Cigarette smoking is a complex mixture of many constituents identified, among them reactive substances (reactive oxygen and nitrogen species), which are capable of initiating or promoting oxidative damage. Lungs and brain are affected by cigarette smoke exposure. Exposure to cigarette smoke is related to development of diseases in children and adults. However, children are more susceptible than adults to damage caused by cigarette smoke. Thus, the use of antioxidants is a good alternative to protect tissues of oxidative damage caused by cigarette smoke exposure. Diphenyl diselenide [(PhSe)2] is an organoselenium compound that presents pharmacological effects, among them the antioxidant effect. Nevertheless, the mechanism involved in antioxidant effect of (PhSe)2 was not been elucidated. Therefore, this study was performed to study the effects of cigarette smoke passive exposure in lungs and brain of rat pups in two experimental protocols of oxidative stress. Moreover, the antioxidant effect of (PhSe)2 in these experimental protocols was studied. Besides, the mechanisms involved in the antioxidant effect of (PhSe)2 were investigated. Rat pups that were exposed to two experimental protocols were used. In a first experimental protocol (P1), the effect of exposure to one, two and three cigarettes during the first, second and third weeks of live, respectively, was studied. In a second experimental protocol (P2), the effect of exposure to four, five and six cigarettes during the first, second and third weeks of life, respectively, was carried out. The duration of each exposure was 15 min. Animals were exposed to cigarette smoke during 20 days (3 weeks). Immediately before each exposure, animals that were treated with (PhSe)2 received daily an oral dose of 0.5 mg/kg. At the end of the experimental exposure period (3 weeks), rat pups were euthanized, and lungs and brain were removed for analyses of lipid peroxidation, enzymatic antioxidant defenses (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx), glutathione S-transferase (GST) activities) and non-enzymatic defenses (non-protein thiols (NPSH) and ascorbic acid levels). Rat pups were daily weighed, before each exposure. The weight of animals was not changed after cigarette smoke exposure neither to P1 nor to P2. In both experimental protocols, animals that were exposed to cigarette smoke showed an increase in lipid peroxidation in lungs. In brain, an increase in thiobarbituric acid reactive species (TBARS) was observed only in P2. Levels of non-enzymatic antioxidant defenses decreased in lungs of animals exposed to P1 and P2. In brain, exposure to P1 increased ascorbic acid levels and exposure to P2 reduced NPSH and ascorbic acid levels. Enzymatic antioxidant defenses changed in P2 in lungs of rat pups. In brain, the activity of CAT was reduced after exposure to P1, while SOD and CAT activities were decreased after exposure to P2. Treatment with (PhSe)2 restored the oxidative damage caused by cigarette smoke exposure in lungs and brain of rat pups. Moreover, NPSH levels, ascorbic acid content and GST activity showed an increase per se in lungs of animals treated with (PhSe)2. The mechanisms involved in antioxidant effect of (PhSe)2 (1 - 50 μM) were studied. To this end, dehydroascorbate (DHA) reductase and GST activities were determined. (PhSe)2 at concentration of 5 μM demonstrated DHA reductase and GST-like activities. Furthermore, the scavenger effect of 2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ) radical and 2,2 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS +) radicals, and the protection of Fe2+ autooxidation were studied. However, the compound had no scavenger effect or protected Fe2+ autooxidation, discarding that these mechanisms are involved in the antioxidant effect of (PhSe)2. Synthesis of glutathione (GSH) was also studied as a possible mechanism involved in antioxidant effect of (PhSe)2. For this, buthionine sulfoximine (BSO), a substance that inhibits γ-glutamilcystheine synthase activity, an enzyme involved in the synthesis of GSH was used. BSO blocked the protective effect of (PhSe)2 in reducing NPSH levels caused by cigarette smoke passive exposure in lungs and liver of rat pups. In this study it was concluded that (PhSe)2 had antioxidant effect by different mechanisms. The action of (PhSe)2 to increase NPSH and ascorbic acid levels, and GST activity is one of mechanisms of the antioxidant effect of this compound. (PhSe)2 presented DHA reductase and GST-like activities, demonstrating a new mechanism of antioxidant effect of the compound. Furthermore, the synthesis of GSH is involved in the antioxidant role of (PhSe)2, since blocking the synthesis of GSH, presented the antioxidant effect of this compound. / A fumaça do cigarro é uma mistura complexa de diversos constituintes identificados, entre eles, substâncias reativas (espécies reativas de oxigênio e nitrogênio), as quais podem estar relacionadas com o desenvolvimento de várias doenças em adultos e crianças. Os pulmões e cérebro estão entre os órgãos mais afetados pela exposição à fumaça do cigarro. Entretanto, as crianças são mais suscetíveis aos danos causados pela exposição passiva à fumaça do cigarro do que os adultos. Para proteger os tecidos do dano oxidativo causado por esta exposição são utilizados antioxidantes. O disseleneto de difenila [(PhSe)2] é um composto orgânico de selênio que apresenta diversos efeitos farmacológicos descritos, entre eles, o antioxidante. Entretanto, o mecanismo pelo qual este composto exerce seus efeitos antioxidantes ainda não foi elucidado. Portanto, o presente trabalho visa estudar os efeitos da exposição passiva à fumaça do cigarro nos pulmões e no cérebro de ratos jovens, em dois protocolos experimentais de estresse oxidativo, e verificar o papel protetor do (PhSe)2 nestes protocolos. Além disso, investigaram-se os mecanismos envolvidos no efeito antioxidante desse composto. Para isso, foram utilizados ratos jovens que foram submetidos a dois protocolos experimentais de estresse oxidativo. Em um primeiro protocolo experimental (P1) verificou-se o efeito da exposição passiva à fumaça de um, dois e três cigarros nas primeira, segunda e terceira semanas de vida, respectivamente. Em um segundo protocolo experimental (P2) foi verificado o efeito da exposição passiva à fumaça de quatro, cinco e seis cigarros nas primeira, segunda e terceira semanas de vida, respectivamente. Todos os animais em ambos os protocolos experimentais foram expostos à fumaça do cigarro diariamente, 15 minutos cada exposição, por um período de 20 dias. O animais que foram tratados com o (PhSe)2, receberam diariamente pela via oral a dose de 0,5 mg/kg, imediatamente antes de cada exposição. No 21° dia, os animais foram eutanasiados e os pulmões e cérebro foram retirados para a análise da peroxidação lipídica (níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico TBARS), das defesas antioxidantes enzimáticas (atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-transferase (GST)), das defesas antioxidantes não-enzimáticas (níveis de tióis não-protéicos (SHNP) e ácido ascórbico) e da atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D). Os animais foram pesados diariamente, antes de cada exposição. O peso dos animais não alterou após a exposição à fumaça do cigarro em nenhum grupo experimental, em nenhum dos protocolos. Nos P1 e P2, os animais que foram expostos à fumaça do cigarro apresentaram um aumento da peroxidação lipídica no pulmão. Entretanto no cérebro, o aumento no TBARS foi verificado apenas no P2. Em relação às defesas antioxidantes não-enzimáticas, foi observado uma redução nos níveis dos parâmetros estudados nos animais expostos ao P1 e P2. Enquanto no cérebro, a exposição ao P1 aumentou os níveis de ácido ascórbico e a exposição ao P2 reduziu os níveis de SHNP e de ácido ascórbico. Quanto às defesas antioxidantes enzimáticas, elas alteraram no pulmão apenas no P2. No cérebro, a atividade da CAT reduziu após a exposição ao P1, e a exposição ao P2 reduziu a atividade da CAT e da SOD. A atividade da δ-ALA-D foi alterada no P1 no pulmão e no P2 no cérebro. O tratamento com (PhSe)2 restaurou os danos causados pela exposição passiva à fumaça do cigarro nos pulmões e cérebro dos ratos jovens. Além disso, os níveis de SHNP, o conteúdo de ácido ascórbico e a atividade da GST apresentaram um aumento per se nos pulmões dos animais tratados com (PhSe)2. Para estudar o mecanismo pelo qual o (PhSe)2 apresentou efeito antioxidante, verificou-se o efeito mimético in vitro deste composto orgânico de selênio (1 - 50μM) na atividade das enzimas dehidroascobato (DHA) redutase e GST. O (PhSe)2 a partir da concentração de 5μM apresentou efeito mimético da atividade destas enzimas. Além disso, estudou-se o efeito do (PhSe)2 (10 - 50μM) como scavenger dos radicais 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH ) e 2,2 -azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS +), e na proteção da auto-oxidação do Fe2+. Entretanto, o composto não apresentou efeito scavenger, nem protegeu da auto-oxidação do Fe2+, descartando que esses mecanismos estariam envolvidos na ação antioxidante do composto. O envolvimento na síntese da glutationa (GSH) também foi estudado na tentativa de explicar os mecanismos pelos quais o (PhSe)2 apresenta efeito antioxidante. Para isso, foi utilizado a butionina sulfoximina (BSO), uma substância que inibe a γ-glutamilcisteína sintetase, uma enzima envolvida na síntese da GSH. Verificou-se que o BSO bloqueou o efeito protetor do (PhSe)2 na redução dos níveis de SHNP provocada pela exposição passiva à fumaça do cigarro no pulmão e fígado de ratos jovens. Com o presente trabalho conclui-se que o (PhSe)2 apresenta efeito antioxidante por diferentes mecanismos. A ação do (PhSe)2 em aumentar os níveis de SHNP, ácido ascórbico e a atividade da GST é um dos mecanismos do efeito antioxidante deste composto. O (PhSe)2 apresentou atividade DHA redutase e GST-like, demonstrando um novo mecanismo do efeito antioxidante do composto. Além disso, a síntese da GSH está envolvida no efeito antioxidante do (PhSe)2, uma vez que, bloqueando a síntese da GSH, ocorre um bloqueio no efeito antioxidante do composto.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The physiological state of menopause is characterized by an irreversible loss of ovarian function, with a resulting decrease in estrogen production, leading to the appearance of metabolic, cognitive, and behavioral alterations. For this reason, understanding how the decrease in the estrogen production contributes to the progress of menopausal symptoms can be very useful for the development of alternative therapies than hormone replacement therapy. In this context, the data show that ovariectomized Wistar rats treated with (PhSe)2 at a dose of 5 mg/kg once a day for 30 days presented lower plasma triglyceride levels and increased HDL levels when compared to control ones. Moreover, (PhSe)2 administration reduced the weight gain and fat abdominal accumulation induced by ovariectomy. It was also observed that (PhSe)2 treatment improved hepatic oxidative stress parameters in ovariectomized rats (ascorbic acid and reduced glutathione levels, and glutathione S-transferase and catalase activities). Additionally, (PhSe)2 treatment at a dose of 5 mg/kg once a day for 30 days improved the performance of ovariectomized Wistar rats in the Morris Water Maze test, possibly by inhibiting the increase in brain acetylcholinesterase activity induced by ovariectomy. The present results suggest a promising role of (PhSe)2 against the cognitive decline related to menopause. The transition to menopause is associated with an increased risk of depressed mood. On this bases, the obtained results demonstrate that the prolongation of immobility time in the tail suspension test and forced swimming test in ovariectomized mice submitted to subchronic stress protocol was prevented by (PhSe)2 treatment at a dose of 10 mg/kg. It was also found a possible involvement of the serotonin system in this effect, demonstrated by the modulation of 5-HT2A/2C and 5-HT3 receptor subtypes. Although (PhSe)2 had inhibited in vitro monoamine oxidase A and B activities, treatment of ovariectomized mice with (PhSe)2 did not alter neither MAO-A nor MAO-B ex vivo activity. These findings suggest that (PhSe)2 treatment could influence mood and behavior in postmenopausal women. In order to investigate a possible mechanism of action for the hypocholesterolemic effect of (PhSe)2 it was observed that (PhSe)2 treatment increases the LDL receptor levels and augment the adenosine monophosphate (AMP)-activated kinase (AMPK) activation state without inhibiting directly 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) enzyme activity in HepG2 cell cultures. These findings are in accordance with those from in vivo studies previously published. In addition, L6 skeletal muscle cells treated with (PhSe)2 presented an augment in glucose transporter 4 (GLUT4) translocation from the cytosol to the cell membrane via an increase in AMPK phosphorylation state, which could be linked to the hypoglycemic properties presented by (PhSe)2 in other studies. In conclusion, the body of evidence presented in this thesis points to the use of (PhSe)2 as a promising alternative therapy for the management of postmenopausal symptoms. However, it is important to mention that the global net effects of (PhSe)2 still need to be better described in order to identify possible negative side effects. / A menopausa caracteriza-se pela suspensão irreversível da função ovariana, com declínio da produção de hormônios estrogênicos. A falta desses hormônios culmina no aparecimento de alterações metabólicas, cognitivas e comportamentais. Por essa razão, entender de que maneira a depleção de hormônios ovarianos contribui para o surgimento dos sintomas característicos da menopausa pode ser extremamente útil para o desenvolvimento de tratamentos alternativos à terapia de reposição hormonal. Nesse contexto, os dados aqui apresentados demonstram que ratas Wistar ovariectomizadas que foram tratadas com disseleneto de difenila [(PhSe)2] na dose de 5 mg/kg uma vez ao dia durante um período de 30 dias possuíam reduzidos níveis plasmáticos de triglicerídeos e aumentados níveis de HDL quando comparadas as ratas controle não ovariectomizadas. Além disso, a administração de (PhSe)2 foi capaz de reduzir o ganho de peso e o acúmulo de gordura abdominal nas ratas ovariectomizadas. Também foi observado que o tratamento com (PhSe)2 melhorou parâmetros hepáticos relacionados a estresse oxidativo nas ratas ovariectomizadas (níveis de ácido ascórbico e glutationa reduzida (GSH) e atividade das enzimas glutationa S-transferase e catalase). O tratamento com (PhSe)2 na dose de 5 mg/kg uma vez ao dia durante um período de 30 dias também melhorou o desempenho das ratas Wistar ovariectomizadas no teste do Labirinto Aquático de Morris, possivelmente por impedir o aumento da atividade da enzima acetilcolinesterase cerebral observado nas ratas ovariectomizadas. Dessa forma, os resultados sugerem um possível efeito benéfico do (PhSe)2 para o tratamento do declínio cognitivo associado a menopausa. Ainda com relação aos sintomas apresentados pelas mulheres durante a menopausa, dados da literatura mostram que a transição para a menopausa associa-se a um risco aumentado para o aparecimento de sintomas do tipo depressivos. Com base nisso, foi evidenciado que fêmeas ovariectomizadas de camundongos Swiss submetidas a um protocolo de estresse sub-crônico apresentavam aumento no tempo de imobilidade nos testes de Suspensão da Cauda e do Nado Forçado, ambos preditivos de comportamento do tipo depressivo.Também foi observado que esse prolongamento no tempo de imobilidade apresentado pelas fêmeas ovariectomizadas foi prevenido pelo tratamento com (PhSe)2 na dose de 10 mg/kg administrado 30 minutos antes de cada exposição ao protocolo de estresse. Além disso, evidenciou-se o envolvimento dos receptores de serotonina do tipo 5-HT2A/2C e 5-HT3 no efeito do tipo antidepressivo apresentado pelo (PhSe)2. Embora o (PhSe)2 tenha inibido a atividade de ambas isoformas da enzima monoamino oxidase (MAO-A e MAO-B) in vitro, não foi observada inibição da atividade de tais enzimas quando sua atividade foi determinada ex vivo. Com base nesses resultados sugere-se que o tratamento com (PhSe)2 pode influenciar aspectos relacionados ao humor e ao comportamento em mulheres no período pós-menopausa. No intuito de elucidar os mecanismos envolvidos no efeito hipocolesterolêmico do (PhSe)2 em culturas de células HepG2 observou-se que este composto orgânico de selênio leva a um aumento nos níveis de receptores de LDL e a um aumento no estado de ativação da enzima adenosina monofosfato (AMP) quinase (AMPK), sem inibir diretamente a atividade da HMG-CoA redutase. Esses resultados corroboram com os achados de outros trabalhos, os quais demonstram um efeito hipocolesterolêmico do (PhSe)2 in vivo. Além disso, também foi buscado um possível mecanismo para o efeito hipoglicemiante apresentado pelo (PhSe)2 em trabalhos anteriores: resultados obtidos a partir de culturas de células L6 (células de músculo esquelético de ratos), sugerem que o (PhSe)2 aumenta a translocação do transportador de glicose 4 (GLUT4) do citosol para a membrana celular devido a um aumento no estado de ativação da enzima AMPK. Em conclusão, o conjunto de resultados apresentado nesta tese aponta o uso do (PhSe)2 como uma terapia alternativa bastante promissora para o tratamento de algumas das principais conseqüências da menopausa, a saber aumento no ganho de peso, dislipidemia, prejuízos cognitivos e ocorrência de episódios depressivos. Entretanto, faz-se importante mencionar que os efeitos globais do (PhSe)2 ainda precisam ser melhor caracterizados no intuito de verificar a existência de possíveis efeitos adversos.