors.

Atualmente a terapia com células-tronco têm sido uma ferramenta útil na medicina regenerativa com alto potencial terapêutico devido à capacidade de auto renovação e diferenciação destas células. Nos últimos anos a ortopedia vem procurando novos métodos para um tratamento que obtenha como efeito a reparação de defeitos articulares de forma mais efetiva e sem procedimentos invasivos. Por isso, muitos estudos envolvendo terapia celular com objetivo de melhorar a reparação articular estão sendo realizados. O objetivo deste estudo foi avaliar a terapia com células-tronco de saco vitelino e de polpa dentária canina em cães com displasia coxofemoral mediante três aplicações celulares (dia 0, 30 e 60, e um controle dia 90). Para a avaliação dos animais tratados foi instituído um grupo controle para cada tipo celular testado, sendo avaliado o escore de claudicação, escore de atrofia muscular, questionário de qualidade de vida, avaliação radiográfica, análise do líquido sinovial e hemograma. Os resultados obtidos demonstraram não haver uma diferença estatística significante quando comparado os animais dos grupos tratamentos e controle. Quando comparado os animais dos grupos tratamento houve uma diferença estatística significante para os animais tratados com células-tronco de saco vitelino em relação aos animais tratados com células-tronco de polpa dentária. O tratamento com células de saco vitelino mostrou melhores resultados nos testes de Ortolani. / Currently, stem cell therapy have been a useful tool in regenerative medicine with high therapeutic potential due to the capacity for self renewal and differentiation of these cells. In recent years, orthopedics has been seeking new methods of treatment to obtain the effect of repair of articular defects more effectively and without invasive procedures. Therefore, many studies involving cell therapy in order to improve the repair articular are being conducted. The aim of this study was to evaluate the therapy with stem cells from the yolk sac and canine dental pulp in dogs with hip dysplasia by three mobile applications (day 0, 30 and 60, and one day control 90). For the evaluation of the treated animals was set up a control group for each cell type tested, and rated the lameness score, muscular atrophy score, a questionnaire about quality of life, radiographic evaluation, synovial fluidanalysis and blood count. The results showed that there was no statistically significant difference when compared animal treatment and control groups. Comparing the animals, treatment groups showed a statistically significant difference for the animals treated with stem cells from the yolk sac for the animals treated with stem cells from dental pulp. Treatment with yolk sac cells showed better results in Ortolani tests.

A terapia celular com células-tronco (CT) surgiu nos últimos anos como uma esperança para o tratamento de doenças, sem tratamento efetivo, como a osteoartrite (OA) em joelho. Nesse trabalho utilizamos células-tronco imaturas de polpa dentária humana (CTPD) cultivadas ou não em associação com biomateriais para o tratamento de lesões osteoarticulares em joelhos de ovinos. As CTPD humanas foram transduzidas com o gene repórter, EGFP, facilitando o monitoramento das mesmas in vitro e in vivo, após o implante na articulação femorotibiopatelar de ovinos. A capacidade de adesão e acomodação das células de polpa dentária no biomaterial foi observada in vitro 24 horas e um mês após sua aplicação no mesmo, sendo a viabilidade celular semelhante em ambos os períodos, porém com uma maior dispersão celular no período mais longo, segundo as análises realizadas por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e histologia. Ainda para a realização das análises histológicas, foram realizadas técnicas para padronizar os métodos de descalcificação e inclusão do tecido ósseo-articular, prévio aos cortes. Exames radiográficos, ultrassonográficos e artroscópicos foram feitos para acompanhar a evolução dos tratamentos. Os resultados revelaram que as CTPD humanas aderem bem ao biomaterial e que em associação possuem uma excelente capacidade aparente de reconstituição do tecido lesado. Com a realização deste trabalho, concluímos que o protocolo de terapia utilizado é um bom modelo para o estudo de OA e serve para futuras aplicações clínicas. / Cell therapy with stem cells (CT) has emerged in recent years as a hope for the treatment of diseases without effective treatment, such as osteoarthritis (OA) in knee. In this work we use stem cells from immature human dental pulp (hSCIDP) in association or not with biomaterials for the treatment of osteoarticular lesions in sheep´s kneef. The human hSCIDP were transduced with the reporter gene EGFP, thus making easier monitoring these in vitro and in vivo after implantation in sheep´s femorotibiopatelar joint. The capacity of adhesion and accommodation of dental pulp cells in the biomaterial in vitro was observed 24 h and one month after its application, resulting in similar cell viability in both periods, but with a greater cell dispersion in the longer, period, according to analysis performed by scanning electron microscopy and histology. Moreover, some histological techiniques were performed to standardize the methods for inclusion and decalcification of bone tissue joints. Radiographic, ultrasonographic and arthroscopic analyses were made to monitor the progress of treatment. The results revealed that the human hSCIDP adhere well to the biomaterial and have an excellent apparent reconstitution of damaged tissue. With this work, we conclude that the therapy protocol used is a good model for studying OA and useful for future clinical applications.

