Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana M.pdf: 3183755 bytes, checksum: ceaa632c444d6daec2678d0f7fe428db (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / This thesis describes the use of self-assembled monolayers (SAM) for the development of biosensors based on horseradish peroxidase enzyme - HRP. In the first chapter, the enzyme was immobilized on self-assembled monolayers of thiolactic acid (Au-TLA) and mixed SAM composed of 11-mercaptoundecanoic acid (MUA) together with the TLA (SAMmix). The steps of construction and characterization of biosensors have been carried out by electrochemical techniques and morphological ones. The enzyme immobilization method on SAM which provided higher stability was by covalent bond. The Au/TLA/HRP biosensor was used for the determination of H2O2 by chronoamperometry, yielding a detection limit (DL) of 5.46 μmol L-1 and quantification (QL) of 18 μmol L-1. Despite the good results for the H2O2 detection presented by this biosensor, the device was stable for only 6 days. Therefore, in order to increase the stability of the biosensor, SAM containing both the mercaptoundecanoic acid molecule (MUA) and TLA was obtained, to the formation of SAMmix (Au/MUA:TLA). In this system, the electron transfer rate can be considerably affected because while the TLA enables an increase of SAMmix conductivity due to formation of “islands”, the MUA provides greater stability for HRP immobilization, although it partially blocks the surface. The biosensor Au-SAMmix-HRP prepared in the ratio 0.5: 1.0 MUA/TLA showed higher sensitivity compared to other modifications ratio, with an apparent Michaelis-Menten constant = 0.40 mmol L-1. This biosensor has been applied to the determination of hydroquinone (HQ) in the presence of a fixed amount of [H2O2] = 0.3 mmol L-1. By differential pulse voltammetry technique (DPV), the biosensor exhibited excellent electrocatalytic activity for HQ in the range 3-30 μmol L-1, with good sensitivity, DL = 1.26 μmol L-1 and QL = 4.23 μmol L -1. The SAMmix increased the stability of the biosensor for at least 15 days, which is more stable when compared to the biosensor Au/TLA/HRP. In the second chapter of this thesis, another strategy was used for immobilization of the HRP enzyme based on the formation of TLA monolayer on the top of gold nanoparticles (AuNPs) stabilized in the inorganic polymer, 3-n-propylpyridinium silsesquioxane chloride (SiPy+Cl-). The presence of AuNPs-SiPy+Cl- was confirmed by UV-Vis spectroscopy from the plasmon band at 521 nm. The AuNps showed good distribution with approximate size between 4-18 nm, evidenced by transmission electron microscopy (TEM) and by dynamic light scattering (DLS), with good stability (ζ = + 38.5 mV). The AuNPs were deposited on the glassy carbon electrode (GCE) and modified with the TLA for immobilization of HRP enzyme. The formation of this biosensor was confirmed by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and morphologically by field-effect scanning electron microscopy (SEM-FEG). The GCE/AuNPs/TLA/HRP biosensor was used for the detection of H2O2 with = 0.46 mmol L-1, which was similar to the Au-SAMmix-HRP biosensor. This biosensor has been applied to the determination of catechol (CT) in presence of [H2O2] = 0.03 mmol L-1. Using the DPV technique, the biosensor showed an excellent electrocatalytic activity for CT in the range 6-46 μmol L-1, with good sensitivity, DL = 0.852 μmol L-1 and QL = 2.84 μmol L -1. The stability of this device was approximately 25 days, being superior to other biosensors developed (TLA-HRP and SAMmix-HRP), which can be attributed to the three-dimensional immobilization