Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [136]-149. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les Toll-Like Receptors (TLRs) jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire innée, en reconnaissant des motifs moléculaires précis retrouvés exclusivement chez différents pathogènes (lipopolysaccharides (LPS), peptidoglycane, flagelline, ...). Le LPS est reconnu pour favoriser la production de cytokines pro-inflammatoires (ex. IL-1, IL-8, et TNF-ot) par les monocytes/macrophages via l'induction du facteur de transcription NK-KB par le TLR4. D'autre part, le virus d'immunodéficience humaine de type I (VIH-1) possède deux sites de liaison pour NF-KB dans sa région promotrice. L'objectif de cette étude était de vérifier l'effet de la stimulation au LPS sur la réplication et la production du VIH-1 dans une lignée cellulaire macrophagique ainsi que dans les macrophages primaires humains. L'ensemble des résultats obtenus montre que le LPS augmente l'activation de la transcription dans la lignée THP89GFP, alors que le contraire est observé dans les macrophages primaires humains et ce même si l'activation de NF-KB et la production de TNF-a sont observées dans ces cellules suite à un traitement au LPS. Cette étude révèle que les conclusions faites à partir d'une lignée cellulaire bien établie ne peuvent directement être appliquées à une un modèle plus physiologique. Ainsi, la réponse aux ligands des TLR devrait être étudiée dans un système de culture cellulaire beaucoup plus proche de la situation in vivo. / Toll-Like Receptors (TLRs) play a major role in the innate immune response, by recognizing precise molecular patterns found exclusively on different pathogens (lipopolysaccharides/LPS, peptidoglycans, flagellin, etc.). LPS is known to induce the production of pro-inflammatory cytokines (e.g. IL-1, IL-8, and TNF-a) by monocytes/macrophages through TLR4-mediated induction of the transcription factor NFKB. Interestingly, HIV-1 carries two consensus NF-KB binding sequences within its promoter region. The main goal of this study is a comparison of the modulatory effect of LPS treatment on HFV-1 transcription and virus production in a promonocytic cell line and primary monocyte-derived macrophages (MDM). We found that LPS increases virus gene expression in THP89GFP cells by activation of NF-KB, which is in sharp contrast with what is seen in primary MDM even though NF-KB and TNF-a were both stimulated upon treatment of the latter cell type by LPS. More importantly, our findings reveals that conclusions made with established human-derived cell lines cannot be directly applied to the situation prevailing in a more natural cellular setting. Thus, the response to TLR ligands should be studied in an appropriate cell culture System to more closely parallel the in vivo situations.

Les lipopolysaccharides (LPS) sont les constituants majeurs de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Ils sont composés d’un polysaccharide (PS) relié à une région lipidique : le lipide A. Ces structures sont très variables d’une bactérie à l’autre. Elles sont aussi susceptibles de subir des modifications post-traductionnelles par des enzymes en réponse à des stimuli extérieurs. Chaque bactérie possède sa propre signature représentée par la structure unique de ses LPS. Les LPS sont reconnus par le récepteur MD-2 :TLR4. Ce complexe discrimine la structure des lipides A et déclenche de façon structure-dépendante ses voies de signalisation. Les LPS sont très étudiés pour leurs activités néfastes, notamment dans le déclenchement de la cascade inflammatoire qui mène au choc septique. Cependant ils présentent aussi de multiples activités bénéfiques. Dans le cadre de cette thèse, nous avons exploré deux types d’activités bénéfiques des LPS chez l’homme.L’analyse structurale des LPS par spectrométrie de masse est une étape indispensable pour comprendre leurs activités biologiques. Nous proposons deux nouvelles micro-méthodes d’analyse appliquées directement sur les membranes bactériennes. Ceci nous permet d’identifier plus rapidement les molécules de LPS au plus proche de leurs configurations natives, en évitant les artefacts dus à l’extraction. Cette méthode puissante pourra également être développée comme outil de détection rapide de pathogènes.Ensuite, nous avons étudié la relation structure-activité de LPS naturellement peu toxiques mais actifs au niveau cutané. Ce sont des composés du lysat bactérien de Vitreoscilla filiformis contenus dans des crèmes dermatologiques et cosmétiques visant à traiter la dermatite atopique. Les lipides A possèdent des chaînes courtes d’acides gras et les groupes phosphates peuvent être substitués par des groupements phosphoéthanolamines. Les activités biologiques induites par ces LPS prennent place comme des mécanismes de défense pour améliorer la réponse immune et lutter contre les pathogènes.En outre, le pouvoir adjuvant des LPS est l’une de leurs activités bénéfiques les plus étudiées. Les LPS sont naturellement trop toxiques pour être utilisés tels quels. Nous avons, caractérisé