INTRODUÇÃO: A hipertensão renovascular (HRV) decorrente da estenose de artéria renal (EAR) é uma patologia potencialmente curável, mas os benefícios da revascularização não são alcançados por todos porque selecionar pacientes com base nos critérios clínicos ou angiográficos pode não ser suficiente para se obter o sucesso clínico. Existe um grande interesse em se desenvolver exames para detectar a presença de EAR e avaliar seu significado funcional. OBJETIVOS: avaliar se a redução da Taxa de Filtração Glomerular (TFG) medida com EDTA-51Cr após o uso de captopril consegue diferenciar pacientes hipertensos com EAR daqueles sem estenose da artéria e avaliar se existe correlação entre as variações da TFG e a evolução de pacientes submetidos a diferentes tratamentos. MÉTODOS: Foram estudados 41 pacientes com hipertensão arterial de difícil controle que foram divididos em dois grupos: GP: 21 pacientes com EAR e GH: 20 pacientes sem EAR. Os pacientes foram submetidos à medida de TFG com EDTA-51Cr pré e após a administração do captopril. Os pacientes do GP realizaram simultaneamente cintilografia com DMSA-99mTc para avaliação da função renal diferencial. Os pacientes com estenose de artéria renal foram subdivididos de acordo com o tratamento recebido: clínico (GP-CL) ou por intervenção (GP-I). As medidas das TFGs antes e após o captopril foram comparadas entre os grupos. Foi também, investigado se a relação pré/pós captopril tinha correlação com a resposta clínica dos pacientes. RESULTADOS: a média da TFG (ml/min./1,73m2) no total de pacientes estudados, foi de 56,7±26,5 na fase pré-captopril e 47,0±24,4 após o captopril. A modificação da TFG determinada pelo captopril,foi avaliada pela relação da filtração glomerular pré/pós-captopril. A média da relação TFG pré/pós-captopril foi 1,36 ±0,54 no grupo total de pacientes e quando foi feita a comparação entre a TFG pré e pós-captopril, houve uma redução significativa (p= 0,016). O GH mostrou relação média da TFG pré/pós-captopril de 1,13, valor significativamente menor que o GP que teve a relação média de 1,57 (p= 0,007). Quando foi avaliada a variação da TFG após o captopril nos dois grupos não foi observada diferença estatisticamente significativa no GH (p=0,68), mas observou-se diferença significativa no GP (p<0,001). No total, 15 pacientes apresentaram melhora dos seus níveis pressóricos, sendo oito do grupo de intervenção e sete do grupo clinico, não havendo diferença estatisticamente significativa em relação à melhora clínica entre os dois grupos (p=0,36). Quando comparamos os pacientes com e sem melhora clínica não se observou diferença significativa na TFG basal (p=0,09) ou na relação TFG pré/pós-captopril (p=0,74). A função renal diferencial obtida pelo DMSA-99mTc pré e pós captopril não mostrou diferença estatisticamente significativa nos rins com e sem estenose, (p=0.09). CONCLUSÃO: O captopril acarreta uma redução significativa da TFG e esta redução é mais acentuada em pacientes com EAR, mas não houve correlação entre as mediadas da TFG e a evolução clínica dos pacientes / INTRODUCTION: Renovascular hypertension (RVH) resulting from renal artery stenosis (RAS) is a potential curable pathology, but the revascularization benefits are not reached among all patients because selecting patients on the basis of clinical and angiographic criteria may not be sufficient to achieve clinical success. There has been increasing interest in developing screening tests capable of accurately detecting the presence of RAS and also of evaluating its functional consequences PURPOSE: the purpose of this study was to evaluate if captopril induced changes in 51Cr-EDTA clearance could be used to differentiate between hypertensive patients with and without renal artery stenosis and to investigate if there was a correlation between these changes and patients clinical response to therapy. METHODS: 41 patients with poor-controlled severe hypertension were studied. Patients were divided into two groups: GP=patients with renal artery stenosis (n=21), and GH=patients without renal artery stenosis (n=20). They were submitted to a Glomerular Filtration Rate (GFR) measurement with EDTA-51Cr pre and post captopril administration. The GP patients were submitted simultaneously to 99mTc-DMSA scintigraphies to estimate individual renal function. GP patients were further subdivided according to the treatment strategy: optimization of clinical treatment (GP-Cl) and interventional procedures (GP-I). The GFRs before and after captopril administration were compared between the groups. It was also investigated if baseline to post-captopril GFR ratio had a correlation to clinical response of patients. RESULTS: The GFR average (ml/min./1,73m2) on the total patients, was 56,7±26,5 on pre-captopril phase and 47,0±24,4 post captopril. The GFR alteration determinated by captopril was evaluated by Baseline/post-captopril GFR ratio. Baseline/post-captopril GFR mean ratio was 1,36 in total patients and the GFR had a significant decrease after captopril administration (p value 0.016). Baseline/post-captopril GFR mean ratio in GH was 1.13, value significantly lower than the GP which had the average relation of 1,57 (p= 0,007). When GFR pre and post-captopril was compared among the two groups separately, there was no significantly difference on the GH (p=0,68), but a expressive difference was observed on GP (p<0,001). 15 patients had a clinical response to the treatment. Clinical response was observed in 8/10 patients from GP-I and 7/11 from GP-Cl and there was not observed a significantly difference between the two groups (p=0,36). Comparing the groups with or without clinical improvement there was not a significantly difference on the GRF baseline (p=0,09) or on or baseline/post-captopril ratio (p=0,74). When evaluating the differential renal function obtained by pre and post-captopril DMSA-99mTc, significantly difference was not observed (p=0.09) for the kidneys with or without stenosis. CONCLUSION: captopril induced a decrease in GFR of hypertensive patients and it is more pronounced in patients with renal artery stenosis, but no correlation was observed between captopril induced decrease in GFR and clinical response of patients submitted to interventional or clinical treatment

Este trabalho teve por objetivo a preparação e caracterização de membranas de polissulfona (PSU) e a imobilização da enzima lipase nestes filmes, para a produção de membranas enantiosseletivas, visando utilização futura em separação de misturas quirais. Membranas de PSU foram preparadas pelo processo de inversão de fase, utilizando clorofórmio como solvente e água como agente coagulante para a inversão. Foram preparadas membranas com diferentes espessuras e os seguintes parâmetros para a inversão de fase foram definidos: concentração das soluções, tempo de evaporação do solvente, secagem e tratamento térmico. As membranas foram caracterizadas, visando a utilização em processo de eletrodiálise (ED) e imobilização da enzima lipase PS. Para a imobilização foi utilizado o glutaraldeído como agente bifuncional para ligação da enzima ao polímero. Na imobilização foram determinados os parâmetros cinéticos velocidade máxima (Vmáx) e constante de Michaelis-Menten (Km), a quantidade de enzima imobilizada nas membranas pelo método de Bradford e a atividade da enzima livre e imobilizada através da hidrólise do acetato de p-nitrofenila (PNPA). As membranas de PSU preparadas por inversão são hidrofóbicas, e apresentaram características de permesseletividade e capacidade de troca iônica inferiores às apresentadas pelas membranas comerciais Selemion®; CMT e CMV e resistência elétrica superior à destas membranas. O diâmetro dos poros nas membranas é menor que 100 nm. . A quantidade máxima de enzima imobilizada foi de 2,35 mg .g-1 de polímero em 18 horas de imobilização com um rendimento de 61,2%. A atividade da enzima decai após a imobilização, de 14780 U.g-1 (enzima livre) para 1184 U.g-1 (enzima imobilizada). / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-13T17:21:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jadison Fabricio de Souza.pdf: 3168334 bytes, checksum: ec62af877268ce2e7d357db5c8c5e372 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-13T17:21:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jadison Fabricio de Souza.pdf: 3168334 bytes, checksum: ec62af877268ce2e7d357db5c8c5e372 (MD5) / Preparation and characterization of polysulfone (PSU) membranes and the immobilization of lipase enzyme in these membranes to produce enantioselective membranes, in order to separate chiral compounds, is the subject of the present work. PSU membranes were prepared by phase inversion, using chloroform as solvent and water as nonsolvent. Membranes with different thickness were prepared and phase inversion parameters such as (solution concentrations, solvent evaporation time, drying and thermal treatment) were investigated. Membranes were characterized, in order to use them in electrodialysis process (ED) and in the lipase PS enzyme immobilization. For immobilization, bifunctional agent glutaraldehyde was used to link the enzyme to the polymer. On immobilization, the kinetic constants (Km e Vmax), the amount of immobilized enzyme with Bradford method and the activity of free and immobilized enzyme with p-nitrophenyl acetate (PNPA) hydrolysis, were determined. PSU membranes prepared by phase inversion are hydrophobic and, when compared with Selemion®; CMT and CMV commercial membranes, present lower permeselectivity, lower ion exchange capability and higher resistance. Membranes pore diameter is lower than 100 nm. The maximum amount of immobilized enzyme in the membranes reached 2.35 mg per gram of polymer after 18 hours of immobilization with a 61,2% yield . Enzyme activity decays after immobilization , from 14780 U.g-1 (free enzyme) to 1184 U.g-1 (immobilized enzyme).

