Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881362 bytes, checksum: 0e498263c87a06e3c091110afa80ddfe (MD5) Previous issue date: 2012-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Tissue culture techniques are often associated with the occurrence of somaclonal variation, characterized by a genetic/epigenetic alteration found in cells, embryos, organs or in vitro grown plants, due to stress conditions imposed by the system. The propagation process involving the calogenesis step has a higher susceptibility to variation, because of many cell divisions. Calli are disorganized cell masses, whose cells divide at different rates depending on where they are located in relation to the culture medium, therefore, they are not considered homogeneous materials. Flow cytometry is a tool that has been used to evaluate the competence of somatic embryogenesis in callus, both to identify the different types as possible and to detect early changes in DNA content of their cells. However, there are no reports in the literature of the flow cytometry use to determine the existence of heterogeneity in relation to the DNA content in callus. In this perspective, the present work adapted this methodology for friable Passiflora cincinnata calli in order to verify the existence of vertically regionalized heterogeneity in relation to DNA ploidy level, and relate it to factors inductors of somaclonal variation, such as cultivation time and subculture numbers. Initially, P. cincinnata cotyledonary leaves were inoculated onto semi-solid medium containing 2, 4-D and BA, for friable embryogenic callus induction. The calli were multiplied and subcultured at different times, thus generating three callus types: new, intermediate and old. Twenty calli of each type were subjected to sagittal cuts resulting two layers (I, II) in new calli, and three layers (I, II and III) in intermediate and old calli, totalizing 160 layers, which were analyzed by flow cytometry. Six different DNA ploidy levels and multiploidies were detected in the layers. In new calli, 25% were heterogeneous, i.e. at least one callus layer showed different DNA ploidy level from the others, differently from intermediate and old calli, which 75% and 63% were heterogeneous, respectively. The homogeneous new calli were predominantly diploid. The highest DNA ploidy levels were observed in the layers in contact with the culture medium on intermediate calli, and 4C and 4C/8C cells were more evident in older calli. These observations suggest that the appearance of new DNA ploidy levels between the layers and between the different callus types is related to the exposure time to the medium containing relatively high concentration of 2,4-D. It was also possible to verify that the layer in contact with the culture medium is more proliferative when compared the percentages of the G2 peaks in homogeneous diploid calli. The heterogeneity in DNA ploidy level between the layers was observed, and it implies that parts of a callus cannot infer about a whole callus. This work suggests that time influences the appearance of different DNA ploidy levels in calli induced in vitro. / Técnicas de cultura de tecidos estão frequentemente associadas com a ocorrência de variação somaclonal, caracterizada pela alteração genética e/ou epigenética encontrada em células, embriões, órgãos ou plantas cultivadas in vitro, em decorrência das condições de estresse impostas pelo sistema. O processo de propagação que envolve a etapa de calogênese apresenta maior susceptibilidade à ocorrência de variação, em função das inúmeras divisões celulares. Calos são massas celulares não organizadas, cujas células se dividem a diferentes velocidades dependendo de onde se localizam em relação ao meio de cultura; portanto, não são considerados materiais homogêneos. A citometria de fluxo é uma ferramenta que tem sido utilizada para avaliar a competência da embriogênese somática em calos, tanto para identificar seus diferentes tipos quanto para detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA de suas células. No entanto, não há relatos na literatura da utilização da citometria de fluxo para verificar a existência da heterogeneidade quanto ao conteúdo de DNA em calos. Nesta perspectiva, o presente trabalho adaptou essa metodologia para calos friáveis de Passiflora cincinnata, a fim de verificar a existência de heterogeneidade verticalmente regionalizada, em relação à ploidia de DNA, e relacioná-la com fatores de indução de variação somaclonal, como tempo de cultivo e número de subcultivos. Inicialmente, folhas cotiledonares de P. cincinnata foram inoculadas em meio semissólido contendo 2,4-D e BA, para indução de calos embriogênicos friáveis. Os calos foram multiplicados e subcultivados em diferentes tempos, gerando, assim, três tipos de calos, denominados como novos, intermediários e velhos. Vinte calos de cada tipo foram submetidos a cortes sagitais que resultaram duas camadas (I e II) em calos novos, e três camadas (I, II e III) em calos intermediários e velhos, totalizando 160 amostras que foram analisadas por citometria de fluxo. Seis diferentes ploidias de DNA e multiploidias foram detectadas nas camadas. Em calos novos, 25% deles foram heterogêneos, ou seja, pelo menos uma camada apresentou nível de ploidia de DNA diferente das demais, diferentemente dos calos intermediários e velhos, os quais 75% e 63% foram heterogêneos, respectivamente. Os calos novos homogêneos foram predominantemente diploides. As ploidias de DNA mais altas foram observadas nas camadas em contato com o meio de cultura em calos intermediários, e células 4C e 4C/8C foram mais evidentes em calos velhos. Essas observações sugerem que o surgimento de novos níveis de ploidia entre as camadas e entre os calos de diferentes tipos está relacionado com o tempo de exposição ao meio contendo concentração relativamente alta de 2,4-D. Foi possível, também, verificar que a camada em contato com o meio é mais proliferativa quando se comparou os percentuais dos picos G2 de calos diploides homogêneos. A heterogeneidade quanto ao nível de ploidia de DNA entre as camadas foi constatada e isto implica que partes de um calo não podem inferir sobre um calo inteiro. Esse trabalho sugere que o tempo influenciou o surgimento de diferentes ploidias de DNA em calos induzidos in vitro.