Neste trabalho, foram preparados inicialmente dez diferentes extratos brutos etanólicos de diferentes espécies vegetais da região da mata atlântica mineira das proximidades do município de Alfenas-MG. Após a padronização do teste antichagásico in vitro contra as formas epimastigotas da cepa Y, e utilizando-se o método colorimétrico com solução de resazurina, todos os extratos foram submetidos ao bioensaio, o que permitiu a determinação do extrato de maior potencial anti-epimastigota como sendo da Miconia willdenowii, da família Melastomataceae. Tal extrato, foi posteriormente submetido a particionamento por extração líquido-líquido com hexano, acetato de etila e uma mistura etanol:água (1:3), o que permitiu separar compostos em grupos por diferença de polaridade. As 3 frações obtidas foram novamente submetidas ao teste biológico, para determinação do grupo de compostos de maior atividade. A fração acetato foi assim determinada como a de maior potencial contra as formas epimastigotas dos parasitas da doença de Chagas, sendo esta submetida ao fracionamento por cromatografia em coluna, obtendo-se assim ao final, um total de 12 subfrações. Estas foram na sequência submetidas também ao teste in vitro, determinando-se as de maior potencial contra os epimastigotas. No geral, três destas subfrações apresentaram maior atividade antichagásica (A2, A3 e A4), as quais foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) por conseguinte, a partir das quais puderam ser isoladas dois derivados de hidroquinonas, já relatadas para outras espécies de Miconia: miconidina e primina. As duas substâncias tiveram suas estruturas identificadas por espectroscopia de RMN e também espectrometria de massas, e confirmadas com dados da literatura. A quantificação das duas substâncias isoladas foi feita para cada amostra de M. willdenowii (extrato bruto, fração acetato e subfrações), o que permitiu deduzir que a presença de tais compostos, nestas amostras, é a principal responsável pela atividade tripanocida apresentada pelas mesmas. O bioensaio anti-T. cruzi realizado também para os compostos isolados permitiu observar o alto potencial tripanocida frente a forma epimastigota do parasita, apresentando valores de CE50 inferiores até mesmo que a droga padrão de referência, o benznidazol. O teste de citotoxicidade in vitro com fibroblastos derivados de pele humana normal também com a miconidina e primina, isoladas de M. willdenowii, demonstrou que estas só apresentavam efeito adverso a partir de 50 µg/mL (dentre as concentrações testadas), valor este superior ao CE50 apresentado pelas mesmas, sugerindo o alto potencial efetivo de utilização destes compostos na terapia da doença de Chagas. / In this work, ten different ethanol crude extracts were prepared from different plant species of rainforest nearby the city of Alfenas-MG. After standardization of in vitro antichagasical test against T. cruzi (Y strain) epimastigote form, and using colorimetric method with resazurin solution, all extracts had the activity evaluated and the most active was Miconia willdenowii extract, from the Melastomataceae family. This extract was subsequently subjected to partitioning by liquid-liquid extraction using hexane, ethyl acetate and ethanol:water (1:3) mixture, allowing the separation of compounds in groups by difference in polarity. The 3 fractions obtained were submitted to bioguided assay in order to determine the most active. The ethyl acetate fraction displaying the higher potential against epimastigote form of Chagas’ disease parasites was extensively purified under CC conditions. In the end, this process provided a total of 12 subfractions. All subfractions were subjected to bioguided assay, determining those with the greatest potential against epimastigote. Overall, three subfractions showed antichagasical activity (A2, A3 and A4), which were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), and two hydroquinones derivatives previously reported for other species Miconia: miconidin and primin, could be isolated. Both compounds had their structures identified by NMR spectroscopy, mass spectrometry and confirmed by database comparison in the literature. The quantification of these two compounds was made for each sample of M. willdenowii (crude extract, acetate fraction and subfractions), which allowed deducing that their presence or absence is related to trypanocidal activity. The anti-T. cruzi bioassay, when performed to the isolated compounds, allowed observing higher trypanocidal potential than the reference drug (benznidazole). The in vitro cytotoxicity assay for miconidin and primin, using normal human skin-derived fibroblasts, showed that they only present cytotoxicity over 50 µg/mL, in which is higher than the EC50 presented by these compounds in the trypanocidal assay, suggesting high potential for effective use of these compounds as therapeutical alternative for Chagas’ disease after further studies. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas (DCh) representa um grave problema de saúde pública na maioria dos países da América Latina. Sintomatologia frequente, a dor torácica ou precordial em pacientes com DCh pode assemelhar-se àquela observada na doença arterial coronária (DAC), constituindo-se, dessa forma, em desafio diagnóstico para os clínicos. A frequência da DAC em pacientes com DCh continua indefinida na literatura, permanecendo a hipótese de que pacientes com DCh possam apresentar menor proporção de DAC. A angiografia coronária por tomografia computadorizada (ATC), em aparelho de múltiplas colunas de detectores, é um método não invasivo de alta acurácia que permite o diagnóstico precoce de placas ateromatosas, obstrutivas ou não, e que poderia detectar a frequência de DAC neste grupo de pacientes. OBJETIVO: Investigar a presença de aterosclerose coronária em pacientes com DCh, comparando com um grupo controle de indivíduos assintomáticos e sem doença coronária conhecida, utilizando