des LPS détoxifiés par modifications chimiques, établi et effectué différents tests de « screening » permettant d’évaluer leur adjuvanticité et leur non-pyrogénicité.Enfin, pour des applications thérapeutiques chez l’homme, les LPS doivent être produits en grandes quantités. Nous exposons la compatibilité du procédé de production de la société LPS-BioSciences à l’échelle industrielle et la réglementation des médicaments. Une amélioration de la méthode d’extraction est proposée pour extraire des quantités de l’ordre du gramme. De plus, le procédé de production est réalisable en respectant les bonnes pratiques de fabrication des médicaments. / Lipopolysaccharides (LPS) are the main components of the outer membrane of Gram negative bacteria. They are composed of a polysaccharide moiety linked to a lipid one, the lipid A. These structures are different from one bacterium to the other. They are also able to be modified by enzymatic post-translational modifications in response to external stimuli. Each bacterium possesses its own footprint shown by the unique structure of its LPS. LPS are recognized by the MD-2:TLR4 receptor. This complex distinguishes the lipid A structures and it actives some signalling pathways with a structure dependant manner. LPS are studied for their harmful effects, especially for their implication in the inflammatory cascade leading to septic shock. However, LPS keep multiple beneficial activities. In the context of this thesis, we have explored two kinds of beneficial activities for human.Structural analysis of LPS by mass spectrometry is an indispensable step to understand their biological activities. We propose two new micromethods of analysis directly applied on bacterial membranes. We can identify quickly the LPS molecules as close as possible to their native configurations. Thus, we can check the LPS structures before their extraction. This powerful method could be developed as a rapid tool for pathogens detection.Then, we studied the structure-activity relationships of naturally low-toxic, but active LPS at the skin level. They are compounds of the Vitreoscilla filiformis bacterial lysate. This lysate is used in dermatological and cosmetic creams to treat atopic dermatitis. Lipids A are composed of short fatty-acid chains (10 and 12 carbons), and the phosphate groups can be substituted by ethanolamine-phosphate. The biological activities induced by these LPS take place as defense mechanisms to improve the immune response against pathogens.Moreover, the adjuvant capability of LPS is another well studied beneficial activity. LPS are naturally too toxic to be used as vaccine adjuvant. We characterized chemically detoxified LPS and we established and realized different « screening » tests to evaluate their adjuvanticity and non-pyrogenicity.Finally, for human therapeutic applications, LPS must be produced on a large scale. We exposed the compatibility between the LPS-BioSciences process of production at the industrial scale and the medical regulation. One improvement of the extraction method is proposed in order to extract about one gram of LPS. The process is compatible with the good manufacturing practices.

Les propriétés insecticides du Bacillus thuringiensis, découvert par ShigentaneIshiwatari, ont été utilisées pendant des décennies comme biopesticides et cette utilisation a augmenté rapidement en raison de préoccupations au sujet des effets environnementaux négatifs des pesticides chimiques. Actuellement, la toxine Bt dans la forme de biopesticides et des plantes transgéniques Bt peut compléter ou remplacer les pesticides chimiques. Il y a peu d’indication que la toxine Bt a un effet nocif pour l'environnement ou la santé humaine. Néanmoins, il ya des préoccupations que les cultures transgéniques commerciales peuvent avoir des effets néfastes sur l'environnement. Après son introduction dans le sol l'exsudation racinaire et la dégradation des résidus végétaux, la toxine Bt interagit avec les particules de sol. Les interactions de la toxine Bt avec des particules de sol influencent sa mobilité, sa biodisponibilité, sa persistance et sa toxicité.Dans cette étude, nous visons à établir l'importance relative des facteurs biologiques et physico-chimiques dans la détermination de la dynamique des protéines Cry détectables dans les sols, de clarifier si la protéine adsorbée conserve ses propriétés insecticides et d'identifier les propriétés du sol qui déterminent le devenir des protéines Cry dans le sol. Les résultats montrent que les protéines Cry ont une forte affinité sur la surface du sol. Cependant, il y avait peu de relation entre l'affinité pour le sol ou le rendement d'extraction et les propriétés du sol, y compris la teneur en argile, teneur en carbone organique et le pH du sol. Il y avait peu de rapport entre l'affinité et le rendement d'extraction. Les protéines diffèrent à la fois dans leur affinité pour les sols et leurs rendements d'extraction.Une évaluation du rôle du sol et des facteurs environnementaux dans le sort des protéines Cry de la formulation de biopesticides