Made available in DSpace on 2014-12-17T15:28:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BrunaSL_DISSERT.pdf: 1891001 bytes, checksum: 1d482b920c53ec1f846060dbc2158ebb (MD5) Previous issue date: 2012-08-10 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The cerebral cortex of mammals is histologically organized into different layers of excitatory neurons that have distinct patterns of connections with cortical or subcortical targets. During development, these cortical layers are established through an intricate combination of neuronal specification and migration in a radial pattern known as "insideout": deep-layer neurons are generated prior to upper-layer neurons. In the last few decades, several genes encoding transcription factors involved in the sequential specification of neurons destined to different cortical layers have been identified. However, the influence of early-generated neurons in the specification of subsequent neuronal cohorts remains unclear. To investigate this possible influence, we induced the selective death of cortical neurons from layer V and VI before the generation of layer II, III and IV neurons. Thus, we can evaluate the effects of ablation of early born neurons on the phenotype of late born neurons. Our data shows that one-day after ablation, layer VI neurons expressing the transcription factor TBR1 are newly generated while virtually no neuron expressing TBR1 was generated in the same age in control animals. This suggests that progenitors involved in the generation of neurons destined for superficial layers suffer interference from the selective death of neurons in deep layers, changing their specification. We also observed that while TBR1-positive neurons are located exclusively in deep cortical layers of control animals, many TBR1-positive neurons are misplaced in superficial layers of ablated animals, suggesting that the migration of cortical neurons could be controlled independently of neuronal phenotypes. Furthermore, we observed an increase in layer V neurons expressing CTIP2 and neurons expressing SATB2 and that these cells have changed their distributions. As a conclusion, our data indicate the existence of a mechanism of control exercised by the early-generated neurons in the cerebral cortex on the fate of the progenitors involved in the generation of the following cortical neurons. This mechanism could help to control the number of neurons in different layers and contribute to the establishment of different cortical areas / O c?rtex cerebral de mam?feros encontra-se histologicamente organizado em camadas de neur?nios excitat?rios que, por sua vez, apresentam distintos padr?es de conectividade com alvos corticais ou sub-corticais. Durante o desenvolvimento, estas camadas corticais s?o estabelecidas atrav?s de uma intrincada combina??o entre especifica??o neuronal e migra??o radial num padr?o conhecido como "inside-out" (de dentro para fora). Desta forma, por exemplo, neur?nios infragranulares nas camadas V e VI s?o gerados anteriormente aos neur?nios granulares da camada IV, que por sua vez s?o gerados antes dos supra-granulares das camadas II e III. Na ?ltima d?cada, foram identificados diversos genes codificando fatores de transcri??o envolvidos na especifica??o sequencial de neur?nios destinados ?s diferentes camadas corticais. No entanto, ainda pouco ? sabido sobre a influ?ncia dos neur?nios gerados previamente sobre a especifica??o das coortes neuronais subsequentes. Para investigar esta poss?vel influ?ncia, n?s utilizamos um m?todo de recombina??o g?nica (sistema Cre- Lox) para induzir a morte seletiva de neur?nios das camadas corticais V e VI antes da gera??o dos neur?nios das camadas II, III e IV. Dessa forma, pudemos avaliar os efeitos da abla??o de neur?nios infragranulares sobre o fen?tipo dos