a angiografia coronária por tomografia computadorizada. MÉTODOS: Foram estudados 43 pacientes portadores da DCh, sendo 16 (37,2%) homens. O grupo controle foi composto por 66 indivíduos não portadores da DCh, sendo 28 (42,4%) homens. Os grupos foram pareados pelo escore de risco de Framingham, respeitando-se a mesma faixa de risco (baixo, intermediário e alto), além do pareamento por sexo e faixa etária. Os exames foram realizados em tomografia computadorizada de 320 colunas de detectores e o diagnóstico de DAC foi definido pela presença de placa aterosclerótica, mesmo sem causar obstrução luminal. DAC obstrutiva significativa foi considerada pela presença de ao menos uma placa causando redução maior do que 50% do diâmetro da luz arterial. RESULTADOS: Foram observadas diferenças significativas nos parâmetros relacionados à DAC, sendo sua frequência significativamente menor nos pacientes portadores da DCh. A presença de DAC foi observada em 9 indivíduos (20,9%) portadores da DCh e em 32 indivíduos do grupo controle (48,5%), com p=0,004. A magnitude da estenose coronária foi significativamente menor nos pacientes com DCh que nos controles na análise por paciente, por território e por segmentos coronários (p<0,001, p=0,012 e p=0,045, respectivamente). CONCLUSÕES: Os pacientes portadores da DCh apresentam baixa frequência de DAC definida pela tomografia computadorizada de artérias coronárias. A frequência de DAC, obstrutiva ou não, em pacientes com DCh foi significativamente menor que a observada no grupo controle de pacientes sem DAC prévia conhecida / INTRODUCTION: Chagas disease (CD) is a serious public health problem in most of Latin American countries. Precordial or chest pain in patients with CD is a frequent symptom and can be similar to that observed in coronary artery disease (CAD), what represents a diagnostic challenge to the physicians. The frequency of CAD in patients with CD continues undefined in the literature, remaining the hypothesis that patients with CD could present a lower proportion of CAD. Computed tomography angiography (CTA) is a high accuracy and non-invasive method that allows an early diagnostic of atherosclerotic plaque, obstructive or not, and that could detect the frequency of CAD in this group of patients. OBJECTIVE: Investigate coronary atherosclerosis by CTA in patients with CD, comparing with an asymptomatic control group without known CAD. METHODS: 43 patients with CD were studied and 16 (37.2%) were men. The control group was composed by 66 non-carriers of CD and 28 (42.4%) were men. The groups were matched for Framingham risk score (low, medium and high) as well as sex and age. The exams were performed in 320-multidetector rows CT and the CAD diagnostic was defined as the presence of atherosclerotic plaques, even without luminal obstruction. Significant obstructive CAD was considered if at least one plaque was present causing more than 50% of reduction in the arterial lumen diameter. RESULTS: Significant differences were observed in parameters related to CAD, showing lower frequency of CAD in patients with CD. The presence of CAD was observed in 9 patients (20.9%) with CD and in 32 patients (48.5%) from the control group, with p=0.004. The magnitude of coronary stenosis was significantly lower in patients with CD than in controls, in a per patient, per territory and per segment coronary analyses (p<0.001, p=0.012 e p=0.045, respectively). CONCLUSIONS: Patients with CD have a low frequency of CAD defined by coronary CTA. The CAD frequency, obstructive or not, in patients with CD was significantly lower than the observed in the control group without known CAD

SOUSSUMI, LMT. Estudo da distribuição de doadores reativos para a doença de Chagas no Hemocentro de Ribeirão Preto, SP. 2004. 106f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004. Este estudo, de que participaram 25.891 doadores de sangue que compareceram pela primeira vez ao Hemocentro de Ribeirão Preto, de junho de 1996 a junho de 2001, teve por objetivos: 1) estudar a freqüência de resultados sorológicos positivos e inconclusivos na triagem sorológica para a doença de Chagas; 2) estimar a prevalência de doadores infectados com T. cruzi entre os doadores acima definidos, através da aplicação de testes confirmatórios; e 3) caracterizar os doadores infectados segundo algumas variáveis de interesse epidemiológico. Foram levantados dados registrados no sistema informatizado do Hemocentro de Ribeirão Preto, coletando-se informações referentes ao doador, ao tipo de doação e ao resultado de teste de triagem para doença de Chagas. Foram estudados ainda os resultados dos testes confirmatórios, além de algumas variáveis de interesse epidemiológico, como idade, local de procedência e de nascimento, tipo da doação e motivo da doação. A população foi composta majoritariamente por homens (83,6%) e indivíduos de 26 a 45 anos de idade (64,1%), em sua maioria residente no Estado de São Paulo (88,2%). Predominaram as doações vinculadas (85,4%), tendo como principal motivação a solicitação de amigos ou razões familiares. A triagem sorológica foi realizada com a aplicação de dois testes (ELISA e IHA), com 244 resultados positivos e 386 inconclusivos; destes, 236 foram submetidos a testes confirmatórios, dos quais 28 (11.9%) tiveram resultado positivo confirmado. Os 272 com resultado positivo correspondem um valor de prevalência de 1,1% (IC95%: 0,9 – 1,2). A situação sorológica dos demais candidatos foi classificada em: negativa (n=25.521; 98,6%), indeterminada (n=14; 0,1%) e desconhecida (n=84; 0,3%). Do grupo dos doadores com situação sorológica desconhecida, 80 não compareceram ao retorno e 4 apresentaram problemas relacionados às amostras de sangue. A grande maioria dos doadores infectados, apesar de residir na região administrativa da cidade de Ribeirão Preto, no Estado de São Paulo, migrou de outras Unidades Federadas, onde era alta a prevalência da doença de Chagas no passado. Esse fato ficou evidenciado pela elevação progressiva e constante da prevalência da doença, intimamente relacionada com a idade mais avançada dos procedentes de Minas Gerais e, especialmente, de São Paulo. Os baixos percentuais de soropositividade entre os jovens nascidos em São Paulo evidenciam os avanços obtidos no controle da doença neste estado, que antecederam aqueles realizados em outras UFs do Brasil. Entretanto, os resultados deste estudo mostraram que ainda existem doadores jovens infectados procedentes de áreas onde o Programa Nacional de Controle da Doença de Chagas tem sofrido problemas crônicos de continuidade. / SOUSSUMI, LMT. Seropositivity for Chagas’ disease among blood donators in the Regional Blood Bank of Ribeirão Preto, State of São Paulo, Brazil. 