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / The compound 2,2 -dithienyl diselenide (DTDS), an organoselenium compound with thiophene moieties, has been proven to be a promising antioxidant in vitro and in vivo, as well as an antifungal and antimicrobial agent. However, its toxicity, an important point to be investigated, has not been evaluated. The objective of this study was to evaluate whether DTDS has potential toxicity in vitro or in vivo. For this reason, sulfhydryl enzyme activities, such as δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) and Na+, K+-ATPase were assessed to predict in vitro DTDS toxicity in rat brain homogenate, in addition to its thiol oxidase-like activity. In other section of experiments, DTDS was administered to rats (50 or 100 mg/kg; per orally) in order to determine toxicological parameters in vivo. Plasma samples were collected in order to measure the biochemical parameters: alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase activities and urea and creatinine levels. Besides, in brain homogenates, it was determined the activity of the enzymes δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase, as well as lipid peroxidation levels and antioxidant defenses (catalase and superoxide dismutase activities and ascorbic acid and reduced glutathione levels). The compound DTDS inhibited in vitro both δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities (IC50 2 μM and 17 μM, respectively). The DTDS inhibitory effect on δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities was restored by dithiol dithiothreitol. In addition, DTDS (5-25 μM) showed a thiol oxidase-like activity. In vivo, DTDS (50 and 100 mg/kg) caused a decrease in food and water intakes and the loss of body weight, indicating systemic toxicity, even causing death of the animals. At a dose of 100 mg/kg, DTDS decreased urea levels and increased plasma alanine and aspartate aminotransferase activities. Lipid peroxidation was increased in both administered doses. Moreover, in the highest dose, DTDS inhibited δ-ALA-D activity. By contrast, neither Na+, K+-ATPase activity nor antioxidant defenses were altered in the brain of rats exposed to DTDS. In conclusion, the interaction with thiol groups of sulfhydryl enzymes seems to mediate the inhibitory effect of DTDS against δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities in vitro. Furthermore, in the administered doses, DTDS causes cerebral and systemic toxicity in rats. Although other studies are necessary to give more information about this specific compound, our findings contribute to the knowledge on the toxicology of DTDS, a compound with pharmacological properties. / O composto 2,2 -disseleneto de ditienila (DSDT), um composto orgânico de selênio com grupamento tiofeno, fora comprovado como um promissor antioxidante in vitro e in vivo, assim como um agente antifúngico e antimicrobiano. Entretanto, sua toxicidade ainda não fora avaliada, representando um importante ponto a ser investigado. O objetivo deste estudo foi avaliar se o DSDT apresenta potencial toxicidade in vitro ou in vivo. Para este fim, a atividade de enzimas sulfidrílicas, como δ-aminolevulato desidratase (δ-ALA-D) e Na+, K+-ATPase fora testada para predizer a toxicidade in vitro do DSDT em homogeneizado de cérebro de ratos, bem como a sua atividade tipo-tiol oxidase. Em outra seção de experimentos, o DSDT foi administrado em ratos (50 ou 100 mg/kg; oralmente) com o intuito de determinar parâmetros toxicológicos in vivo. Amostras de plasma foram retiradas para dosagem dos parâmetros bioquímicos: atividade das enzimas alanina (ALT) e aspartato (AST) aminotrasferase e níveis de ureia e creatinina. Além disso, em homogeneizado de cérebro foram dosadas a atividade das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase, assim como os níveis de peroxidação lipídica e as defesas antioxidantes (atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase e níveis de ácido ascórbico e glutationa reduzida). O composto DSDT inibiu in vitro, tanto a atividade da δ-ALA-D quanto da Na+, K+-ATPase (IC50 2μM e 17μM, respectivamente). O efeito inibitório do DSDT sobre a atividade das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase foi restaurado pelo ditiol ditiotreitol. Adicionalmente, DSDT (5-25μM) apresentou atividade do tipo-tiol oxidase. In vivo, o DSDT (50 e 100 mg/kg) causou uma diminuição no consumo de comida e água e perda de peso corporal, evidenciando toxicidade sistêmica, causando inclusive morte de ratos. Quando administrado na dose de 100 mg/kg, DSDT diminui os níveis de ureia e aumentou a atividade plasmática da ALT e da AST. Os níveis de peroxidação lipídica encontraram-se aumentados em ambas as doses administradas. Na maior dose, o DSDT inibiu a atividade da δ-ALA-D. Em contrapartida, nem a atividade da Na+, K+-ATPase nem as defesas antioxidantes foram alteradas no cérebro de ratos expostos ao DSDT. Em conclusão, a interação com grupos tióis de enzimas sulfidrílicas parece mediar o efeito inibitório do DSDT em relação a atividade da δ-ALA-D e da Na+, K+-ATPase in vitro. Além disso, nas doses administradas, o DSDT induz toxicidade cerebral e sistêmica em ratos. Embora outros estudos sejam necessários para fornecer mais informações sobre este composto em específico, estes dados contribuem para o conhecimento sobre a toxicologia do DSDT, um composto com propriedades farmacológicas.

The liver presented exceptional characteristics, like controlling energy production, immunological defenses, and blood reserve. In the environment like in the work place, the human is exposed to a different kind of hepatotoxic compounds, for example, on inks and derivatives (2-nitropropane), chemical reagents (carbon tetrachloride) and in tobacco smoke (2-nitropropane and cadmium). In fact, is interesting studies of therapies which protect or ameliorated the damage induced by these compounds. Considering the growing interesting around organochalcogens, in special interest, diphenyl diselenide (PhSe)2, which posses important pharmacological properties, such as: anti-ulcer, antiinflammatory, antinociceptive, anti-hyperglycemic, protected against orofacial diskinesia induced by reserpine and halopheridol and may act on memory facilitation in mice, the hepatoprotective properties of this compound induced by different models of liver damage (2-nitropropane, cadmium and carbon tetrachloride) were examined. The results demonstrated that (PhSe)2 (100 µmol/kg) significantly reduced hepatic markers levels when compared to 2-nitropropane (2-NP) group. Treatment with diphenyl diselenide, at all doses, effectively protects against the increase of lipid peroxidation when compared to 2-NP group. In addition, histological examination revealed that 2-NP treatment causes a moderate swelling and degenerative alterations on hepatocytes and (PhSe)2 protects against these alterations. This study evidences the protective effect of diphenyl diselenide by 2-NP-induced acute hepatic damage. In addition the effect of post-treatment with (PhSe)2 on liver damage induced by 2-NP was also examined. (PhSe)2 effectively restored the increase of aminotransferase activities and urea level when compared to the 2-NP group. At the highest dose (100 mol/kg), (PhSe)2 decreased -glutamyl transferase activity (GGT) and ameliorated the increase of hepatic and renal lipid peroxidation when compared to 2-NP group. 