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PabloCS.pdf: 513122 bytes, checksum: 78dbc24a28ad9d22efb06ffdb7409a3f (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / A ?-D-N-acetilglucosaminidase extracted and partially isolated from crustacean Artemia franciscana by ammonium sulfate precipitation and filtration gel chromatography Bio Gel A 1.5m. the enzyme was immobilized on ferromagnetic Dacron yielding a insoluble active derivative with 5.0 units/mg protein and 10.35% of the soluble enzyme activity. ?-D-N-acetilglucosaminidase-ferromagnetic Dacron was easily removed from the reaction mixture by a magnetic field, it was reused for ten times without loss in its activity. The ferromagnetic Dacron was better activated at pH 5.0. The particles visualized at scanning electron microscope (SEM) had presented different sizes, varying between 721nm and 100?m. Infra red confirmed immobilization on support, as showed by primary amino peaks at 1640 and 1560 cm-1 . The immobilize enzyme presented Km of 2.32 ? 0.48 mM and optimum temperature of 50?C. Bought presented the same thermal stable of the soluble enzyme and larger enzymatic activity at pH 5.5. ?-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagn?tico showed sensible for some ?ons as the silver (AgNO3), with loss of activity. The ?-D-N acetilglucosaminidase activity for mercury chloride (HgCl2), whom is one of the most toxic substance joined in nature, it was presented activity already diminished at 0,01mM and lost total activity at 4mM, indicating sensitivity for this type of metal. ?-D-N-acetilglucosaminidase-ferromagnetic Dacron showed degradative capacity on heparan sulfate, the enzyme still demonstrated degradative capacity on heparan sulphate, suggesting a possible application to produce fractions of this glycosaminoglycan / A ?-D-N-acetilglucosaminidase, extra?da e parcialmente isolada do crust?ceo Artemia franciscana atrav?s de precipita??o com sulfato de am?nio e cromatografia em gel filtra??o Bio Gel A 1.5m foi imobilizada em Dacron ferromagn?tico rendendo um derivado insol?vel ativo contendo 5,0 unid/mg de prote?na e retendo 10,35% da atividade da enzima sol?vel. A ?-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagn?tico foi facilmente removida do meio reacional com o aux?lio de um campo magn?tico e p?de ser reutilizada por dez vezes seguidas sem perda de atividade. O Dacron ferromagn?tico foi melhor ativado a pH 5,0 As part?culas visualizadas no microsc?pio eletr?nico de varredura (MEV) apresentaram diferentes tamanhos, variando entre 721nm e 100?m. O infra vermelho confirmou a imobiliza??o ao suporte, quando exibiu os picos de aminas prim?rias a 1640 e 1560 cm-1 . A enzima imobilizada apresentou Km aparente de 2,32 ? 0,48 mM e atividade ?tima a temperatura de 50?C. Ambos apresentaram praticamente a mesma estabilidade t?rmica da enzima sol?vel e maior atividade enzim?tica no pH 5,5. A ?-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagn?tico apresentou-se sens?vel a alguns ?ons como a prata (AgNO3), demonstrando perda de atividade. A atividade ?-D-N-acetilglucosaminidasica para cloreto de merc?rio (HgCl2), que ? uma das subst?ncias mais t?xicas encontradas na natureza, apresentou-se diminu?da j? a 0,01mM e perdeu a atividade total a 4mM, indicando sensibilidade a esse tipo de metal. A enzima ainda demonstrou capacidade degradativa sobre o heparan sulfato, sugerindo uma poss?vel aplica??o para produzir fragmentos desse glicosaminoglicano

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O oxigênio é importante não só por sua participação no metabolismo energético, mas também por sua conversão em derivados parcialmente reduzidos, as espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO participam de funções importantes em diversas vias do metabolismo, entretanto, em concentrações desequilibradamente elevadas deflagram a peroxidação lipídica, processo deletério que forma aldeídos tóxicos, como o 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE). A manutenção de concentrações não deletérias das ERO é realizada por moléculas componentes do sistema antioxidante. Peixes podem ser expostos a grandes variações das concentrações de oxigênio, o que provoca ciclos oxidantes. A maioria dos estudos usa fígado e rim para avaliar estresse oxidante por meio de ensaios das atividades antioxidantes, o que requer o sacrifício dos animais. Contudo, o sangue sofre efeitos das ERO e avaliações no sangue podem permitir o estudo de antioxidantes no mesmo animal, sem a necessidade de sacrifício. Em consequência, foram nossos objetivos estabelecer uma técnica de cateterismo branquial em peixes, a padronização dos ensaios e a avaliação em sangue de componentes do sistema antioxidante de duas espécies de teleósteos em diferentes tensões de oxigênio. Pacus e tilápias foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1 e em hipoxia a 0,5 mg de O2.L-1 por 42 horas . Para os ensaios de hiperoxia os animais foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1, depois de 6 horas em 9,5 mg de O2.L-1 e depois de 30 horas de recuperação a 6,0 mg de O2.L-1. A utilização de materiais para o cateterismo de humanos permitiu a implantação de um acesso branquial. Infelizmente, houve formação de trombo após 24 horas. Mesmo assim, a observação de fluxo sanguíneo no interior da cânula e a sobrevida dos animais testados, confirmam a viabilidade da técnica. Verificamos em sangue uma maior atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) sobre o 4-HNE em relação ao 1-cloro-2-dinitrobenzeno (CDNB). Isto reflete a importância de avaliações de atividade de enzimas, como a GST, sobre substratos endógenos. As respostas enzimáticas de tilápias mostraram-se mais sensíveis que as dos pacus quando comparadas em diferentes tensões de oxigênio. / Oxygen is important not only for their role in energy metabolism, but also for its conversion into partially reduced derivatives, the reactive oxygen species (ROS). ROS participate in important roles in several metabolic pathways, however, at concentrations lopsidedly high they trigger lipid peroxidation process to form deleterious toxic aldehydes such as 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE). Maintenance of non deleterious concentrations of ROS molecules is performed by components of the antioxidant system. Fish may be exposed to large variations in the concentrations of oxygen, which causes oxidative cycles. Most studies use liver and kidney to assess oxidative stress through antioxidant activities assay, which requires the sacrifice of animals. However, the blood undergoes effects of ROS and evaluations in blood may allow the study of antioxidants in the same animal, without the need of sacrifice. Consequently, our objectives were to establish a catheterization technique in fish gill, standardization of testing and evaluation of components of blood antioxidant system of two species of teleost in various oxygen tensions. Pacus and tilapias were evaluated at 6.0 mg O2.L-1 hypoxia and 0.5 mg O2.L-1 for 42 hours. For assays of hyperoxia animals were evaluated at 6.0 mg O2.L-1, after 6 hours at 9.5 mg O2.L-1 and after 30 hours recovery at 6.0 mg O2.L-1. The use of materials of human catheterization allowed the implantation of a gill access. Unfortunately, there was thrombus formation after 24 hours. Nevertheless, the observation of blood flow within the cannula and survival of the animals tested, confirm the viability of the technique. We found blood in a higher activity of glutathione S-transferase (GST) on the 4-HNE compared to 1-chloro-2-dinitrobenzene (CDNB). This reflects the importance of assessing the activity of enzymes, such as GST with endogenous substrates. The enzymatic responses of tilapia were more sensitive than those of pacus when compared to different oxygen tensions.