2004. 106f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004. This study involved 25.891 subjects who donated blood for the first time at the Blood Center of Ribeirao Preto, State of Sao Paulo, Brazil, from June 1996 to June 2001. The investigation had the following objectives: 1) to study the frequency of positive and indeterminate results for Chagas’ disease in screening tests; 2) to estimate the prevalence of blood donors infected with Trypanosoma cruzi through confirmatory assays; and 3) to describe the infected individuals according to some variables of epidemiological interest. Information was obtained from the computerized system of the Blood Center, by collecting data about blood donors, type of donation and results of screening and confirmatory tests for Chagas´ disease. In addition, some variables of epidemiological interest, such as age, origin, place of birth, type of donation and motive for donation were also studied. The population was mostly composed of men (83,6%) and individuals from 26 to 45 years of age (64,1%), most of them resident in the State of Sao Paulo (88,2%). Family reasons and friends’ requests were the main determinants for blood donation (85,4%). The serological screening was carried out by applying two tests (ELISA and IHA), resulting 244 positive and 386 inconclusive. Of the latter group, 386 inconclusive results, 236 were submitted to confirmatory assays, 28 of whom (11.9%) were found to be positive. In the total, there were 272 positive results, corresponding to a prevalence rate of 1,1% (CI95%: 0,9 – 1,2). Regarding the serological situation, the other subjects were classified as: negative (n=25.521; 98,6%), indeterminate (n=14; 0,1%) and unknown (n=84, 0,3%). Of this last group, 80 did not attend to the return visit and 4 presented problems related to blood samples. Despite living in the area around Ribeirao Preto, the great majority of infected donors migrated from other States, where the prevalence of Chagas´ disease was high in the past. This fact was evidenced by the progressive and constant elevation of prevalence rates, closely related to older ages among donors coming from the State of Minas Gerais and, especially, from the State of Sao Paulo. The low rate of positive results among young individuals born in Sao Paulo confirms the improvements obtained in the control of the disease in this State, that preceded those accomplished in other parts of Brazil. However, this study still shows the existence of infected young blood donors, originally living in areas where the National Program for Control of Chagas’ Disease has been suffering chronic operational problems.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / A doença de Chagas afeta cerca de 8 milhões de pessoas ao redor do mundo e cerca de um terço dessas desenvolve as formas graves da doença, sendo o maior caso de cardiomiopatia causada na América Latina e também está entre o maior causador de mortes dentro das doenças tropicais negligenciadas. Mesmo sendo conhecida há 111 anos, os mecanismos que desenvolvem a patologia continuam um enigma, principalmente se tratando de estudos em humanos. Apesar disso, hoje é indiscutível o papel da resposta imune do hospedeiro frente ao agente etiológico, o Trypanosoma cruzi, no controle da infecção ou na sua disseminação, além dos mecanismos desencadeados na fase inicial da doença serem determinantes para o estabelecimento de uma fase crônica. Uma das primeiras células imunes a interagir com este patógeno são as céluls dendríticas (DCs), as quais são responsáveis por intermediar uma resposta imune não específica para uma específica e que possui uma função determinante dentro da patologia.. Este trabalho então visa uma análise da resposta inicial que é desencadeada em DCs frente ao T. cruzi a partir da validação de genes que foram vistos como diferencialmente expressos no trancriptoma realizado da interação inicial ente DCs e T. cruzi após 12h. Alguns desse genes modulados diferencialmente sob ação do patógeno foram o ligante da superfamília de fator necrose tumoral, membro 18 (TNFSF18), ligante 9 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL9) e peptidase específica de ubiquitina 18 (USP18), que possuíram sua expressão aumentada sob infecção. Essa superexpressão constatada por RNA-seq, foi confirmada neste estudo através de RT-qPCR após um processo de padronização e escolha de critérios rigorosos para garantir a qualidade da interpretação dos dados e poder comparar com veracidade os dados provenientes de duas metodologias distintas. Ficou comprovado então que a expressão gênica dessa interação patógeno-hospedeiro poderia ser atestada por RT-qPCR, viabilizando estudos posteriores de outros genes e também em uma população amostral maior, permitindo assim analisar a resposta inicial de forma mais abrangente. Isso tornará possível garimpar genes que tenham um papel fundamental na infecção e estuda-los com mais profundidade. Também é importante ressaltar que não necessariamente um aumento de expressão de transcrito reflete no nível proteico, como foi aferido neste trabalho ao mensurar algumas citocinas como IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 e