commerciale a montré un déclin rapide de la protéine Cry détectable soumise aux rayons du soleil sous la condition de laboratoire, alors que peu d'effet a été observé dans des conditions de terrain. La demi-vie des protéines dans le sol dans des conditions naturelles était d'environ 1 semaine. Des effets de la température forts ont été observés, mais ils diffèrent pour les biopesticides et la protéine purifiée, indiquant différentes étapes limitantes. Pour le biopesticide, la baisse observée était ralenties par des facteurs biologiques, y compris éventuellement sporulation. En revanche pour des protéines purifiées, augmentation de la température améliorée des changements conformationnels de la protéine adsorbée du sol, conduisant à une fixation et, par conséquent diminué efficacité d'extraction qui a diminué avec le temps. En outre, l'étude de la persistance de diverses protéines Cry dans les sols contrastés a été réalisée par immuno-détection et dosage biologique a montré que la toxine extractible diminue avec incubation allant jusqu'à quatre semaines. L'activité insecticide était toujours maintenue à l'état adsorbé, mais a disparue après deux semaines d'incubation à 25°C. La baisse de la protéine extractible et la toxicité était beaucoup plus faible à 4°C à 25°C. La stérilisation du sol n'a pas eu d'effet significatif sur la persistance de la toxine Cry indiquant que le déclin observé était provoqué par la fixation en fonction du temps de la protéine adsorbée ce qui diminue la quantité de toxine Cry extractable, la dégradation de la protéine par l’activité microbienne jouant un rôle plus mineur.L’exposition des insectes aux protéines Cry sous la forme adsorbé pourrait avoir un impact significatif sur les insectes cibles et même les insectes non cibles, et devrait être plus étudiée afin de déterminer son impact potentiel. / The insecticidal properties of Bacillus thuringiensis, discovered by Shigentane Ishiwatari, have been used for decades as biopesticides and this use has been increasing rapidly because of concerns about the negative environmental effects of chemical pesticides. Currently, Bt toxin in the form of both biopesticides and Bt transgenic plantsmay supplement or replace chemical pesticide. There is little evidence to demonstrate that Bt toxin has any harmful effect to the environment or to human health. Nevertheless, there are concerns that commercial transgenic crops may have harmful impacts on the environment. After release into soil via root exudation and breakdown of plant residues, Bt toxin interacts with soil particles. The interactions of Bt toxin with soil particles influence its mobility, its bioavailability, its persistence and its toxicity. In this study, we aim to establish the relative importance of biological and physicochemical factors in the determination of the dynamics of detectable Cry proteins in soils, to clarify if adsorbed protein maintains its insecticidal properties and to identify the soil properties that determine the fate of Cry proteins in soil. The results show that Cry proteins have strong affinity on soil surface. However, there was little relationship between affinity for soil or the extraction yield and soil properties including clay content, organic carbon content and soil pH. There was little relationship between the affinity and the extraction yield. The proteins differ in both their affinity for soil and their extraction yields.An assessment of role of soil and environmental factors in the fate of Cry protein from commercial biopesticide formulation showed a rapid decline of detectable Cry protein subjected to direct sunlight under the laboratory condition, whereas, little effect was observed under field conditions. The half-life of proteins in soil under natural conditions was about one week. Strong temperature effects were observed, but theydiffered for biopesticide and purified protein, indicating different limiting steps. For biopesticide, the observed decline was due to biological factors, possibly including sporulation. In contrast for purified proteins, increased temperature enhanced conformationalchanges of the soil-adsorbed protein, leading to fixation and hence extraction efficiency decreased that decreased with time. Moreover, the study of persistence of various Cry proteins in contrasting soils was carried out by immuno-detection and bioassay showed that extractable toxin decreased with incubation of up to four weeks. Insecticidal activity was still retained in the adsorbed state, but lost after two weeks of incubation at 25°C. The decline in extractable protein and toxicity was much lower at 4°C than 25°C. There was no significant effect of soil sterilization to persistence of Cry toxin indicating that decrease in detectable Cry toxin in soil may be time-dependent fixation of adsorbed protein as well as decreasing solubilization in larva midgut, but not microbial breakdown.Exposition to Cry in the adsorbed form could have a significant impact on target and even non target insects and should be investigation to determine the potential impact.