Uma potencial alternativa para o transplante de tecidos é a engenharia de tecidos. Células-tronco mesenquimais e scaffolds eletrofiados são comumente utilizados nesta área devido à capacidade multipotente de diferenciação destas células e à rede de poros interconectados destas estruturas fibrosas. Além disso, bioreatores de perfusão podem ser utilizados para melhorar o transporte de nutrientes e reduzir o acúmulo de metabolitos tóxicos. Neste contexto, uma maneira de estudar e otimizar o sistema de cultivo é utilizar técnicas de modelagem para descrever interações ou processos individuais envolvidos no crescimento celular. Deste modo, o objetivo geral deste estudo é realizar o cultivo de células-tronco mesenquimais da polpa de dente decíduo (DPSCs) utilizando scaffolds tridimensionais eletrofiados de policaprolactona (PCL), biorreatores e técnicas de modelagem. Inicialmente foram testadas diferentes misturas de solventes (clorofórmio e metanol), a fim de produzir scaffolds com poros adequados ao cultivo tridimensional. Os diâmetros de fibra e de poro foram determinados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O crescimento e o metabolismo das células foram avaliados através da determinação da atividade metabólica e das concentrações de glicose e lactato do meio de cultivo, e a infiltração celular foi observada com a marcação do núcleo celular. Depois de estabelecidos os parâmetros de eletrofiação, o efeito da perfusão direta no desprendimento de DPSCs de scaffolds eletrofiados de PCL foi estudado. A atividade metabólica das células foi determinada para diferentes tempos de adesão, vazões e densidades de semeadura, e a tensão de cisalhamento na parede do poro foi calculada para cada vazão. A morfologia das células foi avaliada através de imagens de microscopia confocal e MEV. Paralelamente, foram realizadas simulações utilizando o software OpenFOAM para estudar como os parâmetros e variáveis de entrada (concentração inicial de glicose, porosidade e espessura do scaffold) afetam as saídas (fração volumétrica de células e concentração de substrato) de um modelo de proliferação celular que considera a difusão e o consumo de glicose. As contribuições do teor de oxigêno na cinética de crescimento de Contois e da variação da porosidade com o tempo devido à degradação do polímero também foram avaliadas. Inicialmente, foi observado que apenas um tamanho de poro maior que o diâmetro da célula permitiu a infiltração das células no scaffold. Então, observou-se que o aumento do tempo de adesão acarretou em maior espalhamento das células e, assim como a diminuição da densidade de semeadura e da tensão de cisalhamento, resultou em uma redução do desprendimento das células sob perfusão. Quanto ao modelo fenomenológico, observou-se maior sensibilidade à concentração inicial de glicose e à porosidade do scaffold, e aos parâmetros adimensionais relacionados à proliferação e morte celular e ao consumo de nutrientes. Além disso, o número inicial de células apresentou maior impacto no transporte de massa do que no crescimento celular. Neste estudo, foi possível obter scaffolds eletrofiados e conduções de cultivo dinâmico adequadas ao cultivo tridimensional de DPSCs, e elucidar os efeitos da limitação do transporte de massa e do oxigênio no crescimento celular, e da degradação do polímero no transporte de massa. / A potential alternative to tissue transplant is tissue engineering. Mesenchymal stem cells and electrospun scaffolds are commonly used in this field due to the multipotent differentiation capacity of these cells and the interconnected pore network of these fibrous structures. In addition, perfusion bioreactors can be used to enhance nutrient transport and reduce the accumulation of toxic metabolites. In this context, one way to study and optimize the culture system is to use modeling techniques to describe interactions or individual processes involved in cell growth. Thus, the objective of this study is to perform the three-dimensional culture of mesenchymal stem cells of dental pulp (DPSCs) using electrospun polycaprolactone (PCL) scaffolds, bioreactors and modeling techniques. Initially, different solvent mixtures (chloroform and methanol) were tested to produce scaffolds with pores suitable to three-dimensional culture. Fiber and pore diameter was determined using a scanning electron microscope. Cell growth and metabolism were evaluated through the metabolic activity and the culture medium concentration of glucose and lactate, and the cell infiltration was observed with cell nuclei staining. After the establishment of the elesctrospinning parameters, the effect of direct perfusion on DPSCs detachment from PCL electrospun scaffolds was investigated. The metabolic activity of the cells was determined for different adhesion times, flow rates and seeding densities and the pore wall shear stress was calculated