IL-12, em que houve aumento de expressão de TNF sob infecção que condiz com seu nível de transcrito detectado, porém IL-10 que também foi supraregulado a nível transcricional, não possuía o mesmo comportamento a nível proteíco, tendo uma regulação importante e decisiva na expressão pelo hospedeiro. / Chagas disease affects around 8 million people worldwide and about one-third of them develops severe forms of the disease, being the largest case of cardiomyopathy caused in Latin America and also among the largest cause of death within neglected tropical diseases. Even though it has been known for 111 years, the mechanisms that develop pathology remain an enigma, especially when it comes to studies in humans. Despite this, the role of the host immune response to the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, in the control of the infection or its dissemination is indisputable, besides the mechanisms triggered in the initial phase of the disease are determinant for the establishment of a chronic phase. One of the first immune cells to interact with this pathogen is the dendritic cells (DCs), which are responsible for being a mediator between a less specific immune response to a more specific and that has a determining function within the pathology. This work then aims an analysis of the initial response that is triggered in DCs against T. cruzi from a transcriptome performed from the initial interaction between DCs and T. cruzi after 12h. Some of these genes differentially modulated under the action of the pathogen were the tumor necrosis factor, member 18 (TNFSF18), CXC (CXCL9) motif chemokine ligand 9 and ubiquitin 18 specific peptidase (USP18), which had their expression considerably infection. This overexpression verified by RNA-seq was confirmed in this study through RT-qPCR after a process of standardization and selection of strict criteria to guarantee the quality of data interpretation and to be able to compare data from two different methodologies. It was then proved that the differential gene expression obtained in the transcriptome, a robust but more expensive and inaccessible technique, could be attested by RT-qPCR, allowing further studies of other genes and also in a larger sample population, thus allowing an analysis of the initial response in DCs by the T, I crossed more comprehensively in order to mine genes that have a fundamental role in the infection and study them in more depth. It is also important to note that not necessarily an increase in transcript expression reflects at the protein level, as measured in this work when measuring some cytokines such as IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 and IL-12, in which there was an increase in expression of TNF under infection that matches its detected level of transcript, but IL-10, which was also supraregulated at the transcriptional level, did not have the same behavior at the protein level, having an important and decisive regulation in expression by the host.

O controle da transmissão da doença de Chagas no Estado de São Paulo, delineado\" no presente estudo, foi equacionado e solucionado e não constitui, nos dias atuais, problema de saúde pública. O risco de ocorrência de casos agudos fica restrito a eventos isolados. Este quadro, portanto, autoriza otimismo, podendo-se supor que a atual incidência da doença no Estado seja próxima de zero e esperar que a incidência futura se mantenha nesse nível. Sob a ótica da transmissão vetorial, as ações de vigilância sobre as espécies peridomiciliares presentes atualmente no Estado têm respondido de maneira eficaz à possibilidade de infecção por Trypanosoma cruzi a partir do contato homem-vetor. A casa rural paulista não constitui hoje ecótopo adequado para a domiciliação de tais espécies de triatomíneos. O comportamento invasor, característico principalmente dos indivíduos adultos fêmeas, não tem passado despercebido à população que prontamente coleta e encaminha o inseto para análise utilizando-se, na maioria das vezes, do Centro de Saude local, numa integração da vigilância vetorial à rede de atenção à saude. O pronto atendimento a cada notificação serve de estímulo à participação. Em síntese, a vigilância vetorial está consolidada junto à comunidade e à rede de saúde local. A transmissão transfusional constitui fenômeno raro dadas as condições com que se pratica a hemoterapia no Estado de São Paulo. As ações de controle do sangue foram implementadas pela Secretaria de Saúde a partir de 1988, com índices de cobertura de seleção de doadores próximos de 100 por cento já em 1990. Mais recentemente, com a instalação da Hemo-rede estadual e a ampliação da cobertura dos Hemocentros incluindo os pequenos municípios, pode-se observar uma melhora da qualidade da hemoterapia. O descarte do candidato à doação quando procedente de área endêmica de doença de Chagas, tem contribuído para a obtenção de baixos percentuais de prevalência na triagem sorológica, situados próximos a 1 por cento . A transmissão congênita, entendida como mecanismo residual de perpetuação da infecção, ocorre em níveis discretos e pode ser perfeitamente controlada desde que se realizem provas sorológicas para doença de Chagas em gestantes com epidemiologia compatível e se pesquise a infecção na criança ao nascer e seguimento até os 6 meses. A persistência da positividade sorológica deve orientar para tratamento específico. Outros mecanismos de transmissão não apresentam qualquer importância no contexto da endemia. Resta ao sistema de saúde, portanto, olhar de frente os indivíduos infectados que merecerão atenção médica e previdenciária e cujo direito à saúde está garantido pela carta constitucional. / The present study about the contrai of Chagas\' disease transmission in the State of Sao Paulo has pointed out that nowadays the disease is no more a public health problem. The risk of occuring acute cases is restricted to isolate events. Therefore it is possible to suppose that