neur?nios gerados em seguida. Nossos dados mostraram que, um dia ap?s a abla??o, neur?nios da camada VI expressando o fator de transcri??o TBR1 voltaram a ser gerados enquanto praticamente nenhum neur?nio expressando TBR1 foi gerado na mesma idade em animais controle. Esse dado sugere que os progenitores envolvidos na gera??o de neur?nios destinados ?s camadas superficiais sofrem interfer?ncia da morte seletiva de neur?nios de camadas profundas, mudando sua especifica??o. Uma parte dos neur?nios TBR1 se estabeleceu na camada VI e outra migrou at? as camadas II e III, indicando que o controle dos padr?es migrat?rios pode ser independente dos fen?tipos neuronais. Al?m disso, observamos que na popula??o neuronal total tamb?m ocorreu um aumento na quantidade de neur?nios de camada V expressando CTIP2 e uma altera??o na distribui??o dessas c?lulas. O mesmo foi observado para neur?nios supragranulares expressando SATB2. Em conjunto, nossos dados indicam a exist?ncia de um mecanismo de controle exercido pelos neur?nios gerados inicialmente no c?rtex cerebral sobre o destino dos progenitores envolvidos na gera??o dos demais neur?nios corticais. Tal mecanismo poderia contribuir para o controle do n?mero de neur?nios em diferentes camadas e contribuir para o estabelecimento de diferentes ?reas corticais

Myelin wird durch einem speziellen Membran von Oligodendrozyten im ZNS hergestellt. Diese mehrschichtige Struktur umhüllt Axonen mit ihner trophischen Unterstützung und erleichtert die schnelle Übertragung von elektrischen Signalen. Um die kurzfristigen Auswirkungen der Demyelinisierung zu untersuchen, die histologische Analyse in einem Maus-Modell wurde durchgeführt, wo die myelinisierende Oligodendrozyten wurden abgetragen durch die Expression von Diphtherie-Toxin-Rezeptor in reifen Oligodendrozyten und systemische Diphtherie-Toxin Injektionen. Wir beobachteten, dass so eine Abtragung in einer tödlichen Krankheit resultiert, wo Demyelinisierung der weißen Substanz Bahnen durch Mikroglia Aktivierung von der axonalen Schäden begleitet wurde. Wir haben gezeigt, dass dieses Modell daher auch für das Studium von der kurzfristigen Demyelinisierung-vermittelte axonale Schädigung und Myelin Abbau geeignet ist. Um die Auswirkungen der reversibel Demyelinisierungepisoden auf langfristige Bewegungsapparates Leistung und neuro-axonalen Integrität zu untersuchen, wurden Cuprizon-behandelten Tieren mit motorischen Sequenz (MOSS) überwachtet. Mit MOSS haben wir beobachtet, ob eine funktionelle Erholung erreicht und in langfristig erhalten konnte. Trotz die komplette scheinbare Erholung, die behandelte Tieren zeigten eine late-onset motorischen Beeinträchtigung und laufenden akuten axonalen Schädigung. Dieses Modell imitiert viele Aspekte der axonalen Pathologie bei chronisch progredienter MS und könnte daher bei der Untersuchung der Faktoren, die Initiierung, Aufrechterhaltung oder Kompensation axonalen Schädigunggenutzt werden. Schließlich, weil Myelin Neuroprotektionwahrscheinlich eine direkte Kommunikation zwischen Axonen und Oligodendrozyten beinhaltet/braucht , Proteomanalyse der Myelin-Fraktionen in axo glialen Regionen ist durchgeführt, um neue Kandidaten in axo-glialen Interaktion im Rahmen des Myelin Biogenese beteiligt sind zu finden. Zahlreiche funktionalle Assays wurden gegründet und verwenden, um identifizierten Kandidaten zu bewerten, um ihre Rolle in axoglial Kommunikation und Myelinbildung zu bestimmen. Wir haben festgestellt, dass einige Mitglieder der IgLON Familie binden beide Oligodendrozyten und Axone. Wir beobachteten, dass diese Proteine kein Effekt auf die Migration, Proliferation, Differenzierung von der Oligodendrozyte-Vorläuferzellen haben. Allerdings beobachteten wir, dass ein Mitglied, Ntm wirkt sich negativ auf die frühen Phasen der Myelinisierung.