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Herbicides inhibitors of the enzyme acetohydroxyacid synthase (AHAS) present high efficiency in the inhibitory activity with low doses of application and low toxicity for man and the environment. However, several weeds are getting resistence to some classes of herbicides, mainly in the case of AHAS group. Therefore, a proper computational planning of new bioactive compounds is crucial area to model new herbicides. In this study, the enzyme-herbicide interactions were analyzed from the analogous derivated of the pyrimidinylsalicylates group (PSA) which are AHAS inhibitors using quantum- mechanical and molecular docking calculations. The molecular properties obtained after running computer calculation shown that the volume and molecular area can make influence on the inhibition capacity of the ligand, neverthenless, the substituent group has more influence on this parameter. Electronical properties from the HOMO orbitals can certanly make influence on the biological activity due its electron donor capability. The binding free energies of the ligand on the enzyme after docking calculation ranged from - 1.88 to 4.50 kcal mol- 1 , whereas, H, CH3, COCH3 , OH, NO2 and NH2 had the best scored binding energies as substituent groups. Those favorable binding free energies can be justified by the intermolecular interactions between PSAs ligands and AHAS active site residues. In terms of effiency, hydrogen bonds formation can be explained by carboxylate group from the ligands and ARG-377 group from AHAS. / Os herbicidas inibidores da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS) apresentam alta eficiência na atividade inibitória com baixas doses de aplicação com baixa toxicidade para o homem e o meio ambiente. No entanto, várias ervas daninhas estão obtendo resistência a algumas classes de herbicidas, principalmente no caso do grupo AHAS. Portanto, um planejamento computacional adequado de novos compostos bioativos é área crucial para modelar novos herbicidas. Neste estudo, as interações enzima-herbicida foram analisadas a partir do derivado análogo do grupo pirimidinilsalicilato (PSA) que são inibidores de AHAS usando cálculos mecânicoquânticos e de docking molecular. As propriedades moleculares obtidas mostraram que o volume e a área molecular podem influenciar a capacidade de inibição do ligante, mesmo que o grupo substituinte tenha mais influência sobre este parâmetro. As propriedades eletrônicas dos orbitais HOMO podem certamente influenciar a atividade biológica devido à sua capacidade de doação de elétrons. As energias livres de ligação do ligante na enzima após o cálculo de docking variaram de -1,88 a - 4,50 kcal mol- 1 , enquanto que H, CH3, COCH3, OH, NO2 e NH2 apresentaram as melhores energias de ligação pontuadas como grupos substituintes. Estas energias livres de ligação favoráveis podem ser justificadas pelas interações intermoleculares entre ligantes de PSAs e resíduos de sítio ativo de AHAS. Em termos de eficiência, a formação de ligações de hidrogênio pode ser explicada pelo grupo carboxilato partir dos ligantes e do grupo ARG-377 de AHAS. / Dissertação (Mestrado)

Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

O sistema renina-angiotensina (SRA) circulante é um sistema endócrino que promove a produção de angiotensina (Ang) II, a qual exerce seus efeitos pela interação com receptores específicos. O conceito clássico do SRA circulante está sendo modificado, pois tem sido demonstrada a existência de sistemas locais capazes de gerar angiotensinas de forma independente do SRA circulante em vários tecidos e órgãos. Trabalhos recentes sugerem a existência de alguns componentes do SRA em tecido gengival e fibroblastos gengivais de diferentes espécies. Porém, não são encontrados na literatura achados inequívocos sobre a presença de importantes componentes do SRA, tais como renina e angiotensinogênio, no tecido gengival de rato. Portanto, os objetivos do presente trabalho foram: 1) estudar a expressão e localização de componentes do SRA no tecido gengival de rato e 2) estudar in vitro a funcionalidade do SRA local em homogenato de tecido gengival de rato quanto à formação de Ang II e outros peptídeos vasoativos a partir de precursores de Ang II. Transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RTPCR) foi utilizada para avaliar a expressão de RNAm. Análise imunohistoquímica foi utilizada para detecção e localização de renina no tecido gengival de rato. Um método fluorimétrico padronizado com o tripeptídeo Hipuril-Histidina-Leucina (Hip-His-Leu) foi usado para medir a atividade da ECA em homogenatos de tecido gengival de rato. A técnica de cromatografia líqüida de alto desempenho (HPLC) foi usada para analisar os produtos formados após a incubação de homogenatos de tecido gengival de rato com Ang I ou tetradecapeptídeo substrato de renina (TDP). RT-PCR revelou a expressão de RNAm para renina, angiotensinogênio, ECA e receptores de Ang II (AT1a, AT1b e AT2) em tecido gengival; em fibroblastos cultivados de tecido gengival foi observada expressão de RNAm para renina, angiotensinogênio e receptor AT1a. A técnica de imunohistoquímica demonstrou a existência de renina em vasos de tecido gengival de rato. Atividade da ECA foi detectada por meio do ensaio fluorimétrico (4,95±0,89 nmol His-Leu/g.min). Quando Ang I foi usada como substrato, análises de HPLC mostraram a formação de Ang 1-9 (0,576±0,128 nmol/mg.min), Ang II (0,066±0,008 nmol/mg.min) e Ang 1-7 (0,111±0,017 nmol/mg.min), enquanto que os mesmos peptídeos (0,139±0,031; 0,206±0,046 e 0,039±0,007 nmol/mg.min, respectivamente) e Ang I (0,973±0,139 nmol/mg.min) foram formados quando TDP foi usado como substrato. Adicionalmente, análises de HPLC revelaram a ausência de enzimas que degradam Ang II em homogenatos de tecido gengival de rato. Em conclusão, os resultados apresentados neste trabalho mostram claramente a existência de um SRA local em tecido gengival de rato, que é capaz de gerar Ang II e outros peptídeos vasoativos in vitro. Estudos adicionais são necessários para elucidar o papel deste sistema local no tecido gengival de rato. / Systemic renin-angiotensin system (RAS) promotes the plasmatic production of angiotensin (Ang) II, which acts through the interaction with specific receptors. The concept of this classic circulating RAS has been modified since there is growing evidence that local systems in various tissues and organs are capable of generating angiotensins independently of the circulating RAS. Recent works suggest the existence of some RAS components in the gingival tissue and cultured gingival fibroblasts of different species, but there is paucity of data in the literature regarding the unequivocal existence of crucial RAS components, such as renin and angiotensinogen, in the rat gingival tissue. Therefore, the aims of the present work were to: 1) study the expression and localization of RAS components in the rat gingival tissue and 2) evaluate the in vitro production of Ang II and other peptides catalyzed by rat gingival tissue homogenates incubated with different precursors of Ang II. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to assess mRNA expression. Immunohistochemical (IHC) analysis aimed to detect and localize renin in the rat gingival tissue. A standardized fluorimetric method with the tripeptide Hippuryl-Histidyl-Leucine (Hip-His-Leu) was used to measure tissue ACE activity in rat gingival tissue homogenates. High performance liquid chromatography (HLPC) was used to analyze the products formed after the incubation of rat gingival tissue homogenates with Ang I or tetradecapeptide renin substrate (TDP). RT-PCR revealed the mRNA expression for renin, angiotensinogen, ACE and Ang II receptors (AT1a, AT1b and AT2) in the rat gingival tissue; cultured gingival fibroblasts expressed renin, angiotensinogen and AT1a receptor. IHC demonstrated the existence of renin in vessels of the rat gingival tissue. ACE activity was detected by the fluorimetric assay (4.95±0.89 nmol His-Leu/g.min). When Ang I was used as the substrate, HPLC analyses showed the formation of Ang 1-9 (0.576±0.128 nmol/mg.min), Ang II (0.066±0.008 nmol/mg.min) and Ang 1-7 (0.111±0.017 nmol/mg.min) whereas these same peptides (0.139±0.031; 0.206±0.046 and 0.039±0.007 nmol/mg.min, respectively) and Ang I (0.973±0.139 nmol/mg.min) were formed when TDP was the substrate. Additionally, HPLC revealed absence of Ang II degrading enzymes in rat gingival tissue homogenates. In conclusion, the results presented here clearly show the existence of a local RAS in the rat gingival tissue, which is capable of generating Ang II and other vasoactive peptides in vitro. Further studies are required to elucidate the role of this system in the rat gingival tissue.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Este trabalho relata o perfil quÃmico e farmacolÃgico de quatro espÃcies do gÃnero Senna Mill. â Senna gardneri, Senna georgica, Senna splendida e Senna macranthera var. pudibunda. Este estudo permitiu identificar 38 compostos diferentes de vÃrias classes, com destaque para os flavonoides, dentre os quais: galocatequina, epigalocatequina, (2R*,3S*,4S*,2ââR*,3ââS*)-guibourtinidol-(4&#61537;&#61614;8)-catequina, quercetina glicoarabinose, taxifolina, isoramnetina, procianidina B1, miricetina e di-hidromiricetina. Todos esses compostos foram relatados pela primeira vez em espÃcies de Senna. AnÃlise quantitativa por cromatografia lÃquida de alta eficiÃncia (CLAE-DAD-ESI-MS) do material em estudo indicou o (E)- 3,3â,5,5â- tetra-hidroxi 4-metoxi estilbeno como majoritÃrio nas raÃzes de Senna georgica (6,14 g/Kg), S. gardneri (5,36 g/Kg) e S. splendida (19,23 g/kg). Nas raÃzes e no caule de S. macranthera var. pudibunda, a catequina foi o composto majoritÃrio com teores de 0,87 g/kg e 1,32g/kg, respectivamente. Nas folhas, a quercetina glicoarabinose foi o composto majoritÃrio nas espÃcies de S. gardineri (11,99g/kg) e S. splendida (3,24 g/kg), e a epigalocatequina, nas folhas de S. macranthera var. pudibunda (1,68 g/kg). O fracionamento cromatogrÃfico (CLAE) resultou na obtenÃÃo de seis compostos puros: (E)- 3, 3â, 5,5â- tetra-hidroxi 4-metoxi estilbeno, catequina, rutina, quercitrina, quercetina e (2R*,3S*,4S*,2'R*,3'S*)-guibourtinidol-(4&#61537;&#61614;8)-catequina. A atividade antioxidante dos extratos e compostos puros foi analisada atravÃs das tÃcnicas de DHBA, DPPH, FRAP e ORAC, com resultados promissores para todas as amostras investigadas. Os extratos de S. georgica, S. macranthera var. pudibunda e S. gardneri apresentaram atividade anticolinesterÃsica e, para os ensaios enzimÃticos de inibiÃÃo da enzima conversora da angiotensina I, as folhas e raÃzes de S. gardneri apresentaram os melhores resultados. Os extratos das espÃcies de Senna nÃo apresentaram toxidade frente à Artemia salina e nem potencial leishmanicida. O estudo confirmou o potencial como fonte de compostos bioativos para as espÃcies de Senna estudadas. / This Thesis describes the chemical and pharmacologic profile of four species of the genus Senna Mill. Namely Senna gardneri, Senna georgica, Senna splendida and Senna macranthera var. pudibunda. In this study 38 different polyphenolic compounds of various classes, especially flavonoids were identified by HPLC-DAD-ESI-MS and NMR where possible. The flavonoids were identified as (+)-gallocatechin, (-)-epigallocatechin, 2R,3S,4S,2ââR,3ââS)-guibourtinidol-(4&#61537;&#61614;8)-catechin, quercetin glucoarabinoside, taxifolin, isorhamnetin, procyanidin B1, myricetin and dihydromyricetin. All these compounds are reported for the first time in species of Senna. Quantitative analysis by HPLC showed that, in the material under study (E)-3, 3', 5, 5'-tetrahydroxy-4-methoxy stilbene was the major compound in the roots of Senna georgica (6.14 g/kg), Senna gardneri (5.36 g/kg) and Senna splendida (19.23 g/kg). In the roots and bark of Senna macranthera var. pudibunda, the flavonoid (+)-catechin was the major compound, with levels at 0.87 g/kg and 1.32g/kg, respectively. In the leaves of Senna gardineri and Senna splendida, the major compound was quercetin glucoarabinoside at 12.10 g/kg and 3.241g/kg respectively, and in the leaves of Senna macranthera var. pudibunda (-)-epigallocatechin at 1.68 g/kg. Chromatographic fractionation by semi-preparative HPLC resulted in the purification of six compounds: (E)-3, 3', 5, 5'-tetrahydroxy-4-methoxy stilbene, (+)-catechin, rutin, quercitrin, quercetin and (2R*,3S*,4S*,2''R*,3''S*)- guibourtinidol-(4&#61537;&#61614;8)-catechin. The antioxidant capacity of the extracts and pure compounds was analyzed by the DPPH, FRAP, ORAC, and HPLC-based HX/XO assays, with promising results for all samples investigated. Extracts of Senna georgica, macranthera var. pudibunda and gardneri displayed anticholinesterase activity and, inhibition of angiotensin converting enzyme-I. Extracts of the leaves and roots of Senna gardneri showed the best results. No toxicity of the extracts in the brine shrimp and leishmanicidal assays was evident. This study confirmed the potential of Senna species as a valuable source of bioactive polyphenolic compounds, which may augment their use in traditional Brazilian medicine.