of HRP molecules in this device. / Esta tese descreve a utilização das monocamadas auto-organizadas (SAM) para o desenvolvimento de biossensores enzimáticos a base da enzima horseradish peroxidase – HRP. No primeiro capítulo, diferentes biossensores foram desenvolvidos utilizando a SAM de ácido tioláctico (Au/TLA) e também a SAM mista composta por ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) juntamente com o TLA (SAMmista). As etapas de construção e caracterização dos biossensores foram realizadas pelas técnicas eletroquímicas e também morfológicas. O método de imobilização da enzima sobre a SAM que proporcionou maior estabilidade foi pela ligação covalente. O biossensor Au/TLA/HRP foi utilizado para a detecção do H2O2 por cronoamperometria, obtendo-se um limite de detecção (LD) de 5,46 μmol L-1 e de quantificação (LQ) de 18 μmol L-1. Apesar dos bons resultados na detecção do H2O2 apresentados por este biossensor, o dispositivo foi estável por apenas 6 dias. Portanto, no intuito de aumentar a estabilidade do biossensor utilizou a molécula de ácido mercaptoundecanóico (MUA) juntamente com TLA, para a formação da SAMmista (Au/MUA:TLA). Neste sistema, a velocidade de transferência eletrônica é sensivelmente afetada, pois enquanto o TLA possibilita o aumento da condutividade da SAMmista devido a formação de “ilhas”, o MUA confere maior estabilidade à monocamada para a imobilização da enzima HRP, apesar de bloquear parcialmente a superfície. O biossensor Au/SAMmista/HRP preparado na razão 0,5:1,0 MUA:TLA apresentou a melhor sensibilidade em comparação as outras modificações, com uma constante de Michaelis-Menten aparente, = 0,40 mmol L-1. Este biossensor foi aplicado na detecção da hidroquinona (HQ) na presença de uma quantidade fixa de [H2O2] = 0,3 mmol L-1. Pela técnica de voltametria de pulso diferencial (VPD), o biossensor exibiu uma excelente atividade eletrocatalítica para HQ na faixa de 3 a 30 μmol L-1, com boa sensibilidade, LD = 1,26 μmol L-1 e o LQ = 4,23 μmol L-1. A SAMmista aumentou a estabilidade do biossensor para 15 dias, sendo este mais estável quando comparado ao biossensor Au/TLA/HRP. No segundo capítulo da tese, outra estratégia para a imobilização da enzima HRP sobre o TLA foi realizada a partir de nanopartículas de ouro (AuNps) estabilizadas no cloreto de 3-n-propilpiridínio silsesquioxano (SiPy+Cl-). A presença das AuNps-SiPy+Cl- foi confirmada pela Espectroscopia UV-Vis a partir da banda plasmon em 521 nm, as quais apresentaram boa distribuição com tamanho aproximado entre 4 a 18 nm, constatado pela microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por espalhamento dinâmico de luz (DLS), apresentando boa estabilidade (ζ = + 38,5 mV). As AuNps foram incorporadas sobre o eletrodo de carbono vítreo (ECV) e modificadas com o TLA para imobilização da enzima HRP. A formação deste biossensor foi comprovada pela espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e morfologicamente pela microscopia de varredura de efeito de campo (MEV-FEG). O biossensor ECV/AuNps/TLA/HRP foi utilizado na detecção do H2O2 com = 0,43 mmol L-1, sendo próxima ao biossensor Au-SAMmista-HRP. Este biossensor foi aplicado na detecção do catecol (CT) na presença de [H2O2] = 0,03 mmol L-1. Pela técnica de VPD, o biossensor exibiu uma excelente atividade eletrocatalítica para CT na faixa de 6 a 46 μmol L-1, com boa sensibilidade, LD = 0,852 μmol L-1 e o LQ = 2,84 μmol L-1. A estabilidade deste dispositivo é de 25 dias, sendo superior aos outros biossensores desenvolvidos (TLA/HRP e SAMmista/HRP) devido a imobilização ocorrer tridimensionalmente aumentando a quantidade de moléculas da TLA e HRP no dispositivo.