Dados sorológicos sobre doenças imunopreveníveis são úteis para avaliar o sucesso de programas de imunização e a identificação de populações suscetíveis. Nos últimos 20 anos, as campanhas de imunização na infância foram eficientes no controle da difteria em muitos países. No entanto, uma taxa importante da população adulta continua suscetível à doença, uma vez que os níveis de anticorpos protetores reduzem com o passar do tempo. A infecção pelo HIV-1 leva a uma perda progressiva das funções imunes. Com o aumento da expectativa de vida dos pacientes HIV-1, e a maior incidência de infecções, torna-se importante a avaliação dos níveis de anticorpos antitoxina diftérica nestes grupos. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis de anticorpos antitoxina diftérica e a contagem de linfócitos T (LT) em indivíduos infectados ou não pelo HIV -1, assistidos no Instituto de Biologia do Exército (IBEx). Investigamos a correlação entre níveis de anticorpos específicos e os seguintes parâmetros dos grupos de estudo: sexo, faixa etária, categoria militar ou civil; vacinação prévia contra difteria; número de LT CD4+ e CD8+; e entre os indivíduos HIV-1 positivos a correlação com a carga viral e a terapia com antirretrovirais potentes (HAART). Para a quantificação de anticorpos antitoxina diftérica utilizou-se um kit ELISA (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) e amostras de sangue de 180 indivíduos, sendo que 75 eram doadores de sangue e 105 eram pacientes positivos para o HIV-1. Aproximadamente 60% dos indivíduos estavam parcialmente protegidos contra a difteria (IgG específica &#8805; 0,1 < 1,0 UI/mL). Entre os doadores de sangue, 56% dos indivíduos estavam protegidos (IgG específica &#8805; 1,0 UI/mL) contra a doença, contra apenas 29 % dos indivíduos positivos para HIV-1. Em relação aos doadores de sangues de origem civil não se observou correlação entre os níveis de IgG e a idade, enquanto que, para os militares observou-se uma correlação inversa. Não houve diferença significativa na resposta de anticorpos para difteria entre os indivíduos soropositivos com CD4+ baixo ou normal. Pacientes com HAART mostraram uma resposta significativamente mais baixa de anticorpos (média geométrica de 0.39 IU/mL, n = 84) do que os pacientes não tratados (média geométrica de 0.58 IU/mL, n = 19). A diferença na idade média dos pacientes não tratados (46 anos) e tratados com HAART (35 anos) provavelmente influenciou estes resultados, já que os níveis de anticorpos contra a difteria declinam com o tempo. A existência em nossa comunidade de adultos (militares e civis) suscetíveis à difteria, incluindo os indivíduos soropositivos, reforça que a imunização a cada 10 anos e os estudos soroepidemiológicos são muito importantes e devem ser estimulados. / Serologic data on diseases that are preventable by vaccine are useful to evaluate the success of immunization programs and to identify susceptible subgroups. In the last 20 years the childhood immunization program has been efficient in the control of the diphtheria in many countries. However, an important rate of adult population remains susceptible to the illness, since diphtheria protective antibodies decline with time. HIV-1 infection leads to a progressive loss of immune functions. With the increase of life expectancy of HIV-1 patients, and also the increment of infections, it is important to known the antibody levels to diphtheria toxin in these population. The aim of this study was to evaluate the IgG levels to diphtheria toxin and T lymphocytes (LT) counts in HIV-1 infected and non- infected individuals assisted at the Instituto de Biologia do Exército (IBEx), Rio de Janeiro. We investigated the correlation between specific antibody levels and the following parameters of the study groups: gender, age-group, military or civilian origin, previous diphtheria immunization, CD4+ and CD8+ counts. For HIV-1 patients, we also analysed the correlation of specific antibodies with viral load and the use of highly active antiretroviral therapy HAART. A commercial diphtheria-ELISA kit (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) was used to evaluate IgG levels in serum samples of 180 individuals. Blood donors accounted for 75 individuals and 105 subjects were HIV-1 patients. About 60% of individuals were partially protected against diphtheria (specific IgG levels &#8805; 0,1 < 1,0 IU/mL). About 56% of blood donors were protected against diphtheria (specific IgG > 1.0 IU/mL). Howerver, only 29% of HIV-1 patients showed the same level of protective antibodies. For the civilian blood donors, there were no correlation between specific antibody levels and age group. In contrast, a negative correlation was observed in the military group. There were no differences in diphtheria serology according to CD4+ counts of HIV-1 patients or blood donors. Interesting, HAART- treated (n = 84) patients showed a significantly lower antibody response (geomean of 0.39 IU/mL) than untreated patients (geomean of 0.58 IU/mL, n = 19). As tetanus and diphtheria antibodies tend to decrease with time, the difference in age between HAART-treated patients (mean of 46 years) and those not being treated (mean of 35 years) might introduce a bias in the study. Concluding, the existence of susceptible military and civilian adults in our community, including HIV-1 patients, reinforce that reliable seroepidemiological data and immunization campaigns should be routinely stimulated.