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-06-19T17:53:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1 - Tese Talita Balzon.pdf: 3215171 bytes, checksum: 43e908272811472a37f4b2257cfe3a4a (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-06-19T17:54:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1 - Tese Talita Balzon.pdf: 3215171 bytes, checksum: 43e908272811472a37f4b2257cfe3a4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-19T17:54:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1 - Tese Talita Balzon.pdf: 3215171 bytes, checksum: 43e908272811472a37f4b2257cfe3a4a (MD5) Previous issue date: 2017-10-27 / In this work, three Chapters are proposed: 1) Optimization of somatic embryogenesis in oil palm (Elaeis spp.) from mature zygotic embryos; 2) Influence of initial cutting thickness on somatic embryos differentiation in oil palm (Elaeis spp.) using the thin cell layer technique (TCL), and; 3) Vegetative reproduction and molecular analysis of interspecific backcrosses of oil palm regenerated by somatic embryogenesis. In the first Chapter, we developed an efficient and simple system for inducing somatic embryogenesis and regenerating plantlets from mature zygotic embryos of oil palm. Embryogenic calli were induced from mature zygotic embryos of oil palm on modified Murashige and Skoog medium with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid or picloram, alone or in combination with activated charcoal. The greatest frequency of embryogenic callus induction (97.5%) was obtained by culturing mature zygotic embryos on callus induction medium with 450 μM picloram and 2.5 gL−1 activated charcoal. Embryogenic calli proliferated on a medium with a reduced concentration of picloram. Embryogenic calli were then subcultured on a medium supplemented with 12.3 μM 2-isopentenyladenine and 0.54 μM naphthaleneacetic acid, with subcultures at 4-wk intervals. Somatic embryos were regenerated on a medium with Murashige and Skoog macro- and micronutrients at halfstrength concentrations supplemented with 20 g.L−1 sucrose, 2.5 g.L−1 activated charcoal, and 2.5 g.L−1 Phytagel. Detailed histological analysis revealed that somatic embryogenesis followed an indirect pathway. Primary calli were observed after 4–6 wk of culture and progressed to embryogenic calli at 12 wk. Embryogenic cells exhibited dense protoplasm, a high nucleoplasmic ratio, and small starch grains. Proembryos, which seemed to have a multicellular origin, formed after 16–20 wk of culture and successive cell divisions. Differentiated somatic embryos had a haustorium, a plumule, and the first and second foliar sheaths. In differentiated embryos, the radicular protrusion was not apparent because it generally does not appear until after the first true leaves emerge. In the second Chapter, 1, 2 and 3 mm thick TCL explants obtained from in vitro germinated plants were established on MS culture medium with Picloram (450 μM). It was observed that the TCL technique can efficiently induce somatic embryogenesis in oil palm. Genotypes and thickness of the explants used exert a strong influence on the induction of somatic embryogenesis. Explants with a thickness of up to 2 mm are more responsive. Genotypes also exert a strong influence on the induction of somatic embryogenesis, because shown important differences in the percentage of callus with somatic embryos and number of somatic embryos formed per callus. Finally, the third Chapter proposed a method for the vegetative reproduction of zygotic embryos (ZE) from interspecific backcrosses of palm oil by somatic embryogenesis, as well as to analyze genetically and epigenetically the regenerated plants through ISSR and AFLP markers. To this end, 195, 281 and 198 ZE from the respective interspecific backcrosses SQ150, SR78 and SR84 were cultured in vitro under the experimental conditions developed in Chapter 1, with minor modifications. From the regenerated plants, 36 individuals of three different zygotic embryos (considered as matrices) were randomly evaluated by ISSR and AFLP (MSAP) markers for possible genetic and epigenetic variations. After 36 months of cultivation, plant regeneration rates ranged from 6.2% to 34.2%. When the regenerants were evaluated by ISSR, it was possible to infer that regenerated individuals of ZE can present between 97.5% and 100% of similarity when evaluated within the same matrix that originated them (intrapopulations). However, when individuals are compared with regenerated plants from other ZE used as matrices, they showed genetic variability of more than 20%, that is, genetic similarity of only 80% (interpopulations). In the analysis performed by the AFLP (MSAP), 357 loci were amplified. In these amplifications, it was verified that 69% of these