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Développement du couplage électrophorèse capillaire - spectrométrie de masse haute sensibilité : application à la caractérisation fine de protéines / Development of high sensitivity capillary electrophoresis - mass spectrometry coupling : application to multi-level characterization of proteins

Gahoual, Rabah 29 September 2014 (has links)
Les interfaces permettant le couplage entre l'électrophorèse capillaire (CE) et la spectrométrie de masse (MS) à source ESI souffrent actuellement d'un manque de robustesse ou de sensibilité. Les travaux présentés décrivent la mise en oeuvre d'un nouveau type d'interface CE-ESl-MS â haute sensibilité CESl-MS. La caractérisation du spray généré par CESl-MS a montré la production d'un nanoESI induisant une augmentation importante de la sensibilité par rapport au régime ESI classique. Le système CESl-MS a pu ainsi être mis en oeuvre comme plateforme d'infusion nanoESI et utilisé pour l'étude de complexes non-covalents de haut poids moléculaires en MS native. Une méthodologie par CESl-MS/MS a également été développée pour la caractérisation complète de la structure primaire d'anticorps monoclonaux (mAbs). Les résultats montrent la possibilité en une unique injection de caractériser l'ensemble de la séquence d'acides aminés, un nombre significatif de glycosylations et l'ensemble des modifications d'intérêts. Cette méthodologie a pu être appliquée pour déterminer la similarité entre des mAbs commerciaux et leur candidat biosimilaire respectif. / Interfacings allowing the hyphenation of capillary electrophoresis (CE) to ESI mass spectrometry(MS) currently suffer from lack of robustness and sensitivity. This work describes the application of a new design of CE-ESl-MS coupling referred as the CESl-MS. Characterization of the ESI generated through the CESl-MS system showed the production of a nanoESI allowing to increase drastically the sensitivity compared to conventional ESI. The CESl-MS was used as a nanoESI infusion platform allowing to study high molecular masses noncovalent complexes in native MS. A CESl-MS/MS method was developed enabling the complete primary structure characterization o fmonoclonal antibodies (mAbs). Results showed the ability of the methodology in a single injection to simultaneously characterize the entire amino acid sequence, a significant number of glycosylation and all the posttranslational modifications of interest. Finally the methodotogy was applied to assess the similarity between marketed mAbs and their respective biosimilar candidate.
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Évaluation analytique d’anticorps monoclonaux thérapeutiques à visée anticancéreuse dans le contexte hospitalier : nouvelles approches / Analytical evaluation of anticancer monoclonal antibody in hospitals : new approaches

Jaccoulet, Emmanuel 07 February 2017 (has links)
Les anticorps monoclonaux (Acms) représentent une part importante des traitements médicamenteux à visées anticancéreuses à l'hôpital. Leur action ciblée et leur efficacité favorisent leur essor considérable dans le monde pharmaceutique. Leur reconstitution est nécessaire avant d'être administré par voie intraveineuse chez le patient. A l’heure actuelle, il n’existe pas de contrôle rigoureux permettant leur indentification. Compte-tenu de leurs propriétés physico-chimiques similaires leur discrimination par un contrôle analytique hospitalier pré-libératoire est un véritable défi. Dans cette thèse trois nouvelles approches ont été explorées pour permettre la discrimination et l'identification rapide d’un mélange de quatre anticorps monoclonaux après reconstitution: le bevacizumab, le cetuximab, le rituximab et le trastuzumab. Parmi ces approches, deux portent sur des méthodes séparatives : la chromatographie d'échange de cations sur support monolithique et l'électrophorèse capillaire de zone. Les conditions d'analyse de ces méthodes ont été optimisées dans l'objectif d’une identification rapide et fiable. Nous avons également étudié les paramètres intrinsèques des anticorps monoclonaux influençant leur séparation. La troisième approche est basée sur une méthode spectrale ultra-rapide par spectroscopie UV dérivée associant l'analyse par injection en flux et l'analyse multivariée. L'étude des données spectrales par l'analyse multivariée nous a permis de concevoir un algorithme capable de discriminer sans ambigüité les anticorps monoclonaux à partir de leurs informations spectrales. / Anticancer monoclonal antibodies (mAbs) represent a large part of anticancer drugs at hospital. Their success is related to their capacity to specifically interact with their target with relatively low adverse effects. mAbs must be compounded at the hospital before patient's infusion. They exhibit common features rendering their discrimination through fast analytical methods difficult. At the hospital, quality controls mainly rely on mAbs identity and quantity compliance. However, identity of compounds with high similarity remains challenging. In this thesis, three new approaches for the discrimination and the identification of four mAbs, bevacizumab, cetuximab, rituximab and trastuzumab have been investigated. Among them, two approaches are based on separation methods Cation exchange chromatography on a monolithic stationary phase and capillary electrophoresis. The analytical conditions were extensively optimized to obtain rapid and suitable method allowing their discrimination. We have also studied the influence of their physico-chemical properties on their separations. The third approach relies on a rapid second derivative spectral method combining flow injection analysis and multivariate analysis. An algorithm able to discriminate accurately the monoclonal antibodies has been designed from in-depth study of the spectral data through multivariate analysis.