Dados sorológicos sobre doenças imunopreveníveis são úteis para avaliar o sucesso de programas de imunização e a identificação de populações suscetíveis. Nos últimos 20 anos, as campanhas de imunização na infância foram eficientes no controle da difteria em muitos países. No entanto, uma taxa importante da população adulta continua suscetível à doença, uma vez que os níveis de anticorpos protetores reduzem com o passar do tempo. A infecção pelo HIV-1 leva a uma perda progressiva das funções imunes. Com o aumento da expectativa de vida dos pacientes HIV-1, e a maior incidência de infecções, torna-se importante a avaliação dos níveis de anticorpos antitoxina diftérica nestes grupos. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis de anticorpos antitoxina diftérica e a contagem de linfócitos T (LT) em indivíduos infectados ou não pelo HIV -1, assistidos no Instituto de Biologia do Exército (IBEx). Investigamos a correlação entre níveis de anticorpos específicos e os seguintes parâmetros dos grupos de estudo: sexo, faixa etária, categoria militar ou civil; vacinação prévia contra difteria; número de LT CD4+ e CD8+; e entre os indivíduos HIV-1 positivos a correlação com a carga viral e a terapia com antirretrovirais potentes (HAART). Para a quantificação de anticorpos antitoxina diftérica utilizou-se um kit ELISA (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) e amostras de sangue de 180 indivíduos, sendo que 75 eram doadores de sangue e 105 eram pacientes positivos para o HIV-1. Aproximadamente 60% dos indivíduos estavam parcialmente protegidos contra a difteria (IgG específica &#8805; 0,1 < 1,0 UI/mL). Entre os doadores de sangue, 56% dos indivíduos estavam protegidos (IgG específica &#8805; 1,0 UI/mL) contra a doença, contra apenas 29 % dos indivíduos positivos para HIV-1. Em relação aos doadores de sangues de origem civil não se observou correlação entre os níveis de IgG e a idade, enquanto que, para os militares observou-se uma correlação inversa. Não houve diferença significativa na resposta de anticorpos para difteria entre os indivíduos soropositivos com CD4+ baixo ou normal. Pacientes com HAART mostraram uma resposta significativamente mais baixa de anticorpos (média geométrica de 0.39 IU/mL, n = 84) do que os pacientes não tratados (média geométrica de 0.58 IU/mL, n = 19). A diferença na idade média dos pacientes não tratados (46 anos) e tratados com HAART (35 anos) provavelmente influenciou estes resultados, já que os níveis de anticorpos contra a difteria declinam com o tempo. A existência em nossa comunidade de adultos (militares e civis) suscetíveis à difteria, incluindo os indivíduos soropositivos, reforça que a imunização a cada 10 anos e os estudos soroepidemiológicos são muito importantes e devem ser estimulados. / Serologic data on diseases that are preventable by vaccine are useful to evaluate the success of immunization programs and to identify susceptible subgroups. In the last 20 years the childhood immunization program has been efficient in the control of the diphtheria in many countries. However, an important rate of adult population remains susceptible to the illness, since diphtheria protective antibodies decline with time. HIV-1 infection leads to a progressive loss of immune functions. With the increase of life expectancy of HIV-1 patients, and also the increment of infections, it is important to known the antibody levels to diphtheria toxin in these population. The aim of this study was to evaluate the IgG levels to diphtheria toxin and T lymphocytes (LT) counts in HIV-1 infected and non- infected individuals assisted at the Instituto de Biologia do Exército (IBEx), Rio de Janeiro. We investigated the correlation between specific antibody levels and the following parameters of the study groups: gender, age-group, military or civilian origin, previous diphtheria immunization, CD4+ and CD8+ counts. For HIV-1 patients, we also analysed the correlation of specific antibodies with viral load and the use of highly active antiretroviral therapy HAART. A commercial diphtheria-ELISA kit (IBL Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Alemanha) was used to evaluate IgG levels in serum samples of 180 individuals. Blood donors accounted for 75 individuals and 105 subjects were HIV-1 patients. About 60% of individuals were partially protected against diphtheria (specific IgG levels &#8805; 0,1 < 1,0 IU/mL). About 56% of blood donors were protected against diphtheria (specific IgG > 1.0 IU/mL). Howerver, only 29% of HIV-1 patients showed the same level of protective antibodies. For the civilian blood donors, there were no correlation between specific antibody levels and age group. In contrast, a negative correlation was observed in the military group. There were no differences in diphtheria serology according to CD4+ counts of HIV-1 patients or blood donors. Interesting, HAART- treated (n = 84) patients showed a significantly lower antibody response (geomean of 0.39 IU/mL) than untreated patients (geomean of 0.58 IU/mL, n = 19). As tetanus and diphtheria antibodies tend to decrease with time, the difference in age between HAART-treated patients (mean of 46 years) and those not being treated (mean of 35 years) might introduce a bias in the study. Concluding, the existence of susceptible military and civilian adults in our community, including HIV-1 patients, reinforce that reliable seroepidemiological data and immunization campaigns should be routinely stimulated.