As doenças cardiovasculares (DCV) são responsáveis pela maioria das mortes ocorridas em todo o mundo. Os riscos para o desenvolvimento destas patologias podem ser amenizados, em parte, por meio de uma dieta rica em alimentos de origem vegetal. Neste sentido, os frutos nativos brasileiros, como os pertencentes à família Myrtaceae, podem contribuir para melhorar a qualidade da alimentação, pois apresentam altos teores de compostos bioativos, entre eles, os fenólicos (CBF). Pouco se sabe sobre os efeitos dos polifenóis destes frutos para redução do risco de desenvolvimento das DCV. Sendo assim, este trabalho buscou avaliar a bioacessibilidade dos CBF presentes em polpas de cambuci e jabuticaba e seus efeitos in vitro sobre mecanismos de ação relacionados às DCV. Para tanto, extratos ricos em polifenóis foram obtidos a partir de extrações em fase sólida (C18 e PA) das polpas de ambos os frutos, submetidas ou não à simulação da digestão gastrointestinal. Estes extratos tiveram seus efeitos inibitórios sobre a atividade da Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA) e a agregação plaquetária induzida por adenosina difosfato avaliados in vitro. De acordo com os resultados obtidos, a digestão in vitro foi capaz de liberar os CBF da matriz alimentar. Tal bioacessibilidade parece ter sido importante apenas para a inibição da agregação plaquetária, uma vez que a capacidade inibitória destes compostos sobre a atividade da ECA não melhorou depois da digestão in vitro. Quanto aos resultados obtidos pelos extratos provenientes das colunas PA e C18, observa-se que as maiores concentrações de taninos nestes últimos não foram suficientes para melhorar a capacidade antiagregante, mas foram importantes para aumentar a inibição da atividade da ECA. Comparando-se as respostas apresentadas pelos dois frutos, os CBF presentes no cambuci exibiram, predominantemente, potenciais anti-hipertensivo e antiagregantedo maiores do que os da jabuticaba. Neste contexto, o consumo de cambuci e jabuticaba, bem como a utilização de seus polifenóis purificados, podem ser adjuvantes para a redução dos riscos relacionados ao desenvolvimento das DCV. / The cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. The risk of development of these disorders can be reduced, partially, by a vegetal-based diet. In this way, the Brazilian native fruits from Myrtaceae family may contribute to improve the diet quality, once they have high quantity of bioactive compounds, such as the phenolic (PC). The knowledge about the cardioprotective effects of consuming these fruit polyphenols is limited, so this study aimed to evaluate the bioaccessibility of the cambuci and jaboticaba PC and their in vitro potential on CVD-related mechanisms. First, gastrointestinal digestion simulation of each fruit pulp was done, and then the polyphenols rich extracts were obtained by solid phase extractions, before and after the pulps digestion. The polyphenols rich extracts had their phenolic concentrations determined and were used to evaluate the capacity of PC in inhibit the Angiotensin Converting Enzyme (ACE) activity and the platelet aggregation induced by ADP. The results were expressed as IC50, considering the total phenolic content per milliliter of reaction. According to the results, the in vitro digestion process was able to release the polyphenols from the food matrix. Therefore, the bioaccessibility had no significant effect on ACE activity, but decreased the IC50 values of platelet aggregation. In relation to the extracts from PA and C18 columns, the higher tannin concentration In comparison to the IC50 values presented by PA extracts, the higher concentrations of tannins in the last one were not enough to improve the antiaggregant effect, but were important to increase the inhibition of ACE activity. Cambuci polyphenols presented higher antihypertensive and antiaggregant potentials than the jaboticaba compounds. In this respect, the ingestion of cambuci and jaboticaba and the use of their purified polyphenols can be of particular importance in reducing the risk for the CVD development.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

Na África subsaariana, as serpentes do gênero Bitis são de extrema importância, pois suas vítimas apresentam sintomas como dano local, hemorragia e uma severa hipotensão. Este trabalho identificou moléculas capazes de inibir a atividade da enzima conversora de angiotensina I (ECA) presentes no veneno de quatro serpentes do gênero Bitis. Para isto, as porções de baixa massa molecular desses 4 venenos foram fracionadas em RP-HPLC e as frações com boa inibição sobre a atividade da ECA foram analisadas por espectrometria de massas. Foram identificados 34 oligopeptídeos ricos em prolina (PRO), sendo 8 sintetizados e suas constantes de inibição (Ki) determinadas. Em testes com substratos naturais da ECA, angiotensina I e bradicinina, foi constatada a maior inibição da hidrólise da angiotensina I por quatro PROs. Todos os PROs in vivo reduziram a pressão arterial, e seis deles aumentaram a frequência cardíaca em ratos Wistar. Com isto, conclui-se que existem toxinas no veneno de serpentes do gênero Bitis responsáveis pela hipotensão. / In the sub-saharian Africa, snakes from the Bitis genus are of extreme medical importance, since its victims show symptoms as local tissue damage, hemorrhage and a severe hypotension. This work identified molecules that inhibit the angiotensin I converting enzyme (ACE) in the venom of 4 snakes from the Bitis genus. The low molecular portions of the venom of these snakes were fractionated in RP-HPLC and the fractions that efficiently inhibited the ACE activity were analyzed by mass spectrometry. 34 proline-rich oligopeptides were identified, 8 of them synthesized and had their inhibition constants (Ki) determined. In tests using natural substrates of ACE, angiotensin I and bradykinin, the angiotensin I hydrolysis were better inhibited by four PROs. In vivo tests results showed that all PROs decreased the mean arterial pressure and six of them increased the heart rate. Therefore, we can conclude that there are toxins present in the venom of Bitis capable of cause hypotension.