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Développement de stratégies d'analyse miniaturisée de biomarqueurs de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine / Development of miniaturized analytical strategies for the analysis of biomarkers of familial transthyretin amyloid polyneuropathy

Bataille, Jeanne 20 December 2017 (has links)
La polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (FAP-TTR) est une maladie rare héréditaire à transmission autosomique dominante liée à la production de formes mutantes de la transthyrétine (TTR). Ces mutations sont à l’origine d’un changement de conformation de la protéine qui, in vivo, se présente sous forme de tétramère. Celui-ci est alors déstabilisé et évolue vers la formation de fibrilles amyloïdes qui s'accumulent au niveau du système nerveux autonome, des nerfs périphériques et des organes. Ces dépôts sont responsables de la pathologie. Dans le but d’évaluer l’efficacité des thérapies pouvant être mises en œuvre, nous avons développé des stratégies analytiques visant à concevoir un système « point of care » à usage hospitalier permettant de quantifier les formes mutante et native circulantes de la TTR. La méthodologie développée consiste à réaliser la séparation électrocinétique de fragments ciblés de la TTR, obtenus par digestion enzymatique de la protéine. Cette approche analytique a été développée en se focalisant sur une mutation fréquente en France : la TTR Thr49Ala où une thréonine est remplacée par une alanine en position 49. Au cours de cette thèse, deux types de microréacteurs enzymatiques ont été étudiés, i.e. (i) un lit fluidisé contenant des particules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de trypsine et (ii) une puce monolithique à base de thiol-ène fonctionnalisée également par la trypsine. Le pouvoir catalytique de ces microsystèmes a été comparé en mesurant l’efficacité de digestion du BApNA (substrat modèle) et de la TTR à l’aide de méthodes analytiques telles que la spectrophotométrie d’absorption UV-Visible, l’électrophorèse capillaire couplée à une détection UV (EC-UV) et la chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de masse (UHPLC-SM). Les résultats obtenus ont montré que le microréacteur enzymatique monolithique à base de thiol-ène était le plus performant pour digérer la TTR. Par ailleurs, nous avons réalisé, au cours de cette étude, l’optimisation d’une méthode EC-UV, adaptée à l’analyse des digestats recueillis en sortie de microréacteur. Elle a permis de séparer et de quantifier les peptides d’intérêt pour déterminer le rapport de TTR mutante (Thr49Ala) sur TTR native. / Transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP) is a hereditary rare disease with an autosomal dominant transmission, related to the production of mutant forms of transthyretin (TTR). These mutations lead to a conformational change of the protein whose in vivo form is a tetramer. As a consequence, this tetramer is destabilized and evolves towards the formation of amyloid fibrils that aggregate on the autonomic nervous system, peripheral nerves, and organs. These deposits are responsible for the pathology. In order to evaluate the efficiency of possible therapies, we developed analytical strategies aiming at designing a “point of care” system for hospital use, which would enable the quantification of circulating mutant and native forms of TTR. The methodology that we developed consists in undertaking the electrokinetic separation of targeted TTR fragments obtained through the enzymatic digestion of the protein. This analytical approach has been developed while focusing on a frequent mutation in France: the TTR Thr49Ala mutation in which a threonine is substituted by an alanine in position 49. In this thesis, two types of enzymatic microreactors have been studied, i.e. (i) a fluidized bed containing magnetic particles functionalized by trypsin molecules and (ii) a thiol-ene-based monolithic chip also functionalized by trypsin. The catalytic power of these microsystems has been compared by measuring the digestion efficiency of BApNA (model substrate) and TTR through analytical methods such as UV-visible absorption spectrophotometry, capillary electrophoresis with UV detection (CE-UV), and liquid chromatography with mass spectrometry detection (UHPLC-MS). The results showed that the thiol-ene-based monolithic enzymatic microreactor was the most efficient system to digest TTR. Besides, during this study, we undertook the optimization of a CE-UV method which is adapted to the analysis of digested sample collected directly out of the microreactor. This allowed us to isolate and quantify the peptides of interest to measure the ratio of mutant TTR (Thr49Ala) versus the wild one.