2-NP reduced catalase activity (CAT) and did not alter superoxide dismutase activity (SOD) nor ascorbic acid level. This study points out the involvement of CAT activity in 2-NP-induced acute liver damage and suggests that the post-treatment with diphenyl diselenide was effective in restoring the hepatic damage induced by 2-NP. Similar results were obtained with cadmium (Cd), an environmental toxic metal implicated in human diseases. Cadmium content determined in the tissue of rats exposed to cadmium chloride (CdCl2) provides evidence that the liver is the major cadmium target. The concentration of cadmium in liver was about three fold higher than that in kidney, and (PhSe)2 reduced about six fold the levels of this metal in liver of rats exposed. Rats exposed to CdCl2 showed histological alterations abolished by (PhSe)2 administration. In addition, (PhSe)2 administration ameliorated plasma malondialdehyde (MDA) levels, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), lactate dehydrogenase (LDH) and GGT activities increased by CdCl2 exposure. In conclusion, this study demonstrated that co-treatment with (PhSe)2 ameliorated hepatotoxicity and cellular damage in rat liver after sub-chronic exposure with CdCl2. The proposed mechanisms by which (PhSe)2 acts in this experimental protocol are its antioxidant properties and its capacity to form a complex with Cd. On the contrary, the administration of (PhSe)2 potentiated acute hepatic damage induced by carbon tetrachloride (CCl4), as manifested by an increase in biochemical parameters (AST, ALT, ALP, GGT and BT) and severe alteration in histopathology. This study also demonstrated a potentiation of lipid peroxidation levels and a consequent depletion of important antioxidant defenses including catalase and ascorbic acid, suggesting that the oxidative damage is related to the potentiation effect induced by (PhSe)2. Considering the results obtained, could be suggested that (PhSe)2 present a hepatoprotective effect depending of experimental protocol. / O fígado apresenta extraordinária pluralidade funcional, destacando-se no controle de produção de energia, defesa imunológica e reserva volêmica. No meio ambiente e ocupacionalmente, o ser humano está exposto a uma variedade de compostos hepatotóxicos, como por exemplo, no uso de tintas e seus derivados (2-nitropropano), reagentes químicos (tetracloreto de carbono) e na exposição ao cigarro (cádmio e 2-nitropropano). Portanto, é interessante o estudo de terapias que previnam ou até mesmo revertam à intoxicação causada por estes compostos. Considerando o crescente interesse por compostos orgânicos de selênio, em especial o disseleneto de difenila ((PhSe)2) que possui propriedades farmacológicas mais amplas como: efeitos anti-úlcera, antiinflamatório e antinociceptivo, anti- hiperglicemiante, protege contra a discinesia orofacial induzida por reserpina e haloperidol e pode atuar na facilitação da formação de memória em camundongos. Deste modo, os efeitos hepatoprotetores deste composto frente a diferentes modelos de dano hepático (2-nitropropano, cádmio e tetracloreto de carbono) foram examinados. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a administração de (PhSe)2 (100 µmol/kg) reduziu os níveis de marcadores hepáticos e os níveis de peroxidação lipídica quando comparado ao grupo tratado com 2-nitropropano (2-NP). Além disso, os exames histológicos revelaram que o tratamento com 2-NP causou alterações degenerativas nos hepatócitos e que o (PhSe)2 foi capaz de proteger, evidenciando o efeito hepatoprotetor desse composto sobre o dano hepático induzido por 2-NP. O efeito do pós-tratamento com (PhSe)2 sobre o dano hepático induzido com 2-NP também foi investigado. Este composto restaurou a atividade plasmática das enzimas aminotransferases e os níveis de uréia quando comparado ao grupo tratado com 2-NP. Na maior dose (100 mol/kg), o (PhSe)2 causou uma diminuição na atividade da enzima -glutamil transferase (GGT) e restituiu o aumento nos níveis de peroxidação lipídica hepáticos e renais quando comparado ao grupo tratado com 2-NP. O tratamento com 2-NP reduziu a atividade hepática da catalase, entretanto não alterou a atividade da superóxido dismutase (SOD) e os níveis de ácido ascórbico, sugerindo que a inibição da CAT pode estar relacionada com o aumento nos níveis de peroxidação lipídica hepática nos ratos tratados com 2-NP. Resultados similares foram encontrados quando o dano hepático foi induzido por cádmio (Cd), um contaminante ambiental implicado em várias doenças. O conteúdo de Cd determinado nos ratos expostos ao cloreto de cádmio (CdCl2) provêm evidências de que o fígado é o maior alvo da toxicidade deste metal. A concentração de cádmio no fígado foi em torno de 3 vezes maiores que os níveis encontrados no rim. O (PhSe)2 reduziu em torno de 6 vezes os níveis deste metal no fígado dos ratos expostos ao CdCl2. Além disso, a administração de (PhSe)2 causou uma redução nos níveis de malondialdeído plasmáticos (MDA), na atividade das aminotransferases, na fosfatase alcalina (ALP), lactato desidrogenase (LDH) e GGT quando comparado ao grupo tratado com cádmio. Em conclusão, esse estudo demonstrou que o tratamento concomitante com (PhSe)2 reduziu a hepatotoxicidade e o dano celular em fígado de ratos expostos ao cádmio. O mecanismo proposto para ação do (PhSe)2 pode ser devido as suas propriedades antioxidantes ou pela sua capacidade de formar um complexo com Cd. Em contraste, a administração de (PhSe)2 potencializou o dano induzido por tetracloreto de carbono (CCl4), o que foi demonstrado pelo aumento dos níveis de marcadores bioquímicos (AST, ALT, ALP, GGT and BT) e pela severa alteração na histologia. Esses estudos também demonstraram que a administração de (PhSe)2 potencializou os níveis de peroxidação lipídica com consequente depleção das defesas antioxidantes, como a catalase e o ácido ascórbico, sugerindo que o dano oxidativo está relacionado com este efeito. Considerando os resultados obtidos, podemos sugerir que o disseleneto de difenila apresenta um efeito hepatoprotetor dependendo do modelo experimental.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this study, acute effects of mercury on mouse blood, kidneys and liver were evaluated. Mice received a single dose of mercuric chloride (HgCl2 - 4.6 mg/kg, subcutaneously) for three consecutive days. We investigated the possible beneficial effects of antioxidant therapy (N-acetylcysteine (NAC) and diphenyl diselenide (PhSe)2) comparing to sodium salt of 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid (DMPS), an effective chelating agent on mercury exposure in mice. We also verified if metallothionein (MT) induction would be involved in a possible mechanism of protection against mercury poisoning and if different therapies would modify MT levels and other toxicological parameters. The results demonstrated that animals treated with mercuric chloride presented a reduction in the body weight gain and therapies did not were effective in reverting this damage. HgCl2 exposure inhibited δ-aminolevulinic dehydratase (δ-ALA-D) activity in liver and only DMPS treatment prevented the inhibitory effect. Animals treated with mercury presented an increase in renal NPSH and therapies did not modify these levels. Urea concentration was increased after mercury exposure. NAC plus (PhSe)2 was partially effective in protecting against this effect of mercury . DMPS and (PhSe)2 were effective in restoring the increment in urea concentration caused by mercury. Thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), ascorbic acid levels, aspartate (AST) and alanine (ALT) aminotransferases were not modified after mercury exposure. Moreover, mercury poisoning caused an increase in hepatic and renal MT levels and antioxidant therapies did not modify this parameter. Our data pointed out the lack of the therapeutic effect of antioxidants tested. / Neste trabalho foram avaliados os efeitos da intoxicação aguda induzida por cloreto de mercúrio (HgCl2) em sangue, rim e fígado de camundongos. Os animais receberam uma única dose de HgCl2 (4,6 mg/Kg de peso), via sub-cutânea, por três dias consecutivos. Investigou-se o possível efeito protetor da terapia com antioxidantes (N-acetilcisteína-NAC e disseleneto de difenila-(PhSe)2) comparando ao ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfônico (DMPS), um agente quelante efetivo contra intoxicações por mercúrio. Além disto, foi verificado se a indução de metalotioneínas (MT) poderia estar envolvida em um possível mecanismo de proteção contra a intoxicação pelo mercúrio e se as diferentes terapias poderiam modificar os níveis de MT e outros parâmetros toxicológicos. Os resultados demonstraram que os animais tratados com cloreto de mercúrio apresentaram uma redução no ganho de peso corporal e as terapias não foram efetivas em reverter este dano. A exposição ao HgCl2 causou inibição na atividade da enzima δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) em fígado de camundongos e somente a terapia com DMPS foi efetiva em reverter esta inibição. Os animais tratados com mercúrio apresentaram um aumento nos níveis de NPSH renal e as terapias não modificaram estes níveis. A concentração de uréia foi aumentada nos animais expostos ao cloreto de mercúrio. A terapia com NAC + (PhSe)2 foi parcialmente efetiva em proteger contra este efeito do mercúrio. Já as terapias com DMPS e (PhSe)2 foram efetivas em proteger contra o aumento nos níveis de uréia induzido pelo mercúrio. As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), os níveis de ácido ascórbico e as transaminases (aspartato-AST e alanina-ALT) não foram alteradas após a exposição ao HgCl2. Além disso, os resultados demonstraram que a exposição ao mercúrio causou um aumento nos níveis de metalotioneínas hepático e renal e as terapias com antioxidantes não modificaram este parâmetro. Nossos dados apontam para a falta de efeito terapêutico dos antioxidantes testados.