regions were sensitive to methylation and of these, 58% were caused by the gain of fragments, that is, by the hypomethylation of the genomic DNA. / Neste trabalho, três capítulos são propostos: 1) Otimização da embriogênese somática em palma de óleo (Elaeis spp.) a partir de embriões zigóticos maturos; 2) Influência da espessura inicial de corte sobre a diferenciação de embriões somáticos em palma de óleo utilizando a técnica Thin Cell Layer (TCL) e; 3) Reprodução vegetativa de retrocruzamentos interespecíficos de palma de óleo por embriogênese somática. No primeiro capítulo foi desenvolvido um sistema para a indução de embriogênese somática e regeneração de plantas a partir de embriões zigóticos maturos de palma de óleo. Calos embriogênicos (CE) foram induzidos por embriões zigóticos (EZ) maturos em meio de Murashige e Skoog (MS) modificado, com o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ou picloram e em combinação ou não com carvão ativado. A maior percentagem de indução de CE (97,5%) foi obtida através da cultura de embriões zigóticos maturos no meio de MS modificado com 450 μM de picloram e 2,5 g.L-1 de carvão ativado. Os CE proliferaram facilmente em meios com concentrações reduzidas de picloram. Esses CE foram repicados em meio de MS suplementado com 12,3 μM de 2-isopenteniladenina (2iP) e 0,54 μM de ácido naftalenoacético (ANA), com subcultivos em intervalos de 4 semanas. Os embriões somáticos foram convertidos em plantas em meio de MS modificado com macro e micronutrientes, suplementado com 20 g.L-1 de sacarose, 2,5 g.L-1 de carvão ativado e 2,5 g.L-1 de Phytagel®. A análise revelou que morfohistologicamente a embriogênese somática seguiu uma via indireta. Calos primários foram observados após 4-6 semanas de cultura que progrediram para CE em 12 semanas. Células embriogênicas exibiram um protoplasma denso, uma relação nucleoplásmica alta, e pequenos grãos de amido. Proembriões formados após 16-20 semanas de cultura e com sucessivas divisões celulares, têm origem multicelular. Embriões somáticos diferenciados apresentaram haustório, plúmula, e a primeira e segunda bainhas foliares. Nesta fase, a protrusão radicular não foi aparente, pois isso ocorre geralmente após emersão das primeiras folhas verdadeiras. No segundo capítulo, explantes obtidos por cortes de plantas de 1 mm, 2 mm e 3 mm de espessura foram estabelecidos em meio de cultura de MS, com Picloram (450 μM). Utilizando TCL foi possível induzir eficientemente a embriogênese somática em palma de óleo. Os genótipos e a espessura dos explantes exerceram influência na indução da embriogênese somática, mas explantes de menor espessura (até 2 mm de espessura) se mostram os mais responsivos. Os genótipos também exercem uma forte influência na indução da embriogênese somática, pois mostraram importantes diferenças quanto à percentagem de calos embriogênicos e número de embriões somáticos por calo. Por fim, o terceiro capítulo propôs um método para a reprodução vegetativa de EZ de retrocruzamentos interespecíficos de palma de óleo por embriogênese somática, bem como, analisar a fidelidade genética e epigenética por meio da utilização de marcadores ISSR e AFLP das plantas regeneradas. Para tanto, 195, 281 e 198 embriões zigóticos de sementes maduras dos respectivos retrocruzamentos interespecíficos SQ150, SR78 e SR84 foram cultivados sob as condições do experimento desenvolvido no Capítulo 1, com pequenas modificações. Dos regenerantes, 36 plantas de 3 diferentes embriões zigóticos foram aleatoriamente avaliadas por marcadores ISSR e AFLP (MSAP) quanto a possíveis variações genéticas e epigenéticas. Após 36 meses do início do cultivo, as taxas de regeneração de plantas alcançaram entre 6,2% e 34,2% dos EZ inoculados inicialmente. Quando se avaliou os regenerantes por ISSR foi possível inferir que indivíduos regenerados de EZ podem apresentar entre 97,5% e 100% de similaridade quando avaliadas dentro da mesma matriz que lhe deu origem (intrapopulações). No entanto, quando os indivíduos são comparados com plantas regeneradas de outros EZ utilizados como matrizes, eles podem apresentar variabilidade genética superior a 20%, ou seja, similaridade genética de apenas 80% (interpopulações). Na análise por AFLP (MSAP) verificou-se a amplificação de 357 locos nas 36 plantas avaliadas. Nessas amplificações, constatou-se que 69% destas regiões revelaram-se sensíveis à metilação e, destas, 58% foram ocasionadas pelo ganho de fragmentos, ou seja, pela hipometilação do DNA genômico.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-07-04T10:50:02Z No. of bitstreams: 1 eduardosiqueiraferandes.pdf: 2252400 bytes, checksum: 56e960a38ee98a43aa5d60c466f2b6e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-08T14:07:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eduardosiqueiraferandes.pdf: 2252400 bytes, checksum: 56e960a38ee98a43aa5d60c466f2b6e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T14:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eduardosiqueiraferandes.pdf: 2252400 bytes, checksum: 56e960a38ee98a43aa5d60c466f2b6e8 (MD5) Previous issue date: 2009-08-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O extrato de Ginkgo biloba (EGb) é usado no tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas, como antiinflamatório, no tratamento da vertigem, na perda de memória relacionada a idade. Efeitos do extrato de ginkgo na reprodução demonstraram que ele inibia a fertilização por reduzir a viabilidade de espermatozóides e degenerar o oócito. Administrado a camundongos alterou o peso de