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A sinalização pelo ácido retinóico e a origem evolutiva das câmaras cardíacas. / Retinoic acid signaling and the evolutionary origins of cardiac chambers.Marcos Sawada Simões Costa 17 April 2009 (has links)
Nos últimos anos, nós propusemos um modelo de duas etapas para a padronização antero-posterior do coração. Ácido retinóico (AR) produzido pela enzima RALDH2 induz o destino sino atrial nos precursores cardíacos posteriores. Subsequentemente, estes precursores adquirem a capacidade de expressar RALDH2, formando uma onda caudo-rostral desta enzima. A nossa hipótese é que esta onda surgiu nos para padronizar as células precursoras da bomba circulatória ancestral em regiões de influxo e efluxo, resultando na origem das câmaras cardíacas. Para testar se a onda cauro-rostral é ancestral nos vertebrados, nós mapeamos a expressão de RALDH2 em relação ao campo cardíaco em anfíbios, vertebrados basais e no cordado invertebrado anfioxo. Nossos dados sugerem que o modelo de duas etapas está presente em anfíbios e peixes. Clonagem do gene RALDH em lampréias indica presença de AR no campo cardíaco. Em anfioxo, a caracterização do padrão de expressão do ortólogo da RALDH2 revela ausência da onda caudo-rostral. Nossos resultados sugerem que a onda caudo-rostral de RALDH2 foi cooptada nos vertebrados para padronizar o campo cardíaco no eixo AP, o que corrobora a hipotése de que este mecanismo foi importante na origem evolutiva das câmaras cardíacas. / In the last years, we have proposed a 2-step model for the establishment of cardiac chamber identities. Retinoic acid (RA) produced by its synthetic enzyme RALDH2, induces an atrial fate in posterior cardiac precursors of amniote embryos. Subsequently, a RALDH2 caudorostral wave engulfs posterior precursors. Our hypothesis is that this wave evolved in vertebrates to pattern an ancestral circulatory pump into AP fields, which were later fashioned into cardiac chambers. To test whether the wave is an ancestral or derived feature of amniotes, we mapped expression of RALDH2 in relation to the cardiac field in amphibians, basal vertebrates and the amphioxus. Our data suggests RA signaling patterns amphibian and piscine hearts. Cloning of RALDH in lampreys shows that RA synthesis takes place in the heart field. In the amphioxus, cloning of RALDH reveals a vertebrate-like expression pattern, although the RALDH2 wave is absent. Our results support the hypothesis that the caudorostral wave of RALDH2 was coopted to pattern the vertebrate cardiac field. This supports the hypothesis that the caudorostral wave of RALDH2 was an important player in the evolutionary origin of the cardiac chambers.
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Mecanismos embrionários de diferenciação de precursores coronários: princípios para aplicação em terapia celular. / Embryonic mechanisms of coronary precursor differentiation: principles for cell therapy.Azambujá, Ana Paula 17 August 2009 (has links)
As coronárias derivam do proepicárdio, uma estrutura formada por precursores dos constituintes de vasos coronários, células endoteliais e musculares lisas (CoSMC). In vivo observa-se um marcante atraso entre a diferenciação endotelial e a integração de CoSMC à parede do vaso. O objetivo deste trabalho foi identificar os mecanismos que inibem a diferenciação a CoSMC in vivo. Baseados na perda progressiva da expressão de raldh2, a principal enzima de síntese de ácido retinóico (AR), nós exploramos a sinalização por AR como um possível inibidor da diferenciação a CoSMC. Através de um vetor adenoviral de expressão de raldh2 e da inibição in vivo da síntese de AR nós demonstramos que a sinalização por AR bloqueia a diferenciação a CoSMC dos precursores coronários. Nós também identificamos o VEGF como um fator chave no controle da diferenciação a CoSMC. Em conjunto, nossos dados suportam o modelo que a síntese de AR e VEGF durante o desenvolvimento cardíaco foi co-optada para o bloqueio da diferenciação a CoSMC até o estabelecimento de uma vasta malha vascular. / Coronary vessels derive from the proepicardium (PE), a structure formed by precursor of coronary vessels cells, endothelial and smooth muscle cells (CoSMC). In vivo there is a clear gap between the endothelial differentiation and the integration of CoSMC into the vascular tubes. The aim of this work was to understand the mechanisms controlling the delayed in vivo CoSMC differentiation. Based on the progressive loss of expression of raldh2, the main retinoic acid (RA) synthesizing enzyme, we explored the RA signaling as a possible candidate inhibitor of CoSMC differentiation. Using a adenoviral raldh2 expression system and in vivo inhibition of RA synthesis we showed that RA signaling act as a brake to slow CoSMC differentiation in PE-derived cells. We also identified VEGF as key factor acting on the control of CoSMC differentiation. Together our results support a model that AR and VEGF synthesis during cardiac development was co-opted to block the CoSMC differentiation of coronary precursors before an extensive endothelial network of tubes is established.