A heme oxigenase (HEOX) é uma enzima que converte o anel heme em quantidades equimolares de biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Fe3+. Esta enzima tem um importante papel fisiológico, regulando os níveis de hemeproteínas e protegendo as células da agressão oxidativa do heme livre. A biliverdina é, subseqüentemente, transformada em bilirrubina que apresenta propriedades antioxidativas e o Fe3+ é seqüestrado pela ferritina. O CO ativa a guanilil ciclase, com resultante produção de 3?,5?-monofosfato de guanosina cíclico provocando relaxamento da musculatura lisa vascular. Em trabalho anterior, nós verificamos o efeito da inibição aguda da heme oxigenase com zinco protoporfirina (ZnPP IX) sobre a pressão arterial de ratos Wistar machos recebendo dietas hipossódica (0,15% de NaCl), normossódica (1,3% de NaCl) ou hipersódica (8% de NaCl) desde o desmame. Nos animais sob dieta hipersódica houve diminuição nos níveis pressóricos, enquanto que nos animais que recebiam dieta hipo e normossódica, ocorreu um aumento dos níveis pressóricos. A análise destes resultados mostrou a existência de uma correlação negativa entre a pressão arterial basal medida antes da injeção de ZnPP IX e o efeito deste tratamento sobre os níveis pressóricos. Esta correlação independeu do conteúdo de sal na dieta consumida pelos animais. Concluímos assim, que a resposta à inibição da HEOX é modulada pela pressão arterial basal. Recentemente, foi mostrado que a heme oxigenase é induzida por incrementos da pressão obtidos de maneiras diversas e que ao retornar os níveis pressóricos a valores basais esta indução da enzima é revertida. A estimulação da HEOX promove consumo de anel heme. O heme integra a estrutura molecular de enzimas importantes na regulação da pressão arterial, como por exemplo, guanilato ciclase, óxido nítrico sintase, hidroxilase e epóxigenase (enzimas pertencentes à família do citocromo P-450). Permitimo-nos conjecturar que a falta de heme repercute sobre a atuação destas enzimas, uma vez que o turnover destas enzimas é dependente de heme. O objetivo deste estudo foi confirmar em outros modelos de hipertensão arterial os achados anteriores e verificar se a enzima epoxigenase que metaboliza o ácido araquidônico formando compostos vasodilatadores, tais como EET e DiHTE, está envolvida na queda da pressão arterial dos animais sob dieta hipersódica. Neste estudo foi induzida hipertensão arterial crônica com angiotensina II (AII - 0,7 mg.kg-1.d-1, via minibomba osmótica durante 7 dias) ou com L?-nitro L-arginina metil ester (L-NAME ? 50 mg/L fornecido na água de beber ao longo de duas semanas) e hipertensão arterial aguda com fenilefrina (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazina (15 mg.kg-1.dia-1 fornecido na água de beber durante 9 dias) e nitroprussiato de sódio (SNP - 7,7?g.kg-1.min-1 iv) foram utilizados para induzir diminuição crônica e aguda, respectivamente, da pressão arterial. A participação da via do citocromo P-450 no mecanismo de queda pressórica em resposta ao ZnPP IX nos animais sob dieta hipersódica (descrita no trabalho anterior), foi avaliada através da inibição desta via com clotrimazole (80 mg/kg/24 horas) em animais na vigência de sobrecarga de sal ou consumindo dieta normossódica. Grupos de ratos submetidos ao tratamento com AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazina e clotrimazole foram submetidos ao teste de inibição da HEOX. A pressão arterial direta (artéria carótida) foi avaliada antes e após a administração de zinco protoporfirina IX (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) ou veículo (carbonato de sódio ? 0,15mmol/kg ip). Nós verificamos nos modelos de hipertensão arterial crônicos ou no modelo agudo um resultado similar ao encontrado no estudo anterior, ou seja, em resposta à inibição da heme oxigenase houve uma queda importante da pressão arterial. Nos animais submetidos a hipotensão arterial não houve modificação da pressão arterial em resposta à administração de ZnPP IX. Nos grupos de animais submetidos ao tratamento com clotrimazole não houve modificação da pressão arterial após administração de ZnPP IX. Em conclusão, pressão basal elevada modifica o efeito da inibição da heme oxigenase sobre os níveis pressóricos em comparação com pressão arterial basal normal ou reduzida. A via do citocromo P-450 parece estar envolvida na queda pressórica após inibição da heme oxigenase nos animais submetidos a tratamento crônico com dieta hipersódica, uma vez que nos animais tratados com clotrimazole não houve modificação pressórica após a inibição da heme oxigenase. / Heme oxygenase (HEOX) is the rate-limiting enzyme that opens the heme ring, resulting in equimolar quantities of biliverdin, carbon monoxide (CO) and Fe3+. HEOX plays an important physiological role in the degradation of heme, regulating hemoprotein levels and therefore protecting cells from the deleterious effects of free heme. Biliverdin is subsequently reduced by biliverdin reductase to bilirubin that has antioxidant properties. Iron is sequestered by ferritin. CO activates soluble guanylate cyclase with resultant production of 3?,5?-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) which produces relaxation of the vascular smooth muscle cells. Previously we demonstrated the effect of acute HEOX inhibition by zinc protoporphyrin IX (ZnPP IX) on blood pressure in male Wistar rats that were fed with low (LSD ? 0.15% NaCl), normal (NSD ? 1.3%) or high salt diet (HSD - 8% NaCl) from weaning (21 days-old animals). The blood pressure decreased in rats on HSD, and increased in the animals on NSD and LSD after ZnPP IX administration. A negative correlation was obtained between blood pressure measured before ZnPP IX and the area under the curve of the percentage of blood pressure changes induced by ZnPP IX. This correlation seems to be independent of the salt content in the diet. Our conclusion is that the response to heme oxygenase inhibition is modulated by basal arterial blood pressure. Recently it was showed that heme oxygenase is induced by high blood pressure and the levels of the enzyme returns to normal with blood pressure control. It is known that heme oxygenase stimulation provokes breakdown of heme ring. The heme integrates the molecular structure of several important enzymes that are involved in the regulation of blood pressure, such as, soluble guanylate cyclase, nitric oxide synthase, hydroxylase and epoxygenase (cytochrome P-450 family). We postulate that the deficiency in heme rings due to heme oxigenase induction might lead to disturbances in the activities of some of these enzymes and hence hypertension. The objective of this study was 1) to confirm the results observed previously in others models f hypertension and 2) to the role of epoxygenase in the regulation of blood pressure in response to HEOX inhibition in hypertensive animals. The chronic hypertension was induced by angiotensin II (AII - 0.7 mg.kg-1.d-1, by osmotic mini pumps during 7 days) or with L?-nitro L-arginine metyl ester (L-NAME ? 50 mg/L in the tap water was given during two weeks ) and acute hypertension with phenylephrine (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazine (15 mg.kg-1.d-1 in the tap water was given during 9 days) and sodium nitropruside (SNP - 7.7?g.kg-1.min-1 iv) were used, respectively, to induce chronic and acute decreases of the blood pressure. The participation of the cytochrome P-450 pathway in the mechanism of blood pressure reduction in response to ZnPP IX was evaluated through the inhibition of this pathway by clorimazole (80 mg/kg/24 hours) in animals on high salt diet or nornal salt diet. Groups of rats treated with AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazine and clotrimazole were submitted to HEOX inhibition. Direct blood pressure (carotid artery) measurements were undertaken before and after zinc protoprphyrin IX administration (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) or vehicle (sodium carbonate ? 0,15mmol/kg ip). In the chronic or acute hypertension models heme oxygenase inhibition induced a decrease of blood pressure. In the hypotension group there was no modification on blood pressure of these animals in response to ZnPP IX. Animals on high salt diet submitted to the clotrimazole treatment did not modify the blood pressure after ZnPP IX administration. Thus; the cytochrome P-450 pathway seems to be involved in the blood pressure decreases after HEOX inhibition in the animals under long term of high salt diet since there was no change in blood pressure in the clotrimazole-treated groups after heme oxygenase inhibition.