órgãos como a próstata e alterou o perfil reprodutivo desses animais – levando a uma menor taxa de prenhez e aumento das mortes embrionárias. Em ratas, o EGb demonstrou causar crescimento intra-uterino restrito, aventando-se a possibilidade do efeito ter sido causado por sua atividade estrogênica. Outros trabalhos também demonstraram efeito estrogênico do Ginkgo biloba. Sabe-se que os níveis adequados de estrogênio, progesterona e de prostaglandinas são cruciais para o transporte do concepto pela tuba uterina e sua implantação uterina, portanto existe a possibilidade da administração do EGb no início da prenhez causar alterações no desenvolvimento embrionário, sendo esse o propósito do presente trabalho. Para o estudo foram usadas 68 ratas Wistar, adultas, nulíparas, prenhes, provenientes do Biotério do Centro de Biologia da Reprodução, Universidade Federal de Juiz de Fora. As ratas foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n=17): Controle e tratados Gb 3.5, Gb 7 e Gb 14, que receberam, respectivamente, 3,5, 7 e 14mg/Kg/dia do extrato de Ginkgo biloba em 1mL de suspensão aquosa, via intragástrica, uma vez ao dia, durante os oito primeiros dias de prenhez. As ratas do grupo controle receberam pelo mesmo esquema 1mL de água destilada. As ratas foram eutanasiadas, no 15o dia de prenhez, por exsanguinação total sob anestesia. Foram avaliados: sinais clínicos indicativos de toxicidade materna – entre outros, alteração do consumo de ração e de água, alteração do peso corporal, hiper ou hipoatividade, piloereção, estereotipia, perfil bioquímico e hematológico e morte –; número de corpos lúteos; peso de órgãos maternos (ovários, fígado e rins); perfil hematológico e bioquímico maternos; peso de fetos e de placentas; número de fetos viáveis, reabsorvidos e mortos; malformações fetais em membros superiores e inferiores, fechamento de tubo neural e morfologia de face. Com exceção do perfil bioquímico materno em que houve aumento do nível de colesterol e decréscimo dos níveis de ALT, uréia e creatinina, significativamente relevantes, nos animais tratados com 7 e 14mg/Kg/dia de EGb, nenhuma outra alteração significativa foi encontrada nos parâmetros maternos ou fetais avaliados. De forma geral, o tratamento com EGb em ratas Wistar, durante o período de trânsito tubário e implantação, não causou efeito tóxico no organismo materno, tampouco induziu mortes, crescimento intrauterino retardado ou malfomações fetais. Há ainda indícios de que o EGb poderia agir de forma hepatoprotetora e nefroprotetora quando administrado a ratas Wistar durante o período de prenhez quando usado nas doses 7 e 14 mg/Kg/dia. / The Ginkgo biloba extract (EGb) is mainly used in the treatment for and in the prevention of neurodegenerative diseases. It is also used in the treatment for dizziness, age-related memory loss and as an anti-inflammatory. Effects of EGb on reproduction include fertilization inhibition through the reduction of spermatozoa viability and oocyte degeneration. When administered to male mice, EGb led to alterations in the weight of organs such as the prostate, and in the reproductive behavior of these animals (leading to lower pregnancy rates and embryo death increase). In female rats, EGb was proved to cause intra-uterine growth retardation, this effect being thought to be related to its estrogenic activity. Other studies have also shown EGb estrogenic effects. Adequate levels of estrogen, progesterone and prostaglandins are known to be very important to tubal transit and uterine implantation. Hence, there is the possibility of EGb causing embryonic development alterations when administered in the beginning of pregnancy. Investigating this possibility is the aim of this thesis. In order to achieve that, the following experimental protocol was carried out with 68 nulliparous pregnant Wistar rats. The rats were randomly distributed into four experimental groups (n=17): Control, Gb 3.5, Gb 7 and Gb 14, which were treated, respectively, with zero, 3.5, 7.0 and 14.0mg/Kg/Day of EGb diluted in 1mL of distilled water through gavage, once a day, during the first eight days of pregnancy. Rats were euthanized in the 15th day of pregnancy, through total exsanguination under anesthesia. The following parameters were assessed: clinical signs of maternal toxicity – such as feed and water intake alterations, body weight alterations, hyper or hypoactivity, piloerection, stereotypy, biochemical and hematological profile and death –; number of corpora lutea; maternal organs (ovaries, liver and kidneys) weight; maternal hematological and biochemical profiles; fetuses and placentas weight; number of viable, resorpted and dead fetuses; fetal malformations in both superior and inferior members, neural tube closure and facial morphology. Amongst the parameters evaluated, alterations were found only in the maternal hematological profile. There was significant raise in the cholesterol level and reduction in the levels of ALT, urea and creatinine for the animals treated with 7 and 14mg/Kg/day of EGb. No significant alteration was found for other maternal and fetal parameters evaluated. Hence, it seems that treatment with EGb during both tubal transit and implantation periods did not cause toxic effects to the maternal organism of Wistar rats. Neither did it induce deaths, intra-uterine growth retardation or fetal malformation. There is also evidence that EGb could present hepatoprotective and nephroprotective effects when administered to Wistar rats during pregnancy in the dosages of 7 and 14 mg/Kg/day.