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Regulação molecular da expressão atrial - específica do gene SMyHC3. / Molecular regulation of atrial-specific expression of the SMyHC3 gene.Sampaio, Allysson Coelho 02 June 2010 (has links)
Para elucidar as vias genéticas controlando a formação das câmaras cardíacas, foi analisada a regulação do promotor atrial-específico do gene de codorna que codifica a isoforma lenta da cadeia pesada de miosina (slow myosin heavy chain 3 -SMyHC3). Em camundongos transgênicos, a expressão atrial-específica dos 840 pb do promotor SMyHC3 fundido ao gene repórter da fosfatase alcalina (HAP), SMyHC3-HAP, é controlada pelos 72 pb mais distais deste promotor. Este fragmento contém sítios putativos para ligação a receptores nucleares os quais foram denominados ECRRN (elemento complexo de resposta a receptores nucleares), definidos por modelagem molecular. Tratamento de embriões SMyHC3-HAP com ácido retinoico (AR) expande o domínio atrial de expressão do transgene, enquanto que a inibição da via de sinalização por AR reduz o domínio de expressão do transgene. Ensaios de gel shift revelam que os receptores de AR, RAR/RXR se ligam fracamente a esse promotor. Também, esses receptores não ativam o promotor SMyHC3 em experimentos de transfecção transiente, mesmo na presença de coativadores, tais como p300, CBP e GRIP1. Isso sugere a participação indireta de AR na regulação deste marcador atrial. Ensaios de transfecção celular demonstram que COUPTF2 é capaz de ativar o promotor SMyHC3 e, siRNA contra COUPTF2 inibe esta transativação. Embriões tratados com AR apresentam um aumento geral da expressão de COUPTF2, reforçando a idéia de que AR age indiretamente ativando este gene. Estudos de bioinformática revelam que o ECRRN está presente na região 3 do gene AMHC1 de galinha e alinhamentos indicam que pode se tratar de um elemento móvel que pode ter sido adquirido por um evento de exaptação. Em resumo, COUPTF2 e AR controlam a expressão do promotor SMyHC3, porém a natureza da relação entre os 2 elementos necessita ser elucidada. / To elucidate the genetic pathways controlling cardiac chamber formation, the atrial specific gene promoter SMyHC3 was analyzed. In transgenic mice, the atrial specific expression an 840 bp of the SMyHC3 promoter was linked to reporter gene human alkaline phosphatase (HAP), SMyHC3-HAP. By directed mutagenesis and deletion analysis we identified the more distal 72 bp of the promoter as responsible of the atrial expression. This fragment contains putative binding sites to nuclear receptors, the CNRRE (complex nuclear receptor response element), defined by molecular modeling. RA (retinoic acid) treatment in SMyHC3-HAP embryos expands the atrial domain. However, the RA effectors, RXR/RAR bind with low affinity to the SMyHC3 promoter. These receptors are not able to activate the promoter even in the presence of coactivators such as p300, CBP and GRIP1. These results suggest that RA acts indirectly to regulate this atrial marker. Cell transient transfection shows that COUPTF2 activate the SMyHC3 promoter, and COUPTF2 siRNA inhibits the transactivation of the SMyHC3 promoter. Treatment of embryos with RA increases the COUPTF2 expression reinforcing the idea that this receptor could be regulatedindirectly by RA. Bioinformatic studies revealed that CNRRE is present in the 3 region of the ortholog chicken AMHC1 gene. Alignments indicate that this CNRRE could have been acquired by an exaptation event. In conclusion, the SMyHC3 promoter seems to be controlled by RA and COUPTF2 governing atrial expression. However the nature of relationships between RA and COUPTF2 need to be elucidated.