Em trabalho anterior, identificamos a mutação c.382C8594;T no gene UBE2A, localizado em Xq24 e codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de nova síndrome de deficiência mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de mutação nesse gene e a primeira associação de mutação em gene que codifica conjugase de ubiquitina com patologia humana. Neste trabalho, focalizamos o gene UBE2A quanto a expressão dos transcritos alternativos, função das isoformas por eles codificadas e o efeito da mutação c.382C 8594; T como causa de deficiência mental (DM). No Capítulo I, revisamos os aspectos genéticos da DM, dando ênfase à herança ligada ao cromossomo X, principal causa de DM herdada e resumimos o estudo que levou à identificação da mutação em UBE2A como causa de quadro sindrômico de DM. Revisamos o papel da via de ubiquitinação de proteínas e das enzimas que participam do processo, em especial as conjugases de ubiquitina. Levantamos evidências na literatura que não deixam dúvida sobre a importância da via de ubiquitinação no sistema nervoso, tanto em processos de neurodesenvolvimento como neurodegeneração. No Capítulo II, avaliamos a contribuição de mutações em UBE2A como causa de DM. Apresentamos os resultados do sequenciamento direto da região codificadora do gene UBE2A em afetados de 23 famílias em que a DM segrega ligada à segmento que inclui Xq24, onde está localizado o gene UBE2A. Uma dessas famílias foi averiguada no Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP (LGH-IB/USP), coordenado pelo Dr. Paulo A. Otto e pela Dra. Angela Vianna Morgante. As demais 22 famílias pertencem ao banco de amostras do Consórcio Europeu de Deficiência Mental (European Mental Retardation Consortium EURO-MRX). A triagem foi também realizada em um indivíduo afetado por DM sindrômica que compartilha características clínicas com nossos pacientes. Como acontece com a maioria dos genes do cromossomo X, o gene UBE2A não parece ser responsável por parcela significativa dos casos de DM, já que novas mutações em UBE2A não foram detectadas nessa triagem. Avaliamos o efeito da mutação c.382C 8594; T nos níveis da transcrição e da tradução em homem afetado e em mulher portadora. A presença da mutação que leva a um códon de parada prematura não resultou na degradação do RNA, que detectamos nas células do afetado. Já na mulher portadora, apenas o transcrito normal foi detectado, de acordo com nossos dados anteriores que mostraram desvio completo no padrão de inativação do cromossomo X nas portadoras da mutação, tendo um mesmo cromossomo X ativo nas células do sangue. A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com alelo mutado estava inativo deve ter levado a esse padrão de inativação desviado do casual, evidenciando o efeito deletério da mutação. Entretanto, o mecanismo pelo qual a mutação afeta a via de UBE2A permanece interrogado. A proteína UBE2A alterada foi encontrada em baixa quantidade nas células do paciente, o que pode ser o resultado de síntese prejudicada ou de degradação pós-traducão. Independente do mecanismo responsável, o fato de apenas uma pequena quantidade da proteína mutada ter sido encontrada, nos permite afirmar que, nas células desses indivíduos, há perda de função de UBE2A. Devemos, contudo, considerar que a proteína mutada é sintetizada e que, no caso de a menor quantidade dever-se à degradação pós-tradução, esse processo pode prejudicar a homeostase celular e contribuir para o quadro clínico. O capítulo II focaliza os transcritos alternativos de UBE2A. Diversos bancos de dados apontam para a existência de três transcritos alternativos do gene UBE2A humano, mas não há trabalho científico que caracterize os tecidos em que os transcritos são expressos ou a função das proteínas por eles codificadas. A mutação c.382C 8594; T localiza-se no éxon 6 do gene, comum a todos os transcritos, de forma que, no caso de eles codificarem proteínas funcionais, a mutação comprometeria três proteínas, e não apenas uma. Demonstramos que os três transcritos de UBE2A são xpressos em leucócitos, pré-adipócitos, placenta, córtex cerebral e hipocampo humanos. Detectamos também os três transcritos nas células de sangue e pré-adipócitos de um de nossos pacientes portador da mutação c.382C 8594; T. Embora os bancos de dados apontem para a existência de apenas um transcrito de UBE2A em camundongos, identificamos um transcrito alternativo correspondente ao transcrito alternativo 3 humano. Este foi detectado inclusive em camundongos nocaute quanto ao gene UBE2A o processo de geração do animal nocaute foi realizado por recombinação homóloga em que o cassete de neomicina foi inserido no éxon 1 do gene, de maneira que não eliminou a existência do transcrito correspondente ao transcrito 3 humano, que utiliza uma 5 UTR alternativa localizada no íntron 3. Entretanto, as proteínas codificadas pelos transcritos alternativos não foram detectadas nos extratos protéicos analisados humanos e de camundongo. Esse resultado poderia ser explicado pela falta de especificidade do anticorpo utilizado ou por essas isoformas representarem pequena parcela do pool de proteínas da célula. Os anticorpos comerciais anti-RAD6 e anti-HR6A/HR6B foram produzidos após imunização de coelhos com a porção N-terminal da isoforma 1. Seria, portanto, possível que não fossem capazes de detectar as isoformas 2 e 3, em que o segmento utilizado para a produção dos anticorpos está total ou parcialmente ausente. No caso de as proteínas estarem pouco representadas na célula, experimentos de co-imunoprecipitação auxiliariam na identificação dessas isoformas nos extratos protéicos. Entretanto, para a detecção de todas as isoformas de UBE2A seria necessário anticorpo que reconhecesse a porção C-terminal de UBE2A. Em 2009, duas novas mutações em UBE2A foram descritas em estudo colaborativo realizado no Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Reino Unido, após sequenciamento em larga escala de aproximadamente 700 genes do cromossomo X de cerca de 200 indivíduos com DM de herança ligada ao X. Ambas as mutações c.215C 8594; T e c.328C 8594; G eram do tipo missense. Não foram fornecidas informações quanto ao quadro clínico dos portadores dessas mutações e também não foi esclarecido porque apenas a alteração c.215C 8594; T que resulta na troca do resíduo de fenilalanina da posição 72 por um resíduo de serina (F72S) foi considerada pelos autores como possivelmente patogênica. Nossos estudos in vitro, apresentados no Capítulo III, sugerem que ambas as alterações afetam a função de UBE2A. Em 2010, foram publicados dois trabalhos associando novas alterações em UBE2A a quadro de DM. Honda e col. (2010) descreveram uma microdeleção em Xq24 que inclui UBE2A e outros oito genes, em um menino com DM e características também presentes em nossos pacientes. Budny e col. (2010) descreveram mutações missense em UBE2A em duas famílias em que segregava quadro de DM sindrômica semelhante ao de nossos pacientes. Por comunicação pessoal de Arjan de Brouwer (Departamento de Genética Humana da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda), soubemos da existência de três outras microdeleções de segmentos do cromossomo X que incluem UBE2A, em pacientes do sexo masculino, não aparentados. Comparamos as características clínicas de nossos pacientes com as dos portadores das microdeleções em Xq24 e com aquelas dos portadores de mutações