for each flow rate. The cell morphology was evaluated through scanning electron and confocal microscopy imaging. In parallel, simulations with the software OpenFOAM were performed to study how parameters and inputs (initial glucose concentration, porosity and thickness of the scaffold) affect the outputs (cell volume fraction and substrate concentration) of a model of cell proliferation and glucose diffusion and consumption. The contribution of the oxygen in the Contois growth kinetics and the porosity variation with time due to polymer degradation was also evaluated. Initially, it was observed that only a pore size higher than the cell diameter allowed the infiltration of the cells through the scaffold. Then, it was observed that a higher adhesion time leaded to higher cell spreading in static conditions and, similar to smaller seeding densities and shear stresses, reduced cell detachment under perfusion. Regarding the phenomenological model, it was observed that the model is more responsive to the initial glucose concentration and scaffold porosity, and to the dimensionless parameters related to cell proliferation, death and nutrient uptake. Furthermore, the initial cell number had a more significant impact on mass transport than on cell growth. In this study, it was possible to obtain an electrospun scaffold and dynamic culture conditions suitable for the three-dimensional culture of DPSCs, and to elucidate the effects of transport limitations and of oxygen on cell growth, and of polymer degradation on mass transport were elucidated.

O objetivo do presente estudo clínico foi compreender o efeito do uso prévio de agentes antimicrobianos na diversidade e a estrutura do microbioma procariótico de saliva, biofilme supragengival e canal radicular de dentes com infecção endodôntica aguda. Realizaram-se coletas microbiológicas de saliva (S), biofilme supragengival (BS) e canal radicular (CR) de pacientes que não utilizaram antibióticos (G1: n=6) e de pacientes que utilizaram antibióticos (G2: n=6). Para a caracterização das comunidades de procariotos por meio de sequenciamento de alto rendimento, foram produzidos pools de seis amostras para cada um dos sítios. A região hipervariável V3-V4 do gene 16S rRNA foi amplificada e a plataforma Illumina MiSeq foi empregada para análise das sequências geradas. Foram determinadas a presença e abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em cada amostra. Procedeu-se a análise de alfa-diversidade para cada amostra, considerando-se as métricas de Simpson, dominância, estimativa de riqueza de Chao-I e o Índice de Shannon. Os valores obtidos foram comparados por meio de testes estatísticos. Para a análise dos índices de beta-diversidade, empregou-se o método de agrupamento UPGMA, com jackknifing e método de comparação UniFrac com peso. A representação gráfica tridimensional da beta-diversidade foi realizada por meio de análise de coordenadas principais. A técnica de PCR gene específico foi empregada para determinar a presença de genes relacionados à resistência bacteriana para agentes beta-lactâmicos (blaTEM, blaZ, ampC, mecA), macrolídeos (ermB, ermC, mefA), tetraciclinas (tetM, tetQ, tetW), lincosamidas (lnuB, lsaB) e vancomicina (vanA, vanD, vanE). A similaridade para a presença/ausência de genes de resistência nas amostras de S, BS e CR em G1 e G2 foi determinada por meio de coeficiente de agrupamento, utilizando-se o método UPGMA com distância Euclidiana. Todos os pacientes apresentavam infecção endodôntica aguda, caracterizada pela presença de dor espontânea, necrose pulpar e dor à percussão vertical. Aumento de volume foi observado em 8/12 pacientes. Os pacientes do Grupo 2 utilizaram beta-lactâmicos previamente à consulta (amoxicilina = 5; cefalexina = 1). Há predomínio de integrantes do domínio Bactéria em todas S, BS e CR. Archaea pertencentes ao gênero Methanobrevibacter foram encontradas apenas em amostras de CR, constituindo menos de 1% do total de OTUs (G1-CR = 0,319%; G2-CR = 0,014%). Há predomínio de bactérias dos filos Firmicutes e Bacteroidetes em amostras de S, BS e CR. Há redução intensa no percentual de OTUs pertencentes ao Filo Firmicutes em amostras de saliva, quando antibiótico foi utilizado (G1-S = 75,371; G2-S = 35,242). Comportamento oposto ocorreu neste ecossistema para integrantes do Filo Bacteroidetes (G1-S = 12,657; G2-S = 33,947). Tanto em G1 quanto em G2, bactérias do gênero Streptococcus predominam em amostras de S e BS. Em canais radiculares, maiores percentuais de OTUs foram observados para os gêneros Porphyromonas e Prevotella. As métricas de alfadiversidade indicam que o uso prévio de antimicrobiano parece oportunizar o estabelecimento de espécies antes menos abundantes, especialmente em saliva (dominância: G1-S>G2-S; índice de Shanon: G1-S<G2-S; índice de Simpson: G1- S<G2-S; índice de Chao-1: G1-S<G2-S). A análise de beta-diversidade