Les réactions de type hypersensibilité parfois observées au début de séances d'hémodialyse ont été corrélées à la présence, dans les bains de dialyse, d'endotoxines ou lipopolysacharides (LPS) provenant de bactéries de type gram négatif. Nous nous sommes tout d'abord attachés au développement d'un système de production de bains de dialyse stériles et apyrogènes qui soit intégrable au matériel existant. Notre étude nous a permis de rejeter les dispositifs d'ultrafiltration utilisant des membranes organiques planes ou des membranes minérales tubulaires. Nous avons proposé l'emploi d'un hémofiltre à fibres creuses en polyamide qui s'avère un bon compromis puisque, dans des conditions de contamination normales, le bain produit est stérile et apyrogène et la faible perte de charge générée par le filtre permet son intégration aux générateurs de bains existants. Nous avons également déterminé plus précisément la masse moléculaire des LPS par électrophorèse et par filtrations successives sur des membranes de seuils de coupure décroissants. Nous avons ainsi pu mettre en évidence les LPS après filtration sur des membranes de 5 kDa pour les LPS de type R. Dans une dernière étape, nous avons cherché à modifier la membrane de dialyse pour augmenter sa rejection des LPS. Un revêtement de la face dialysat de la membrane par un polymère organique polycationique nous a permis d'obtenir des absorptions notables de LPS. La conjonction des deux méthodes que nous avons proposées, ultrafiltration des bains de transfert des LPS vers le compartiment sanguin. Des essais cliniques nous permettront de valider ce procédé.

Parmi les méthodes alternatives respectueuses de l'environnement pour la lutte contre les ravageurs et la protection des cultures agricoles, les bioinsecticides à base de Bacillus thuringiensis sont les plus largement utilisés. L’activité insecticide de B.thuringiensis réside dans la production d’inclusions cristallines protéiques appelées δ-endotoxines qui sont formées au cours de la sporulation. En préalable à ces travaux, de nouvelles souches de B.thuringiensis ont été isolées du sol libanais et ont montré un potentiel insecticide élevé, supérieur à des souches classiquement utilisées. Dans le cadre du développement d'une production industrielle, au Liban, de biopesticides à base de ces souches de B.thuringiensis, ce travail a visé à optimiser la production des δ-endotoxines afin d'augmenter les rendements et de réduire les coûts de production. A l'échelle industrielle, le milieu de culture des bactéries représente une part importante du coût de production. Ainsi, l'effet, sur la concentration des δ-endotoxines, de substitution des sources synthétiques coûteuses d'azote, de carbone et de minéraux, par un sous-produit de la minoterie de blé (le son de blé) a été étudié. L’efficacité de ce sous-produit agro-industriel comme source complète de nutriments, disponible localement à faible prix, a été prouvée pour des fermentations submergées de deux souches différentes toxiques contre des diptères ou des lépidoptères. La comparaison du milieu son de blé à d’autres milieux (synthétiques ou non), classiquement utilisés en bibliographie, a montré que ce milieu présente de nombreux avantages en termes de productivité, de rendement relatif des δ-endotoxines et de coût. Parallèlement à ce travail, une méthode simple et rapide de purification des cristaux a été développée de façon à obtenir des cristaux protéiques purs à 99 % nécessaires comme standards pour le dosage des cristaux dans le milieu de fermentation. Un autre objectif du travail a été d’analyser l'effet de l'aération sur la cinétique de croissance et de sporulation d'une nouvelle souche de B.thuringiensis var kurstaki. Les différentes conditions d’aération testées en fermenteurs de 2 L, caractérisées par le coefficient volumétrique de transfert de dioxygène (KLa), ont permis de montrer l’importance de ce paramètre et de l’optimiser pour obtenir la meilleure productivité en biopesticides. Le meilleur rendement en protéines de toxines a été obtenu dans un milieu son de blé 6 % (masse/volume) dans des conditions d’aération correspondant à un KLa de 65,5 h-1 alors que la meilleure productivité des protéines de toxines a été atteinte dans le milieu 9 % pour un KLa de 102 h-1. Sur la base de cette étude, le dimensionnement de la production de B.thuringiensis à l’échelle 1000 L a été réalisé. L’unité de production a été construite et les premiers essais réalisés ont permis de produire de façon satisfaisante des lots de biopesticides. L’ajustement des protocoles industriels reste à faire. / Among the safe and environment friendly methods for the fight against pests and agricultural crops protection, Bacillus thuringiensis based biopesticides are the most widely used. The insecticidal activity of B. thuringiensis resides in the production of protein crystal inclusions called δ-endotoxins, which are formed during sporulation. Preliminary to this work, new B. thuringiensis strains were isolated from Lebanese soil and showed higher insecticidal potential than the conventionally used strains. As part of the development of an industrial production, in Lebanon, of biopesticides based on these strains of B.thuringiensis, this work aimed to optimize the production of δ-endotoxins to increase yields and reduce the cost of mass production. At industrial scale, the bacteria culture medium represents a significant part of the production cost. Thus, the effect on the concentration of the δ-endotoxins, of substituting expensive synthetic sources of nitrogen, carbon, and minerals, with a byproduct of wheat mill (wheat bran) was studied. The effectiveness of this agro-industrial by-product available locally at low prices, as complete source of nutrients, in submerged fermentations of two different strains of B.thuringiensis toxic against Lepidoptera and Diptera, has been proven. The comparison of the wheat bran medium to other mediums (synthetic or not), conventionally used in the bibliography, has shown that this medium this medium has many advantages in terms of productivity, relative yield of δ-endotoxins and cost. In parallel to this work, a simple and quick method of crystal purification was developed to obtain pure protein crystals to 99 % required as standards for the determination of crystals concentration in the fermentation medium. Another objective of the study was to analyze the effect of aeration on growth and sporulation kinetics of a new strain of B.thuringiensis var kurstaki. The different aeration conditions tested in fermenters of 2 L, characterized by the volumetric oxygen transfer coefficient (KLa), permitted to show the importance of this parameter and to optimize it to get the best biopesticides productivity. The best yield of toxin proteins relative to the wheat bran ratio in the culture medium was obtained in the 6 % (weight/volume) medium in aeration conditions corresponding to a KLa of 65.5 h-1, while the highest productivity of toxin proteins has been reached in the 9 % medium for KLa of 102 h-1. On this study basis, the scale up of B. thuringiensis production was performed in a bioreactor of 1000 L. The production unit was built and the first tests carried out have produced satisfactory batches of biopesticides. Industrial protocols are still to be adjusted.