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Clonagem e análise da expressão do fator de transcrição Scratch2 durante a embriogênese inicial de galinha. / Cloning and expression analysis of the transcription factor Scratch2 during the chicken early embryogenesis.Vieceli, Felipe Monteleone 23 November 2009 (has links)
Em invertebrados, os genes Scratch (Scrt) codificam fatores de transcrição que promovem a neurogênese durante o desenvolvimento. A função de Scrt em vertebrados é desconhecida, mas em camundongos Scrt1 e Scrt2 são especificamente expressos em neurônios pós-mitóticos no embrião e no sistema nervoso central adulto. Neste trabalho, nós clonamos a sequência codificante de Scrt2 de galinha (cScrt2) e caracterizamos seu padrão de expressão no embrião por PCR quantitativo e hibridação in situ. A sequência codificante completa foi clonada no vetor de expressão pMES-GFP e o produto previsto da tradução é uma proteína com 276 aminoácidos. A sequência de aminoácidos compartilha identidades de 70% com Scrt2 de rato e 58% com Scrt de zebrafish. Transcritos cScrt2 são detectados primeiramente na periferia do tubo neural do rombencéfalo em HH 15 e da medula espinhal em HH 17, coincidindo com os locais onde alguns dos primeiros neurônios se diferenciam durante a embriogênese. Entre HH 19-23, a expressão no domínio motor da medula espinhal se concentra progressivamente na interface entre as zonas ventricular e do manto. Além disso, a expressão de cScrt2 também é observada nos gânglios da raíz dorsal a partir de HH 22-23, principalmente no domínio dorsomedial. O campo de expressão de cScrt2 no tubo neural é complementar aos de Notch1, que é expresso em células-tronco neurais, e SCG10, marcador de neurônios diferenciados. Nossos resultados sugerem que durante a embriogênese da medula espinhal cScrt2 é especificamente expresso em neurônios pós-mitóticos indiferenciados. A construção pMES-GFP(cScrt2) possibilita futuras análises funcionais diretas por interferência gênica no embrião de galinha, que serão de grande valor para um melhor entendimento da função dos genes Scrt em vertebrados. / In invertebrates, the Scratch (Scrt) genes encode transcription factors that promote neurogenesis during development. The Scrt function in vertebrates is unknown, but in mice Scrt1 and Scrt2 are specifically expressed in post-mitotic neurons in the embryo and in the adult central nervous system. In this work, we have cloned the coding sequence of chicken Scrt2 (cScrt2) and characterized its expression pattern in the embryo with quantitative PCR and in situ hybridization. The complete coding sequence was cloned in the expression vector pMES-GFP and the predicted translation product is a 276-aminoacids protein. The aminoacid sequence shares identities of 70% with rat Scrt2 and 58% with zebrafish Scrt. cScrt2 transcripts are firstly detected in the periphery of the neural tube in the hindbrain by HH 15 and in the spinal cord by HH 17, coinciding with the places where some of the first neurons differentiate during embryogenesis. Between HH 19-23, the expression in the motor domain of the spinal cord is progressively concentrated in the interface between the ventricular and mantle zones. Furthermore, cScrt2 expression is also observed in the dorsal root ganglia after HH22-23, particularly in the dorsomedial domain. The expression pattern of cScrt2 in the neural tube is complementary to that of Notch1, which is expressed in neural stem cells, and SCG10, a marker for differentiated neurons. Our results suggest that during embryogenesis cScrt2 is specifically expressed in post-mitotic undifferentiated neurons. The construction pMES-GFP(cScrt2) makes possible future direct functional analysis by genetic interference in the chick embryo, which will be of great value for better understanding the Scrt genes function in vertebrates.