mostra proximidade entre G1-BS e G2-BS; há distanciamento entre G1-S e G2-S. As amostras G1-CR e G2-CR estão mais distantes de S e BS, sugerindo maior seleção imposta pelo ecossistema do CR aos procariotos. Os genes de resistência mais frequentemente detectados foram tetM, tetQ, tetM, ermB e mefA. Não foram detectados genes vanA, vanD, vanE, blaZ, mecA, lnuB e ermC. O gene ermB foi frequentemente detectado em amostras de S, BS e CR em ambos os grupos. Em pacientes que não utilizaram antibiótico, o gene tetM e o gene tetQ foram detectados simultaneamente em S, BS e CR (tetM = 4/6; tetQ = 3/6). A análise multivariada não demonstrou nível de agrupamento alto entre amostras de um mesmo paciente, de um mesmo ecossistema, ou de um mesmo grupo. A partir dos resultados do presente estudo, observou-se que a utilização de agente antimicrobiano betalactâmico parece alterar parâmetros composicionais de comunidades de procariotos na cavidade bucal. Entretanto, particularidades relativas a cada ecossistema podem modular a extensão deste efeito, parecendo ser mais intensos em amostras de S do que em BS e CR. / The present clinical study aimed to assess the effect of antibiotics over the diversity and structure in prokaryotic communities of saliva, supragengival biofilm and root canal of teeth with acute primary infections. Samples of saliva (S), supragengival biofilm (BS) and root canal of teeth with acute primary infections (CR) were collected from patients, and were grouped according with the previous use of antibiotic (G1 = no antibiotics; G2 = antibiotics). Pooled samples for each community were evaluated. DNA sequencing was performed with MiSeq (Illumina). The V3-V4 hypervariable region from the 16S rRNA gene was amplified. The presence and relative abundance of the operational taxonomic units (OTUs) was determined for each sample. Alpha-diversity analysis was performed with the Simpson’s index, dominance, Chao-1 richness index and Shannon’s index. Statistical analysis was carried out to compare their values for each community.Beta-diversity was computed through UPGMA clustering and jackknifing. The principal coordinate analysis employed weighted UniFrac. Gene-specific PCR was employed to detect resistance genes to lactamics (blaTEM, blaZ, ampC, mecA), macrolides (ermB, ermC, mefA), tetracyclines (tetM, tetQ, tetW), lincosamides (lnuB, lsaB) e vancomycin (vanA, vanD, vanE). The UPGA clustering analysis with Euclidean distance was applied to investigate the existence of similar groups of samples. A dendrogram was constructed to show the arrangement of the sample groups produced by clustering. All the patients had primary acute endodontic infections, with spontaneous pain, pulp necrosis and tenderness on percussion. Swelling was observed for 8 out of 12 patients. Patients from G2 had lactamics before the urgency appointment (amoxicillin = 5; cephalexin = 1). Bacteria were predominant in S, BS and CR samples. Archaea belonging to the genus Methanobrevibacter were only detected in RC samples and comprised less than 1% of all the OTUs G1-CR = 0.319%; G2-CR = 0.014%). The great majority of the detected OTUs in S, BS, and CR belonged to the phyla Firmicutes and Bacteroidetes. Reduction in the percentage of Firmicutes was observed in G2-S (G1-S = 75.371%; G2-S = 35.242%). A distinct behavior was demonstrated by the Bacteroidetes (G1- S = 12.657%; G2-S = 33.947%). Components belonging to the genus Streptococcus were predominant in S and BS, for both G1 and G2. CR harbored high percentage of species belonging to the genus Porphyromonas and Prevotella. The alpha-diversity indexes demonstrated that the G2-S had an increase in low abundant species (dominance: G1- S>G2-S; Shanon index: G1-S<G2-S; Simpson index: G1-S<G2-S; Chao-1 index: G1-S<G2- S). Beta-diversity showed that G1-BS and G2-BS had close spatial distribution. G1-CR and G2-CR were more distant from S and BS samples. The RC may promote a most intense species selection, due to environmental conditions. The most frequently detected genes associated with resistance to antibiotics were tetM, tetQ, tetM, ermB, and mefA. The genes vanA, vanD, vanE, blaZ, mecA, lnuB, and ermC were not detected in the samples. The gene ermB was frequently detected in S, BS and CR samples. In patients from G1, tetM and tetQ were detected simultaneously in all the three environments (tetM = 4/6; tetQ = 3/6). There was no clustering behavior for samples belonging to different environments in the same patients and between the same environment samples from different groups. An overall analysis from the data allows for suggesting that the use of lactamic agents may alter compositional parameters from prokaryotic communities in the oral cavity to different extents. Specific environmental characteristics from each site may modulate the effect that seemed to be more intense for S than for BS and CR.