the disease incidence is near to zero. Conceming to the vectorial transmission the surveillance of the peridomestic bugs did not detect actual Trypanosoma cruzi transmission. The rural houses nowadays do not offer conditions to triatomine bugs colonization. The presence of female adult insects indoors is noted by the population. They collect and send the bugs to the local Health Services. Each bug notification is promptly answered in order to induce local communities to participate effectively in the vector surveillance. This surveillance is now consolidated among the communities and the Local Health Services. Transfusional transmission constitutes, as far is known, a rare event because hemotheraphy in the State of Sao Paulo is sufficiently adequated. Blood control practices were improved by Govemment since 1988. Actually almost 100 per cent of blood donors are covered with serological tests. Recently a net of State Blood Services was installed witch improved the quality of hemotherapic practices. The donors coming from Chagas\' disease endemic areas are deleted. The serological prevalence is near by 1 per cent . Congenital transmission occurs in low leveis and can be controlled. Serological tests for Chagas\' disease in pregnants with compatible epidemiology and in new-bom followed up to 6 months of age children is recommended. Children with serological positivity must be treated. Other transmission routes have no importance in the disease context. So, the task of assuring medical health care to the infected people as law order is left for the health system.

SOUSSUMI, LMT. Estudo da distribuição de doadores reativos para a doença de Chagas no Hemocentro de Ribeirão Preto, SP. 2004. 106f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004. Este estudo, de que participaram 25.891 doadores de sangue que compareceram pela primeira vez ao Hemocentro de Ribeirão Preto, de junho de 1996 a junho de 2001, teve por objetivos: 1) estudar a freqüência de resultados sorológicos positivos e inconclusivos na triagem sorológica para a doença de Chagas; 2) estimar a prevalência de doadores infectados com T. cruzi entre os doadores acima definidos, através da aplicação de testes confirmatórios; e 3) caracterizar os doadores infectados segundo algumas variáveis de interesse epidemiológico. Foram levantados dados registrados no sistema informatizado do Hemocentro de Ribeirão Preto, coletando-se informações referentes ao doador, ao tipo de doação e ao resultado de teste de triagem para doença de Chagas. Foram estudados ainda os resultados dos testes confirmatórios, além de algumas variáveis de interesse epidemiológico, como idade, local de procedência e de nascimento, tipo da doação e motivo da doação. A população foi composta majoritariamente por homens (83,6%) e indivíduos de 26 a 45 anos de idade (64,1%), em sua maioria residente no Estado de São Paulo (88,2%). Predominaram as doações vinculadas (85,4%), tendo como principal motivação a solicitação de amigos ou razões familiares. A triagem sorológica foi realizada com a aplicação de dois testes (ELISA e IHA), com 244 resultados positivos e 386 inconclusivos; destes, 236 foram submetidos a testes confirmatórios, dos quais 28 (11.9%) tiveram resultado positivo confirmado. Os 272 com resultado positivo correspondem um valor de prevalência de 1,1% (IC95%: 0,9 – 1,2). A situação sorológica dos demais candidatos foi classificada em: negativa (n=25.521; 98,6%), indeterminada (n=14; 0,1%) e desconhecida (n=84; 0,3%). Do grupo dos doadores com situação sorológica desconhecida, 80 não compareceram ao retorno e 4 apresentaram problemas relacionados às amostras de sangue. A grande maioria dos doadores infectados, apesar de residir na região administrativa da cidade de Ribeirão Preto, no Estado de São Paulo, migrou de outras Unidades Federadas, onde era alta a prevalência da doença de Chagas no passado. Esse fato ficou evidenciado pela elevação progressiva e constante da prevalência da doença, intimamente relacionada com a idade mais avançada dos procedentes de Minas Gerais e, especialmente, de São Paulo. Os baixos percentuais de soropositividade entre os jovens nascidos em São Paulo evidenciam os avanços obtidos no controle da doença neste estado, que antecederam aqueles realizados em outras UFs do Brasil. Entretanto, os resultados deste estudo mostraram que ainda existem doadores jovens infectados procedentes de áreas onde o Programa Nacional de Controle da Doença de Chagas tem sofrido problemas crônicos de continuidade. / SOUSSUMI, LMT. Seropositivity for Chagas’ disease among blood donators in the Regional Blood Bank of Ribeirão Preto, State of São Paulo, Brazil. 2004. 106f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004. This study involved 25.891 subjects who donated blood for the first time at the Blood Center of Ribeirao Preto, State of Sao Paulo, Brazil, from June 1996 to June 2001. The investigation had the following objectives: 1) to study the frequency of positive and indeterminate results for Chagas’ disease in screening tests; 2) to estimate the prevalence of blood donors infected with Trypanosoma cruzi through confirmatory assays; and 3) to describe the infected individuals according to some variables of epidemiological interest. Information was obtained from the computerized system of the Blood Center, by collecting data about blood donors, type of donation and results of screening and confirmatory tests for Chagas´ disease. In addition, some variables of epidemiological interest, such as age, origin, place of birth, type of donation and motive for donation were also studied. The population was mostly composed of men (83,6%) and individuals from 26 to 45 years of age (64,1%), most of them resident in the State of Sao Paulo (88,2%). Family reasons and friends’ requests were the main determinants for blood donation (85,4%). The serological screening was carried out by applying two tests (ELISA and IHA), resulting 244 positive