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hypothyroidism is a syndrome resulting from decreased production and secretion of triiothyronine (T3) and thyroxine (T4) hormones, frequently diagnosed in women. Clinical and experimental evidence support the association between reduction in thyroid hormones, neuropsychiatric disorders and oxidative stress. Selenium (Se) is a trace element essential to thyroid functions. The present study investigated the effect of diphenyl diselenide supplementation in a model of methimazole-induced hypothyroidism in female rats. We evaluated behavioral parameters related to memory and spatial learning (Article 1) and depressive-like behavior (Manuscript 1). Biochemical parameters were also investigated in relation to oxidative stress, MAO activity and the expression of antioxidant enzymes genes (Manuscripts 1 and 2). In Article 1, we observed a significant effect of diet supplemented with diphenyl diselenide in improving memory and spatial learning deficits in hypothyroid animals undergoing the task of Morris Water Maze. In Manuscript 1 we observed that methimazole-induced hypothyroidism caused a depressive-like behavior assessed in the forced swimming test and that supplementation with diphenyl diselenide caused a reversal of this effect. Furthermore, animals supplemented with diphenyl diselenide performed better in evaluating the antidepressant-like effect. In both (Article 1 and Manuscript 1), there were no motor and/or anxiety alterations, which could interfere with the results. Biochemical parameters in Manuscript 1 and 2 demonstrated that diphenyl diselenide improved analyzes related to oxidative stress (TBARS, ROS and NP-SH) in brain structures and restored the activity of MAO-B (Manuscript 1). In addition, Manuscript 2 evaluated the effects of hypothyroidism and supplementation with diphenyl diselenide on gene expression of antioxidant enzymes and transcription factor NRF-2. The results showed that hypothyroidism caused a significant increase in the expression of antioxidant enzymes, positively correlated to the transcription factor NRF-2. This effect was observed predominantly in the cerebral cortex and hippocampus, whereas supplementation with diphenyl diselenide was effective in normalizing the levels of antioxidant gene expression. Although hypothyroidism has caused a significant increase in gene expression levels of SOD, CAT and GPx were not observed changes in enzyme activity. Finally, the results of this study indicate through different experimental protocols that methimazole-induced hypothyroidism caused a deficit in spatial learning and memory, and depressive-like behavior. In addition, there were changes related to oxidative stress and the regulation of gene expression related to the antioxidant defense system. Diphenyl diselenide presented significant effects in promoting the reversal of behavioral effects and restore the biochemical parameters, and its role in regulating the expression of genes related to antioxidant defense system, adding a new interpretation to its pharmacological effects and demonstrates its potential to treat the complications caused by hypothyroidism. / O hipotireoidismo é uma síndrome caracterizada pela produção e secreção insuficiente dos hormônios tireóideos, triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), frequentemente diagnosticada em mulheres. Evidências clínicas e experimentais têm relatado a associação entre redução dos hormônios tireóideos, doenças neuropsiquiátricas e estresse oxidativo. O selênio (Se) é um elemento traço essencial às funções tireóideas. Este estudo investigou o efeito da suplementação com disseleneto de difenila sobre parâmetros comportamentais e bioquímicos em um modelo de indução ao hipotireoidismo pelo metimazol, em ratas. Foram avaliados parâmetros comportamentais relacionados à memória e à aprendizagem espacial (Artigo 1) e ao comportamento semelhante à depressão (Manuscrito 1). Parâmetros bioquímicos também foram investigados em relação ao estresse oxidativo, à atividade da enzima MAO e à expressão gênica relacionada ao sistema de defesa antioxidante (Manuscritos 1 e 2). No Artigo 1, observamos um efeito significativo da dieta suplementada com disseleneto de difenila, ao reverter o déficit relacionando à memória e à aprendizagem espacial nos animais hipotireóideos submetidos à tarefa do Labirinto Aquático de Morris. No Manuscrito 1 observamos que o hipotireoidismo induzido pelo metimazol causou um comportamento semelhante à depressão avaliada no Teste do Nado Forçado e que a suplementação com disseleneto de difenila provocou a reversão desse efeito. Além disso, os animais suplementados com o disseleneto de difenila apresentaram um desempenho melhor na avaliação do efeito semelhante ao antidepressivo. Em ambos (Artigo 1 e Manuscrito 1), não ocorreram alterações motoras e/ou relacionadas à ansiedade, que pudessem interferir nos resultados. Os parâmetros bioquímicos avaliados nos Manuscritos 1 e 2 mostraram que o disseleneto de difenila melhorou os marcadores de estresse oxidativo (TBARS, ROS e NP-SH) nas estruturas cerebrais e restaurou a atividade da enzima MAO B (Manuscrito 1). Além disso, o Manuscrito 2 avaliou os efeitos do hipotireoidismo e da suplementação com disseleneto de difenila sobre a expressão gênica das enzimas antioxidantes e do fator de transcrição NRF-2. Os resultados mostraram que o hipotireoidismo provocou um aumento significativo na expressão das enzimas antioxidantes, correlacionado positivamente ao fator de transcrição NRF-2. Esse efeito foi predominantemente observado no córtex cerebral e no hipocampo, sendo que a suplementação com disseleneto de difenila foi efetiva em normalizar os níveis de expressão gênica antioxidante. Apesar de o hipotireoidismo ter causado um aumento significativo nos níveis de expressão gênica das enzimas SOD, CAT e GPx não se observaram alterações nas atividades enzimáticas. A partir desse estudo pode-se concluir através dos diferentes protocolos experimentais realizados que o hipotireoidismo induzido pelo metimazol causou déficit de memória e de aprendizagem espacial, bem como o comportamento semelhante à depressão. Além disso, observaram-se as alterações relacionadas ao estresse oxidativo e à regulação da expressão gênica relacionada ao sistema de defesa antioxidante. O disseleneto de difenila apresentou efeitos significativos na reversão dos efeitos comportamentais e na restauração dos parâmetros bioquímicos avaliados, sendo que a regulação da expressão de genes relacionados ao sistema de defesa antioxidante acrescenta uma nova interpretação aos seus efeitos farmacológicos e demonstra o seu potencial para tratar as complicações causadas pelo hipotireoidismo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Selenium (Se) is an essential micronutrient present in selenoproteins on living beins, in the form of the amino acid selenocysteine and selenomethionine. Chemically related to Se, tellurium (Te) has no biological function in mammals, however, organic Te compounds showed up as good antioxidant agents. Although ebselen (Ebs), diphenyl diselenide [(PhSe)2] and diphenyl ditelluride [(PhTe)2] present antioxidant properties via their glutathione peroxidase (GPx) mimetic activity, these compounds exhibit toxic effects at high concentrations due to its property in oxidizing thiols groups. However, the toxicity mechanism of these compounds through the modulation of gene expression was never studied in human cells. Thus, this study aimed to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of organochalcogens in human leukocytes, and evaluate their mechanisms through the production of reactive oxygen species (ROS) and modulation of antioxidant proteins expression, and to evaluate the relative amount of organochalcogens in contact with the cells in our ex vivo exposure model. Trypan s blue exclusion test and comet assay were used to evaluate, respectively, cytotoxicity and