Este trabalho objetivou avaliar os efeitos imunomoduladores das células-tronco imaturas da polpa dentária (CTIPD) sobre a diferenciação, maturação das células dendríticas derivadas de monócitos (mo-DC), sua capacidade para ativar linfócitos T (Lin T), bem como verificar fatores solúveis liberados nos cocultivos celulares. As analises foram feitas por citometria de fluxo. Foi observado que mo-DC tiveram a diminuição de moléculas relacionadas à diferenciação para mo-DC e o aumento de moléculas relacionados ao estado precursor, o que parece ter refletido na maturação para mDC, verificado pela diminuição das moléculas de maturação. As mo-DC tiverem sua função em induzir a proliferação de Lin T reduzida, além, de favorecer o aumento da proporção de Lin T CD4+FoxP3+IL-10+ e Lin T CD4+FoxP3+IFN-<font face=\"Symbol\">g+. A mensuração dos fatores solúveis dos cocultivos mostrou que houve aumento de fatores anti-inflamatórios e redução de fatores pró-inflamatórios. Futura investigações podem suportar o uso das CTIPD em uma abordagem imunomoduladora utilizando DC em aplicações clínicas. / This study aimed to evaluate the immunomodulatory effects of immature stem cells from dental pulp on differentiation, maturation of monocyte-derived dendritic cells (mo-DC), their ability to activate T cells, as well as identify soluble factors released in cellular cocultures. The analyzes were performed by flow cytometry. It was observed a decrease of molecules related to mo-DC differentiation and an increase of molecules related to precursor state, which seems to have reflected to mDC maturation verified by reduction of maturation molecules. The mo-DC have their role in inducing T cells proliferation reduced, in addition, favored increase CD4+FoxP3+IL-10+ and CD4+FoxP3+IFN-<font face=\"Symbol\">g+ T cells population proportion. The measurement of soluble factors from coculture showed an increase of anti-inflammatory factors and a reduction of pro-inflammatory factors. Future research may support the use immature stem cells from dental pulp in an immunomodulatory approach using DC in clinical applications.