A conversão enzimática da sacarose pela ação sucessiva da invertase e da glicose oxidase (GOD), permite obter produtos de maior valor agregado, a saber, frutose e o ácido glicônico, dois produtos de amplo uso na indústria farmacêutica, alimentícia e química. Foi estudada a aplicação da invertase imobilizada em resinas aniônicas do tipo Dowex® (um copolímero de poliestireno-divinilbenzeno) sobre a hidrólise da sacarose bem como a oxidação da glicose pela glicose oxidase solúvel ou imobilizada no mesmo suporte em separado (sistema bifásico), utilizando-se um reator de membrana acoplado à membrana de ultrafiltração (100kDa) ou de microfiltração (5µm). Posteriormente, avaliou-se o desempenho de ambas as formas de enzimas, solúveis ou imobilizadas num sistema monofásico empregando o mesmo reator. A bioconversão executada em sistema bifásico permitiu a obtenção de xarope de frutose da ordem de 70% através da separação de glicose e frutose utilizando-se a resina catiônica 50W:8-100. O rendimento de 96,6% e 67,4% para as formas solúveis e imobilizadas respectivamente foram obtidas em sistema monofásico. O não desprendimento das enzimas dos suportes viabilizou o uso da membrana de microfiltração, trazendo vantagens à operação de biorreator com membrana. / The enzymatic conversion of sucrose through a successive action of invertase and glucose oxidase (GOO) allows the obtainment of products with higher commercial value, fructose and gluconic acid, which are widely used in pharmaceutical, food and chemical industries. Invertase and GOO immobilized on Dowex® anionic resin (a polystyrene divinylbenzene copolymer) as well as soluble GOD were used in a membrane bioreactor (MS) for sucrose hydrolysis and glucose oxidation. The MB was coupled with a UF-membrane (100kDa) or a MF-membrane (5µm). The bioconversion was conducted in two steps (biphasic system) as well as in one step (monophasic system). The bioconversion operated in a biphasic system permitted obtaining a fructose syrup with a concentration of about 70% through a separation of glucose and fructose using a cationic resin, 50W:8-100. As for the monophasic system, the yield of 96.6% and 67.4% for soluble and immobilized forms were attained respectively. No leakage of the enzymes from the support allowed the use of a microfiltration membrane, adding advantages to the membrane bioreactor operation.