genotoxicity induced by the compounds. The fluorescence of dichlorofluorescein (DCFH) and propidium iodide (PI) were measured in leukocytes exposed by flow cytometry. The expression of the genes for the enzymes Catalase, Superoxide Dismutase 1, Glutathione Peroxidase 3, Glutathione Peroxidase 4, Thioredoxin Reductase 1 and Nrf-2 were analyzed. A dichloromethane extraction of the buffer and the pellet of the cells was injected into a GC-MS apparatus to evaluate the amount of compound in contact with cells. The compounds induced a reduction in cell viability only in the concentration of 50 μM, being Ebs the most cytotoxic compound, followed by (PhTe)2 and (PhSe)2, while (PhTe)2 was the only compound able of increasing the apoptotic rate of leukocytes, which happened at all concentrations (10-50 μM). (PhTe)2 increased DNA damage index in all tested concentrations (5-50 μM), while Ebs and (PhSe)2 did it only at 50 μM concentration. Surprisingly, (PhSe)2 was the only compound effective in increasing ROS production in all tested concentrations (10-50 μM), which was accompanied by an increase in the SOD1 expression and a decrease in CAT expression. All compounds were effective in decreasing the expression of GPX3 and NFE2L2 (Ebs > (PhTe)2 > (PhSe)2), and none altered the expression of GPX4 and TRXR1. The compounds were found in higher concentrations in leukocyte pellet extraction than in their buffer. We conclude that the toxicity of the compounds in question is not directly related to their property in inducing production of ROS. / O selênio (Se) é um micronutriente essencial presente nas selenoproteínas dos organismos vivos, na forma dos aminoácidos selenocisteína e selenometionina. Quimicamente relacionado ao Se, o telúrio (Te) não possui nenhuma função biológica nos mamíferos, porém, compostos orgânicos de Te se mostraram bons agentes antioxidantes. Apesar do ebselen (Ebs), disseleneto de difenila [(PhSe)2] e ditelureto de difenila [(PhTe)2] possuírem atividade mimética a enzima glutationa peroxidase (GPx), exibindo propriedades antioxidantes, estes compostos apresentam efeitos tóxicos em altas concentrações, devido a sua capacidade de oxidar grupos tióis. Porém, os mecanismos de toxicidade destes compostos através da modulação da expressão gênica nunca foram estudados em células humanas. Desta forma, este estudo objetivou avaliar a citotoxicidade e a genotoxidade dos organocalcogênios em leucócitos humanos, e avaliar seus mecanismos através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e modulação da expressão de proteínas antioxidantes, além de avaliar a quantidade relativa de organocalcogênio em contato com as células em nosso modelo de exposição ex vivo. O teste de exclusão do azul de Trypan e o ensaio cometa foram utilizados para avaliar, respectivamente, a citotoxicidade e a genotoxicidade dos organocalcogênios. A fluorescência da diclorofluoresceína (DCFH) e iodeto de propídeo (IP) foi medida nos leucócitos expostos por citometria de fluxo. A expressão dos genes para as enzimas Catalase, Superóxido Dismutase 1, Glutationa Peroxidase 3, Glutationa Peroxidase 4, Tiorredoxina Redutase 1 e Nrf-2 foram analisados. Uma extração de diclorometano do tampão e do pellet das células foi injetada em um aparelho de GC-MS para avaliar a quantidade de composto em contato com as células. Os organocalcogênios induziram a uma redução da viabilidade celular apenas na concentração de 50 μM, sendo que o efeito maior foi do Ebs, seguido pelo (PhTe)2 e pelo (PhSe)2, enquanto o (PhTe)2 foi o único composto capaz de aumentar a taxa apoptótica dos leucócitos, o que aconteceu em todas as concentrações (10-50 μM). O (PhTe)2 aumentou o índice de dano ao DNA em todas as concentrações testadas (5-50 μM), enquanto o Ebs e o (PhSe)2 o fizeram apenas na concentração de 50 μM. Surpreendentemente, o (PhSe)2 foi o único composto efetivo em aumentar a produção de EROs em todas as concentrações testadas (10-50 μM), o que foi acompanhado por um aumento na expressão da SOD1 e uma diminuição da expressão da CAT. Todos os compostos foram efeitovs em diminuir a expressão da GPX3 e do NFE2L2 (Ebs > (PhTe)2 > (PhSe)2), sendo que nenhum alterou a expressão da GPX4 e da TRXR1. Os organocalcogênios foram encontrados em maior concentração na extração do pellet de leucócitos do que no seu tampão. Concluímos que a toxicidade dos compostos em questão não está diretamente relacionada com a propriedade dos mesmos em produzir EROs.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Selenium (Se) is an essential trace element for man and is known for its role in regulating growth and development of the fetus and newborn. Furthermore, Se is a micronutrient required for normal spermatogenesis and, therefore, essential for normal male reproductive function. However, it is well known that this element, depending of dose, can be highly toxic to several species of animals. Diphenyl diselenide [(PhSe)2] is a Se-compound widely used as intermediate in organic synthesis, as a consequence, the risk of human exposure to this chemical at the workplace may increase. Several studies demonstrated that (PhSe)2 is an organoselenium compound with potential therapeutic use. The present study evaluates the effects of single maternal subcutaneous injection of 50 and 100 mg/kg (PhSe)2 at gestational days (GD) 6, 10 or 17 in Wistar rats (article 1). The highest dose of (PhSe)2 was also administered at GD7-12. External and internal fetal soft-tissue examination was performed at GD20. No mortality was observed in fetuses or dams at any (PhSe)2 treatment. Neither did exposure to (PhSe)2 cause significant changes to fetal body weight, organ weight, or fetal size when dministered at GD6-8, 10-12 or 17. Exposure to 100 mg/kg (PhSe)2 at GD 9 produced significant changes in fetal biometry (crown-rump (CR) length) and body weight. No increase in the proportion of fetuses with external visible abnormalities was observed in groups exposed to (PhSe)2. Skeletal anomalies were observed in fetuses in the GD 9-11 treatment groups and included incomplete ossification of cranial bones, misshapen and incomplete ossification of sternebrae, reduced sternebrae number, wavy and extra ribs, incomplete ossification of fore and hindpaw bones and incomplete ossification of sacral and caudal bones. We conclude that maternal administration of (PhSe)2 during GD 7-12 led to increased incidences of these skeletal variations or anomalies, but did not cause externally visible malformations in rat fetuses. Another focus of this study was the evaluation of the effect of paternal exposure to (PhSe)2 on the development of progeny of Wistar male rats (article 2). Male rats were exposed to (PhSe)2 subcutaneously for 4 weeks (wk) at the dose of 5.0 mg/kg and 8 weeks at the dose of 2.5 mg/kg, prior to mating with unexposed females. No lethality was noted in any group. At term of exposure period, 4-wk-exposed male rats presented significant decrease in the body weight. Sex organ weights were similar in (PhSe)2-exposed and control male groups. The number of implantation sites in females mated with males exposed to (PhSe)2 for 8-wk was significantly higher than those of the respective control group. Male exposure to (PhSe)2, administered for 4- and 8-wk, did not change fetal body weight. Gross examination of fetuses from 4- and 8-wk-exposed groups did not reveal the appearance of external anomalies. Examination of live fetuses for ossification centers did not show any significant difference between groups. No increase in the incidence of skeletal anomalies was observed in fetuses obtained from females impregnated with (PhSe)2-exposed males. The current study indicated that (PhSe)2 given sub-chronically (4 or 8 weeks) to male rats had no adverse effects on their progeny. On the basis of results mentioned above, it is possible conclude that (PhSe)2 is a compound with low developmental toxicity, since adverse effects observed were only manifested at a high level dose. Of particular importance, (PhSe)2 possess its pharmacological properties at doses lower than these tested here. / O selênio (Se) é um elemento traço essencial para humanos e desempenha uma importante função durante a gestação, regulando o crescimento e desenvolvimento de fetos e recém-nascidos. Além disso, o Se é um micronutriente requerido para o processo da espermatogênese e, portanto, essencial para a função reprodutiva em machos. Entretanto, o elemento Se, dependendo da dose, pode ser tóxico para diversas espécies de animais. O disseleneto de difenila [(ØSe)2] é um composto de Se amplamente utilizado como intermediário em reações de síntese orgânica, o que aumenta o