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Imunoexpressão de caderinas e integrinas no desenvolvimento do epitélio cutâneo humano / Immunoexpression of cadherins and integrins in the development of human skin epitheliumLeonardo Kamibeppu 15 June 2011 (has links)
Introdução: Caderinas e integrinas são importantes para a manutenção da integridade tecidual e transdução de sinal durante o desenvolvimento da pele. A distribuição destas moléculas no desenvolvimento da pele humana foi investigada e associada com os marcadores de diferenciação, Citoqueratinas (CK) e involucrina (INV). Método: Usando a técnica de imunoistoquímica foram investigadas as proteínas E- e P- caderinas, integrinas beta- 1 e -4, CK 10, CK 14 e INV em fragmentos de pele de várias regiões corpóreas de 7 fetos humanos (semana gestacional de 4 a 24, todos pesando até 500 g). Resultados: Na fase inicial do desenvolvimento, integrinas beta-1 e -4 and E- and P- caderinas estavam presentes na membrana plasmática das células epiteliais em todos as camadas do epitélio. CK14 e CK10 foram observadas em todas as camadas epiteliais e a INV fracamente detectada em células da camada mais superficial. Em estágios mais avançados, integrinas foram detectadas em todas as camadas epiteliais, com expressão polarizada principalmente na camada basal. E- caderina foi detctada em todas as camadas, menos no estrato cornificado e a P- caderina foi observada em camadas mais profundas do epitélio. CK14 estava presente na camada basal, CK 10 no estrato suprabasal e a INV foi observada no estrato cornificado. Conclusão: Caderinas e integrinas são essenciais para o desenvolvimento da pele, sendo espacialmente e temporalmente regulados. Suas expressões são relatas com a expressão da maturação de marcadores da epiderme. / Introduction: Cadherins and integrins are important for maintenance of tissue integrity and in signal transduction during skin development. Distribution of these molecules in human skin development was investigated and associated with markers of differentiation, cytokeratins (CK) and involucrin (INV). Methods: Using immunohistochemistry expression of E- and P- cadherins, integrins beta-1 and -4, CK10, CK 14 and INV was assessed in skin fragments of 7 human fetuses (gestacional weeks ranged from 4 to 24, all weighing up to 500 g). Results: At initial phases of development, integrins beta-1 and -4 and E- and P- cadherins were present on epithelial cell membranes in all layers. CK 14 and CK 10 were expressed in all epithelial layers and INV weakly detected in the superficial layer. In more advanced stages, integrins were detected in all layers, but a marked polarized expression was seen in basal layer. E- cadherin was detected in all layers, but the cornified stratum and P- cadherin were observed in the lower layers. CK 14 was expressed in layer, CK 10 in suprabasal stratum and INV was observed in cornified layer. Conclusions: Cadherins and integrins are essential for skin development, being spatially and temporally regulated. Their expression is related with the expression of maturation markers of the epidermis.