Corynebacterium diphtheriae, Pseudomonas aeruginosa, Ricinus communis, Shigella dysentariae, and Vibrio cholerae produce AB toxins which share the same basic structural characteristics: a catalytic A subunit attached to a cell-binding B subunit. All AB toxins have cytosolic targets despite an initial extracellular location. AB toxins use different methods to reach the cytosol and have different effects on the target cell. Broad-spectrum inhibitors against these toxins are therefore hard to develop because they use different surface receptors, entry mechanisms, enzyme activities, and cytosolic targets. We have found that grape seed extract provides resistance to five different AB toxins: diphtheria toxin (DT), P. aeruginosa exotoxin A (ETA), ricin, Shiga toxin, and cholera toxin (CT). To identify individual compounds in grape seed extract that are capable of inhibiting the activities of these AB toxins, we screened twenty common phenolic compounds of grape seed extract for anti-toxin properties. Three compounds inhibited DT, four inhibited ETA, one inhibited ricin, and twelve inhibited CT. Additional studies were performed to determine the mechanism of inhibition against CT. Two compounds inhibited CT binding to the cell surface and even stripped bound CT off the plasma membrane of a target cell. Two other compounds inhibited the enzymatic activity of CT. We have thus identified individual toxin inhibitors from grape seed extract and some of their mechanisms of inhibition against CT. This work will help to formulate a defined mixture of phenolic compounds that could potentially be used as a therapeutic against a broad range of AB toxins.

A imunização materna com a vacina acelular para pertussis (dTpa) é uma intervenção adicional que visa fornecer proteção aos recém-nascidos (RN). No entanto, tem sido relatado que altos níveis de anticorpos adquiridos por transferência placentária podem afetar adversamente a resposta imune desses RN após a imunização ativa, devido ao mascaramento antigênico. Neste estudo, avaliamos a aquisição passiva neonatal de anticorpos específicos para pertussis e sua influência na resposta imune celular dos neonatos. A casuística foi composta por gestantes vacinadas com a vacina dTpa (grupo caso, n=66) ou por gestantes que não receberam a vacina (grupo controle, n=101). As concentrações de anticorpos IgG séricos específicos para Bordetella pertussis total (Bp), toxina pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (PRN) foram quantificadas em soro materno e de cordão umbilical de seu respectivo RN, e as concentrações de anticorpos IgA específicos para Bp e PT foram dosadas nas amostras de colostro por meio de ensaio imunoenzimático. A responsividade dos linfócitos do sangue neonatal foi avaliada após estimulação ex vivo com Bp inativada por citometria de fluxo com o intuito de detectar a proliferação, produção de citocinas e fenótipo de ativação dos linfócitos T em um contexto de altas concentrações de IgG específicas adquiridas após a vacinação materna. As concentrações de anticorpos IgG anti-Bp, PT, FHA e PRN foram maiores nas amostras de soro materno e de cordão umbilical do grupo caso quando comparadas ao grupo controle (p < 0,0001), com índices de correlação positivos em ambos os grupos para todos os antígenos estudados (p < 0,0001). As vacinações realizadas entre 26 e 31 semanas de gestação foram associadas com as melhores taxas de transferência placentária, embora índices significativamente menores foram detectados no grupo caso (p < 0,01). As concentrações de anticorpos IgA anti-Bp e anti-PT no colostro não foram afetadas pelo estado vacinal da parturiente. Os ensaios de cultura celular revelaram que os RN responderam ao estímulo com Bp, com maior expressão de CD40L, CD69 e proliferação de células T CD4, em comparação com células não estimuladas. Também foi observada uma menor resposta Th1, enquanto a resposta Th2 foi preservada, em comparação com os adultos, mas sem diferenças entre os grupos de neonatos em nenhum dos parâmetros estudados. Nossos resultados indicam que níveis mais altos de anticorpos IgG específicos para B. pertussis no soro dos RN após a vacinação materna não afetam a resposta imune neonatal mediada por células / Maternal immunization with pertussis acellular vaccine (Tdap) is an additional intervention that provides protection to newborns. However, it has been reported that high antibody levels acquired via placental transfer may adversely affect the immune response of newborns after