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Approches analytiques pour l'analyse et la caractérisation d'anticorps thérapeutiques dégradés : intérêt de la spectrométrie de masse en mode non-dénaturant / Analytical approaches for the analysis and characterization of degraded therapeutic antibodies : potentials of native mass spectrometry

Le, Minh Thang 18 December 2019 (has links)
La manipulation des anticorps monoclonaux thérapeutiques (Acm) reconstitués avant administration aux patients est susceptible d’entraîner leurs dégradations physiques (e.g. dénaturation, agrégation). Ceci peut avoir un impact sur leur efficacité et sécurité. Afin d’étudier la conformation et la stabilité des Acms reconstitués, nous avons développé des méthodes séparatives couplées avec la spectrométrie de masse (MS) en conditions non-dénaturantes (« native »). Une méthode de CZE-native MS utilisant un revêtement constitué d’une triple-couche ionique a été développée pour séparer et détecter les différentes conformations (monomère natifs, dénaturés, dimères) d’Infliximab. Une étude approfondie réalisée en analysant de l’infliximab digéré a permis d’établir que la formation du dimère était liée à la dénaturation du fragment Fab. L’intérêt des revêtements statiques (commerciaux et préparés in situ) ont été étudiés pour analyser les Acms par CZE-UV et CZE-MS. Nos résultats ont montré l’intérêt d’un nouveau revêtement monolithique. Un couplage simultané de la SEC avec la MS et un détecteur de fluorescence a été développé. Nous avons ainsi identifié les conditions expérimentales qui entraînaient des dénaturations et des dimérisations artificielles. Cette méthode a ensuite été également appliquée avec succès pour la caractérisation d’un échantillon de Trastuzumab stressé. Une méthode orthogonale en utilisant la SEC-mobilité ionique-MS a été employé pour évaluer la proportion de monomères dénaturés par rapport aux monomères natifs. La méthodologie ainsi développée permettra la détection de très faibles taux d'anticorps dégradés dans des poches d'infusion. Ceci permettra de définir les paramètres critiques à maîtriser lors de la reconstitution et la manipulation d’anticorps à usage hospitalier. / Manufacturing and manipulation of therapeutic monoclonal antibodies (mAb) in the hospital before administration to patient is prone to induce their physical degradations (e.g., denaturation, aggregation). This may impact their efficacy and safety. To study the stability of mAbs, capillary zone electrophoresis (CZE) and size exclusion chromatography (SEC), coupled to native mass spectrometry (MS) have been developed. CZE-native MS method using a triple-layer coating was developed to detect and separate different conformational states (unfolded monomer, dimer) of Infliximab in a single analysis. In-depth study with digested infliximab confirmed that dimer formation was related to the Fab fragment. We also focused on covalent coatings in order to find the more adapted coating to analyze mAbs by CZE-UV and CZE-MS. We also developed for SEC a simultaneous coupling with MS and a fluorescence detector to detect the degraded mAbs. We have identified the biases inducing conformational changes (e.g. dimerization, denaturation) that may arise during native MS. We also successfully characterized aggregates and denatured monomer in stressed Trastuzumab sample. In addition, the orthogonal method SEC-ion mobility-MS has been employed to separate and measure the denatured monomers compared to their related native conformations. Moreover, the developed system enables the detection of a very low levels of degraded mAbs in infusion bags. It allows to define the critical parameters to be controlled during the reconstitution and manipulation of therapeutic mAbs in hospital.