La protéine découplante mitochondriale UCP2 est exprimée basalement dans différents tissus et le rôle de régulateur négatif de la production des espèces actives oxygénées (ROS) mitochondriales a été avancé. Les travaux présentés se sont intéressés à l'implication potentielle d'UCP2 dans le déroulement de la réponse immunitaire. Une induction de l'expression d'UCP2 est démontrée dans un modèle murin d'encéphalite par le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) tout d'abord, puis dans un modèle parasitaire de leishmaniose causée par Leishmania donovani. Cette expression d'UCP2 a été observée dans les cellules immunitaires, colocalisée avec différents marqueurs inflammatoires exprimés à des niveaux élevés. Le modèle d'infection virale a montré un délai entre la mise en place de la réponse immunitaire innée et l'apparition d'UCP2 dans le cerveau, impliquant UCP2 dans les étapes tardives de la défense antivirale. A cette étape, la réplication du virus et la neuroinflammation sont au maximum, expliquant la susceptibilité des souris déficientes en UCP2. De plus, l'invalidation des gènes codant pour TNF-a et/ou IL-ip sensibilise au virus HSV-1 les souris naturellement résistantes et modifie le profil d'expression d'UCP2. Dans le modèle parasitaire, l'invalidation du gène codant UCP2 n'a pas permis de diminuer la croissance des parasites dans la première phase de la leishmaniose. Ainsi la protéine UCP2 ne serait pas impliquée dans les étapes précoces de mise en place de la défense antiparasitaire; les tactiques des parasites pour inhiber la réponse de l'hôte pourraient expliquer l'absence de différences nettes liées à la perte d'UCP2. La dernière étude portait sur la chronologie d'apparition d'UCP2 par rapport aux marqueurs neuroinflammatoires suite à l'injection intrastriatale de LPS. Dans ce modèle, une forte expression transitoire de TNF-a, bcBa et TLR2 est repérée dans la zone adjacente au site d'injection dès 6 h suivant l'injection puis diminue. UCP2 est seulement observable 48 h post injection dans les mêmes régions cérébrales. En conclusion, nous avons démontré dans 3 types de stimulations infectieuses de la réponse immunitaire que l'apparition d'UCP2 était liée avec un délai à l'expression de facteurs inflammatoires et UCP2 n'a semblée être qu'un marqueur. En effet, la fonction antioxydante tenue par UCP2 dans les étapes tardives de l'immunité semble modeste à la vue des résultats des souris déficientes en UCP2, mais ce rôle reste encore à préciser. / Mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP2) is basally expressed in diverse tissues and a function of negative regulator of reactive oxygen species (ROS) production has been proposed. Studies presented in this thesis emphasize the potential role of UCP2 in immunity. Induction of UCP2 expression was demonstrated first in a murine model of encephalitis caused by Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), then in a parasitic leishmaniasis model. UCP2 mRNA expression was observed in immune cells, colocalized with different inflammatory factors at high levels. Models of viral infection demonstrated that the transcriptional activation of UCP2 was delayed compared with the inflammatory response, involving UCP2 in the later stages of the antiviral response. At those later steps, viral replication and neuroinflammation were maximal, which could explain susceptibility in UCP2-deficient mice. Moreover, invalidation of the genes encoding TNFa and/or IL1B in resistant mice allowed HSV-1 for replicating in neurons and modified the distribution pattern of UCP2m RNA in the brain. In parasitic models, growth of parasites in UCP2- deficient mice was not impaired in the first phase of pathogenesis. Therefore UCP2 did not appear to be implicated in early steps of the antiparasitic response; parasites could develop strategies for inhibiting the host response, which would explain the similarity in the immune responses between UCP2-deficient and wild type mice. The last study addressed the chronology of UCP2 expression in relation with neuroinflammation following intrastriatal injection of LPS. In this model, strong and transitory expressions of TNFa, IkB and TLR2 were shown in ipsilateral region at 6h after injection. UCP2 was only expressed 48h post injection in the same cerebral region. In conclusion, we have demonstrated, in three models of infection triggering an immune response that the induction of UCP2 expression occurs in a coordinated but delayed manner with that of common inflammatory factors. UCP2 appears to be a marker of the severity of the immune response. It does not appear, based on the results obtained in UCP2-deficient mice, to play an essential role in the models of infection that we used. The role of UCP2 in those models remains to be folly elucidated.