Submitted by Marilene Donadel (marilene.donadel@unioeste.br) on 2017-08-11T14:43:57Z No. of bitstreams: 2 Andriele Magarinos Focking 2017.pdf: 2481446 bytes, checksum: 763f767d058face92edaaa394dc5b780 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-11T14:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Andriele Magarinos Focking 2017.pdf: 2481446 bytes, checksum: 763f767d058face92edaaa394dc5b780 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-09 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The utilization of biodiesel as a substitute for diesel oil is one of the alternatives that aims to minimize the utilization of non-renewable fuels (petroleum) in the world energy matrix. Worldwide, biodiesel production occurs through the transesterification process. In Brazil, the most commonly used raw material for this purpose is soybean oil. A new way that has been promising for the biodiesel production is the Hidroesterification process. With that, the present work a imed to evaluate the soy oil enzymatic hydrolysis, using the comercial enzyme Lipozyme TL IM as the catalyst of the reaction. Was performed hydrolysis test of soy oil in closed and batch system, based on two experimental plannings (Placket-Burmann ad DCCR), to evaluate the effects of the variables involved in the process(pH; temperature; molar fraction water/oil; stirrings peed of the batch reactor and mass fraction enzyme/substrate). Since that, was perfomed kinetic studies with different conditions of molar fraction water/oil and different dosages of catalyst, as well as the utilization of a tip ultrasonic and a chemical agent to evaluateit’s effects on the kinetic of the reaction. To describe the kinetic of enzymatic hydrolysis of soy oil, was used a mathematical model based on the Michaelis-Menten kinetic. The results of experimental planningsindicatedthattheaciditylevelswerefavoredwhenthetemperatureof 52,2ºC, pH 6.1, stirring speed 150 rpm and molar fraction water/oil 37,7:1, getting 82,4% in the value of acidity level. The kinetic studies showed that the utilization of the probe ultrasonic did not accelerated the velocity of the enzymatic hydrolysis reaction. The kinetic involving the utilization of the chemical agent suffered a high decrease in the velocity of reaction, showing that this would be a inhibitor of enzymatic activity of Lipozyme TL IM. By the mathematical model, was verified that the model described well the experimental datas, as well made able the visualization of others components concentration (triacylglycerols, diacylglycerols, monoacylglycerols, glycerol, free fatty acids and water). It is believed that the values of the constants of the reaction velocity obtained in the model has more physical meaning and could be used to conducting the simulations in anothers conditions. / A utilização do biodiesel como substituto do óleo diesel é uma das alternativas que visa minimizar a utilização de combustíveis não renováveis (petróleo) na matriz energética mundial.Mundialmente, a produção de biodiesel ocorre pelo processo de transesterificação. No Brasil, a matéria-prima mais utilizada para esta finalidade é o óleo de soja. Uma nova rota que se mostra promissora para a produção de biodiesel é o processo de hidroesterificação. Desta maneira, o presente trabalho objetivou avaliar a hidrólise enzimática do óleo de soja, utilizando a enzima comercial Lipozyme TL IM como catalisador da reação. Foram realizados ensaios de hidrólise do óleo de soja em sistema fechado e batelada, baseados em dois planejamentos experimentais (Placket-Burmann e DCCR), visando avaliar os efeitos das variáveis envolvidas no processo (pH; temperatura; razão molar água/óleo; velocidade de agitação no reator batelada e razão mássica enzima/substrato). A partir disto, foram realizados estudos cinéticos com diferentes condições de razão molar água/óleo e diferentes dosagens de catalisador, bem como a utilização de ultrassom de ponta e um agente químico visando avaliar seus efeitos na cinética da reação. Para descrever a cinética da hidrólise enzimática do óleo de soja foi utilizado um modelo matemático baseado na cinética de Michaelis-Menten. Os resultados dos planejamentos experimentais indicaram que o índice de acidez foi favorecido quando temperatura de 52,2ºC, pH 6,1, velocidade de agitação de 150 rpm e razão molar água/óleo 37,7:1, obtendo 82,4% no valor do índice de acidez. Os estudos cinéticos demonstraram que a utilização do ultrassom de sonda não acelerou a velocidade da reação de hidrólise 13 enzimática. A cinética envolvendo a utilização de agente químico sofreu um alto decaimento na velocidade da reação, demonstrando que este seria um inibidor da atividade enzimática da Lipozyme TL IM. Pela modelagem matemática verificou-se que o modelo descreveu bem os dados experimentais, bem como possibilitou a visualização da concentração dos demais componentes (triacilgliceróis, diacilgliceróis, monoacilgliceróis, glicerol,ácidos graxos livreeágua). Acredita-se que os valores das constantes da velocidade de reação obtidos no modelo tenham maior significado físico e possam ser utilizados para realização de simulações em outras condições.