active immunization due to epitope masking. In this study, we evaluated neonatal passive acquisition of pertussis-specific antibodies and their influence on the neonatal cell-mediated immune response. The sample consisted of pregnant women vaccinated with the Tdap vaccine (case group, n=66) or pregnant women who received no vaccine (control group n=101). Whole-cell Bordetella pertussis (Bp), pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA) and pertactin (PRN)-specific serum IgG concentrations were quantified in paired maternal-cord sera, and Bp- and PT-specific IgA concentrations were evaluated in colostrum samples by immunoenzymatic assay. Ex vivo neonatal blood lymphocyte responsiveness after inactivated Bp stimulation was assessed using flow cytometry to detect the proliferation, cytokine production and activation phenotype of T lymphocytes in the context of high specific IgG concentrations acquired after maternal vaccination. Anti-Bp, PT, FHA and PRN IgG antibody concentrations in maternal and cord serum samples from case group were higher than those in control group (p < 0.0001), with positive correlation indexes in both groups for all pertussis antigens (p < 0.0001). Vaccinations performed between 26 and 31 gestation weeks were associated with the best placental transfer ratios, although significantly lower ratios were detected in case group (p < 0.01). Anti-Bp and anti-PT IgA concentrations in colostrum were not affected by vaccine status. Cell culture assays revealed that newborns responded to Bp stimulation with higher expression of CD40L CD69 and CD4+ T cell proliferation compared to unstimulated cells. It was also observed a lower Th1 response, while a preserved Th2 response compared to adults, but there were no differences between neonatal groups for any of the studied parameters. Our results indicate that higher pertussis-specific IgG levels in newborn sera after maternal vaccination do not affect the neonatal cell-mediated immune response

A imunização materna com a vacina acelular para pertussis (dTpa) é uma intervenção adicional que visa fornecer proteção aos recém-nascidos (RN). No entanto, tem sido relatado que altos níveis de anticorpos adquiridos por transferência placentária podem afetar adversamente a resposta imune desses RN após a imunização ativa, devido ao mascaramento antigênico. Neste estudo, avaliamos a aquisição passiva neonatal de anticorpos específicos para pertussis e sua influência na resposta imune celular dos neonatos. A casuística foi composta por gestantes vacinadas com a vacina dTpa (grupo caso, n=66) ou por gestantes que não receberam a vacina (grupo controle, n=101). As concentrações de anticorpos IgG séricos específicos para Bordetella pertussis total (Bp), toxina pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (PRN) foram quantificadas em soro materno e de cordão umbilical de seu respectivo RN, e as concentrações de anticorpos IgA específicos para Bp e PT foram dosadas nas amostras de colostro por meio de ensaio imunoenzimático. A responsividade dos linfócitos do sangue neonatal foi avaliada após estimulação ex vivo com Bp inativada por citometria de fluxo com o intuito de detectar a proliferação, produção de citocinas e fenótipo de ativação dos linfócitos T em um contexto de altas concentrações de IgG específicas adquiridas após a vacinação materna. As concentrações de anticorpos IgG anti-Bp, PT, FHA e PRN foram maiores nas amostras de soro materno e de cordão umbilical do grupo caso quando comparadas ao grupo controle (p < 0,0001), com índices de correlação positivos em ambos os grupos para todos os antígenos estudados (p < 0,0001). As vacinações realizadas entre 26 e 31 semanas de gestação foram associadas com as melhores taxas de transferência placentária, embora índices significativamente menores foram detectados no grupo caso (p < 0,01). As concentrações de anticorpos IgA anti-Bp e anti-PT no colostro não foram afetadas pelo estado vacinal da parturiente. Os ensaios de cultura celular revelaram que os RN responderam ao estímulo com Bp, com maior expressão de CD40L, CD69 e proliferação de células T CD4, em comparação com células não estimuladas. Também foi observada uma menor resposta Th1, enquanto a resposta Th2 foi preservada, em comparação com os adultos, mas sem diferenças entre os grupos de neonatos em nenhum dos parâmetros estudados. Nossos resultados indicam que níveis mais altos de anticorpos IgG específicos para B. pertussis no soro dos RN após a vacinação materna não afetam