Submitted by NOALA VICENSOTO MOREIRA MILHAN null (noalinha@gmail.com) on 2017-03-14T15:32:19Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_biblioteca_pdf_com ficha..pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-20T22:29:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 milhan_nvm_dr_sjc.pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T22:29:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 milhan_nvm_dr_sjc.pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) Previous issue date: 2017-01-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O peptídeo LL-37 (catelicidina derivada de humano), é liberado por algumas células humanas e capaz de neutralizar os tecidos com lipopolissacarídeo (LPS), além de atrair células da polpa, e induzir a angiogênese, características que o tornam um possível adjunto para a regeneração do complexo dentino-pulpar. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a biocompatibilidade do peptídeo LL-37 nas concentrações de 5 e 10 μg/mL, e sua possível atuação na diferenciação de células-tronco da polpa dentária (DPSC) para odontoblastos- like. Com esse propósito, foram avaliados: (a) a citotoxicidade, pelo teste MTT; (b) a genotoxicidade, através do ensaio do micronúcleo; (c) a produção e quantificação de óxido nítrico; (d) as fases do ciclo celular, por citometria; (e) a expressão de alguns genes associados à formação de tecido mineralizado, através do teste qRT-PCR; (f) o conteúdo de proteína total; (g) a atividade de fosfatase alcalina (ALP); e (h) a produção de sialofosfoproteína dentinária (DSPP), pelo ensaio imunoenzimático ELISA. Foi observado que as concentrações de 5 e 10 μg/mL de LL-37 não foram citotóxicas e ainda aumentaram, em geral, a viabilidade celular (p<0,05), sendo que os maiores valores de absorbância foram observados no 3° dia de contato. As concentrações testadas também não induziram genotoxicidade, após 7 dias de contato, tendo sido genotóxico apenas o grupo controle positivo (EMS) (p<0,05). Ainda, não foi observado diferença estatisticamente significativa na produção de nitrito, pelas células expostas ao LL-37 após 7 dias, em ambas as concentrações. A análise do ciclo celular, evidenciou maior porcentual de células na fase G0/G1, em todos os grupos (p<0,05). Quando estes foram comparados, foi observado maior quantidade de células na fase G0/G1 na concentração de 10 μg/mL de LL- 37 comparada ao grupo controle (p<0,05). Por outro lado, o grupo controle exibiu mais células na fase G2 e em mitose (M) que os grupos tratados com 5 e 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05), e mais células na interfase (S) que o grupo tratado com 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05). A análise da expressão gênica demonstrou que não houve aumento de expressão dos genes fosfatase alcalina, osteocalcina, osteopontina e Runx2 após tratamento com ambas as concentrações do peptídeo, no 3° dia. Além disso, não foi observado diferença estatisticamente significativa na ALP nos grupos tratados e controle, após 3 e 14 dias, enquanto o conteúdo de proteína total foi maior aos 14 dias nos grupos tratados com LL-37 (p<0,05). Ainda, aos 3 dias, a produção da proteína DSPP foi maior no grupo tratado com 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05). Com base nesses resultados, pode-se concluir que o LL-37 é biocompatível nas concentrações testadas nesse trabalho, e ainda aumenta o número de células viáveis, principalmente em período inicial. Além disso, aos 3 dias, na concentração de 10 μg/mL, ele retarda o ciclo celular e aumenta a expressão da proteína DSPP, além de aumentar a síntese proteica aos 14 dias, o que indica que esse peptídeo pode desempenhar algum tipo de função na diferenciação odontoblástica. / The LL-37 peptide (human derived cathelicidin) is released by some human cells and able of neutralizing the tissues that present lipopolysaccharide (LPS), as well as, attracts pulp cells and induces angiogenesis; characteristics that makes it a possible adjunct for regeneration of the dentin-pulp complex. The aim of this study was evaluate in vitro the biocompatibility of LL-37 in the concentrations of 5 and 10 μg/mL, and its possible performance in the differentiation of dental pulp stem cells (DPSC) into odontoblasts-like cells. For this purpose, it was evaluated: (a) the cytotoxicity by MTT assay; (b) the genotoxicity by the micronucleus test; (c) the production and quantification of nitric oxide; (d) the cell cycle, by flow cytometry; (e) the expression of genes associated with the mineralization by qRT-PCR; (f) the total protein content; (g) the alkaline phosphatase activity (ALP); and (h) the production of dentine sialofosfoprotein (DSPP) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that the concentrations of 5 and 10 μg/ml of LL-37 were not cytotoxic, in addition to they increased, in general, the cell viability (p<0,05). Moreover, higher absorbance values were observed on 3rd day of contact. After 7 days, the tested concentrations also did not induce genotoxicity, (p<0,05); only the positive control group (EMS) was genotoxic (p<0.05). Furthermore, there was not statistical significance in the nitrite production by the cells exposed to LL-37 for 7 days, in both concentrations. The cell cycle test showed higher percentage of cells in the phase G0/G1 in all groups (p<0.05). When they were compared, it was noticied that concentration of 10 ug/ml of LL-37 arrested the cells in G0/G1 compared to the control group (p<0.05). On the other hand, the control group, exhibited higher amount of cells in G2 and mitosis (M) than the others (p<0.05) and also higher number of cells in interfase (S) than the group treated with 10 μg/mL of LL-37 (p<0.05). On the 3rd day, the analysis of gene expression demonstrated no increase in the expression of the genes alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin and Runx2, after treatment with both peptide concentrations. Furthermore, it was not observed statistical significance in the ALP in the treated and control groups after 3 and 14 days, while total protein content was higher in the groups treated with LL-37, at 14 days (p<0.05). On the 3rd day, the production of DSPP protein was higher in the group treated with 10 μg/mL of LL-37 (p<0.05). Based on these results, it can be concluded that LL-37 is biocompatible at these concentrations and increases the number of viable cells, especially in the initial period. Moreover, on the 3rd day, the concentration of 10 μg/mL arrests the cell cycle, and increases the expression of DSPP protein, in addition to raising the protein content at 14 days, which indicates that this peptide may present some kind of function in the odontoblastic differentiation.