and 386 inconclusive. Of the latter group, 386 inconclusive results, 236 were submitted to confirmatory assays, 28 of whom (11.9%) were found to be positive. In the total, there were 272 positive results, corresponding to a prevalence rate of 1,1% (CI95%: 0,9 – 1,2). Regarding the serological situation, the other subjects were classified as: negative (n=25.521; 98,6%), indeterminate (n=14; 0,1%) and unknown (n=84, 0,3%). Of this last group, 80 did not attend to the return visit and 4 presented problems related to blood samples. Despite living in the area around Ribeirao Preto, the great majority of infected donors migrated from other States, where the prevalence of Chagas´ disease was high in the past. This fact was evidenced by the progressive and constant elevation of prevalence rates, closely related to older ages among donors coming from the State of Minas Gerais and, especially, from the State of Sao Paulo. The low rate of positive results among young individuals born in Sao Paulo confirms the improvements obtained in the control of the disease in this State, that preceded those accomplished in other parts of Brazil. However, this study still shows the existence of infected young blood donors, originally living in areas where the National Program for Control of Chagas’ Disease has been suffering chronic operational problems.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, ainda faz parte do grupo de doenças negligenciadas, uma vez que ainda são escassos os investimentos destinados às pesquisas para desenvolvimento de novas drogas, de modo que as opções terapêuticas são limitadas. Sendo assim, é evidente a necessidade de estudos com a finalidade de desenvolver novos medicamentos eficazes na quimioterapia da doença. A espécie Tithonia diversifolia, o margaridão, é uma planta considerada invasora no Brasil, sendo encontrada ao longo de rodovias e em terrenos baldios. As lactonas sesquiterpênicas (LSTs) isoladas desta planta, possuem ação anti-inflamatória e anti-parasitária, dentre outras ações farmacológicas. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade tripanocida in vitro do extrato de lavagem foliar rico em LSTs (ELF) e da tagitinina C (TC) extraídos de T. diversifolia, isolados e em combinação com benznidazol (Bz). Adicionalmente, foi avaliado o potencial dos tratamentos, em monoterapia e combinados, em relação à capacidade de induzir a cura parasitológica, prevenir ou reduzir o índice de miocardite e suas influências na resposta imune celular e humoral de animais experimentalmente infectados pela cepa Y do T.cruzi. Os resultados demonstraram que tanto o ELF quanto a TC isolada possuem atividade tripanocida in vitro, apresentando a IC50 de 0,6426 μg/mL e 0,4022 μg/mL, respectivamente. Tais resultados foram considerados promissores quando comparados à IC50 de 9,32 μg/mL do fármaco de referência Bz. Ainda foi observado que o ELF e a TC reduziram em 32% e 51%, respectivamente, o índice de infecção por amastigotas em células H9c2, enquanto o Bz inibiu 36%. Nos experimentos in vivo, foi verificado que tanto o ELF quanto a TC foram capazes de suprimir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados pela cepa Y, sendo observada uma potencialização desta atividade quando as LSTs foram combinadas ao Bz, uma vez que o tratamento com ELF+Bz induziu a 70% de cura nos animais, o mesmo índice foi observado no tratamento com Bz em monoterapia. Já a combinação TC+Bz foi capaz de suprimir totalmente a parasitemia e os testes do critério de cura confirmaram um índice de 100% de cura entre os animais submetidos a este tratamento. Através da dosagem de citocinas, foi observado que as terapias combinadas inibiram a produção de IFN-γ e TNF-α, importantes citocinas pró-inflamatórias ligadas à lesão tecidual associada à doença de Chagas, e foi verificado também que animais submetidos aos tratamentos contendo as LSTs apresentaram maiores produções da citocina IL-10, o que sugere uma modulação da resposta imunológica induzida pela atividade anti-inflamatória das LSTs. O benefício da modulação da resposta imune também foi evidenciado pela ausência e/ou redução de miocardite nos animais que receberam o tratamento combinado com ELF+Bz e TC+Bz. De maneira geral, nossos resultados demonstram que o tratamento combinado entre TC e Bz é promissor, pois além de induzir ao índice de cura superior ao Bz em monoterapia, ainda preveniu a miocardite nos animais. Além disso, as LSTs são capazes de interferir na resposta imune do hospedeiro, podendo esta interferência estar relacionada a melhor prognóstico da doença. / According to the World Health Organization, Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is still part of the neglected diseases group, since investments for research into new drug development are scarce, therapeutic options are limited. Thus, the need for studies with the purpose of developing new drugs effective in the chemotherapy of the disease is evident. The Tithonia diversifolia species, daisy, is a plant considered invasive in Brazil, being found along highways and in vacant lots. The sesquiterpene lactones (STLs) isolated from this plant have anti-inflammatory and anti-parasitic action, among other pharmacological actions. In this sense, the objective of this work was to evaluate the trypanocidal activity of foliar lavage extract in STLs (ELF) and tagitinin C (TC) extracted from T. diversifolia, isolated and in combination with benznidazole (Bz). In addition, the potential of monotherapy and combined treatments in relation to the ability to induce parasitological cure, and to prevent or reduce the myocarditis index and its influences on the cellular and humoral immune response of experimentally infected animals by T.cruzi Y strain were evaluated. The results demonstrated that both the ELF and the isolated TC have trypanocidal activity in vitro, presenting the IC50 of 0.6426 μg/mL and 0.4022 μg/mL, respectively. These results were considered