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Etude par électrophorèse capillaire des propriétés de résolution chirale des oligonucléotides en série ADN / Capillary electrophoresis study of the chiral resolution properties of DNA oligonucleotides

Tohala, Luma 17 July 2018 (has links)
De nos jours, la stéréochimie des médicaments est devenue un enjeu important aussi bien pour l'industrie pharmaceutique que pour les autorités réglementaires. Il a été démontré que les nucléotides / nucléosides ou les structures en double hélice et tétrade de guanine présentaient certaines propriétés énantio sélectives. Néanmoins, à ce jour, très peu d’études se sont focalisées sur l’utilisation de l’ADN en tant que sélecteur chiral. Grâce à l’utilisation d’une méthode de remplissage partiel, les propriétés de discrimination chirale d'un répertoire d'oligonucléotides (ONs) en série ADN caractérisé par diverses compositions de bases et de structures ont été testées sur une large gamme de mélanges racémiques par électrophorèse capillaire (EC), méthode séparative performante utilisant de faibles volumes d’échantillons. A des concentrations d'ADN sub-millimolaire, il a été montré que tous les ONs en série ADN testés, présentaient des capacités d'énantio discrimination vis-à-vis de plusieurs composés pertinents. Les couples d’énantiomères séparés sont, soit des composés cationiques possédant un groupement phényle, soit des analytes sans charge nette ou avec une charge positive et comportant deux cycles aromatiques. Une étude portant sur les capacités séparatives de plusieurs séquences d'homopolymères poly-dT de longueurs différentes (de 5 à 60-mer) a ensuite été menée sur certains couples d’énantiomères. Les résultats ont montré qu’une longueur minimale de 30 bases, où l'ADN semble adopter une conformation de type pelote, présentait de meilleures propriétés d'énantioséparation qu’une séquence constituée d’un maximum de 10 bases. De plus, la reconnaissance chirale des ONs en série ADN implique principalement des bases d'ADN libres dont la diversité chimique augmente leur capacité d'énantio résolution. Finalement, afin d'étudier la contribution thermodynamique impliquée dans les séparations énantiomériques obtenues par les ONs simples brins testés, des mesures de constantes d’affinité pour les énantiomères du tryptophane ont été réalisées vis-à-vis du Poly-dT30 par trois techniques différentes. Les méthodes utilisées n’ont pas permis de déterminer une différence d’affinité entre les deux énantiomères. / Nowadays, drug stereochemistry has become a significant issue for both the pharmaceutical industry and the regulatory authorities. It has been demonstrated that nucleotides/ nucleosides or duplex and G-quadruplex structures showed some enantioselective properties. Nevertheless, to date, the use of DNA as chiral selector has been largely neglected. Using partial filling capillary electrophoresis (CE) method, highly efficient technique with little volume consumption need, the assessment of the enantioselective properties of a repertoire of arbitrarily chosen DNA oligonucleotides (ONs) characterized by diverse base compositions and structural features was studied for a series of various racemates. Under (sub) millimolar DNA concentration conditions, it was shown that all the ONs tested presented enantiodiscrimination properties for interesting organic compounds. The resolved compounds are either cationic carrying one phenyl group or contain two aromatic cycles with no net or one positive charge. Then, sequence prerequisites of ONs for the CE enantioseparation process were studied for a series of homopolymeric sequences (Poly-dT) of different lengths (from 5 to 60-mer) and for the discrimination of various enantiomers. The results showed that the sequence length of 30-mer (or more) of the ONs was better for the enantioseparation properties, where the DNA adopted a coil-like conformation, than ONs with a sequence length ≤ 10-mer. The base-unpaired state constituted also an important factor in the chiral resolution ability of ONs. Moreover, the chemical diversity enhanced the enantioresolution ability of single-stranded ONs. Finally, several attempts have been conducted to study the thermodynamic contribution involved in enantiomeric separation obtained with DNA strands. Binding affinity constants were determined for tryptophan enantiomers towards Poly-dT30 by three different techniques. The used methods did not allow determining a difference of affinity between enantiomers.