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Utilização de células de trofoblasto de embriões partenogenéticos na descrição de haplótipos de BoLA-DRB3-DQA-DQBSÁ, André Luiz Alves de 30 March 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-03-30 / A perspectiva de aumentar a produtividade do gado bovino a partir da aplicação de melhoramento genético do rebanho é cada vez mais estudada. Dentre as regiões genômicas mais estudadas e promissoras têm-se o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), já que este reúne genes importantes na resposta imunológica do animal, sendo possível selecionar marcadores nesta região para maior resistência a enfermidades e, portanto, maior produção pecuária. A diversidade do MHC bovino, conhecido como BoLA (Bovine Leukocyte Antigens), foi estudada inicialmente investigando seus genes isoladamente. A maioria dos bovinos são heterozigotos em BoLA e apenas em ocasiões especiais (animais homozigotos ou que possuam informação de pedigree) seu haplótipo pode ser caracterizado. Portanto, este trabalho objetivou desenvolver uma nova abordagem para descrever haplótipos de BoLA de vacas heterozigotas, utilizando células do trofoblasto de embriões partenogenéticos bovinos. Dois métodos para validação desta abordagem foram utilizados: um painel de 445 SNPs em BoLA foi informativo acerca do efeito que a recombinação meiótica apresenta na zigose da região; e a comparação de alelos de BoLA-DRB3 entre a fêmea bovina e sua célula trofoblástica partenogenética (CTP) demonstrou ser um método confiável e prático para a investigação de homozigose em BoLA. A partir de ambos os métodos, a metodologia desenvolvida aqui foi validada, já que CTPs homozigotas em BoLA foram derivadas de vacas heterozigotas, permitindo a descrição de haplótipos de BoLA. A análise detalhada da região de Classe IIa de BoLA-DRB3-DQA-DQB revelou a presença de 18 haplótipos distintos, sendo 16 destes nunca antes descritos. Além disso, dois alelos de DQA e um de DQB presentes nestes haplótipos são novos. O método descrito aqui foi mais eficiente do que a investigação por fêmeas homozigotas ou inferir a composição haplotípica baseada em informação de pedigree, além de evitar ambiguidades nos resultados. Novas pesquisas buscando a otimização deste método podem aumentar a sua eficiência e torná-lo mais facilmente aplicável a uma variedade de estudos genéticos, usando espécies diferentes e com finalidades distintas. / The prospect of increasing the productivity of cattle by means of genetic improvement is increasingly investigated. Among the most studied and and promising genomic regions is the Major Histocompatibility Complex (MHC), since it includes key genes of the immune response of the animals, being able to select makers in this region for increased disease resistance and therefore greater production. The diversity of the cattle MHC, known as BoLA (Bovine Leukocyte Antigens), has been primarily studied using variants of serological specificities or sequencing some of its genes. Most cattle are heterozygous at BoLA and only in special occasions (homozygous animals or animals for which pedigree information is available) can the haplotypes be characterized. Therefore, this study aims to develop a novel approach to describe BoLA haplotypes from heterozygous cows, using trophoblast cells from parthenogenetic bovine embryos derived from slaughterhouse ovaries. Two methods for validating this approach were used: a panel of 445 SNPs spanning BoLA region was informative on the effect of meiotic recombination on the region zigosity; and the comparison of BoLA-DRB3 alleles between the dam and its parthenogenetic embryo derived trophoblast cells (PEDTC) proved to be a reliable and practical method for investigating BoLA homozigosity. Using both methods, the approach presented here was validated, since BoLA homozygous PEDTC were derived from heterozygous cows, allowing the description of BoLA haplotypes. Detailed analysis of the BoLA Class IIa region identified 18 different BoLA-DRB3-DQA-DQB haplotypes, including 16 novel haplotypes. Furthermore, two DQA and one DQB alleles included in these haplotypes were novel. This method was more efficient than to look for homozygous cows or infer haplotype composition based on pedigree information, in addition to avoid ambiguities on the results. New researches aiming for the improvement of this method can increase its efficiency and make it more easily applicable for a variety of genetic studies, using different species and for other purposes.