Orientador: Mário Tanomaru Filho / Banca: Marco Antônio Húngaro Duarte / Banca: Paulo Sérgio Cerri / Resumo: A proposta do estudo foi avaliar a microbiota endodôntica de dentes de humanos sem vitalidade pulpar com ou sem lesão periapical visível radiograficamente por meio das técnicas de "Checkerboard DNA-DNA Hybridization" e cultura microbiológica. Foram utilizados 20 dentes unirradiculados, divididos em casos de necrose pulpar sem lesão periapical (Grupo I) e dentes com necrose pulpar e lesão periapical (Grupo II). A colheita do material do canal radicular foi realizada com lima K e cones de papel absorvente. Para a técnica de cultura, as amostras foram semeadas em meios As, Ask, Ms e Tio's, para avaliação da presença de microrganismos anaeróbios, aeróbios e facultativos. Para a técnica de "Checkerboard DNA-DNA Hybridization", foi realizado o processamento do DNA extraído das amostras e das sondas de DNA de 33 microrganismos. Os resultados mostraram nas duas técnicas empregadas a presença de microrganismos. A técnica de hibridação DNA - DNA checkerboard permitiu a identificação de 31 espécies diferentes no Grupo I e de 32 espécies diferentes no Grupo II. Fusobacterium nucleatum spp polymorphum (80%), Porphyromonas gingivalis (80%), Prevotella melaninogenica (90%) predominaram no Grupo I. As sondas Streptococcus mitis e Selenomonas noxia não foram detectadas em nenhuma amostra deste grupo. No Grupo II, Fusobacterium nucleatum spp polymorphum, Neisseria mucosa e Porphyromonas gingivalis foram detectadas em todos os casos e Selenomonas noxia não foi encontrada em nenhuma das amostras deste grupo. Houve tendência para maior presença de bactérias anaeróbias obrigatórias moderadas no Grupo II, embora sem diferença significante (p>0,05), em relação ao Grupo I, de acordo com a cultura microbiológica. Foi observada maior freqüência de espécies bacterianas anaeróbias obrigatórias moderadas nos canais radiculares, tanto para o Grupo I como para o Grupo II, de acordo com a técnica de hibridação DNA-DNA checkerboard. / Abstract: The purpose of this study was to evaluate the endodontic microbiota from human's teeth, with no pulp vitality, with or without radiographic chronic periapical lesion, using a culture microbiologic method and checkerboard DNA-DNA hybridization technique. The whole sample, with 20 single root's teeth, was collected and divided into: teeth with no pulp vitality without periapical lesion (Group I) and teeth with no pulp vitality with periapical lesion (Group II). The samples were obtained with K file and absorbent paper points. To the culture technique, the samples were grown by using media like As, Ask, Ms and Tio's. To checkerboard DNA-DNA hybridization technique, the samples of DNA extracted crossed with microorganisms' DNA obtained from ATCC. The results demonstrated in two techniques used that in all the samples identified microorganisms, at least 20 ufc/ml. The checkerboard DNA-DNA hybridization technique demonstrated the identification of 31 different species of microorganisms in Group I and 32 different species of microorganisms in Group II. Fusobacterium nucleatum spp polymorphum (80%), Porphyromonas gingivalis (80%), Prevotella melaninogenica (90%) predominated in Group I. The probes Streptococcus mitis and Selenomonas noxia were not detected in no sample in this group. At Group II, Fusobacterium nucleatum spp polymorphum, Neisseria mucosa and Porphyromonas gingivalis were detected in all cases, and Selenomonas noxia was not present in sample of this group. It was tendency to greater number strict anaerobe microorganisms in Group II, however without statistical significance (p>0.05), in relation Group I, in accord with culture microbiologic method. It was detected a greater frequency of anaerobe strict microorganisms species in root canal, in both Groups I and II, in accord with the checkerboard DNA-DNA hybridization technique. / Mestre