Le système immunitaire nous protège contre les infections et les cancers. Cependant, des réponses immunitaires excessives ou incontrôlées peuvent causer des pathologies potentiellement mortelles comme le choc endotoxinique, des maladies auto-immunes, ou le rejet d’allogreffe. Une compréhension claire des mécanismes de régulation des réponses immunes permettrait d’envisager de nouvelles thérapeutiques plus ciblées. Dans ce travail réalisé chez la souris, la modulation de la réponse inflammatoire à une toxine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS), a été utilisée comme archétype de la régulation immunitaire. Ceci nous a permis de démontrer que la régulation de la prolifération homéostatique de lymphocytes T CD4+CD25- par des lymphocytes T régulateurs naturels tempère la réponse inflammatoire au LPS. Cet effet est notamment dépendant d’une diminution de la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes activés par la prolifération induite par la lymphopénie. Nous avons aussi observé, que la désensibilisation du système immunitaire inné vis-à-vis du LPS, suite à des injections répétées d’endotoxine, induit le développement de cellules myéloïdes suppressives (myeloïd-derived suppressor cells MDSC) capables de réguler des réponses lymphocytaires T in vitro et in vivo. Nous avons pu mettre en évidence que l’effet suppresseur des MDSC est dépendant de leur expression de l’enzyme hème oxygénase-1 et de leur production d’IL-10. Le dialogue constant entre les cellules de l’immunité innée et de l’immunité acquise assure donc à la fois l’activation et la régulation du système immunitaire. Dans la majorité des cas, ceci permet aux réponses immunitaires d’être efficaces sans être excessives. La mise en évidence de ces processus identifie les lymphocytes T régulateurs et les cellules myéloïdes suppressives comme des éléments clefs de la régulation d’un processus inflammatoire. Les traitements immunosuppresseurs, les thérapies cellulaires et les greffes de moelle ont des effets variables et mal connu sur ces populations de cellules régulatrices. Tenir compte de ces interférences thérapeutiques avec les processus naturels de régulation de notre système immunitaire permettra certainement d’optimaliser l’utilisation de ce type de traitements. D’autre part, l’utilisation thérapeutique de ces deux types de cellules régulatrices pourrait être envisagé dans de nouvelles stratégies d’immuno-modulation plus « physiologique ».<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les travailleurs impliqués dans la gestion des matières résiduelles domestiques sont continuellement exposés à des bioaérosols pouvant entrainer des problèmes de santé de nature infectieux, allergène et cancérigène. Le but de cette étude était d’évaluer l’exposition aux bioaérosols des éboueurs et des chauffeurs de camion durant la collecte des déchets et des matières résiduelles à Montréal par une analyse multimétrique et multimédia. Les conditions de travail ont été évalués dans six camions (2 recyclages, 2 organiques et 2 domestiques). Pour chaque camion, des mesures ambiantes (cabine du chauffeur) et des mesures dans la zone respiratoire d’un collecteur et d’un chauffeur ont été réalisées. Des prélèvements sur la surface des sièges des chauffeurs ont aussi été effectués et les filtres à air de l’habitacle des camions ont été évalués. Les échantillons ont été analysés au laboratoire microbiologique de l’IRSST selon la méthode par culture microbienne et la méthode moléculaire Droplet Digital PCR. Les résultats indiquent que les collecteurs sont généralement les plus exposés aux bioaérosols. Les collecteurs des déchets domestiques étaient notamment les plus exposés avec des concentrations moyennes pour les bactéries (27 000 UFC/m3), les endotoxines (100 UE/m3) et les moisissures (5 900 UFC/m3) excédant les recommandations sanitaires. Néanmoins, les collecteurs du compost étaient les plus exposés aux moisissures (6 800 UFC/m3). E.coli et A.fumigatus ont été détectés dans tous nos échantillons avec des expositions plus importantes pour les travailleurs du domestique. De plus, les sièges des chauffeurs des camions domestiques avaient les niveaux de contamination les plus élevés. La concentration moyenne de A.fumigatus (2 500 UG/m3) dans l’air de ces camions était supérieure à celle des camions de recyclage et de compost. Les résultats des filtres n’ont pas permis de tirer de conclusions quant à l’exposition des chauffeurs aux bioaérosols. Les résultats de cette recherche ont permis de mettre en évidence que l’exposition des travailleurs lors de la collecte des déchets pourrait être influencée par le type de déchets, le poste de travail ainsi que les tâches exécutées. Cette étude confirme le potentiel élevé