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"Acetato de medroxiprogesterona administrado em período pré-natal induz hipospádia em machos e virilização em fêmeas de camundongos" / Medroxyprogesterone acetate administered during pre-natal period causes hypospadia in male and virilization in female miceSouza Junior, Antonio Euclides Pereira de 09 September 2005 (has links)
A fertilização in vitro tem sido associada com um aumento na incidência das hipospádias, e alguns hormônios esteróides usados em seus protocolos têm sido implicados neste processo. Para testar essas hipóteses em um modelo animal, descrevemos neste trabalho as alterações morfológicas ocorridas no tubérculo genital de camundongos, expostos à progesterona durante a vida intrauterina. Foi administrado acetato de medroxiprogesterona por via subcutânea no período pré-natal em animais normais e animais desprovidos de receptores androgênicos (Tfm). A progesterona induziu a formação de hipospádia nos animais do sexo masculino, virilização nos do sexo feminino e não causou alterações nos animais Tfm / In vitro fertilization (IVF) has been associated with an increase incidence of hypospadias. IVF protocols require the maternal use of progesterone which may be a factor in causing hypospadias. To test these hypotheses in an animal model, we describe the effects of maternal progesterone exposure on genital development in mice. Medroxyprogesterone acetate (MPA) was administered by subcutaneous injection during the pre-natal period to wild type mice and animals knockout to androgen receptors (Tfm mice). Progesterone caused hypospadias in male mice fetuses, a virilizing effect in the female mice genitalia and didn't have any effect in Tfm animals
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Estudo do potencial vascular de precursores de vasos coronários em sítio adulto. / Study of the vascular potential of coronary vessel precursors in adult site.Oliveira, Bruno de 13 April 2011 (has links)
O Proepicárdio (PE) é uma estrutura transitória que dá origem aos componentes dos vasos coronários. Para avaliar seu potencial vascular em sítio adulto, transplantamos um coração neonatal para o pavilhão auricular de um animal adulto. Duas semanas depois, 2 PEs de embriões GFP+ foram transferidos para a superfície deste coração. Em outro grupo, transferimos os PEs diretamente para o pavilhão auricular. Para avaliar a incorporação de células GFP, e investigar sua diferenciação realizamos ensaios de imunofluorescência (IF) para GFP em combinação com outros marcadores. A adição do PE em sítio adulto teve como resultado a participação deste em processos de vasculogênese, iniciando a formação de novos vasos sanguíneos via formação de ilhotas sanguíneas e em um processo angiogênico, diferenciando-se em células endoteliais que se incorporaram aos vasos já existentes. Baseados nisso podemos afirmar que o PE possui potencial vasculogênico/angiogênico em sítio adulto, podendo ser exploradas como modelo para revascularização cardíaca e recuperação de tecidos vasculares. / The Proepicárdio (PE) is a transient structure giving rise to all components of the coronary vessels. To evaluate the vasculogenic potential of the PE in an adult site, a neonatal heart was transplanted into the subcutaneous of an adult ear Later, two PE from GFP-transgenic mice were transferred to the surface of this heart. In another group, we transferred the PEs directly into the ear pinna. To evaluate the incorporation of GFP cells derived from the PE, and to investigate their possible differentiation, we performed immunofluorescence (IF) for GFP in combination with other markers. The addition of PE in an adult site resulted in its participation in a vasculogenic and in an angiogenic processes. Based on this we conclude that PE cells can differentiate and likely participate in a neovascularization process when transplanted to adult sites. These findings demonstrate that the vasculogenic potential of the PE cells is conserved in an adult site and our model is adequate to study the mechanisms involved in the development and regeneration of vasculature.