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Interaction et structure de copolymères neutres-chargés dissymétriques en solution aqueuse

Muller, François 01 December 2000 (has links) (PDF)
Nous avons étudié les propriétés volumiques de copolymères diblocs neutres-chargés dissymétriques. Ces molécules sont composées d'une courte partie neutre de poly(éthylène propylène) (PEP) ou de poly(tert-butyl styrène) (PtBs), et d'une longue partie chargée (polyélectrolyte) poly(styrène sulfonate) sodium (PSSNa) de taux de sulfonation supérieur à 80. Des expériences de diffusion de neutrons aux petits angles et de diffusion quasi-élastique de la lumière ont montré que ces copolymères s'auto-assemblent en solution aqueuse en micelles sphériques : coeur composé de l'auto-association des parties neutres en mauvais solvant, duquel émergent les parties chargées en une grande couronne qui peut être vue comme une brosse polyélectrolyte en géométrie sphérique. La forme et la taille des coeurs hydrophobes ont été trouvées invariantes en fonction de la concentration en polymère et de la concentration en électrolyte ajouté (sel monovalent, NaCl). Cette invariance a permis de déterminer les facteurs de structure des solutions (images des interactions) : les interactions électrostatiques ordonnent les solutions même dans le régime dilué (régime sans contact entre micelles). Dans le régime dilué sans sel ajouté, les parties polyélectrolytes (composant la couronne micellaire) ont été trouvées avec une conformation étendue (quasi-bâtons). Avec du sel ajouté, cette conformation devient de plus en plus flexible dès que la concentration en sel est supérieure à la concentration interne en sel d'une micelle. Dans le régime concentré sans sel ajouté, l'apparition d'un pic polyélectrolyte aux petites échelles, typique de la formation d'un semi dilué de polyélectrolytes, a été mise en évidence. De manière surprenante, cet ordre polyélectrolyte coexiste avec l'ordre entre micelles. L'influence du nombre de chaîne par micelle (nombre d'agrégation) a été discutée. Avec du sel ajouté, le pic polyélectrolyte disparaît, tandis que les solutions restent ordonnées. La distribution des contre-ions a été étudiée par des expériences de diffusion de rayons x aux petits angles. Les contre-ions Na+ ont été remplacés par d'autres contre-ions (typiquement Cs+ et TMA+) par dialyse des solutions. Dans le cas des micelles de faible nombre d'agrégation, la distribution des contre-ions a été trouvée en accord avec la distribution donnée par l'équation de Poisson-Bolztmann autour d'un bâton. Dans le cas des micelles de grand nombre d'agrégation, une forte corrélation entre contre-ions, due au recouvrement des différents nuages, a été mise en évidence. Enfin, la concentration micellaire critique (concentration à partir de laquelle des micelles existent) et l'équilibre des solutions ont été étudiés par électrophorèse capillaire. Les résultats ne sont pas encore bien compris : il existe, quelle que soit la concentration en polymère, 20% de chaînes libres (non associées en micelles).
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Développement d’outils ultra-performants de criblage enzymatique de produits naturels par électrophorèse capillaire / Development of high-performance tools for enzymatic screening of natural products by capillary electrophoresis

Fayad, Syntia 18 December 2017 (has links)
Le vieillissement de la peau est l'un des signes extérieurs du passage du temps. Avec l’âge, la peau devient plus sèche et se ride suite à la dégradation des macromolécules de la matrice extracellulaire par des enzymes cutanées telles que l’élastase, l’hyaluronidase et la collagénase. L’objectif de ce travail de thèse est de développer des tests enzymatiques miniaturisés en électrophorèse capillaire pour cribler des extraits de plantes et identifier de nouveaux bioactifs pour la cosmétique et le bienêtre de la peau. Ces essais ont été développés soit en dehors du capillaire (qui sert uniquement de milieu de séparation) ou dans le capillaire (qui sert alors de nanoréacteur enzymatique), puis optimisés pour permettre la détermination des constantes cinétiques (Km, Vmax et IC₅₀). La diffusion transversale des réactifs (TDLFP) a été appliquée pour mélanger les créneaux de réactifs injectés dans le capillaire. Des détecteurs tels que la fluorescence induite par laser ou la spectrométrie de masse à haute résolution ont été couplés à l’électrophorèse capillaire afin d’atteindre de fortes sensibilités de détection et la possibilité d’identifier les produits de la réaction enzymatique. Ces essais miniaturisés ont été appliqués à des algues extraites par électroporation ou à des plantes régionales extraites par des technologies vertes afin d’évaluer leur activité biologique vis-à-vis des enzymes de la peau. Les essais développés sont fiables, robustes et économes en réactifs. Enfin, l’utilisation d’une nouvelle technique d’analyse, la thermophorèse à micro-échelle, s’est montrée très utile et pleine d’espoir pour l’étude des interactions enzyme-effecteur. / Skin aging is one of the exterior/external signs of the passage of time. With age, the skin becomes drier and gets wrinkled due to the degradation of macromolecules of the extracellular matrix by skin enzymes such as elastase, hyaluronidase and collagenase. The aim of this thesis is to develop miniaturized enzymatic assays by capillary electrophoresis to screen plant extracts and identify new bioactives for cosmetics and skin wellbeing. These assays were developed either outside the capillary (which serves only as a separation tool) or in the capillary (which then serves as an enzymatic nanoreactor) then optimized to allow the determination of kinetic constants (Km, Vmax and IC₅₀). Tranvserse diffusion of laminar flow profiles (TDLFP) was applied to mix the reactants injected into the capillary. Detectors such as laser-induced fluorescence or high-resolution mass spectrometry have been coupled to capillary electrophoresis to achieve high sensitivities of detection and the possibility of identifying the products of the enzymatic reaction. These miniaturized assays were applied to algae extracted by electroporation or to regional plants extracted by green technologies in order to evaluate their biological activity towards skin enzymes. The assays developed are reliable, robust and economic in reactants consumption. Finally, the use of a new analytical technique, microscale thermophoresis, was shown to be very useful and hopeful for the study of enzyme-effector interactions.