missense em UBE2A. A DM grave e o comprometimento significativo ou ausência de fala são comuns a todos. Outras características como baixa estatura, sinófris, boca grande e lábios finos com comissuras voltadas para baixo, pescoço curto e largo, implantação baixa de cabelos na nuca, mamilos espaçados, pênis pequeno, hirsutismo generalizado e a ocorrência de convulsões parecem predominar. Entretanto, enquanto a microcefalia aparece em dois dos três portadores de microdeleções avaliados, a macrocefalia parece predominar no grupo em que ocorrem as mutações de ponto. No Capítulo III, abordamos estudos funcionais in vivo e in vitro para avaliar se as isoformas alternativas de UBE2A compartilham suas funções de conjugase de ubiquitina e compreender o efeito da mutação c.382C8594;T na função de UBE2A. Buscamos estabelecer modelo celular para avaliar o efeito da mutação na formação de neuritos. Trabalho previamente publicado havia demonstrado que a diferenciação neuronal de células PC12 concomitantemente com a inibição parcial do mRNA de UBE2B (parálogo de UBE2A) resultava na redução de 20-30% do comprimento de neuritos. Entretanto, nossos ensaios de diferenciação de pré-adipócitos não responderam nossas questões sobre o efeito da mutação na formação de neuritos, pois não conseguimos obter, nas células do controle ou nas do paciente, a densidade de neuritos descrita anteriormente na diferenciação de pré-adipócitos. Diferentemente das células PC12, de origem ectodérmica, os pré-adipócitos tem origem mesodérmica, o que dificulta sua diferenciação em linhagem derivada de outro folheto germinativo. A elevada conservação entre as proteínas ortólogas UBE2A e UBE2B humanas e RAD6 de levedura e a observação de que ambas as parálogas humanas são capazes de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de Saccharomyces cerevisiae nos levou a considerar a linhagem de levedura 916;rad6 como modelo para nossos estudos funcionais. Também, avaliamos a capacidade das isoformas 2 e 3 e da isoforma Q128X de UBE2A para ubiquitinar histonas H2A in vitro, conforme previamente descrito para a isoforma UBE2A/1. Os resultados dos ensaios in vivo indicam que apenas a expressão do transcito 1 de UBE2A é capaz de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de S. cerevisiae. A expressão dos transcritos 2 ou 3 não resulta na restituição do fenótipo de sensibilidade à UV - a expressão gera certa toxicidade, agravada quando as células são cultivadas a 37o C. Entretanto, as isoformas por eles codificadas não parecem ser estáveis na levedura: assim como nos tecidos humanos testados, não conseguimos detectá-las nos extratos protéicos das leveduras que expressavam esses transcritos. A expressão do transcrito 1 contendo a mutação c.382CT revelou que a isoforma UBE2A/Q128X, por sua vez, é estável na linhagem 916;rad6, porém, além de não restituir o fenótipo de sensibilidade à UV, foi, dentre as isoformas de UBE2A, a mais tóxica. Os fenótipos de toxicidade não foram observados após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Esses resultados indicam que as isoformas 2 e 3 de UBE2A não apresentam atividade de conjugase de ubiquitina e que são, aparentemente, degradadas imediatamente após sua expressão em levedura. O fato de o fenótipo de toxicidade ser agravado, em condições de choque térmico, apóia a hipótese de degradação dessas isoformas, em levedura. A degradação pode ser resultado da ausência de parceiro que permita sua estabilidade, mas a ausência das isoformas também em extratos protéicos de tecidos humanos sugere que o mesmo processo de degradação ocorra em mamíferos. Segundo a classificação das E2, as diversas conjugases de ubiquitina têm em comum o domínio UBC altamente conservado e as variações observadas consistem em inserções ou extensões C-terminais, mas nunca deleções, como ocorre nas isoformas 2 e 3 de UBE2A. Os transcritos alternativos teriam, assim, função regulatória. Os ensaios in vitro confirmaram a capacidade de UBE2A/1 ubiquitinar histonas H2A. Os ensaios com UBE2A/2 e UBE2A/3 não foram conclusivos, uma vez que a incapacidade de ubiquitinação de histonas que observamos pode ter consequência da renaturação in vitro, que pode ter ocorrido prejudicando sua função. Entretanto a obtenção das isoformas puras nos permitiu verificar que, caso a isoforma 2 estivesse presente nos extratos de levedura, ela seria reconhecida pelo anticorpo anti-RAD6. Verificamos que a proteína mutada UBE2A/Q128X é capaz de interagir com a E1, da qual recebe a molécula de ubiquitina, mas não é capaz de transferi-la para a histona. O segmento C-terminal ausente nessa isoforma é, portanto, importante nesse processo. Os ensaios in vitro despertaram nossa atenção para o fenômeno de autoubiquitinação de UBE2A, possível mecanismo de autorregulação previamente considerado na literatura. O fato de alguns trabalhos sugerirem que as E2 atuem também como dímeros in vivo e in vitro e a elevada conservação entre as parálogas humanas UBE2A e UBE2B nos levaram a considerar a possibilidade de mecanismo de regulação recíproca. Dessa maneira, a degradação de UBE2A/Q128X nas células do paciente poderia ser dependente de UBE2B. A reduzida capacidade de autoubiquitinação da isoforma mutada dificultaria sua degradação e tornaria necessária a atividade da paráloga. Isso explicaria porque ela é estável quando expressa na linhagem de levedura 916;rad6, mas não nas células do paciente. A presença de RAD6 estaria diretamente relacionada à ausência de toxicidade após a expressão de UBE2A/Q128X em linhagem selvagem a degradação da isoforma mutada está ocorrendo nessas células. A não viabilidade de camundongo duplo-nocaute quanto as parálogas UBE2A e UBE2B não permite testar a estabilidade da isoforma mutada em células de mamíferos. Observamos, de fato, que a inibição do proteassoma nas células do paciente leva ao acúmulo dessa proteína. A presença da mutação c.382C8594;T nas células do paciente parece resultar no fenótipo de DM devido à perda de função de UBE2A: a isoforma mutada não restitui o fenótipo de sensibilidade à UV de S. cerevisiae e não foi capaz de ubiquitinar histonas H2A in vitro. Além disso, indivíduos com microdeleções de UBE2A apresentam fenótipo semelhante ao de nossos pacientes. Por outro lado, a presença da proteína mutada que necessitaria de UBE2B para ser degradada pode caracterizar um ganho tóxico de função - comprometeria a função de ambas as parálogas. É possível que os dois mecanismos contribuam para o quadro clínico. Os dados dos ensaios in vivo e in vitro abrem caminhos de investigação do processo de regulação de UBE2A e UBE2B no nível da proteína, sugerindo a autoubiquitinação e a ubiquitinaão recíproca como possíveis mecanismos reguladores, que podem explicar a conservação das duas parálogas de RAD6 em mamíferos. / We have previously described a nonsense mutation (c.382C8594;T) in the UBE2A gene, at Xq24, which encodes a ubiquitin conjugating enzyme (E2), as the cause of a new X-linked mental retardation syndrome. The predicted protein lacks the 25 C-terminal amino acid residues conserved in vertebrates and in Drosophila. This was the first description of a mutation in a ubiquitin conjugating enzyme gene causative of a human disease. In the present work, we focused on the UBE2A gene, its alternative transcripts and isoforms, and the effect of the c.382C8594;T mutation. We screened for UBE2A mutations 23 males