Se ha desarrollado un nuevo método de inmovilización de tirosinasa de champiñón, basado en la adsorción de esta enzima a un éster cinámico de un carbohidrato fotoentrecruzado, con muy buenos resultados. Se han obtenido inmovilizados de tirosinasa directamente a partir de extractos de champiñón. Se han estudiado los parámetros que afectan a la inmovilización (pH, tiempo y concentración de enzima), las características de tirosinasa inmovilizada (cantidad de enzima inmovilizada, actividad enzimática, pH y temperatura óptimos de reacción, estabilidad térmica, operacional y al almacenado), las propiedades cinéticas (constante de Michaelis, velocidad máxima y constante catalítica) de tirosinasa inmovilizada sobre distintos soportes al actuar sobre diversos sustratos y la estereoespecificidad de tirosinasa inmovilizada sobre un soporte quiral y otro no quiral respecto a los isómeros L y D y racémicos. Los conocimientos adquiridos se han aplicado con éxito a la producción de diversos o-difenoles como L-dopa, a partir de sus correspondientes monofenoles. / A new mushroom tyrosinase immobilization method consisting of tyrosinase adsorption on a photocrosslinked cinnamic carbohydrate ester has been developed with very good results. Immobilized tyrosinase was obtained directly from a mushroom extract. We studied the parameters affecting the immobilization process (pH, time and enzyme concentration), the properties of immobilized tyrosinase (quantity of immobilized enzyme, enzymatic activity, optimum pH and reaction temperature; thermal, operational and storage stability), kinetic properties (Michaelis constant, maximum steady-state rate and catalytic constant) of tyrosinase immobilized on several supports and acting over several substrates, and tyrosinase stereospecificity immobilized on a chiral and a nonchiral support acting on L and D isomers and racemics. The knowledge acquired was used to successfully produce several o-diphenols, such as L-dopa, from the corresponding monophenols.

Vinte e um isolados de Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc), provenientes de cinco municípios do RS, foram cultivados em meio de cultura CYE (casitone, 1; extrato de levedura, 0,35; glicerol, 2; ágar, 15 g/1), com zero, 16, 32, 40, 48 , 64 , 80 , 96 , 112 e 128x10-2 nM de CuS04. A concentração mínima inibitória (CMI) de CuS04 foi de 40x10-2 nM para todos os isolados. O clone pCuR2.A de X. campestris pv. vesicatoria, associado com resistência ao cobre, foi utilizado como sonda para detecção de homologia com o ADN total de Xcc. Não houve hibridização com o ADN total de nenhum dos 21 isolados. Quando o ADN plasmidial de 16 isolados foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI, fragmentos, variando de 9 a 10 kb e 4 a 5 kb, respectivamente, foram detectados com maior frequência. Os plasmídeos apresentaram grande polimorfismo, porém a análise de grupos hierárquicos indicou a formação de pelo menos três grupos distintos. O uso de perfis de restrição para identificação de Xcc dependerá da escolha de perfis realmente representativos de cada grupo para viabilizar comparações. A relação entre a virulência de Xcc com o perfil de restrição plasmidial não foi confirmada. / Twenty one isolates of Xanthomonas campestris pv. citri (Xcc ), from five counties of RS, were grown on CYE (casitone, 1; yeast extract, 0. 35; glycerol, 2; agar 15 g per liter ) culture amended with zero, 16, 32, 40, 48, 64, 80, 96, 112 and 128x10-2 mM CuS04. The CuS04 minimum inhibitory concentration (CMI) was 40x10-2 mM to all isolates . The pCuR2.A clone of X. campestris pv. vesicatoria, associated with copper resistance, was used as a probe to detect homology with total DNA of Xcc. No hibridization with DNA of the 21 isolates was found. When hybridization with total DNA of 16 isolates was digested with Hind III and Bam HI restriction enzymes, fragments, ranging from 9 to 10 kb and 4 to 5 kb, respectively, were detected more frequently. There was great polymorphism among plasmids, and the a nalysis of hierarquical groups showed at least three distinct groups. The use of DNA restriction profile to ide ntify Xcc depends on a representative profile of each group to allow comparinsons. The relationship betweem virulence of Xcc and the plasmid DNA restriction profile was not confirmed.