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Etude des réactions enzymatiques par électrophorèse capillaire / The study of enzymatic reactions by capillary electrophoresis

Nehme, Hala 17 December 2013 (has links)
Les enzymes sont les catalyseurs de toutes les réactions biochimiques. Leur dérégulation peut être impliquée dans de nombreuses pathologies graves. L’étude de ces réactions est importante pour dépister les anomalies, mieux comprendre le fonctionnement des enzymes et rechercher des modulateurs de leur activité. Le présent travail de thèse présente différents types d’essais enzymatiques basés sur l’électrophorèse capillaire pour étudier la cinétique d’enzymes variées. Le mode pré-capillaire où la réaction enzymatique est effectuée à l’extérieur du capillaire et les essais homogènes en-ligne en mode discontinu où la réaction est réalisée dans le capillaire, sont appliqués. Les méthodes développées sont optimisées pour assurer un mélange optimal des réactifs et une bonne séparation électrophorétique. Les constantes cinétiques et d’inhibition (Vmax, Km et IC50) de la réaction enzymatique sont déterminées et comparées à celles obtenues par les techniques classiques. Pour les essais en-ligne, plusieurs types de mélange (par application d’un champ électrique, par diffusion longitudinale ou diffusion transversale) des créneaux de réactifs sont utilisés selon le système enzymatique étudié. Finalement, jusqu’à quatre réactifs injectés successivement dans le capillaire sont mélangés avec succès. De nombreux essais sont effectués sur des matrices complexes (cellules, extraits de plantes). Le criblage d’inhibiteurs de référence et de synthèse est réalisé sur plusieurs kinases humaines : CDK1/cycline B, CDK5/p25, DYRK1A, GSK3!, PI3K, Akt et mTOR. Les essais développés se sont avérés être simples, rapides, quantitatifs, économes en réactifs et répétables. / Enzymes catalyze all enzymatic reactions. Their deregulation can be involved in several severe diseases. The study of these reactions is important to detect anomalies, to better understand enzyme functioning and to seek modulators of their activity. This thesis presents capillary electrophoresis based enzymatic assays developed to study kinetics of various enzymes. The pre-capillary mode in which the enzymatic reaction occurs outside the capillary and the incapillary plug-plug mode of homogenous assays where the reaction is performed inside the capillary are applied. The methods developed are optimized to ensure optimum reactant mixing and a good electrophoretic separation. The kinetic and inhibition constants (Vmax, Km and IC50) of the enzymatic reaction are determined by these assays and compared to the results obtained using conventional techniques. For in-capillary assays, several mixing types (by application of an electric field, by longitudinal diffusion or transverse diffusion) of the reactant plugs are used depending on the enzymatic system studied. Finally, up to four reactants injected successively in the capillary are successfully mixed. Many assays are performed on complex matrices (cells, plant extracts). Screening of referenced and synthesized inhibitors on several human kinases: CDK1/cyclin B, CDK5/p25, DYRK1A, GSK3!, PI3K, Akt and mTOR are performed. Developed assays proved to be quantitative, simple, economic, fast and robust.
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Characterization of therapeutic proteins by capillary electrophoresis (CE) coupled to mass spectrometry (MS) / Caractérisation de protéines thérapeutiques par électrophorèse capillaire (CE) couplée à la spectrométrie de masse (MS)

Said, Nassur 18 September 2017 (has links)
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif. / Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions.