d’exposition aux bioaérosols des travailleurs attitrés au transport des matières résiduelles et des déchets. Elle valide aussi le besoin de réduire les expositions professionnelles par diverses stratégies, y compris les procédures de nettoyage de la cabine et l’utilisation d’équipement de protection respiratoire lors de tâches génératrices de bioaérosols (nettoyage des camions au jet, déchargement des camions). / Workers involved in the management of household residual materials are continuously exposed to bioaerosols which can cause them health problems of an infectious, allergenic and carcinogenic nature. The purpose of this study was to assess the exposure to bioaerosols of collectors and trucks drivers during the collection of domestic waste and residual materials in Montreal by a multimeric and multimedia analysis. A sampling campaign was conducted on six drivers and six collectors. A total of 6 trucks that collect recyclable (2), organic (2) and compost (2) waste were evaluated. Samples were also taken from the surface of the drivers' seats, and the cabin air filters were recovered. Samples were analyzed at the microbiology laboratory of the IRSST using the microbial culture method and the molecular method of Droplet Digital PCR (ddPCR). The results indicate that collectors are generally the most exposed to bioaerosols. Domestic waste collectors were in particular the most exposed with average concentrations for bacteria (27,000 CFU/m3), endotoxins (100 EU/m3) and fungi (5,900 CFU/m3) exceeding health recommendations. However, the compost collectors were the most exposed to fungi (6,800 CFU/m3). E. coli and A. fumigatus were detected in all of our samples, but exposures were greater for workers collecting domestic waste. In addition, the seats of drivers involved in domestic waste collection had the highest levels of contamination. The average concentration of A. fumigatus (2,500 UG/m3) in the air of the cabin of domestic waste trucks was higher than that of recycling and compost trucks. The results of the filters did not allow us to draw any conclusions on their role in terms of drivers exposure to bioaerosols. The results of this research highlighted that workers exposure to bioaerosols could be influenced by factors such as the type of waste, the workplace and workers’ tasks performed. This study confirms the high potential for exposure to bioaerosols of workers assigned to the transport of household residual materials and waste. It also validates the need to reduce workers exposures by various strategies including, cabin cleaning procedures and the use of respiratory protection equipment for specific tasks generating bioaerosols (water jet cleaning of trucks, unloading of trucks).

Des études ont récemment mis en évidence le rôle des lipopolysaccharides (LPS) des bactéries à Gram négatif de la flore intestinale dans le processus de l’inflammation conduisant à l’obésité et au diabète de type 2.Le présent travail est réalisé dans le cadre d’une collaboration entre les équipes du Dr. Caroff (U. Paris-Sud, Orsay) et du Pr. Zhao (U. Jiao Tong, Shanghai). Les expériences présentées ont été réalisées lors de séjours dans les deux laboratoires.Il a été démontré en Chine que des bactéries Sulfato-réductrices (SRB) à Gram négatif étaient présentes en plus forte proportion dans la flore intestinale chez les souris suivant un régime gras. Les mêmes résultats ont été observés chez l'homme. L’hypothèse selon laquelle des SRB seraient à l’origine de grandes quantités d’endotoxines chez les obèses et les patients diabétiques a été émise. Plusieurs souches de SRB isolées de la flore intestinale humaine d’un sujet sain et d’un sujet diabétique ont été cultivées en Chine. Des études de relation structure/activité des LPS isolés de ces bactéries ont été réalisées dans le laboratoire Français pour déterminer leur rôle dans le développement des maladies métaboliques. Les souches isolées des deux sujets ont pu être classées dans le genre Desulfovibrio. Les LPS correspondants ont été extraits et purifiés par des méthodes mises au point dans l’équipe d’Orsay. La structure chimique a été élucidée par les méthodes suivantes : Electrophorèse, Chromatographie sur couche mince, Chromatographie en phase gazeuse et Spectrométrie de masse MALDI. C’est ainsi que des spectres de masse ont été obtenus et que la structure des lipides A, principes actifs des LPS, isolés de SRB a été décrite pour la première fois. Les activités biologiques testées (TNFα, IL-6) varient en fonction du nombre d’acides gras présents. Les LPS de SRB du patient sain ont une structure variable (Smooth versus Rough) en fonction de la quantité de fer présent dans le milieu, et ceux isolés du patient diabétique présentent des structures