a resposta imune neonatal mediada por células / Maternal immunization with pertussis acellular vaccine (Tdap) is an additional intervention that provides protection to newborns. However, it has been reported that high antibody levels acquired via placental transfer may adversely affect the immune response of newborns after active immunization due to epitope masking. In this study, we evaluated neonatal passive acquisition of pertussis-specific antibodies and their influence on the neonatal cell-mediated immune response. The sample consisted of pregnant women vaccinated with the Tdap vaccine (case group, n=66) or pregnant women who received no vaccine (control group n=101). Whole-cell Bordetella pertussis (Bp), pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA) and pertactin (PRN)-specific serum IgG concentrations were quantified in paired maternal-cord sera, and Bp- and PT-specific IgA concentrations were evaluated in colostrum samples by immunoenzymatic assay. Ex vivo neonatal blood lymphocyte responsiveness after inactivated Bp stimulation was assessed using flow cytometry to detect the proliferation, cytokine production and activation phenotype of T lymphocytes in the context of high specific IgG concentrations acquired after maternal vaccination. Anti-Bp, PT, FHA and PRN IgG antibody concentrations in maternal and cord serum samples from case group were higher than those in control group (p < 0.0001), with positive correlation indexes in both groups for all pertussis antigens (p < 0.0001). Vaccinations performed between 26 and 31 gestation weeks were associated with the best placental transfer ratios, although significantly lower ratios were detected in case group (p < 0.01). Anti-Bp and anti-PT IgA concentrations in colostrum were not affected by vaccine status. Cell culture assays revealed that newborns responded to Bp stimulation with higher expression of CD40L CD69 and CD4+ T cell proliferation compared to unstimulated cells. It was also observed a lower Th1 response, while a preserved Th2 response compared to adults, but there were no differences between neonatal groups for any of the studied parameters. Our results indicate that higher pertussis-specific IgG levels in newborn sera after maternal vaccination do not affect the neonatal cell-mediated immune response

Abstract Wnt4, a member of the Wnt family of secreted factors, is essential for kidney organogenesis since the kidney fails to develop in its absence. Besides the kidney, Wnt4 signaling is involved in the control of development of several other organs such as the gonads, adrenal glands and pituitary gland. In the context of the embryonic kidney, Wnt4 signaling induces mesenchymal to epithelial transition of the progenitor cells in the metanephric mesenchyme, an early step in nephrogenesis. Wnt4 signaling may also be relevant in the development of a childhood kidney tumor, the Wilms’ tumor, that involves the function of Wilms’ tumor suppressor protein 1 (WT1). Wilms’ tumor is thought to arise from the early metanephric mesenchymal cells of the embryonic kidney, but the detailed mechanisms are not known. The main aim of this project was to study the mechanisms that regulate expression of the Wnt4 gene by using immortalized embryonic kidney mesenchyme-derived mK4 cells as a model. The Wnt4 gene expression was also analyzed in vivo in the frog embryonic pronephros. Through the use of reporter assays and a two-hybrid screen, Sox11, a member of the SoxC family of transcription factors, was identified as a synergistic protein that interacts with WT1. Immunoprecipitation studies provided further evidence that Sox11 and WT1 may physically interact with each other in the developing embryonic kidney. Indeed, Sox11 and WT1 may regulate the Wnt4 gene expression in vivo since the morpholino-based knock-down of either WT1 or Sox11 led to notable downregulation of the Wnt4 gene expression in the frog embryonic pronephros. The other general aim of this thesis was to develop novel tissue targeting and therapy tools to the cell lineages regulated by the Wnt4 signals, including the podocytes. For this purpose, we utilized mice carrying a floxed expression cassette for the avidin-LDL receptor fusion protein, Lodavin, in the constitutively active Rosa-26 locus. Three Cre driver mice, including the Wnt4-Cre knock-in line, were used to activate Lodavin expression in the respective cells of the embryonic kidney. Moreover, we generated a podocyte injury model by expressing the human receptor