promising when compared to the IC50 of 9.32 μg/mL of the reference drug Bz. It was also observed that ELF and TC reduced the rate of infection by amastigotes in H9c2 cells by 32% and 51%, respectively, while Bz inhibited 36%. In the in vivo experiments, it was verified that both ELF and TC could suppress the parasitemia of the animals experimentally infected by strain Y, being observed a potentiation of this activity when the STLs were combined with Bz, once the treatment with ELF + Bz induced 70% cure in the animals, the same rate was observed in the treatment with Bz monotherapy. The TC + Bz combination could completely suppress the parasitaemia and the tests of the curing criterion confirmed a cure rate of 100% among the animals submitted to this treatment. Through dosing of cytokines has been observed that combination therapy inhibited the production of IFN-γ and TNF-α, important inflammatory cytokines related to tissue injury associated with Chagas’ disease, and was also found that animals subjected to treatments containing the STLs, presented higher IL-10 cytokine productions, suggesting a modulation of the immune response induced by the anti-inflammatory activity of the STLs. The benefit of modulation of the immune response was also evidenced by the absence and / or reduction of myocarditis in the animals receiving combined treatment with ELF + Bz and TC + Bz. In general, our results demonstrate that the combined treatment between TC and Bz is promising, since in addition to inducing the cure rate superior to Bz in monotherapy, it still prevented the myocarditis in the animals. In addition, the STLs are capable of interfering in the immune response of the host, and this interference may be related to a better prognosis of the disease. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais. / Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T14:09:58Z No. of bitstreams: 1 Tese_RafaelleCGomesFaresGusmão.pdf: 2582678 bytes, checksum: c69c8890c0878586f273089f5214d41f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T14:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_RafaelleCGomesFaresGusmão.pdf: 2582678 bytes, checksum: c69c8890c0878586f273089f5214d41f (MD5) Previous issue date: 2013 / A cardiomiopatia dilatada crônica decorrente da infecção pelo T. cruzi está associada com o remodelamento do miocárdio e com a fibrose intersticial, o que resulta em mudanças significativas da matriz extracelular (MEC). O remodelamento da MEC é regulado por enzimas proteolíticas como as metaloproteinases de matriz (MMPs). Nesse estudo, avaliamos pela primeira vez o envolvimento das MMPs 2 e 9 e seus inibidores (TIMPs) em pacientes portadores das formas clínicas indeterminada (IND) e cardíaca (CARD) da doença de Chagas. Nossos resultados mostraram que os níveis séricos da MMP-9 estão associados com a gravidade do acometimento cardíaco e que a MMP-9 possui maior potencial de atividade proteolítica no soro de pacientes CARD. Os níveis séricos de TIMP-1 não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos estudados. Por outro lado, os níveis séricos de TIMP-2 foram maiores no grupo CARD. A partir da análise de correlação, foi possível observar uma possível especificidade do TIMP-1 pela MMP-9. A análise da produção de MMPs por linfócitos T e monócitos mostrou que essas células do sistema imune são capazes de produzir MMP-2 e MMP-9 e, ainda que linfócitos T CD8+ são as principais células mononucleares produtoras de MMP-2 e MMP-9. A partir da cultura tridimensional de cardiomiócitos de camundongos, observamos que existem componentes no soro dos pacientes com doença de Chagas capazes de induzir a expressão de componentes da matriz extracelular no microtecido cardíaco. Além disso, MMP-2 apresentou correlação negativa com proteínas de matriz (laminina e fibronectina) e com citocinas inflamatórias (TNF-IL-6 e IL-1), enquanto que a MMP-9 apresentou correlação positiva com proteínas de matriz (laminina e fibronectina) e com a citocina inflamatória IL-1. A partir da análise da ocorrência de polimorfismos de nucleotídeo único, não foi possível observar influência da genética do hospedeiro sobre os níveis séricos das MMPs 2 e 9 e seus inibidores, bem como sobre a morbidade da doença de Chagas. Nossos resultados sugerem que MMP-2 e MMP-9 participam de maneira diferente na patogênese da doença de Chagas, sendo que a MMP-9 parece estar mais envolvida no processo inflamatório e no remodelamento cardíaco. Em resumo, nossos resultados mostram, pela primeira vez, o envolvimento da MMP-9, mas não da MMP-2, na cardiomiopatia chagásica. Esses dados são inovadores e representam um avanço no conhecimento dos mecanismos envolvidos no estabelecimento e manutenção da patologia do acometimento cardíaco na doença de Chagas. / Dilated chronic cardiomyopathy (DCC) in Chagas disease is associated with myocardial remodeling and interstitial fibrosis, resulting in significant extracellular matrix (ECM) modifications. ECM remodeling is regulatedby proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinases (MMPs). In this study, we evaluated, for the first time, the serum MMPs 2 and 9 levels, as well as their main cell sources in the peripheral blood from patients presenting the indeterminate (IND) or cardiac (CARD) clinical forms of Chagas disease. Our results showed that MMP-9 serum levels are associated with the severity of Chagas disease. The serum levels of TIMP-1 were not different between the studied groups; however the serum levels of TIMP-2 were higher in CARD group.The correlation analysis showed a possible specificity of TIMP-1 for MMP-9. The analysis of MMPs production by T lymphocytes showed that CD8+ T cells are the main source of both MMP-2 and MMP-9 molecules. Using a new 3-dimensional model of fibrosis we also observed that serum from patients with Chagas disease induced an increase in the extracellular matrix components in cardiac spheroids obtained from mice cardiomyocytes. Furthermore, MMP-2 