atypiques qui ne sont pas toutes inflamogènes. Une molécule membranaire inconnue, que nous avons nommée « Glycosyl’X » était co-extraite avec les LPS. Elle joue apparemment un rôle important dans la croissance des SRB et a été étudiée après des étapes de purification complexes. Les structures et le pouvoir inflammatoire de ces molécules dont la structure varie avec les souches, et qui chélatent le fer, ont été étudiées. Elles sont de nature principalement osidique et fixées à la membrane. La proportion de ces molécules par rapport aux LPS varie avec la quantité de fer disponible dans le milieu. Un milieu riche en fer favorise la croissance des Desulfovibrio portant les Glycosyl’X qui n’ont pas de pouvoir inflammatoire eux-mêmes, mais entrent en compétition avec les LPS, modulant ainsi indirectement l’activité de ces derniers. L’augmentation du nombre de Desulfovibrio conduisant à l’augmentation des molécules Glycosyl’X pourrait aussi moduler positivement (par présentation) ou négativement (par élimination des bactéries) l’adsorption du fer dans les intestins dont l’équilibre est essentiel pour l’homéostasie métabolique.Par ailleurs, la croissance des Desulfovibrio augmente la production d’Hydrogène Sulfuré connu pour son action délétère sur les cellules. Nous favorisons l’hypothèse selon laquelle son action sur la disjonction des cellules épithéliales permettrait le passage des différents LPS relargués par la flore Gram-négative intestinale, et même des bactéries entières, vers la circulation sanguine. / Recent studies have highlighted the role of lipopolysaccharide (LPS) in the intestinal flora (gut microbiota) which could contribute to the inflammation process leading to obesity and type 2 diabetes. This thesis is part of a collaborative project between the laboratories of Dr. Caroff (U. Paris -Sud, Orsay, France) and Prof. Zhao (U. Jiao Tong , Shanghai, China). It has been shown by Pr.Zhao’s team in 2010 that the Sulfate -Reducing Bacteria (SRB) were presented in greater proportion in the intestinal mice flora following a fat diet compared to mice following a normal diet. The same results were observed in humans. The starting hypothesis was that SRB could produce a large amount of endotoxin in obese and diabetic patients and play a role in the development of metabolic diseases. Several SRB strains isolated from the human intestinal flora of a healthy subject and of a diabetic subject were grown in the Chinese laboratory. Studies of their LPS structure / activity relationships were carried out in the French laboratory. The aim of this study was to determine their roles in the development of metabolic diseases.Strains isolated from the two subjects could be classified in the Desulfovibrio genus. The corresponding LPS were extracted and purified by the methods developed in the French laboratory. The chemical structure was elucidated by the following methods: Electrophoresis, Thin layer chromatography, Gas chromatography and MALDI mass spectrometry. The mass spectra were obtained and the structure of lipid A, the active part of LPS isolated from SRB was described here for the first time. The biological activities test (TNFα, IL-6) vary depending on the number of fatty acids present in their lipid A structure. The LPS of SRB isolated from the healthy patient had a variable structure (Smooth versus Rough) depending on the amount of iron present in the medium, and those isolated from diabetic patients had atypical structures are not all inflamogenic .An unknown membrane molecule, which we named "Glycosyl'X" was co-extracted with the LPS. It apparently plays an important role in the growth of SRB was investigated after complex purification steps. The structures and the inflammatory power of these molecules variying with strains chelating iron were studied. They are mainly of glycosidic nature and linked to the bacterial membrane.The proportion of these molecules relatively to LPS varies with the amount of iron in the medium. An environment rich in iron promotes the growth of Desulfovibrio Glycosyl'X, molecules but competes with LPS and indirectly modulates the activity of the latter. The increase number of Desulfovibrio leading to increased Glycosyl'X molecules may also modulate positively (by presentation) or negatively (by killing bacteria) the absorption of iron in the intestines which balance is essential for metabolic homeostasis.Furthermore, the growth of Desulfovibrio increasing the production of Hydrogen Sulfide is known for its deleterious effects on the cells. We favor the hypothesis that its action on the separation of epithelial cells favors the passage of different LPS released by the Gram- negative of intestinal flora and even whole cell bacteria into the bloodstream.