for diphtheria toxin specifically in the podocytes. This was achieved by crossing mice containing a floxed expression cassette for this receptor in the Rosa-26 locus with those expressing the Cre recombinase under the nephrin promoter. Administration of diphtheria toxin led initially to podocyte damage only, followed by a progression to glomerular sclerosis. As a summary, Sox11 and WT1 serve as synergistic transcription factors that may regulate expression of the Wnt4 gene in vivo. The transgenic mouse models generated and used provide the basis to generate acute and chronic kidney disease models and the potential to purify the respective cells for developing cell-based therapy avenues for the kidney. Moreover, the Lodavin-based approaches may enable targeted delivery of biotinylated small compounds, proteins, viruses or even cells and novel means for in vivo imaging and functional studies. / Tiivistelmä Wnt-4 kuuluu signaloivien proteiinien Wnt-perheeseen ja sen toiminta on välttämätöntä munuaisen kehityksessä. Ilman Wnt-4 proteiinia munuainen ei kehity. Munuaisen lisäksi Wnt4-signalointi on mukana useiden muiden elinten, kuten sukurauhasten, lisämunuaisen ja aivolisäkkeen säätelyssä. Alkion munuaisessa Wnt4-signalointi saa aikaan mesenkymaalisen kantasolukon epitelisoitumisen, edustaen näin ollen nefronin kehityksen varhaisia vaiheita. Wnt4-signaloinnilla on myös merkittävä asema lapsuusiän munuaiskasvaimen, niin kutsutun Wilmsin kasvaimen kehittymisessä. Tämän tyyppisessä kasvaimessa keskeisenä on Wilmsin tuumoriproteiinin WT1:n toiminta, mutta myös Wnt4:n toiminnalla voi olla merkitystä. Wilmsin kasvaimen arvellaan saavan alkunsa varhaisista sikiöaikaisista jälkimunuaisen soluista, mutta yksityiskohtaisia mekanismeja ei vielä tunneta. Tämän projektin tarkoituksena oli tutkia Wnt4-geenin ilmentymistä sääteleviä mekanismeja käyttäen mallina mK4-soluja eli alkion munuaisesta saatuja, immortalisoituja soluja. Wnt4-geenin ilmentymistä analysoitiin myös in vivo sammakon alkion alkumunuaisessa. Tuplahybridi-analysoinnin avulla tunnistettiin transkriptiotekijäperhe SoxC:n jäsen Sox11 samantoimiseksi proteiiniksi transkriptiotekijä WT1:n kanssa Wnt4-geenin ilmentymisen säätelyssä. Immunopresipitaatiotutkimukset tukivat ajatusta, että Sox11 ja WT1 voisivat olla fyysisessä vuorovaikutuksessa säädellessään nefroninmuodostuksen alullepanossa ratkaisevan Wnt4-geenin ilmentymistä. Sox11 ja WT1 voivat mahdollisesti säädellä Wnt4-geenin ilmentymistä myös in vivo, sillä morfoliineihin perustuvissa kokeissa sekä WT1:n että Sox11:n hiljennys laski Wnt4-geenin ilmentymistasoa sammakon alkumunuaisessa. Tämän väitöstutkimuksen toinen yleinen tavoite oli kehittää uusia kudoskohdennus- ja terapiakeinoja Wnt4-signaloinnin säätelemille solulinjoille, kuten podosyyteille. Tätä tarkoitusta varten kloonattiin siirtogeeninen hiiri, jossa floksattu avidiini-LDL -reseptorifuusioproteiini, Lodavin, kohdennettiin jatkuvasti aktiiviseen Rosa-26 -lokukseen. Kolmea eri Cre-hiirilinjaa käytettiin aktivoimaan Lodavinin ilmentyminen kussakin tietyssä alkion munuaisen solupopulaatiossa. Yksi näistä Cre-linjoista oli Wnt4-Cre. Jotta kyettäisiin vahingoittamaan samoja soluja, jotka ilmentävät Lodavinia, hyödynnettiin difteriamyrkyn ihmisen reseptoria (iDTR). IDTR:n ilmentäminen tietyissä hiiren soluissa tekee ne alttiiksi tappavalle difteriamyrkylle. IDTR-perusteisen munuaisvauriomallin kehittämiseksi käytettiin floksattua iDTR-hiirimallia, ja geenin ilmentyminen aktivoitiin Wnt4-indusoiduissa munuaissolulinjoissa, erityisesti podosyyteissä Nephrin Cre -välitteisesti. NephrinCre;R26RiDTR hiiriä altistettiin difteriamyrkylle ja niiden munuaiskerästen muutoksia seurattiin. Tutkimukset antavat viitteitä siitä, että R26R-floksatut iDTR-hiiret toimivat hyvänä mallina kehitettäessä sekä akuutteja että kroonisia munuaistautimalleja. Yhteenvetona voidaan todeta, että Sox-11 ja WT-1 ovat samantoimisia transkriptiotekijöitä, jotka voivat säädellä Wnt4-geenin ilmentymistä in vivo. Tutkimuksessa kehitetyt ja käytetyt siirtogeeniset hiirimallit tarjoavat perustan kehittää sekä akuutteja että kroonisia munuaistautimalleja. Samalla ne mahdollistavat kulloistenkin solujen eristämisen uusien soluperusteisten hoitomenetelmien kehittelemiseksi. Lisäksi Lodavin-perusteiset lähestymistavat voivat mahdollistaa biotinyloitujen pienten yhdisteiden, proteiinien, virusten tai jopa solujen kuljetuksen kohdennetusti sekä avata uusia mahdollisuuksia in vivo -kuvantamiselle ja toiminnallisille tutkimuksille.