risco de intoxicação por exposição ocupacional a este composto. Existem diversos estudos demonstrando que o (ØSe)2 possui propriedades farmacológicas. O presente estudo avaliou os efeitos da administração subcutânea, única, de (ØSe)2 nas doses de 50 ou 100 mg/kg no 6°, 10° ou 17° dia da gestação de ratas Wistar (artigo 1). Os estudos com a maior dose de (ØSe)2 (100 mg/kg) foram estendidos a outros dias da gestação (7° ao 12°). No 20° dia de gestação foi realizada uma laparotomia para a retirada dos fetos e a observação do aparecimento de malformações morfológicas externas e esqueléticas. Não foram observadas mortes maternas e fetais nos grupos expostos ao (ØSe)2. A exposição ao (∅Se)2 não causou alterações significativas nos parâmetros de desenvolvimento avaliados (peso e comprimento fetal), com exceção da exposição a 100 mg/kg de (∅Se)2 no 9° dia de gestação, a qual produziu mudanças significativas na biometria fetal: diminuição do comprimento longitudinal e do peso corporal do feto. Não foi observado um aumento significativo no aparecimento de malformações fetais nos grupos expostos ao (∅Se)2. A exposição ao (∅Se)2 aumentou a incidência de alterações na ossificação do esqueleto dos fetos, principalmente nos grupos tratados no 9°, 10° e 11° dia de gestação sem afetar a sobrevivência dos mesmos. As alterações observadas incluem: ossificação incompleta dos ossos do crânio, das vértebras sacrais e caudais e dos ossos das patas anteriores e posteriores. Além disso, foram observadas alterações nas esternebras das quais, destacam-se: malformação, número reduzido e incompleta ossificação. Um número extra de costelas e costelas onduladas também foi observado. Portanto, com base nos resultados encontrados, concluímos que a exposição materna ao (ØSe)2 leva ao aumento na incidência de alterações esqueléticas nos fetos, sem causar o aparecimento de malformações externas visíveis e sem afetar a sobrevivência dos mesmos. Outro foco deste estudo foi avaliar o grau de toxicidade da exposição sub-crônica ao (ØSe)2 sobre o desenvolvimento da prole de ratos Wistar (artigo 2). Os ratos foram expostos ao composto pela via subcutânea por um período de 4 (na dose de 5,0 mg/kg) ou 8 semanas (2,5 mg/kg) antes do período de acasalamento. Não foram observadas mortes em nenhum dos grupos e, ao final do período de exposição, apenas os animais tratados com o composto por um período de 4 semanas apresentaram uma redução significativa do peso corporal. O peso dos órgãos sexuais masculinos (testículos e epidídimos) não foi alterado pelo tratamento. Foi observado um aumento significativo no número de sítios de implantações nas fêmeas acasaladas com os machos expostos ao (ØSe)2 por um período de 8 semanas. Em relação aos parâmetros fetais, não foram observadas anomalias externas e nem mudanças no peso em ambos os grupos tratados com o (ØSe)2 (4 ou 8 semanas). Não foram observadas diferenças significativas no desenvolvimento do esqueleto dos fetos expostos a este composto. O presente estudo demonstrou que a exposição sub-crônica (4 ou 8 semanas) ao (ØSe)2 não causou efeitos adversos sobre a prole de ratos Wistar. Tendo em vista os dados obtidos no presente estudo, é possível concluir que o composto (ØSe)2 apresenta baixa toxicidade desenvolvimental, uma vez que os efeitos adversos observados neste estudo se manifestam apenas em uma dose muito alta. É importante salientar que o (ØSe)2 desempenha suas propriedades farmacológicas em doses mais baixas do que as testadas neste trabalho.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In recent years have been identifical numerous pharmacological properties of a selenium compound, diphenyl diselenide [(PhSe)2]. Consequently, it is important the investigation of its toxic effect for a safe application in pharmacological studies. It is known that babies, in particular, have many physiological and biochemical changes related to development, which increase the susceptibility to toxic effects of drugs. Thus, the article 1 investigated the appearance of seizure episodes induced by (PhSe)2 when administered orally at doses of 5 to 500 mg/kg in rat pups (pos natal day 12-14) and the possible glutamatergic (article 2) and GABAergic (article 3) mechanisms involved in this process. Some studies using different experimental models have demonstrated the most different pharmacological and toxicodynamics properties of (PhSe)2. However, little is known about the toxicokinetic disposition of this compound. Therefore, the aim of article 4 was to determine and quantify the plasma levels of (PhSe)2 in adult mice and rats after oral (p.o.) administration of 500 mg/kg (PhSe)2; to verify the involvement of different routes of administration, vehicle and animal species in plasma levels of (PhSe)2 and in the onset of the first seizure episode induced by it. In article 5, it was determined and quantified the levels of (PhSe)2 in plasma, liver and brain of rat pups and these levels were correlated to the latency for the onset of the first seizure episode. To obtain more information about the compound, which were to supplement the data obtained, we carried out in vitro kinetic models. The manuscript 1 investigated the drug-like properties of (PhSe)2 in regards to stability, solubility, absorption and plasma protein binding (PPB) in vitro. In manuscript 2, it was conducted an in vitro study in order to identify possible metabolic pathways responsible for the biotransformation of (PhSe)2 in the body. Results of article 1 showed that administration of (PhSe)2 caused toxicity in rat pups, evidenced by the appearance of seizures. These were dose dependent and were, at least in part, related to oxidative stress. Among the mechanisms involved in the convulsive effect of (PhSe)2 were the interaction with: glutamatergic system by stimulating the inotropic glutamatergic receptors NMDA and by inhibiting the uptake of glutamate (Article 2); GABAergic system by antagonize the GABAA receptor, stimulating GABA transaminase enzyme and increasing GABA uptake (Article 3). The article 4 revealed that the maximum concentration of (PhSe)2 in the plasma of adult rats and mice occurred 30 minutes after p.o administration of the compound and remained detectable up to 8 hours after administration. The use of different routes of administration (intraperitoneal (i.p.), p.o., subcutaneous (s.c.)) or vehicle (canola oil or dimethyl sulfoxide (DMSO)) in rats and mice indicated that the onset of the first seizure episode and plasma levels are dependent on the route of administration (i.p. > p.o. > s.c.), vehicle (DMSO > canola oil) and animal species (mouse > rat). In article 5, it was observed that rat pups showed seizures even presenting lower plasma values of (PhSe)2 as compared to adults. This result demonstrated that rat pups are more sensitive to the toxic effects of (PhSe)2 than adult rats. Levels of (PhSe)2 in the liver and brain of rat pups showed a negative correlation with the latency to the first seizure episode. The manuscript 1 showed that (PhSe)2 has chemical and biological stability. However, the compound has a low solubility in water, a high partition coefficient octanol-water and an extensive plasma protein binding. Manuscript 2 indicated that (PhSe)2 is not biotranformed by Phase I reactions, catalyzed by cytochrome P450. It reacted chemically with reduced glutathione (GSH) and N-acetylcysteine (NAC) to form adducts or reacts with protein SH groups. The presence of GSH or NAC in the incubation medium decreased the binding of (PhSe)2 protein. Finally, it was observed that (PhSe)2 reduced the activity of cytochrome P450. Together, the data presented showed that the intensity of toxic effects caused by (PhSe)2 are directly related to its toxicokinetic. / Nos últimos anos, têm sido identificadas inúmeras propriedades farmacológicas do composto de selênio disseleneto de difenila [(PhSe)2]. Assim, a pesquisa dos efeitos tóxicos deste composto torna-se importante para a segurança na aplicação farmacológica. Sabe-se que os bebês, em particular, apresentam muitas mudanças fisiológicas e bioquímicas relacionadas ao desenvolvimento, que aumentam a suscetibilidade aos efeitos tóxicos de drogas. Desta forma, no artigo 1 investigou-se o aparecimento de convulsões induzida pelo (PhSe)2, quando administrado pela via oral (p.o), nas doses de 5 à 500 mg/kg em ratos bebês (12-14 dias de vida) bem como os possíveis mecanismos glutamatérgicos (Artigo 2) e GABAérgicos (Artigo 3) envolvidos em tal processo. Vários estudos, utilizando diferentes modelos experimentais demonstraram as mais diferentes propriedades farmacológicas e toxicodinâmicas do (PhSe)2 no entanto, pouco