A semelhança entre os eventos da embriogênese zigótica e somática permite que sejam estabelecidos parâmetros para o acompanhamento destes dois processos. Neste trabalho foi estudada a embriogênese somática em Ocotea catharinensis, nas fases de maturação e germinação, além do processo germinativo da semente zigótica, avaliando-se parâmetros bioquímicos, e a expressão diferencial de proteínas. O tratamento com ABA + PEG em culturas de embriões somáticos apresentou variações semelhantes a apresentadas por embriões zigóticos no estádio de maturação. Não se observou a germinação de embriões somáticos, contudo verificou-se que a desidratação prévia promoveu importantes alterações bioquímicas. Durante a germinação, não se observou à síntese de novas proteínas no embrião zigótico. Os estudos proteômicos no desenvolvimento da semente permitiram a seleção de polipeptídios, marcadores estádio-específicos. Os resultados obtidos possibilitam a otimização e melhor entendimento das etapas da embriogênese somática, em espécies com sementes recalcitrantes, como O. catharinensis. / The great similarity among the events of zygotic and somatic embryogenesis allows the establishment of parameters for accompaniment of these processes. In the present work it was studied the somatic embryogenesis in Ocotea catharinensis, in the maturation and germination phases, and the zygotic embryogenesis. The biochemical parameters and differential expression of proteins were evaluated: The treatment with ABA + PEG presented similar variations for zygotic embryos in the maturation stage. The germination was not observed for somatic embryos; however, it was verified that the previous dehydration promoted important biochemical alterations. With relation to the zygotic embryo, throughout the germination process, the synthesis of new proteins was not observed. The proteomic studies carried out throughout seed development, allowed the selection of polypeptides with differential expression. The results obtained open perspectives for the methodology optimization of the somatic embryogenesis, for species with recalcitrant seeds, like O. catharinensis.

O. catharinensis e O. odorifera são árvores originárias da Mata Atlântica. Historicamente estas espécies foram intensamente exploradas e atualmente encontram-se vulneráveis de extinção. A embriogênese somática é uma ferramenta de grande potencial na reprodução de espécies de difícil propagação. No presente trabalho analisou-se o efeito dos meios de cultura MS e WPM e de diferentes de ANA e 2,4-D na indução da embriogênese somática nessas espécies. Em O. catharinensis a combinação WPM + 2,4-D mostrou-se mais efetiva na indução de calos. Resultados mais expressivos foram observados no tratamento WPM + 144µM 2,4-D. Os piores índices de indução foram obtidos no meio MS + 2,4-D. Em O. odorifera não foi utilizado o meio MS. Nesta espécie, mais importante do que o tipo do regulador de crescimento foi sua concentração. Maiores percentuais de calos foram observados em concentrações mais elevadas desses reguladores. WPM + ANA mostrou-se bastante efetivo em O. odorifera, ao contrário do que foi observado em O. catharinensis, onde os resultados foram pouco expressivos. / O. catharinensis and. O. odorifera are originary trees of the brazilian Rain Forest. Historically these species had been intensely explored and are currently considered vulnerable of extintion. Somatic embryogenesis is a tool of great potential in the reproduction of species of difficult propagation. In the present work was analyzed the effect of MS and WPM and different concentrations of ANA and 2,4-D in the iniciation of somatic embryogenesis in this species. In O. catharinensis WPM + 2,4-D revealed more effective in the induction of callus. More expressive results had been observed in the treatment WPM + 144µM 2,4-D. The worse rates of induction had been observed at the combination MS + 2,4-D. In O. odorifera the MS medium was not used. In this specie more important of what the type of the growth regulator was its concentration. Higher rates of callus had been observed at higher concentrations of these regulators. WPM + ANA revealed effective in O. odorifera, in contrast of what was observed in O. catharinensis, where the results had been little expressive.

Brachiaria é um gênero de forrageiras da família Poaceae que apresenta plantas que se reproduzem por via sexual e assexualmente por apomixia,reprodução por sementes. A apomixia desperta interesse biológico e biotecnológico, pela perspectiva de levar esta característica de clonagem de plantas via sementes, a outras espécies. As cultivares plantadas de B. brizantha cv. Marandu e B. decumbens cv. Basilisk são poliplóides e reproduzem-se por apomixia, enquanto as plantas sexuais são diplóides,o que inviabiliza os cruzamentos, dificultando sobremaneira o melhoramento. A transformação genética é uma estratégia que vem sendo incorporada ao melhoramento genético. A natureza apomítica destasplantas pode permitir a clonagem e estabilidade das plantas transgênicas. Para transformação genética é necessário o desenvolvimento de um método eficiente de regeneraçãoin vitro. B. brizantha é considerada recalcitrante a cultura de tecidos, e métodos eficientes associados com os sistemas de transformação genética ainda não foram descritos na literatura. O arroz (Oryza sativa) é uma Poaceae modelo para estudos de genética inversa, no entanto, cultivares tropicais do grupo japônica são recalcitrantes a transformação genética, como é o caso da cultivar Primavera. O método direto de transformação genética mais amplamente utilizado é a biobalística, e vem sendo aplicado em espécies de monocotiledôneas, uma vez que essas não são hospedeiros naturais de Agrobacterium tumefaciens. No entanto, vários fatores tem sido testados no sentido de favorecer a interação e transferência de genes durante a cocultura para obtenção de transgênicos em diversas espécies de monocotiledôneas. Os objetivos deste estudo foram obter sistemas de regeneração in vitro deB. Brizanthae de arroz cultivar Primavera para transformação genética destas espécies. Em B. brachiaria foram obtidos sistema de micropropagação, organogênese, calos embriogênicos, unidades embriogênicas e suspensões celulares, e para a cultivar Primavera de arroz foram obtidas unidades