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Complexation des actinides (III, IV et V) par des acides organiques / Complexation of the actinides (III, IV and V) with organic acids

Leguay, Sébastien 05 November 2012 (has links)
L’acquisition de données structurales et thermodynamiques relatives à des systèmes actinides (An(III), Pu(IV) Pa(V))–acides organiques polyfonctionnels (citrique, NTA, DTPA), en solution aqueuse, vise à une meilleure compréhension des interactions actinides-ligands essentielle à l’optimisation de procédés de séparation, de décorporation, et également à l’évaluation de la sûreté des sites de stockage de déchets radioactifs. Le comportement du protactinium pentavalent à l’échelle des traces en présence des anions citrates et NTA a fait l’objet d’études systématiques par extraction liquide-liquide dans le système TTA/Toluène/HClO₄/NaClO₄/Pa(V)/ligands. Après avoir déterminé l’ordre limite des complexes (3 pour Pa(V)-Cit et 2 pour Pa(V)-NTA), les constantes de formation associées à chaque espèce ont pu être calculées. L’étude multi-technique (électrophorèse capillaire et spectrofluométrie laser) sur la complexation des An(III) par le DTPA, réalisée à plusieurs pH, a permis de mettre en évidence la coexistence des complexes mono-protoné (AnHDTPA–) et déprotoné. (AnDTPA²–) pour des solutions acides et faiblement acides. Une réinterprétation des données de la littérature, en considérant les deux complexes, a permis de faire converger les valeurs des constantes de complexation des espèces qui étaient jusqu’à maintenant dispersées. L’étude thermodynamique a ensuite été complétée par une étude théorique (calculs DFT). La structure des complexes protoné et non protoné et le mode de coordination du Curium ont ainsi été établis. L’étude exploratoire sur la complexation du Pu(IV) par le DTPA dans des conditions de pH proches du milieu biologique a nécessité le développement d’un protocole expérimental en trois étapes : protection de Pu(IV) contre l’hydrolyse avec NTA (pH faible), augmentation du pH vers des conditions neutres, compétition entre la complexation de Pu(IV) par le NTA et le DTPA. Les expériences préliminaires réalisées entre pH 1,5 et 3,5 par électrophorèse capillaire (EC-ICP-MS), semblent indiquer l’existence d’effet cinétique ou/et l’existence d’un complexe mixte. Les interprétations faites lors de cette étude exploratoire sont à confirmer. / A thorough knowledge of the chemical properties of actinides is now required in a wide variety of fields: extraction processes involved in spent fuel reprocessing, groundwater in the vicinity of radioactive waste packages, environmental and biological media in the case of accidental release of radionuclides. In this context, the present work has been focused on the complexation of Am(III), Cm(III), Cf(III), Pu(IV) and Pa(V) with organic ligands: DTPA, NTA and citric acid. The complexation of pentavalent protactinium with citric and nitrilotriacetic acids was studied using liquid-liquid extraction with the element at tracer scale (CPa < 10-10M). The order and the mean charge of each complex were determined from the analysis of the systematic variations of the distribution coefficient of Pa(V) as function of ligand and proton concentration. Then, the apparent formation constants related of the so-identified complexes were calculated. The complexation of trivalent actinides with DTPA was studied by fluorescence spectroscopy (TRLFS) and capillary electrophoresis (CE-ICP-MS). The coexistence of the mono-protonated and non-protonated complexes (AnHDTPA– and AnDTPA²–) in acidic media (1.5 ≤ pH ≤ 3.5) was shown unambiguously. Literature data have been reinterpreted by taking into account both complexes and a consistent set of formation constants of An(III)-DTPA has been obtained. The experimental study was completed by theoretical calculations (DFT) on Cm-DTPA system. The coordination geometry of Cm in CmDTPA²- and CmHDTPA- including water molecules in the first coordination sphere has been determined as well as interatomic distances. Finally, a study on the complexation of Pu(IV) with DTPA was initiated in order to more closely mimic physiological conditions. A three-step approach was proposed to avoid plutonium hydrolysis: i/ complexation of Pu(IV) with (NTA) in order to protect Pu(IV) from hydrolysis (at low pH) ii/ increase of pH toward neutral conditions and iii/ competition between the complexation of Pu with NTA and with DTPA. The preliminary experiments performed with CE-ICP-MS in the pH range 1.5 - 3.5 tend to indicate kinetic effect or/and the presence of mixed complex.

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