and MMP-9 have showed different profile of correlation with matrixproteins (laminin and fibronectin) and inflammatory cytokines (TNF-and IL-1) in patients with Chagas disease. Our results suggest that MMP-2 and MMP-9 show distinct activities in Chagas disease pathogenesis. While MMP-9 seems to be involved with the inflammation and cardiac remodeling of Chagas disease, MMP-2 does not show any correlation with inflammatory molecules. There are many factors involved in the determination of the severity and progression of Chagas disease, and host genetics is certainly a contributing factor for the development of the disease. Therefore, we evaluated whether there were significant polymorphisms in MMPs and TIMPs genes. Our results did not show any association between polymorphisms occurrence and morbidity of the disease. In conclusion, our datastress the involvement of MMP-9, and not of MMP-2, in heart disease and, for the first time, its participation in chagasic cardiomyopathy. These data are innovative and represent an advance in the knowledge of the mechanisms involved in the establishment/maintenance of the Chagas heart disease pathology.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-16T23:26:21Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Andre Luis Souza.pdf: 3755617 bytes, checksum: e99b71eb0533b935acc75e908e5504a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-16T23:26:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Andre Luis Souza.pdf: 3755617 bytes, checksum: e99b71eb0533b935acc75e908e5504a3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os peptídeos antimicrobianos têm se mostrado uma boa alternativa para as terapias antiparasitárias. Neste trabalho descrevemos a estrutura e a atividade biológica da temporizina (FLPLWLWLWLWLWKLK) e sua ação contra formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi. A temporizina é um peptídeo híbrido, sintetizado a partir de outros três peptídeos antimicrobianos: a temporina A (FLPLIGRVLSGIL-NH2), a sapecina B (KLKLLLLLKLK-NH2) e a gramicidina A (HCO-VGALAVVVWLWLWLW-NHCH2). Os efeitos da temporizina sobre o Trypanosoma cruzi e sua toxicidade para células de mamíferos foram analisados utilizando as metodologias de citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e liberação da lactato desidrogenase (LDH). O valor concentração efetiva de temporizina para lisar 50% das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (EC50), foi determinado em um ensaio de viabilidade celular através do método de metabolização do brometo azul de tetrazólio (MTT). Para determinar a liberação de hemoglobina e quantificar a porcentagem de hemólise causada pela temporizina em doses letais para o Trypanosoma cruz. Utilizamos o método colorimétrico. Os dados sobre a EC50 e a capacidade hemolítica da temporizina foram então utilizados para a determinação do índice terapêutico do peptídeo. O mapeamento da estrutura da temporizina e a determinação de suas características foram obtidos através da metodologia de dicroísmo circular em um ambiente hidrofóbico que mimetizou as bicamadas das biomembranas. Submetemos a sequência da temporizina à plataforma Itasser para modelagem de proteínas e softwares, com o objetivo de realizar predições teóricas sobre a sua estrutura e características conformacionais. Para avaliar os efeitos da temporizina sobre a eletrofisiologia de membranas, foi usada a técnica de Patch-Clamp em célula inteira ou célula ligada. Essa técnica associada com experimentos envolvendo captação de corantes com diferentes valores de massa molecular permitiu determinar o limite de exclusão dos poros formados pelo peptídeo. Tendo em vista, as características estruturais e a atividade tripanocida da temporizina, concluímos que este peptídeo é uma alternativa viável para o desenho racional de um novo fármaco para o controle da doença de Chagas. / The antimicrobial peptides have been shown to a good alternative for the therapy antiparasites. At this work, we describe the structure and the biological activity of temporizin (FLPLWLWLWLWLWKLK) and its action against epimastigotes of Trypanosoma cruzi. The temporizin is a hybrid peptide, synthesized from three other antimicrobial peptides: the temporin A (FLPLIGRVLSGIL-NH2), the sapecin B (KLKLLLLLKLK-NH2) and gramicidin A (HCO-VGALAVVVWLWLWLW-NHCH2). The effects of temporizin over T. cruzi and its toxicity for the mammalian cells were analyzed using flow cytometry, fluorescence microscopy and release of lactate dehydrogenase (LDH). The value of the effective concentration of temporizin to lyse 50% of epimastigotes forms of T. cruzi (EC50) was determined in a cell viability assay using the method of metabolism of tetrazolium blue thiazol methyl bromide (MTT). To determine the release of hemoglobin and to quantify the percentage hemolysis caused by lethal doses temporizin T. cruzi, we used the method colorimetric. The data about the EC50 and the hemolytic capacity of temporizin were then used to determine the peptide’s therapeutic index. The mapping of the structure of temporizin and the determining the characteristics were obtained through the method of circular dicroism (CD) in a hydrophobic environment that mimicked the bilayers of membranes. We submitted the sequence of the platform itasser and software for modeling proteins, with the purpose to make of theoretical predictions about the structure and conformational characteristics. To evaluate the effect of temporizin over membrane electrophysiology, was used the technique of patch-clamp in a whole cell or attached cell form. This technique associated with experiments involving uptake of dyes with different molecular mass values, allowed to determine the exclusion limit of the pores formed by the peptide. Given the structural characteristics and trypanocidal activity of temporizin, we concluded that this peptide is a viable alternative to the rational design of a new drug for the control of Chagas disease.