embriogênicas, que foram caracterizadas morfo-anatomicamente e quanto as condições de indução, multiplicação e regeneração in vitro. Métodos de expressão transiente e estável de genes marcadores foram estabelecidos para B brizantha via biobalística e Agrobacterium tumefaciens. A natureza da transgenia foi confirmada por métodos histoquímico e molecular como PCR e Southern blot. Os sistemas de regeneração e transformação obtidos mostraram-se eficientes e irão contribuir para os estudos da apomixia e introdução de genes de interesse em braquiária / Brachiaria is a genus of Poaceae family forage grass that reproduces by sexual and asexually by apomixis. Apomixis is of biological and biotechnological interest awakened by the prospect of bringing this feature of cloning plants through seed to other species. B. brizantha cv. Marandu and B. decumbens cv. Basilisk are polyploid and reproduce by apomixis, while the sexual plants are diploid, which makes the crosses, greatly hindering the improvement. Genetic transformation is a strategy that is being incorporated into breeding programs. The nature of these apomictic plants may allow the cloning and the stability of transgenic plants. For genetic transformation is necessary to develop an efficient method of in vitro regeneration. B. brizantha is considered recalcitrant to tissue culture, and efficient methods associated with the genetic transformation systems have not been described in the literature. Rice (Oryza sativa) is a Poaceae model for studies of reverse genetics; however, tropical cultivars from japonica group are recalcitrant to genetic transformation, such as Primavera cultivar. Biolistic is the genetic transformation direct method most widely used, and has been applied to species of monocots, since these are not natural hosts of Agrobacterium tumefaciens. However, several factors have been tested in order to promote interaction and gene transfer during coculture for obtaining transgenics in several monocots species. The objectives of this study were to obtain in vitro regeneration and genetic transformation systems for these species. In B. Brachiaria systemsfor micropropagation, organogenesis, embryogenic units and embryogenic cell suspensions were obtained, and forrice Primavera cultivar embryogenic units were obtained, which was morpho-anatomical characterized and in vitro induction, proliferation and regeneration conditions established. Methods for transient and stable gene expression have been acquired for B. brizanthavia biolistic and Agrobacterium tumefaciens. The nature of the embryogenic callus and transgenic plants was confirmed by histochemical and molecular methods such as PCR and Southern blot. The regeneration and transformation systems showed to be effective and will contribute to apomixis studies and introduction of genes of interest in B. brizantha

Atualmente, o Huanglongbing (HLB), doença associada à bactéria Candidatus Liberibacter spp., é a principal ameaça dos Citrus, não tendo sido encontrado ainda espécies resistentes e tolerantes. O melhoramento genético tradicional apresenta limitações para a obtenção de novas variedades porta-enxerto e copa de citros em decorrência a fatores ligados à biologia do gênero. Na tentativa de sobrepor essas dificuldades, a transformação genética destaca-se por permitir a introdução de genes exógenos, os quais, além de reduzir o período de obtenção de material melhorado geneticamente, poderão conferir resistência a doenças em variedades de interesse agronômico. Desse modo, o objetivo desta pesquisa consistiu no estudo da organogênese in vitro, e na obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', com o gene que codifica o peptídeo antibacteriano atacina A (attA), controlado pelos promotores AtSUC2 e AtPP2, visando a expressão gênica preferencial nos vasos do floema. Adicionalmente, foi avaliada a transformação genética via A. tumefaciens de suspensões celulares de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\', e a transformação genética direta via PEG de protoplastos da tangerina \'W-Murcott\', com os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby, dirigidos pelos promotores com expressão preferencial nos tecidos embrionários 6105 e DC3. A eficiência da organogênese in vitro foi influenciada pelo tipo de explante e concentração de BAP. Após os experimentos de transformação genética de segmentos de epicótilo e internodal das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', as plantas regeneradas foram analisadas por PCR, Southern blot e RT-qPCR e confirmadas como transgênicas pela presença e transcrição do gene attA no tecido vascular. A transformação genética de suspensões celulares mostrou-se eficiente com alta produção de antocianina nos embriões somáticos regenerados de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\'. A transformação genética direta de protoplastos de tangerina \'W-Murcott\' mostrou-se viável e também foi possível a obtenção de embriões somáticos transgênicos. Os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby se mostraram úteis para detecção visual do material transgênico / Currently, Huanglongbing (HLB), associated to Candidatus Liberibacter spp., is the main threat to the citrus culture. The conventional plant breeding shows limitations to the obtain new varieties of rootstock and scion, due to factors related to the biology of the genus. In attempt to overcome these barriers, genetic engineering is notable for allowing the introduction of foreign genes, which, besides reducing the time to obtain genetically improved material may confer disease resistance in varieties of agronomic interest. Thus, the objective of the research was the study of in vitro organogenesis, and obtain transgenic plants of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules\' mandarins via Agrobacterium tumefaciens with the gene encoding the antibacterial peptide attacin A (attA), controlled by the promoters AtSUC2 and AtPP2, aiming to preferential gene expression in phloem. In addition, the genetic transformation of cell suspensions, via A. tumefaciens, of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo and the direct genetic transformation, via PEG, of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts were evaluated with VvmybA1 and Ruby transcription factors driven by 6105 and DC3 promoters, with preferential expression in embryonic tissues. The in vitro organogenesis of the varieties studied was influenced by the type of explant and BAP concentration. After genetic transformation experiments of epicotyl and internodal segments of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules mandarins, regenerated plants were analyzed by PCR, Southern blot and RT-qPCR and confirmed as transgenic by presence and transcription of attA gene. The genetic transformation of cell suspensions was efficient with high anthocyanin production in the somatic embryos regenerated of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo. The direct genetic transformation of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts revealed to be viable and it was also possible to obtain transgenic somatic embryos. The VvmybA1 and Ruby transcription factors were useful tools for visual detection of transgenic material