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Imunoexpressão de caderinas e integrinas no desenvolvimento do epitélio cutâneo humano / Immunoexpression of cadherins and integrins in the development of human skin epitheliumKamibeppu, Leonardo 15 June 2011 (has links)
Introdução: Caderinas e integrinas são importantes para a manutenção da integridade tecidual e transdução de sinal durante o desenvolvimento da pele. A distribuição destas moléculas no desenvolvimento da pele humana foi investigada e associada com os marcadores de diferenciação, Citoqueratinas (CK) e involucrina (INV). Método: Usando a técnica de imunoistoquímica foram investigadas as proteínas E- e P- caderinas, integrinas beta- 1 e -4, CK 10, CK 14 e INV em fragmentos de pele de várias regiões corpóreas de 7 fetos humanos (semana gestacional de 4 a 24, todos pesando até 500 g). Resultados: Na fase inicial do desenvolvimento, integrinas beta-1 e -4 and E- and P- caderinas estavam presentes na membrana plasmática das células epiteliais em todos as camadas do epitélio. CK14 e CK10 foram observadas em todas as camadas epiteliais e a INV fracamente detectada em células da camada mais superficial. Em estágios mais avançados, integrinas foram detectadas em todas as camadas epiteliais, com expressão polarizada principalmente na camada basal. E- caderina foi detctada em todas as camadas, menos no estrato cornificado e a P- caderina foi observada em camadas mais profundas do epitélio. CK14 estava presente na camada basal, CK 10 no estrato suprabasal e a INV foi observada no estrato cornificado. Conclusão: Caderinas e integrinas são essenciais para o desenvolvimento da pele, sendo espacialmente e temporalmente regulados. Suas expressões são relatas com a expressão da maturação de marcadores da epiderme. / Introduction: Cadherins and integrins are important for maintenance of tissue integrity and in signal transduction during skin development. Distribution of these molecules in human skin development was investigated and associated with markers of differentiation, cytokeratins (CK) and involucrin (INV). Methods: Using immunohistochemistry expression of E- and P- cadherins, integrins beta-1 and -4, CK10, CK 14 and INV was assessed in skin fragments of 7 human fetuses (gestacional weeks ranged from 4 to 24, all weighing up to 500 g). Results: At initial phases of development, integrins beta-1 and -4 and E- and P- cadherins were present on epithelial cell membranes in all layers. CK 14 and CK 10 were expressed in all epithelial layers and INV weakly detected in the superficial layer. In more advanced stages, integrins were detected in all layers, but a marked polarized expression was seen in basal layer. E- cadherin was detected in all layers, but the cornified stratum and P- cadherin were observed in the lower layers. CK 14 was expressed in layer, CK 10 in suprabasal stratum and INV was observed in cornified layer. Conclusions: Cadherins and integrins are essential for skin development, being spatially and temporally regulated. Their expression is related with the expression of maturation markers of the epidermis.
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Aurora A kinase function during anaphaseLioutas, Antonio, 1980- 09 November 2012 (has links)
Aurora A (AurA) is an important mitotic kinase mainly studied for its
involvement in cell cycle progression, centrosome maturation,
mitotic spindle pole organization and bipolar spindle formation. It
localizes to duplicated centrosomes and spindle microtubules (MTs)
during mitosis where it regulates various factors participating in
metaphase spindle formation. AurA is degraded late in mitosis
suggesting that it might also have a function in anaphase. In this
study we focused in understanding AurA function during anaphase
in two different experimental systems.
First, we kept AurA active in cycled Xenopus egg extracts and found
that MTs maintained their mitotic organization longer throughout
mitotic exit. We also observed chromosome segregation defects and
problematic nuclear envelope formation. These observations
indicate that AurA activity needs to be down-regulated for the
transition from metaphase back to interphase.
To get insights into the role of AurA during metaphase-anaphase
transition we initially asked whether its kinase activity is still
necessary for the maintenance of the metaphase spindle. We saw
that the inhibition of AurA kinase activity in metaphase resulted to a
collapse of the established metaphase spindle in HeLa cells.
Indicating that AurA activity is necessary for the metaphase spindle
maintenance.
Then, we looked whether AurA kinase activity is still necessary
during anaphase. We inhibited AurA at the onset of anaphase in
Hela cells and found that anaphase spindles were smaller. We also
observed that the MT structure responsible for anaphase spindle
elongation, the central spindle, was defectively assembled and
organized. Moreover, in cells where AurA was inhibited segregation
of chromosomes was defective. These results indicate that AurA
kinase activity is necessary for anaphase spindle elongation, central
spindle assembly and organization and chromosome segregation.