presenting X-linked mental retardation (XLMR), previously mapped to the interval encompassing this gene, and one isolated case, who shared clinical features with our previously described patients. No mutations were detected in this selected series of patients suggesting that mutations in UBE2A is not a common cause of XLMR, similarly to the majority of the XLMR genes hereto described. Very recently four Xq24 microdeletions encompassing UBE2A and three missence mutations were found by other groups in mentally retarded males that shared several clinical features with our patients. Comparing these and our patients, a clinical picture emerges of mental retardation associated with severe speech impairment, present in all of them. Short stature, large mouth with downturned corners and thin lips, short and broad neck, low posterior hairline, widely spaced nipples, marked generalized hirsutism and seizures are common features. However, microcephaly was observed only in patients carrying UBE2A deletions, while carriers of missense or nonsense mutations showed macrocephaly. We evaluated the effect of the UBE2A c.382C8594;T mutation on transcription and translation. This mutation affects the last UBE2A exon and, as expected, does not lead to nonsense mediated RNA decay, demonstrated by the presence of UBE2A mRNA in leucocytes of an affected male. However, only a small amount of the mutated protein was detected in the patients cells, suggesting the loss of UBE2A function as the cause of the syndrome. The posttranslational degradation of the mutated protein could also disturb the cellular homeostasis, a gain of function that remained a possibility. The detrimental effect of the c.382C8594;T mutation was further supported by the presence of only the normal transcript in leucocytes of a heterozygous woman, who had completely skewed X inactivation, thus pointing to the selective advantage of lymphocytes carrying the normal allele on the active X chromosome. Our search in DNA and protein sequence databases suggested that the UBE2A gene produces three alternative transcripts all classified as protein coding. These three tanscripts contain the mutation site (c.382C8594;T). We showed that all three UBE2A transcripts are expressed in human leucocytes, adipocytes, placenta, cerebral cortex and hippocampus. We also detected an alternative transcript in murine, which corresponds to the human transcript 3. This alternative transcript was present in all murine tissues analyzed, including samples from a UBE2A knockout mouse. However, we failed to detect the proteins encoded by the alternative transcripts. This could result from low affinity of the used commercial antibody to the isoforms. Alternatively, a small amount of these proteins in the pool of cellular proteins, might have not been detected by Western blotting. We performed in vivo and in vitro assays to address the role of the alternative UBE2A isoforms, and to evaluate the effect of c.382C-T mutation on UBE2A function. Taking into account the high amino acid conservation between the human UBE2A and the Saccharomyces cerevisiae ortholog RAD6, we used a 916;rad6 yeast strain to verify whether UBE2A alternative and mutated isoforms were able to complement its UV-sensitivity phenotype, as previously demosntrated for UBE2A isoform 1. We also performed in vitro assays to evaluate their ubiquitination activity towards histone H2A, a known in vitro substrate of RAD6 and UBE2A. Only UBE2A isoform 1 could rescue the UV sensitivity phenotype of the knockout yeast strain. The expression of the alternative isoforms 2 and 3 was partially toxic to this yeast strain, and toxicity increased under heat shock conditions. However, these two isoforms do not seem to be stable in yeast cells: as in human tissues, we failed to detect UBE2A isoforms 2 and 3 in yeast cells expressing the corresponding transcripts. The mutant isoform was stable in yeast, but was unable to rescue the UV-sensitivity phenotype, its expression resulting in severe toxicity to the 916;rad6 strain. On the other hand, toxicity was not observed when the mutant UBE2A isoform was expressed in wild type yeast. These findings suggest that isoforms 2 and 3 do not have ubiquitin conjugating activity and, apparently, are degraded immediately after translation. The fact that toxicity is enhanced when these isoforms are expressed under heat shock conditions supports Degradation hypothesis. The degradation could also be due to the absence of a functional partner, in yeast, that could contribute to their stability. Since the alternative isoforms were not detected in the human tissues analyzed, the degradation might occur in human cells as well. E2 enzymes share a catalytic domain and variations among them consist of insertions or terminal extensions, never deletions. Both isoforms 2 and 3 would have deletions of the catalytic domain, suggesting that they are not functional. A regulatory role for these transcripts is a possibility. Our in vitro assays confirmed that UBE2A isoform 1 is capable of histone H2A ubiquitination. The assays for isoforms 2 and 3 were inconclusive, since their lack of ubiquitin conjugating activity could be caused by incorrect in vitro refolding, required because the proteins were obtained from bacterial inclusion bodies after heterologous expression. The mutated protein, however, was able to interact with the ubiquitin molecule, but failed to transfer it to histones, thus pointing to the importance of the C-terminal segment in this process. Our in vitro assays stongly suggested that UBE2A autoubiquitination occur, an activity previously considered a possible E2 regulatory mechanism. Since there is evidence that some E2s form functional dimers, we hypothesized that, due to their high amino acid conservation, UBE2A and its paralog UBE2B might form heterodimers in vivo, as a mutual regulating mechanism. Under this hypothesis, the degradation of the mutated protein could be UBE2B dependent. The reduced autoubiquitination capacity of the mutated isoform could impair its degradation, and require the participation or the paralog. This would explain why the mutated protein was stable in the 916;rad6 yeast strain, but not in the patient´s cells with a functional UBE2B. Following the same reasoning, in wild type yeast, the presence of RAD6 would explain the absence of the mutated protein and toxicity. The non-viability of the double (UBE2A and UBE2B) knockout cells prevented testing whether the mutated protein was stable in the absence of its paralog. However, proteasome inhibition in cultured cells from one of our patients resulted in accumulation of the mutated protein, confirming its degradion via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, the UBE2A c.382C8594;T mutation seems to lead to mental retardation in our patients due to loss of UBE2A function: the mutated isoform is unable to rescue the UV-sensitivity phenotype of 916;rad6 yeast or to ubiquitinate histones in vitro. In addition, patients carrying UBE2A deletions share clinical manifestations with our patients. On the other hand, the possibility remains of a clinical effect of the requirement of UBE2B for degrading the mutated UBE2A. Our data suggest reciprocal ubiquitination in addition to autoubiquitination as UBE2A and UBE2B regulatory mechanism that would explain the conservation of the two paralog genes in mammals.