O estudo do metabolismo de poliaminas (PAS), envolvendo parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares, pode gerar uma melhor compreensão do processo de maturação, e criar estratégias importantes para a otimização da embriogênese somática (ES) em cana-de-açúcar. O objetivo deste trabalho foi estudar a relação entre os conteúdos endógenos de PAs, associados à determinação da competência embriogenética e a maturação progressiva de embriões somáticos em cana-de-açúcar. Calos embriogênicos (E) e não-embriogênicos (NE) da variedade SP-803280, foram submetidos a diferentes tratamentos, utilizando agentes de maturação adicionados ao meio MS. Observou-se que as culturas NE não foram capazes de promover a diferenciação de embriões somáticos, devido principalmente, ao alto grau de oxidação das culturas. Os tratamentos suplementados com 0,75 e 1,5 g.L-1 de carvão ativado (CA), foram os que apresentaram as maiores freqüências de formação de embriões somáticos. A partir dos resultados obtidos, foi possível associar a ES em calos de cana-de-açúcar ao aumento do conteúdo endógeno de Spd (Espermidina) e Spm (Espermina), principalmente Spd, acompanhado por uma redução nos níveis de Put (Putrescina). / Somatic embryogenesis (SE) is a highly potential supplier of the material involved in the regeneration and genetic transformation of transgenic plants. The aim was to study correlations between endogenous PA contents, associated to defining embryogenetic competence and the progressive maturation of somatic embryos. Embryogenic (E) and non-embryogenic (NE) calli from the SP-803280 variety, were submitted to different maturation treatments. It was found that the NE cultures submitted to the two maturation experiments, were incapable of promoting somatic embryo differentiation, mainly due to browning. It was noted that in the first experiment, total PA endogenous content of the E callus was higher than in the NE, although, in the control, no significant differences between both callus types were encountered. We can associate the progression of sugarcane somatic embryogenesis to an increase in endogenous content of Spd e Spm, mainly Spd, accompanied for a reduction in Put levels. Thus, it was shown that somatic embryo maturation in sugarcane can be related with PA biosynthesis, thereby indicating the importance of their metabolism in the competence of sugarcane embryogenic cultures.

Atualmente, o Huanglongbing (HLB), doença associada à bactéria Candidatus Liberibacter spp., é a principal ameaça dos Citrus, não tendo sido encontrado ainda espécies resistentes e tolerantes. O melhoramento genético tradicional apresenta limitações para a obtenção de novas variedades porta-enxerto e copa de citros em decorrência a fatores ligados à biologia do gênero. Na tentativa de sobrepor essas dificuldades, a transformação genética destaca-se por permitir a introdução de genes exógenos, os quais, além de reduzir o período de obtenção de material melhorado geneticamente, poderão conferir resistência a doenças em variedades de interesse agronômico. Desse modo, o objetivo desta pesquisa consistiu no estudo da organogênese in vitro, e na obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', com o gene que codifica o peptídeo antibacteriano atacina A (attA), controlado pelos promotores AtSUC2 e AtPP2, visando a expressão gênica preferencial nos vasos do floema. Adicionalmente, foi avaliada a transformação genética via A. tumefaciens de suspensões celulares de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\', e a transformação genética direta via PEG de protoplastos da tangerina \'W-Murcott\', com os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby, dirigidos pelos promotores com expressão preferencial nos tecidos embrionários 6105 e DC3. A eficiência da organogênese in vitro foi influenciada pelo tipo de explante e concentração de BAP. Após os experimentos de transformação genética de segmentos de epicótilo e internodal das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', as plantas regeneradas foram analisadas por PCR, Southern blot e RT-qPCR e confirmadas como transgênicas pela presença e transcrição do gene attA no tecido vascular. A transformação genética de suspensões celulares mostrou-se eficiente com alta produção de antocianina nos embriões somáticos regenerados de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\'. A transformação genética direta de protoplastos de tangerina \'W-Murcott\' mostrou-se viável e também foi possível a obtenção de embriões somáticos transgênicos. Os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby se mostraram úteis para detecção visual do material transgênico / Currently, Huanglongbing (HLB), associated to Candidatus Liberibacter spp., is the main threat to the citrus culture. The conventional plant breeding shows limitations to the obtain new varieties of rootstock and scion, due to factors related to the biology of the genus. In attempt to overcome these barriers, genetic engineering is notable for allowing the introduction of foreign genes, which, besides reducing the time to obtain genetically improved material may confer disease resistance in varieties of agronomic interest. Thus, the objective of the research was the study of in vitro organogenesis, and obtain transgenic plants of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules\' mandarins via