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-09T15:52:23Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Magalhães Vaz - 2015.pdf: 1556093 bytes, checksum: 261abbdf2b113a9412b9c96e41d826a4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-09T15:54:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Magalhães Vaz - 2015.pdf: 1556093 bytes, checksum: 261abbdf2b113a9412b9c96e41d826a4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Magalhães Vaz - 2015.pdf: 1556093 bytes, checksum: 261abbdf2b113a9412b9c96e41d826a4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Tooth bleaching is the first alternative for obtaining a harmonious smile. However, the bleaching material can cause damage to the pulp. This study aimed to characterize the human pulp response before different bleaching techniques. Twenty-nine volunteers (n = 29) were included in the study and divided into 3 groups. The human third molars with extraction indication of these patients were used. The groups were divided according to the bleaching technique performed: control group - was not performed any bleaching technique (n = 7); Group 01- home bleaching with carbamide peroxide 15% (n = 10); Group 02- professional whitening with hydrogen peroxide 38% (n = 12). The teeth were extracted and the pulp removed and stained with hematoxylin and eosin (H & E) or subjected to immunohistochemistry for microscopic evaluation of immunostained cells and analysis. In microscopic analysis, the groups were evaluated for intensity of the inflammatory infiltrate, collagen degradation and organization of the pulp tissue. For immunohistochemicaltechnique have been identified: mast cells (tryptase positive), macrophages (CD68 +) and blood vessels (CD 31+). Data were submitted to descriptive analysis and, as a result, processed by the statistical program (Chi Square to the criteria evaluated the technique of H & E and Kruskal-Wallis followed by Mann Whitney for the data of immunohistochemistry: values less than 0, 05 were considered statistically significant). The microscopic analysis, groups showed statistically significant differences for the intensity criterion of the inflammatory infiltrate (p <0.05) but not for collagen degradation (p> 0.05) and organization of the pulp tissue (p> 0.05). The findings of immunohistochemistry showed statistical difference between the density of macrophages, being higher in Group 2. When compared in pairs, there was the Group 2 for the remaining difference (p <0.05) but not between Groups Control and domesticated (p> 0.05). The blood vessels presented with similar density among the three groups (p> 0.05) and were not found mast cells. It was concluded that the professional whitening results in a more intense inflammatory response and increased pulp damage when compared to home bleaching in molars. / O clareamento dental é a primeira alternativa para a obtenção de um sorriso harmonioso. Contudo, sabe-se que o material clareador pode ocasionar danos à polpa. Este estudo objetivou caracterizar a resposta pulpar humana frente a diferentes técnicas de clareamento. Vinte e nove voluntários (n=29), divididos em 3 grupos, foram incluídos na pesquisa e deles foram utilizados terceiros molares humanos hígidos com indicação de exodontia. Os grupos foram divididos de acordo com a técnica de clareamento realizada: Grupo Controle –não foi realizada nenhuma técnica de clareamento (n=7); Grupo 01- clareamento caseiro com peróxido de carbamida 15% (n=10); Grupo 02- clareamento profissional com peróxido de hidrogênio 38% (n=12). Os dentes foram extraídos e as polpas removidas e coradas por hematoxilina e eosina(H&E) ou submetidas àimuno-histoquímica, para análise microscópica e avaliação das células imunomarcadas. Na análise microscópica,os grupos foram avaliados quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, degradação de colágeno e organização do tecido pulpar. Pela técnica de imuno-histoquímica, foramidentificados: mastócitos (triptase positivos), macrófagos (CD68+) e vasos sanguíneos (CD 31+). Os dados foram submetidos à análise descritiva e, na sequência, processados pelo programa estatístico (Qui Quadrado para os critérios avaliados com a técnica de H&E e Kruskall-Wallis seguido de Mann Whitney para os dados da imuno-histoquímica- os valores menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos). Na avaliação microscópica, grupos mostraram diferença estatística para o critério intensidade do infiltrado inflamatório (p<0,05), mas não para degradação do colágeno (p>0,05) e organização do tecido pulpar (p>0,05). Os achados da imuno-histoquímica mostraram diferença estatística entre a densidade de macrófagos, sendo maior no Grupo 2. Quando comparados aos pares, observou-se diferença do Grupo 2 para os demais (p<0,05), mas não entre os Grupos Controle e Caseiro(p>0,05). Os vasos sanguíneos apresentaram-se com densidade semelhante entre os três grupos avaliados (p>0,05) e não foram encontrados mastócitos.Conclui-se que o clareamento profissional provoca uma resposta inflamatória mais intensa e um maior dano pulpar quando comparado ao clareamento caseiro em molares.