To understand further how AurA regulates anaphase spindle
formation we looked known AurA substrates. We depleted TACC3,
a known AurA substrate involved in MT formation earlier in mitosis
and observed that TACC3 depletion phenocopied AurA inhibition.
This indicates that TACC3 has a function in MT organization and
chromosome segregation during anaphase and this function could
possibly be regulated by AurA.
In this study we have demonstrated that AurA activity is essential for
metaphase spindle maintenance. We also found that during
anaphase when AurA is either maintained active or inhibited MT
organization is greatly affected and chromosome segregation is
defective. Suggesting that AurA activity needs to be tightly controlled
during anaphase for a correct completion of mitosis. / Aurora A (AurA) es una quinasa mitótica importante que se ha
estudiado principalmente en su papel durante la progresión del ciclo
celular, la maduración del centrosoma, la organización y la
formación del polo y del huso mitótico. Durante la mitosis, AurA se
localiza en los centrosomas duplicados y en los microtúbulos (MTs)
del huso y se ha observado que regula varios factores que
participan en la formación del huso mitótico. AurA se degrada al
final de la mitosis indicando que pueda tener una función durante la
anafase. En este estudio nos hemos centrado en la comprensión de
la función de AurA durante la anafase en dos sistemas
experimentales diferentes.
En primer lugar, utilizando extractos de huevos de Xenopus hemos
mantenido AurA activa durante la transición de metafase a anafase
y hemos visto que los MTs del huso mitótico mantienen su
organización durante más tiempo. También hemos observado que
cuando AurA se mantiene activa existen defectos en la segregación
cromosómica y la formación de la membrana nuclear. Esto indica
que la actividad de AurA tiene un papel regulador sobre los MTs y la
chromatina durante la transición de la metafase a la interfase.
Para entender cual es la función de AurA durante la transición de
metafase a anafase primero hemos estudiado si la actividad de la
quinasa es necesaria para el mantenimiento del huso mitótico.
Hemos visto que la inhibición de la actividad quinasa AurA resultó
en el colapso del huso durante la metafase en células HeLa. Esto
indica que la actividad de AurA es necesaria para el mantenimiento
del huso mitótico de metafase.
A continuación hemos analizamos si la actividad quinasa de AurA
sigue siendo necesaria para la anafase. Para ello hemos inhibido
AurA en células Hela al inicio de la anafase. En estas condiciones
los husos de la anafase son más pequeños y la estructura de los
MTs responsable del alargamiento del huso mitótico durante la
anafase, el huso central, se organiza defectuosamente. Además, se
encontraron errores durante la segregación de los cromosomas.
Estos resultados indican que la actividad quinasa de AurA es
necesaria para el alargamiento del huso durante la anafase y la
organización y segregación cromosómica.
Para entender el mecanismo de la función de AurA durante la
anafase hemos estudiado a sustratos de AurA. Al estudiar TACC3 ,
un sustrato conocido de AurA que participa en la formación de MTs
en las fase iniciales de la mitosis hemos encontrado que su
eliminación de células HeLa produce el mismo fenotipo que la
inhibición de AurA. Esto indica que TACC3 tiene una función en la
organización de MT y la segregación de cromosomas durante la
anafase y que esta función podría estar regulada por la quinasa
AurA.
En este estudio hemos demostrado que la actividad quinasa de
AurA es esencial para el mantenimiento del huso mitótico. También
hemos encontrado que durante la anafase cuando la quinasa AurA
se mantiene activa o se inhibe la organización de los MTs del huso
mitótico se ve muy afectada y los cromosomas se segregan
defectuosamente. Por tanto los resultados de este estudio indican
que la actividad quinasa de AurA está estrechamente controlada
durante la anafase para el correcto cumplimiento de la mitosis.
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