Agrobacterium tumefaciens with the gene encoding the antibacterial peptide attacin A (attA), controlled by the promoters AtSUC2 and AtPP2, aiming to preferential gene expression in phloem. In addition, the genetic transformation of cell suspensions, via A. tumefaciens, of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo and the direct genetic transformation, via PEG, of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts were evaluated with VvmybA1 and Ruby transcription factors driven by 6105 and DC3 promoters, with preferential expression in embryonic tissues. The in vitro organogenesis of the varieties studied was influenced by the type of explant and BAP concentration. After genetic transformation experiments of epicotyl and internodal segments of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules mandarins, regenerated plants were analyzed by PCR, Southern blot and RT-qPCR and confirmed as transgenic by presence and transcription of attA gene. The genetic transformation of cell suspensions was efficient with high anthocyanin production in the somatic embryos regenerated of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo. The direct genetic transformation of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts revealed to be viable and it was also possible to obtain transgenic somatic embryos. The VvmybA1 and Ruby transcription factors were useful tools for visual detection of transgenic material

Brachiaria é um gênero de forrageiras da família Poaceae que apresenta plantas que se reproduzem por via sexual e assexualmente por apomixia,reprodução por sementes. A apomixia desperta interesse biológico e biotecnológico, pela perspectiva de levar esta característica de clonagem de plantas via sementes, a outras espécies. As cultivares plantadas de B. brizantha cv. Marandu e B. decumbens cv. Basilisk são poliplóides e reproduzem-se por apomixia, enquanto as plantas sexuais são diplóides,o que inviabiliza os cruzamentos, dificultando sobremaneira o melhoramento. A transformação genética é uma estratégia que vem sendo incorporada ao melhoramento genético. A natureza apomítica destasplantas pode permitir a clonagem e estabilidade das plantas transgênicas. Para transformação genética é necessário o desenvolvimento de um método eficiente de regeneraçãoin vitro. B. brizantha é considerada recalcitrante a cultura de tecidos, e métodos eficientes associados com os sistemas de transformação genética ainda não foram descritos na literatura. O arroz (Oryza sativa) é uma Poaceae modelo para estudos de genética inversa, no entanto, cultivares tropicais do grupo japônica são recalcitrantes a transformação genética, como é o caso da cultivar Primavera. O método direto de transformação genética mais amplamente utilizado é a biobalística, e vem sendo aplicado em espécies de monocotiledôneas, uma vez que essas não são hospedeiros naturais de Agrobacterium tumefaciens. No entanto, vários fatores tem sido testados no sentido de favorecer a interação e transferência de genes durante a cocultura para obtenção de transgênicos em diversas espécies de monocotiledôneas. Os objetivos deste estudo foram obter sistemas de regeneração in vitro deB. Brizanthae de arroz cultivar Primavera para transformação genética destas espécies. Em B. brachiaria foram obtidos sistema de micropropagação, organogênese, calos embriogênicos, unidades embriogênicas e suspensões celulares, e para a cultivar Primavera de arroz foram obtidas unidades embriogênicas, que foram caracterizadas morfo-anatomicamente e quanto as condições de indução, multiplicação e regeneração in vitro. Métodos de expressão transiente e estável de genes marcadores foram estabelecidos para B brizantha via biobalística e Agrobacterium tumefaciens. A natureza da transgenia foi confirmada por métodos histoquímico e molecular como PCR e Southern blot. Os sistemas de regeneração e transformação obtidos mostraram-se eficientes e irão contribuir para os estudos da apomixia e introdução de genes de interesse em braquiária / Brachiaria is a genus of Poaceae family forage grass that reproduces by sexual and asexually by apomixis. Apomixis is of biological and biotechnological interest awakened by the prospect of bringing this feature of cloning plants through seed to other species. B. brizantha cv. Marandu and B. decumbens cv. Basilisk are polyploid and reproduce by apomixis, while the sexual plants are diploid, which makes the crosses, greatly hindering the improvement. Genetic transformation is a strategy that is being incorporated into breeding programs. The nature of these apomictic plants may allow the cloning and the stability of transgenic plants. For genetic transformation is necessary to develop an efficient method of in vitro regeneration. B. brizantha is considered recalcitrant to tissue culture, and efficient methods associated with the genetic transformation systems have not been described in the literature. Rice (Oryza sativa) is a Poaceae model for studies of reverse genetics; however, tropical cultivars from japonica group are recalcitrant to genetic transformation, such as Primavera cultivar. Biolistic is the genetic transformation direct method most widely used, and has been applied to species of monocots, since these are not natural hosts of Agrobacterium tumefaciens. However, several factors have been tested in order to promote interaction and gene transfer during coculture for obtaining transgenics in several monocots species. The objectives of this study were to obtain in vitro regeneration and genetic transformation systems for these species. In B. Brachiaria systemsfor micropropagation, organogenesis, embryogenic units and embryogenic cell suspensions were obtained, and forrice Primavera cultivar embryogenic units were obtained, which was morpho-anatomical characterized and in vitro induction, proliferation and regeneration conditions established. Methods for transient and stable gene expression have been acquired for B. brizanthavia biolistic and Agrobacterium tumefaciens. The nature of the embryogenic callus and transgenic plants was confirmed by histochemical and molecular methods such as PCR and Southern blot. The regeneration and transformation systems showed to be effective and will contribute to apomixis studies and introduction of genes of interest in B. brizantha