O sistema renina-angiotensina e o estresse oxidativo têm participação importante na fisiopatologia das complicações crônicas do diabetes. No presente estudo, foram avaliados 103 pacientes com diabetes tipo 1 (DM1) com idade de 28,810,6 anos e duração de doença de 13,18,5 anos e 158 controles não diabéticos quanto à presença dos polimorfismos I/D da ECA e C242T do p22phox, componente essencial para a ativação da NADPH oxidase. Esta análise foi realizada por reação de polimerase em cadeia para ambos os polimorfismos, seguida de restrição enzimática para avaliação do polimorfismo C242T p22phox. Ambas as distribuições genotípicas obedeciam ao princípio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os pacientes diabéticos foram submetidos a avaliação clínica e laboratorial quanto à presença de fatores associados ao risco de complicações (história de tabagismo e antecedentes familiares de diabetes tipo 2, dose diária de insulina, níveis pressóricos, índice de massa corporal, relação cintura-quadril, excreção urinária de albumina, taxa de filtração glomerular, perfil lipídico, controle glicêmico, níveis de proteína C-reativa) e rastreados quanto à presença de nefropatia diabética, considerada presença de micro ou macroalbuminúria; retinopatia diabética não proliferativa ou proliferativa e hipertensão arterial. Não houve diferença significativa entre a presença dos alelos D e I da ECA ou C e T do p22phox entre diabéticos e controles. Os polimorfismos avaliados não apresentaram associação com a presença de nefropatia, retinopatia ou hipertensão arterial. Pacientes portadores do alelo D apresentaram maiores níveis de pressão arterial diastólica (72,2 12,3 vs 65,4 11,6 mmHg , p=0,047) e proteína C-reativa comparados aos portadores do genótipo II [0,18 (0,04-0,38) vs 0,09 (0,04-0,16) mg/dl, p=0,05] , porém ambas as análises perderam significância estatística após correção para duração do diabetes. A combinação dos polimorfismos não esteve associada à presença de complicações microvasculares ou hipertensão arterial. Concluímos que, na população de diabéticos tipo 1 estudada, a frequência dos polimorfismos I/D da ECA e C242T do p22phox , isoladamente ou em combinação, não apresentou diferença em pacientes com ou sem complicações microvasculares precoces ou hipertensão arterial. Os níveis dos diferentes marcadores de risco cardiovascular também não apresentaram diferença nos pacientes com os polimorfismos acima descritos. Entretanto, estudos prospectivos poderão determinar a possível interação entre estes polimorfismos e a duração do diabetes na expressão clínica das complicações crônicas da doença. / The renin-angiotensin system and the oxidative stress play an important role in the pathogenesis of the diabetic complications.In the present study 103 patients with type 1 diabetes (T1DM) aged 28.8 10.6 years and with a disease duration of 13.1 8.5 years and 158 non-diabetic controls were evaluated for the presence of the I / D polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) and the C242T polymorphism of the p22phox, an essential component for NADPH oxidase activation. The analysis was performed using polymerase chain reaction for both polymorphisms, followed by enzymatic restriction for C242T p22phox polymorphism. Genotypic distributions of both polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium. Diabetic patients underwent clinical and laboratory evaluation for the presence of risk factors associated with complications of diabetes (smoking and family history of type 2 diabetes, daily insulin dose, blood pressure, body mass index, waist hip ratio, urinary albumin excretion, glomerular filtration rate, lipid profile, glycemic control, C-reactive protein levels) and screened for the presence of diabetic nephropathy, considered as the presence of micro or macroalbuminuria, diabetic retinopathy and hypertension. There was no significant difference between the presence of ACE D or I allele and p22phox C or T allele between diabetic patients and controls. The evaluated polymorphisms were not associated with the presence of nephropathy, retinopathy or hypertension. Patients with the D allele showed higher levels of diastolic blood pressure (72.2 12.3 vs 65.4 11.6 mmHg, p = 0.047) and C-reactive protein compared with those carrying the II genotype [0.18 (0.04-0.38) vs 0.09 (0.04-0.16) mg/dl, p = 0.05], but both analysis lost statistical significance after correction for duration of diabetes. The combination of both polymorphisms was not associated with microvascular complications or hypertension. We conclude that in the studied population of type 1 diabetic patients, the frequency of ACE I / D and C242T of p22phox polymorphisms, alone or in combination, was not different in patients with or without early microvascular complications or hypertension. Also, the levels of different markers of cardiovascular risk did not differ for patients with the polymorphisms described above. However, prospective studies may determine the possible interaction between these polymorphisms and duration of diabetes in the clinical expression of chronic complications of diabetes.