se conhece sobre a toxicodinâmica deste composto. Por isso, o objetivo do artigo 4 foi determinar e quantificar os níveis plasmáticos de (PhSe)2 em ratos e camundongos adultos após a administração p.o. de (PhSe)2 na dose de 500 mg/kg; bem como verificar o envolvimento de diferentes vias de administração, veículos e espécie animal nos níveis plasmáticos do composto e no aparecimento de convulsões induzidas pelo mesmo. No artigo 5, determinou-se e quantificou-se os níveis de (PhSe)2 no plasma, fígado e cérebro de ratos bebês e correlacionou-se estes níveis à latência para o aparecimento de convulsões. Devido a necessidade de obter mais informações sobre o composto, que viessem a complementar os dados obtidos, realizou-se modelos cinéticos in vitro. O manuscrito 1 investigou parâmetros relacionados a estabilidade, solubilidade, absorção e ligação às proteínas plasmáticas do (PhSe)2 in vitro. No manuscrito 2 realizou-se um estudo in vitro para identificar as vias metabólicas responsáveis pela biotransformação do (PhSe)2 no organismo. Os resultados do artigo 1 demonstraram que a administração de (PhSe)2 causou toxicidade em ratos bebês, evidenciada pelo aparecimento de convulsões. Estas são dependentes da dose utilizada e estão, pelo menos em parte, relacionadas ao estresse oxidativo. Dentre os mecanismos neuroquímicos envolvidos no efeito convulsivante do (PhSe)2 estão a interação com o sistema glutamatérgico, por estimular os receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA e por inibir a captação de glutamato (Artigo 2); e com o sistema GABAérgico, por antagonizar os receptores GABAégicos do tipo GABAA, estimulando a enzima GABA transaminase e estimulando a captação de GABA (Artigo 3). O artigo 4 demonstrou que concentração máxima de (PhSe)2 no plasma de ratos e camundongos adultos ocorreu 30 minutos após a administração pela via oral do composto e permaneceu detectável até 8 horas após sua administração. O uso de diferentes vias de administração (intraperitonial (i.p); p.o; subcutânea (s.c)) e veículo (óleo de canola ou dimetil sulfóxido (DMSO)) em ratos e camundongos indicou que o aparecimento de convulsões e os níveis plasmáticos de (PhSe)2 são dependentes da via de administração (i.p > p.o > s.c), do veículo (DMSO > óleo de canola) e da espécie animal (camundongo > rato). No artigo 5 observou-se ainda que os ratos bebês convulsionaram mesmo apresentando níveis plasmáticos menores de composto que os adultos, o que nos leva a crer que estes são mais sensíveis aos feitos tóxicos do (PhSe)2. Os níveis de (PhSe)2 no fígado e no cérebro de ratos bebês no momento do episódio convulsivo apresentaram uma correlação negativa com a latência para o primeiro episódio convulsivo. O manuscrito 1 revelou que o (PhSe)2 apresenta estabilidade química e biológica. No entanto, o composto apresenta uma baixa solubilidade em água, um alto coeficiente de partição octanol-água e uma extensa ligação às proteínas plasmáticas. O manuscrito 2 indicou que o (PhSe)2 não é biotransformado por reações de fase I catalizadas pelo citocromo P450. O composto reage quimicamente com a glutationa reduzida (GSH) e a N-acetilciateína (NAC), formando adutos ou ainda reage com grupos SH de proteínas. A presença de GSH ou NAC no meio de incubação diminuiu a ligação do (PhSe)2 às proteínas. Por fim, foi observado que o (PhSe)2 reduziu a atividade das enzimas do citocromo P450. Em conjunto, os resultados desta tese demonstraram que a intensidade dos efeitos tóxicos causados pelo (PhSe)2 estão diretamente relacionados a sua toxicocinética.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atherosclerosis is a chronic inflammatory condition associated with an overproduction of oxidant species. Since low density lipoprotein (LDL) oxidation plays a key role in the pathogenesis of atherosclerosis, antioxidants that can inhibit this oxidative process might be useful in preventing atherosclerosis-related pathological conditions, such as cardiovascular diseases and stroke. Here, we investigated the potential toxicological effects and the anti-atherogenic properties of diphenyl diselenide (PhSe)2, a simple organoselenium compound that presents important antioxidant properties. Toxicological studies, revealed that (PhSe)2, orally administered, produced minor toxicological effects in rabbits exposure for a long term. The toxic potential of (PhSe)2 was evidenced by a decrease in the ascorbic acid contents in blood, liver and brain of rabbits. Nevertheless, the prolonged exposition with (PhSe)2 was not hepato or renotoxic and not modified the others oxidative stress parameters. The consumption of (PhSe)2 by hipercholesterolemic rabbits significantly decreased the serum cholesterol levels and also diminished the serum and hepatic levels of TBARS, as well as the production of free radical species in blood and brain. In vitro studies demonstrated that (PhSe)2 showed a dosedependent protective effect against Cu2+ and 2,2-azobis-2-amidinopropane (AAPH)-induced oxidation of LDL or parinaric acid (PnA) incorporated into isolated human LDL. Interestingly, (PhSe)2 also protected protein moieties from human isolated LDL against Cu2+-induced oxidation. These effects were related to its thiol-peroxidase activity. In experiments with primary cultures of bovine aortic endothelial cells (BAEC), (PhSe)2 protected endothelial cells from the damage promoted by peroxynitrite exposure, in a more effective way than ebselen. The intracellular levels of glutathione (GSH) were almost completely consumed by peroxynitrite and although the compounds did not restore the normal levels, (PhSe)2 per se increases significantly GSH in a concentration-dependent manner. This effect may be related with the significant increase in cellular glutathione peroxidase (GPx) activity promoted by this compound. Taken together, the results indicated that (PhSe)2 is relatively safe for rabbits even after a prolonged time of ingestion and suggest a new role for diphenyl diselenide as a potential anti-atherogenic agent. / A aterosclerose é uma condição inflamatória crônica associada à produção de espécies oxidantes. A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) parece ter um papel fundamental na patogênese da aterosclerose, desta forma os antioxidantes, substâncias capazes de inibir o processo oxidativo, podem ser úteis na prevenção das condições patológicas associadas à aterosclerose, como doenças cardiovasculares e acidentes vasculares cerebrais. Nesta tese, investigou-se os potenciais efeitos toxicológicos e as propriedades anti-aterogênicas do disseleneto de difenila (PhSe)2, um simples composto orgânico de selênio que apresenta importantes propriedades antioxidantes. Os estudos toxicológicos revelaram que o (PhSe)2 oralmente administrado produziu poucos efeitos tóxicos nos coelhos expostos ao composto por um longo período de tempo. O principal efeito tóxico do (PhSe)2 foi a diminuição dos níveis de ácido ascórbico no sangue, fígado e cérebro dos coelhos. Todavia, a exposição prolongada ao (PhSe)2 não alterou os marcadores clássicos de lesão hepática e renal e os demais marcadores do estresse oxidativo. O consumo de (PhSe)2 por coelhos hipercolesterolêmicos diminuiu significativamente os níveis sorológicos de colesterol total e ainda reduziu os níveis sanguíneos e hepáticos de TBARS, bem como a produção de espécies oxidativas no sangue e no cérebro destes animais. Estudos in vitro demonstraram que o (PhSe)2 protegeu LDLs humanas isoladas contra a oxidação induzida por Cu2+ e AAPH e a oxidação do ácido parinárico (PnA) incorporado nas LDLs de maneira concentração dependente. O (PhSe)2 também foi capaz de prevenir a oxidação da porção protéica das LDLs. Estes efeitos protetores do (PhSe)2 foram associados a sua atividade tiol peroxidase. Em experimentos utilizando cultura primária de células endoteliais de aorta bovina (BAEC), evidenciou-se o efeito protetor do (PhSe)2 contra a morte celular induzida pelo peroxinitrito, de forma mais efetiva que o ebselen. Os níveis intracelulares de glutationa (GSH) foram completamente consumidos pelo peroxinitrito. O (PhSe)2 per se aumentou significativamente os níveis de GSH de maneira concentração dependente, todavia, a adição dos compostos não preveniu o consumo de GSH pelo peroxinitrito. Este efeito pode ser relacionado com o significativo aumento na atividade celular da glutationa peroxidase (GPx) promovido pelo (PhSe)2. Em conclusão estes resultados indicam que a suplementação oral com (PhSe)2 demonstrou baixa toxicidade nos coelhos mesmo após uma ingestão prolongada do composto e sugere-se um novo papel para o (PhSe)2 como um potencial agente anti-aterogênico.